DE69836557T2

DE69836557T2 - Rekombinanten des infektiösen vogel-herpesvirus und rekombinante impfstoffe, die unter dessen verwendung hergestellt wurden

Info

Publication number: DE69836557T2
Application number: DE69836557T
Authority: DE
Inventors: Syuji Kawasaki Saito; Takashi Kawasaki Okuda
Original assignee: Zeon Corp
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: EP1026246B1; US6632664B1; JP3587065B2; JPH11192093A; EP1026246A1; EP1026246A4; DE69836557D1; WO1999018215A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes Herpesvirus von Truthühnern (im Folgenden als HVT bezeichnet) und ein rekombinantes Marek-Disease-Virus (im Folgenden als MDV bezeichnet), wobei ein Fremd-Gen in einen nichtessentiellen Bereich des Genoms von HVT oder MDV integriert ist, sowie Impfstoffe, bei denen diese Rekombinante eingesetzt wird.
Technischer Hintergrund
Zu den herkömmlicherweise bekannten Virusvektorimpfstoffen, die unter Verwendung von Gen-Rekombinationstechnik hergestellt werden, gehören Impfstoffe, bei denen ein Virus der Gattung Pockenvirus als Vektor eingesetzt wird (Ogawa R. et al., Vaccine, 8: 486–490 (1990)), Impfstoffe, bei denen Adenovirus als Vektor eingesetzt wird (Hsu, K.H. et al., Vaccine, 12: 607–612 (1994)), Impfstoffe, bei denen Baculovirus als Vektor eingesetzt wird, sowie Impfstoffe, bei denen ein Virus der Gattung Herpesvirus als Vektor eingesetzt wird (Shin, M.-F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 5867–5870 (1984)). Von diesen werden rekombinante Vektorimpfstoffe, die auf der Gattung Herpesvirus beruhen, in den letzten Jahren intensiv untersucht.
Als Virusvektoren, die die Expression eines Gens für ein fremdes Antigen erlauben, sind humanes Herpesvirus (HSV), Aujeszky-Virus (Pseudorabiesvirus: PRV) (Van Zijl M. et al., J. Virol., 65: 2761–2765 (1991)), Herpesvirus des Truthahns (HVT) (Morgan R.W. et al., Avian Dis. 36: 858–870 (1992)), Marek-Disease-Virus (MDV) und dergleichen bekannt. Da von diesen das HVT-Virus und der Impfstoffstamm MDV eine hohe Sicherheit bei Geflügel, das Gegenstand einer Impfung ist, und gute Impfstoffeigenschaften haben, erregen sie Aufmerksamkeit als Vektorviren für Vögel.
Im Unterschied zu Pockenvirus, das einen Infektionsmodus hat, bei dem das Virus zuerst aus der infizierten Zelle in das Blut freigesetzt wird und dann während seiner Infektion von der infizierten Zelle auf eine andere Zelle die andere Zelle infiziert, etablieren HVT und MDV eine Infektion über eine Zell-Zell-Wechselwirkung mit einer benachbarten Zelle. Sie sind also relativ frei von den Einflüssen von HVT- oder MDV-spezifischen Antikörpern, die im zirkulierenden Blut vorhanden sind.
Herkömmlicherweise werden Probleme in der Tatsache erkannt, dass die Wirksamkeit von Lebendvirusimpfstoffen durch die Anwesenheit von maternalem Antikörper vom Muttervogel abgeschwächt wird, so dass sie nicht ihre vollen Wirkungen entfalten.
In den letzten Jahren wurden Verfahren zum Einimpfen von Impfstoffen in sich entwickelnde Hühnereier als eines der Verfahren der Impfung von Hühnern entwickelt, und die Eignung von HVT oder MDV als Impfstoff gewinnt Anerkennung.
Herkömmlicherweise bekannte genetische Bereiche, die bisher für die Konstruktion von rekombinantem HVT oder MDV für fremdes Antigen beschrieben wurden, waren jedoch nur genetische Bereiche, die als nichtessentiell für das Überleben von HVT gelten, wie der TK-Bereich (Ross L. et al., 16th International Herpes virus Workshop (1991)), der US10-Bereich (Sakaguchi M. et al., Vaccine, 12: 953–957 (1994)) und der US2-Bereich (Sondermeijer, P.J. et al., Vaccine, 11: 349–358 (1993)). Eine solche Integration in nichtessentielle Bereiche kann die Antigenität von HVT oder MDV abschwächen, da sie die Expression eines Fremd-Gens bewirkt anstelle eines Gens, das, obgleich nicht essentiell, natürlicherweise in HVT exprimiert werden sollte, d.h. eines Gens, das eine antigene Determinante bildet. Außerdem kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass die genetischen Maschinerien (Enhancer, Promotoren, Terminatoren usw.), die an der Transcription oder Translation des offenen Leserasters für den inserierten Bereich beteiligt sind, die Expression des inserierten Gens vielleicht beeinträchtigen.
Tatsächlich gibt es Berichte, dass die Deletion von genetischen Bereichen, die Proteine codieren, die als nichtessentiell gelten, oder die Integration von Fremd-Genen in diese Bereiche zur Modifikation der viralen Morphologie oder zur Reduktion der Antigenität führt. Weiterhin wird die Integration von Fremd-Genen in einigen Fällen als Verfahren zur Herstellung von abgeschwächten Impfstoffen verwendet.
Ein weiterer Bericht beweist, dass die Insertion eines Fremd-Gens in den TK-Bereich und seine Expression zu einer reduzierten Antigenität des exprimierten Gens führte (Ross L. et al., J. Gen. Virol., 74: 371–377 (1993)). Dieses Verfahren hat auch insofern mehrere Probleme als Impfstoff, als viele Antigen-Gene nicht inseriert werden können, da die Länge von Antigen-Genen, die in spezifische offene Leseraster inseriert werden können, beschränkt ist.
Als Ergebnis von intensiven Untersuchungen zur Lösung der obigen Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass es die Gen-Insertionsbereiche von HVT oder MDV gibt, in die eine Vielzahl von Genen für fremdes Antigen inseriert werden kann, wobei das Antigenprotein stabil exprimiert werden kann, d.h. der oben genannte untranslatierte Bereich von HVT oder MDV, dass Gene von verschiedenen fremden Antigenen in diesen inseriert werden können und dass durch Herstellen von rekombinantem HVT oder MDV, in die diese Gene von fremdem Antigen inseriert worden sind, und dann Infizieren der Wirte mit diesen rekombinanten Viren eine ausreichende Impfungswirkung auf den Wirt ausgeübt werden kann, und haben dadurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Offenbarung der Erfindung
Als Ergebnis von intensiven Untersuchungen zur Lösung der obigen Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Virus herge stellt, bei dem ein Fremd-Gen in eine spezifische Stelle in einem untranslatierten Bereich einer Virus-DNA inseriert wurde, die zu dem aviär-infektiösen Herpesvirus gehört, und fanden heraus, dass das rekombinante Virus als Impfstoff verwendet werden kann, und haben dadurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf aviär-infektiöse rekombinante Herpesviren, bei denen ein Fremd-Gen in einen genetischen Bereich inseriert ist, bei dem es sich um einen untranslatierten Bereich in dem Genom handelt.
Der obige untranslatierte Bereich ist ein untranslatierter Bereich, der sich im offenen Leseraster von Herpesviren von Truthähnen oder im offenen Leseraster von Marek-Disease-Virus befindet, die jeweils dem offenen Leseraster des humanen Herpes-simplex-Virus entsprechen. Die Insertionsstelle für ein Fremd-Gen ist wenigstens eine Insertionsstelle, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stellen (1) zwischen UL44 und UL45, (2) zwischen UL45 und UL46, (3) zwischen UL41 und UL42, (4) zwischen UL40 und UL41, (5) zwischen UL53 und UL54 sowie (6) zwischen UL36 und UL37 besteht.
Das obige Fremd-Gen ist vorzugsweise ein Gen, das von einem Erreger von Vogelinfektionskrankheiten abgeleitet ist, und am meisten bevorzugt ein Antigen-Gen, das von einem Erreger abgeleitet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Viren, Bakterien, Pilzen und Protozoen besteht. Weiterhin ist das obige Fremd-Gen vorzugsweise ein Gen, das von einem Erreger abgeleitet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Newcastle-Disease-Virus (NDV), Gumboro-Virus (Virus der infektiösen Bursitis, IBDV), Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), Mycoplasma (MG) und Coccidia besteht.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Hühnerimpfstoff, der das obige rekombinante Virus als Wirkstoff umfasst.
Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird jetzt im Folgenden ausführlicher erläutert.
Viren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
Von den Viren, die Vögel infizieren, sind Viren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung solche, die zur Gattung Herpesvirus gehören (aviär-infektiöses Herpesvirus), da Viren, die zur Gattung Herpesvirus gehören, die Eigenschaft haben, im Körper eines infizierten Tiers permanent im Zustand der latenten Infektion oder persistenten Infektion zu überleben.
Von den aviär-infektiösen Herpesviren wird insbesondere das Herpesvirus des Truthahns oder das Marek-Disease-Virus (MDV) verwendet. Ihre Wirksamkeit als Impfstoff ist zu erwarten, da die obigen Viren eine lange Infektionszeit haben und erwartet wird, dass sie während eines langen Zeitraums eine Impfwirkung auf Vögel ausüben.
HVT oder MDV
HVT oder MDV zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können unter anderem natürlich vorkommende oder solche, die von der ATCC usw. mit oder ohne Gebühr zur Verfügung stehen, umfassen.
Bevorzugte Beispiele für HVT sind solche, die zur Unterfamilie der Gamma-Herpesviren gehören, welche ursprünglich nichtpathogen sind und die nichtkarzinogen sind und als Impfstoff für Geflügel verwendet werden. Insbesondere seien FC126 (ATCC VR-584B), PB-THV1, H-2, YT-7, WTHV-1, HPRS-26 und dergleichen erwähnt. Zum Beispiel kann vorzugsweise der Stamm FC126 verwendet werden. Spezielle Beispiele für MDV sind weiterhin CV1988, SB1 und dergleichen.
Um ein rekombinantes Virus der vorliegenden Erfindung aufzubauen, wird zunächst das obige Virus in einer geeigneten Wirtszelle vermehrt, und dann wird die genomische DNA gewonnen. Dann wird der untranslatierte Bereich der genomischen DNA identifiziert, und dann wird ein unten beschriebenen Fremd-Gen in den Bereich inseriert.
Der Wirt und die Bedingungen für die Vermehrung des Virus werden je nach dem zu vermehrenden Virus in geeigneter Weise ausgewählt. Wenn zum Beispiel HVT vermehrt werden soll, werden Hühnerembryofibroblasten (CEF), ein befruchtetes Ei, eine Hühnernierenzelle und dergleichen als Wirtszelle verwendet. Sie kann 3 bis 4 Tage lang bei etwa 37 °C in einem Kulturmedium, wie Eagles minimalessentiellem Medium (MEM), Leibowitz-L-15/McCoy-5A(1:1-Gemisch)-Kulturmedium, kultiviert werden.
Aus den virusinfizierten Zellen, die wie oben kultiviert werden, wird DNA nach einem herkömmlichen Verfahren extrahiert. Die in Monoschichten gewachsenen Zellen werden also abgekratzt und dann zentrifugiert, um den Überstand zu ernten. Nachdem Protein im Lysepuffer denaturiert und entfernt wurde, wird die DNA mit Phenol und Ethanol extrahiert.
Der untranslatierte Bereich der so erhaltenen viralen DNA kann gemäß der folgenden Beschreibung identifiziert werden.
Der hier verwendete Ausdruck "untranslatierte Bereiche" bezieht sich auf einen Bereich von Nucleotiden, die kein offenes Leseraster haben und keine Aminosäuresequenz eines durch Translation zu exprimierenden Proteins codieren, und einen Bereich von Nucleotiden, bei denen das offene Leseraster nicht an der Transcription, Translation oder Proteinexpression beteiligt ist. Die in diesem Bereich enthaltenen Nucleotidsequenzen können solche sein, die Substitutionen, Deletionen oder Additionen von Basen aufweisen, wenn sie kein offenes Leseraster beinhalten.
Bereiche für die Insertion eines Fremd-Gens
Für die Zwecke dieser Erfindung werden Bereiche, in die Fremd-Gene inseriert werden, "Insertionsbereiche für Fremd-Gene" genannt, und Stellen, in die Fremd-Gene inseriert werden, werden "Stellen für die Insertion von Fremd-Genen" genannt.
Bereiche für die Insertion von Fremd-Genen können so erhalten werden, wie es im Folgenden beschrieben ist. Als Beispiele werden HVT oder MDV erläutert.
Die untranslatierten Bereiche dieser Viren können so erhalten werden, wie es im Folgenden beschrieben ist. Zuerst werden Sequenzen, die eine Sequenz, die für einen untranslatierten Bereich gehalten wird, flankieren, aus Bereichen, die identifiziert wurden, wie humanes Herpes-simplex-Virus Typ I (HSV-I), von dem eine ganze Nucleotidsequenz bestimmt wurde, und HVT- und MDV-1-Sequenzen, die eine hohe Homologie damit aufweisen, ausgewählt.
Dann werden DNA-Primer auf der Basis dieser Sequenzen synthetisiert, und eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird unter vorbestimmten Bedingungen durchgeführt, wobei man die DNA von HVT oder MDV als Matrize verwendet, um ein spezifisches Gen zu amplifizieren.
Die Abwesenheit eines offenen Leserasters in dem amplifizierten Gen wird durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt, und die Positionen, wo die genetischen Maschinerien (Enhancer, Promotoren, Terminatoren usw.), die an der Transcription oder Translation des offenen Leserasters beteiligt sind, nicht vorhanden sind, werden ebenfalls lokalisiert, und dann werden Insertionsbereiche für Fremd-Gene bestimmt.
Um zu klären, dass der Bereich für die Virusvermehrung nichtessentiell ist und dass ein Fremd-Gen in diesen Bereich eingeführt werden kann, wird die Addition, Deletion oder der Ersatz einer spezifischen Sequenz in dem Bereich durchgeführt, und dann werden CEF (Hühnerembryofibroblasten) damit infiziert, und Veränderungen der Infektiosität und der Vermehrungseigenschaft vor und nach solchen Modifikationen werden untersucht.
Die oben genannte Addition, Deletion oder der Ersatz einer spezifischen Sequenz kann unter Verwendung von Standardwerkzeugen wie in-vitro-Mutagenese, PCR, ortsgerichtete Mutagenese und ortsspezifische Mutation, wie sie in der Japanischen Patentschrift Nr. 6-16709 (Kokoku) beschrieben ist, durchgeführt werden.
CEF wird mit einer MOI (Multiplizität der Infektion) von ≒ 1 infiziert, 3 bis 4 Tage lang bei 37 °C wachsen gelassen, und dann werden die Virusvermehrung, die Zellmorphologie, die Plaquemorphologie und die Zellimmortalität beobachtet.
Wenn bestätigt wird, dass es keine Unterschiede in Zell- und Plaquemorphologie gegenüber dem Stamm vor der Nucleotidmodifikation gibt und dass der Unterschied in der Virusvermehrung gegenüber dem Stamm vor der Nucleotidmodifikation innerhalb von ±20% als Mittelwert von fünf wiederholten Durchläufen liegt, wird als Ergebnis daraus geschlossen, dass die Stelle ein Bereich ist, in den ein Fremd-Gen inseriert werden kann (ein möglicher Insertionsbereich für Fremd-Gene). Die Größe des Insertionsbereichs für Fremd-Gene einschließlich des untranslatierten Bereichs und von Bereichen, die diesen flankieren, beträgt ausreichenderweise 10 bp oder mehr, vorzugsweise 100 bp oder mehr und besonders bevorzugt 500 bp oder mehr.
Insertionsstellen für Fremd-Gene befinden sich (1) zwischen UL44 und UL45 und zwischen UL45 und UL46, (2) zwischen UL41 und UL42, (3) zwischen UL40 und UL41, (4) zwischen UL53 und UL54 oder (5) zwischen UL36 und UL37. Sie sind für HSV-1 in den Proceedings of the 16th Herpes Virus Workshop (abgehalten am Pacific Grove in Kalifornien, USA, am 7.–12. Juli 1991) beschrieben.
Von diesen sind bevorzugte Stellen solche, (1) für die ein untranslatierter Bereich zwischen offenen Leserastern vermutet werden kann.
Konstruktion von Plasmiden, die ein Fremd-Gen enthalten Um ein Fremd-Gen in einen untranslatierten Bereich von HVT oder MDV zu inserieren, ist es notwendig, eine Sequenz, die den untranslatierten Bereich enthält, im voraus in ein Plasmid zu klonieren, aber das Plasmid unterliegt keiner Einschränkung.
Erwähnt seien zum Beispiel Plasmide, wie pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 und pUC9, sowie Phagen, wie der Lambdaphage und M13-Phage, sowie Cosmide, wie pHC79.
Ein untranslatierter Bereich, der so erhalten wird, wie es oben erwähnt ist, wird nach einem herkömmlichen Verfahren in diese Plasmide integriert.
Um ein Fremd-Gen in den wie oben integrierten untranslatierten Bereich zu inserieren, wird eine Mutation an einer spezifischen Stelle des untranslatierten Bereichs durchgeführt, der wie oben in ein Plasmid kloniert wurde, so dass eine neue Spaltungsstelle für Restriktionsenzyme entstand, und dann wird das Fremd-Gen in die Stelle inseriert.
Ein Verfahren zur Durchführung einer Mutation kann ein herkömmliches Verfahren sein, und es kann ein Verfahren verwendet werden, das üblicherweise vom Fachmann verwendet wird, wie in-vitro-Mutagenese und PCR. So wird im PCR-Verfahren eine Mutation, wie Deletion, Ersatz oder Addition von 1 bis 2 Nucleotiden, im PCR-Primer durchgeführt, und dann wird der Primer zur Schaffung einer Mutation verwendet.
Für die Zwecke dieser Erfindung enthält das Fremd-Gen, das hier inseriert werden soll, vorzugsweise sowohl ein selbstabgeleitetes Gen, das ursprünglich nicht in dem Bereich enthalten ist, als auch ein nichtselbstabgeleitetes Gen und ist vorzugsweise ein Antigen-Gen eines aviär-infektiösen Herpesvirus.
Beispiele für solche Gene sind Gene, die von einem Erreger von Vogelinfektionskrankheiten abgeleitet sind. Beispiele für Erreger, die Infektionen bei Vögeln verursachen, sind Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen und dergleichen. Vorzugsweise können Antigen-Gene verwendet werden, die in diesen Erregern enthalten sind, d.h. Gene, die Antigendeterminanten codieren.
Spezifische Beispiele für solche Erreger sind das Newcastle-Disease-Virus (NDV) und das Gumboro-Virus (Virus der infektiösen Bursitis, IBDV), die für Hühner eine lebenslange Bedrohung darstellen, das Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), das Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), Mycoplasma (MG) und Coccidia, die Bedrohungen für junge und mittelalte Hühner und danach darstellen.
Insbesondere bei Krankheiten, bei denen die Gene von neutralisierenden Antigenen oder die Gene von Antigenen, die als immunschützende Antigene gelten, identifiziert wurden, ist es möglich, diese Gene in aviär-infektiöse Herpesviren, wie HVT und MDV, zu integrieren und sie dann als Antigene im Körper von Hühnern, die mit dem integrierten Virus infiziert sind, zu exprimieren. Dies ermöglicht auch ihre Verwendung als effektive Impfstoffe.
Insbesondere Proteine, die in den Vögeln exprimiert werden, die mit einem rekombinanten Virus infiziert sind, das durch Integrieren eines Gens in ein aviärinfektiöses Herpesvirus, wie HVT und MDV, konstruiert wurden, können entweder strukturelle Proteine oder nichtstrukturelle Proteine sein und unterliegen keiner Einschränkung, solange ihre DNA-Sequenz bekannt ist.
Für NDV seien zum Beispiel HN-Protein, F-Protein und NP-Protein genannt, und für IBV seien M-Protein, N-Protein und Spike-Protein genannt. Für IBDV sei das gesamte Protein genannt, das VP1 bis VP5 umfasst, für ILTV, da es ein Herpesvirus ist, Proteine, die zu HSV-1, MDV oder HVT homolog sind (insbesondere gB-Protein oder UL32-homologes Protein), für Mykoplasma Adhesin-Protein, HMW-verwandtes Protein, 40K-Protein, 66K-Protein, 67K-Protein und dergleichen (die Sequenzen sind in der internationalen Patentschrift WO 94/23019 beschrieben).
Es ist also bevorzugt, Gene zu integrieren, die diese Proteine codieren. Solche Fremd-Gene werden heterologe Antigen-Gene genannt.
Um in HVT oder MDV ein heterologes Antigen-Gen zu exprimieren, ist es notwendig, eine Promotorsequenz in einen Bereich stromaufwärts des heterologen Antigen-Gens zu integrieren. Der verwendete Promotor kann entweder ein synthetischer oder ein natürlicher Promotor sein und unterliegt keiner Einschränkung, solange er in einem Transcriptionssystem der Zelle, die mit HVT oder MDV infiziert ist, effektiv als solcher fungieren kann.
Als solche Promotoren können in der vorliegenden Erfindung nicht nur ein HVT oder MDV inhärenter Promotor, sondern auch ein Promotor oder eine DNA, die von einem anderen Virus als HVT oder MDV abgeleitet sind, ein Promotor, der von einem eukaryontischen oder prokaryontischen Organismus abgeleitet ist, oder ein synthetischer Promotor verwendet werden, solange sie den obigen Anforderungen genügen.
Insbesondere erwähnt seien der Thymidin-Kinase-Promotor von Herpesvirus (Ross L.J., Gen. Virol. 74: 371–377 (1993)), der gB-Protein-Promotor (siehe oben) von HVT oder MDV, der IE-Promotor des humanen Cytomegalievirus (HCMV) (Alting-Mess M.A., Nucleic Acids Res., 17: 9494 (1989)), der SV40-Promoter (Gunning P., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 4931–4835 (1987)), der β-Actin-Promotor (siehe oben und Kost A.T., Nucleic Acids Res., 11: 8287–8301 (1983)), der β-Globin-Promotor (Spitzner J.R., Nucleic Acids Res., 18: 1–11 (1990)), der LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus (Fiek A. et al., Nucleic Acids Res., 20: 1785 (1992)) und dergleichen. Außerdem können auch Promotoren der strukturellen Proteine oder die essentiellen Gene von HVT oder MDV verwendet werden.
Diese können in einer solchen Weise in den oben genannten untranslatierten Bereich integriert werden, dass ein fremdes Antigen-Gen unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors exprimiert werden kann, wodurch ein Plasmid konstruiert wird. Das so konstruierte Plasmid kann eine Rekombination mit einem spezifi schen Bereich des HVT- oder MDV-Genoms erfahren, was zur Schaffung eines rekombinanten Virus führt.
Konstruktion eines rekombinanten Virus
Die Insertion eines Fremd-Gens, wie es oben beschrieben ist, in einen untranslatierten Bereich des Genoms eines aviär-infektiösen Herpesvirus kann nach einem Standardverfahren durchgeführt werden. Als Beispiel wird HVT erläutert.
Ein Plasmid, in dem ein fremdes Antigen-Gen in den wie oben erhaltenen HVT-untranslatierten Bereich inseriert wurde, wird unter Verwendung von Elektroporation, Calciumphosphat, eines Verfahrens auf Lipofectinbasis, eines Genkanonenverfahrens oder dergleichen in eine HVT-infizierte Zelle eingeführt. Wegen der hohen Effizienz der Einführung ist die Elektroporation oder ein Verfahren, bei dem Lipofectin eingesetzt wird, bevorzugt. Wenn die einzuführende Menge des Plasmids im Bereich von 0,1 bis 1000 μg liegt, wird die Effizienz der Erzeugung von rekombinanten Viren durch Rekombination zwischen den homologen Bereichen der HVT-DNA und dem Plasmid in Zellen, in die das Plasmid eingeführt wurde, hoch.
Um nur ein so geschaffenes rekombinantes HVT zu selektieren, werden ein oder mehrere Fremd-Gene in den untranslatierten Bereich des Plasmids integriert, und wenigstens eines der verwendeten Gene ist ein Enzym-Gen für Farberzeugung aus einem spezifischen Substrat. Ein Beispiel für ein solches Enzym-Gen ist das β-Galactosidase-Gen.
Ein rekombinantes HVT, das das β-Galactosidase-Gen enthält, kann eindeutig von nichtrekombinanten Viren unterschieden werden, da es bei Zugabe eines Substrats wie Bluogal eine spezifische Farbe entwickelt. Daher ist es durch Kultivieren von Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, in das ein solches Gen integriert ist, in einem Kulturmedium, das mit einem spezifischen Substrat ergänzt ist, möglich, virusinfizierte Zellen, die eine Farbe entwickeln, zu selektie ren. Durch Wiederholen dieses Verfahrens können rekombinante Viren gereinigt werden.
Lebendimpfstoffe
Zu den Verfahren zur Herstellung eines Lebendimpfstoffs der vorliegenden Erfindung gehören unter anderem die folgenden Verfahren.
Mit Zellen, die mit einem rekombinanten Virus der vorliegenden Erfindung infiziert sind, werden die Zellen (im Folgenden als Wirtszellen bezeichnet), in denen das Virus sich vermehren kann, infiziert und gezüchtet. Dann werden die Zellen unter Verwendung eines Kratzers oder mit Trypsin von den Näpfen gelöst, und die infizierten Zellen werden durch Zentrifugation vom Überstand getrennt.
Als Wirtszellen werden von Hühnern abgeleitete Zellen bevorzugt, und CEF (Hühnerembryofibroblasten), Hühnernierenzellen und dergleichen können bevorzugt verwendet werden.
Die so erhaltenen infizierten Zellen werden in einem Kulturmedium, das 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält, suspendiert und unter flüssigem Stickstoff eingefroren aufbewahrt. Wenn sie als Impfstoff verwendet werden, wird das gefrorene Produkt vor der Verwendung in 100 Volumina Phosphatpuffer gelöst.
Stabilisatoren und andere Komponenten zur Verwendung bei der Aufbewahrung der infizierten Zellen unter flüssigem Stickstoff unterliegen keiner Einschränkung, solange sie die virusinfizierten Zellen in die Lage setzen, stabil zu wachsen, und sie pharmazeutisch annehmbar sind.
Zu den Verfahren zum Einimpfen eines Lebendimpfstoffs der vorliegenden Erfindung in Geflügel gehört unter anderem eine herkömmlicherweise verwendete subkutane Injektion, und es ist dieselbe, wie sie bei den derzeitigen HVT-Impfstoffen verwendet wird. Die einzuimpfende Menge kann ebenfalls dieselbe sein wie bei herkömmlichen Impfstoffen.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann nicht nur als Impfstoff für Infektionen von Herpesviren, sondern auch als Impfstoff für Krankheiten verwendet werden, die durch ein Antigen-Gen verursacht werden, das in den untranslatierten Bereich des Erregers inseriert wird, von dem die Gene stammen. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann als geeigneter rekombinanter mehrwertiger HVT-Impfstoff verwendet werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird jetzt ausführlicher anhand der folgenden Beispiele erläutert, aber es darf nicht angenommen werden, dass die vorliegende Erfindung durch diese Beispiele eingeschränkt ist.
Beispiel 1. Herstellung von HVT-DNA
HVT-DNA wurde im Wesentlichen nach dem Verfahren von Lee et al. (J. of Virol., 7: 289–294 (1971)) hergestellt.
Mit HVT (Stamm FC-126) infizierte Zellen (5 ×10⁷ Zellen), die vier Tage lang in einem Leibowitz-L-15/McCoy-5A(1:1)-Mischmedium in einer Kulturschale von 16 cm Durchmesser bei 37 °C kultiviert wurden, wurden mit einem Kratzer abgekratzt und dann mit niedriger Geschwindigkeit (2000 U/min, 5 Minuten) zentrifugiert. Nach dem Verwerfen des Überstands wurde ein Lysepuffer (0,15 M NaCl, 0,1 M EDTA, 1% SDS, 100 μg/ml Proteinase K) in einer Menge, die zehnmal so groß war wie die Menge der ausgefallenen infizierten Zellen, hinzugefügt.
Nach Inkubieren über Nacht bei 37 °C wurde eine gleiche Menge Phenol hinzugefügt, um Proteine zu denaturieren, und dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um HVT-DNA zu extrahieren. Die extrahierte DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen.
Beispiel 2 Konstruktion von pNZ45/46Sfi
Auf der Grundlage der Information über das gCh-Gen (Coussens et al., J. Virol., 62: 2373–2379 (1988)) des MDV-Serotyps 1 und des flankierenden EcoRI-BamHI-Fragments (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 6-292583) des BamHI-B-Fragments wurden synthetische DNAs (Primer 1 bis 4) so gestaltet, dass eine SfiI-Stelle zwischen den offenen Leserastern eingeführt wurde.
Der obige Artikel von Coussens et al. beschreibt UL44 und 45, während die Japanische Offenlegungsschrift Nr. 6-292583 UL46 beschreibt.
Unter Verwendung der unten beschriebenen Primer wurde eine PCR durchgeführt, und ein amplifiziertes Produkt wurde in pUC18 kloniert.
Aus den HVT-FC126-infizierten CEF wurde nach dem Verfahren von Beispiel 1 DNA geerntet, und 100 ng der DNA wurden als Matrize verwendet. Weiterhin wurde eine PCR nach einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt, wobei man einen Primersatz A, der aus Primer 1 (CCCCGAATTC ATGGAAGAAA TTTCC; SEQ ID Nr. 1) und Primer 2 (CGCGGGCCTT ATTGGCCAAA ACACACCTCT AACGGTTACT; SEQ ID Nr. 2) (jeweils 50 pmol) bestand, und einen Primersatz B, der aus Primer 3 (GCGCGGCCAA TAAGGCCAA ACACAGTAAC CGTTAGAGGT; SEQ ID Nr. 3) und Primer 4 (CCCCAAGCTT TCAAGTGATA CTGCGTGA; SEQ ID Nr. 4) (jeweils 50 pmol) bestand, verwendete. Die Reaktion wurde nach dem 30. Zyklus abgebrochen, und jeweils etwa 10 μg der amplifizierten Produkte wurden erhalten.
Unter Verwendung eines Gemischs dieser beiden PCR-Produkte (Mischungsverhältnis 1:1, jeweils 100 ng wurden miteinander gemischt) als Matrize wurden 30 PCR-Zyklen (wobei ein Zyklus 1 Minute bei 45 °C, 2 Minuten bei 60 °C und 3 Minuten bei 73 °C umfasste) unter Verwendung von Primer 1 und Primer 4 durchgeführt, und dadurch wurde eine SfiI-Stelle zwischen den offenen Leserastern von UL45h und UL46h eingeführt.
Das so erhaltene amplifizierte Produkt wurde mit EcoRI und HindIII gespalten, und das Fragment wurde in die EcoRI-HindIII-Stelle von pUC18 inseriert, wobei man 4 Einheiten T4-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo) verwendete, indem man 30 Minuten lang bei 16 °C inkubierte, wobei pNZ45/46Sfi konstruiert wurde.
Beispiel 3. Konstruktion von pNZ44/45sfi
Wie in Beispiel 2 wurde unter Verwendung von DNA (10 ng), die von den mit dem HVT-FC126-Stamm infizierten CEF erhalten wurde, als Matrize und unter Verwendung eines Primersatzes C, der aus Primer 1 und Primer 5 (GCGCGGCCAA TAAGGCCAAC ATCGGGACGT ACATCAT; SEQ ID Nr. 5) (jeweils 50 pmol) bestand, und eines Primersatzes D, der aus Primer 6 (GCGCGGCCTT ATTGGCCTTA AATACCGCGT TTGGAGTAAA; SEQ ID Nr. 6) und Primer 4 (jeweils 50 pmol) bestand, eine PCR wie in Beispiel 2 durchgeführt. Amplifizierte Produkte von jeweils etwa 10 μg wurden erhalten.
Unter Verwendung eines Gemischs dieser beiden PCR-Produkte (Mischungsverhältnis 1:1, jeweils 100 ng wurden miteinander gemischt) als Matrize wurde eine PCR unter Verwendung von Primer 1 (50 pmol) und Primer 4 (50 pmol) wie in Beispiel 2 durchgeführt, und dadurch wurde eine SfiI-Stelle zwischen den offenen Leserastern von UL44h (gCh von HSV-1 oder gCh (gA) von MDV1) und UL45h eingeführt.
Das Produkt wurde mit EcoRI und HindIII gespalten, und das erhaltene Fragment wurde wie in Beispiel 2 in die EcoRI-HindIII-Stelle von pUC18 inseriert, um pNZ44/45Sfi zu konstruieren.
Beispiel 4. Konstruktion von pG1MCSpolyASfi
(1) Konstruktion des Donorplasmids pGTPs
Eine synthetische DNA (5'-AGCTGCCCCCCCGGCAAGCTTGCA-3' (SEQ ID Nr. 7)) wurde in die HindIII-PstI-Stelle von pUC18 inseriert, und dieser Teil wurde dann unter Verwendung von DNA-Polymerase unter Bildung eines Doppelstrangs repariert. Dann wurde eine synthetische DNA (5'-TCGACATTTTTATGTAC-3' (SEQ ID Nr. 8)) in die SalI-KpnI-Stelle des erhaltenen Plasmids inseriert, das gleichermaßen mit DNA-Polymerase unter Bildung eines Doppelstrangs repariert wurde. Weiterhin wurde ein assoziiertes Produkt von zwei synthetischen DNAs (5'-AATTCGGCCGGGGGGGCCAGCT-3' (SEQ ID Nr. 9) und 5'-GGCCCCCCCGGCCG-3' (SEQ ID NO: 10)) in die SacI-EcoRI-Stelle des Plasmids eingeführt. Schließlich wurde ein etwa 140 bp großes DNA-Fragment, das durch Verdauen des Plasmids pNZ1729R (Yanagida et al., J. Virol., 66: 1402–1408 (1992)) mit HindIII und SacI erhalten wurde, in die HindIII-SacI-Stelle dieses Plasmids inseriert, um ein Plasmid pGTPs zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pGIMCSpolyASfi
pUC18 wurde mit DraI gespalten, und ein XhoI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) wurde wie in Beispiel 2 dort inseriert, wobei pUC18X konstruiert wurde, in das eine XhoI-Stelle eingeführt worden war.
Dieses pUC18X wurde mit HindIII und PstI gespalten, und daran wurden die synthetische DNA 1 (AGCTTGCCAATAAGGCTGCA; SEQ ID Nr. 11) und die synthetische DNA 2 (ATGGCCCGCC GGCTGACCGC; SEQ ID Nr. 12) assoziiert, wobei ein Fragment entstand. Dieses wurde unter Verwendung von T4-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo) in die obige XhoI-Stelle inseriert, um pU18XG zu konstruieren.
Um ein Poly-A-Additionssignal und eine SfiI-Stelle in die KpnI-EcoRI-Stelle von pU18XG einzuführen, wurde ein Fragment, das durch Assoziieren einer synthetischen DNA 3 (GCGGTCAGCC GGCGGGCCAT; SEQ ID Nr. 13) und einer synthetischen DNA 4 (GGTAAACTGC AGACTTGGCA GT; SEQ ID Nr. 14) hergestellt wurde, unter Verwendung von T4-Ligase inseriert, um pUCpolyASfi zu konstruieren.
In die KpnI-BamHI-Stelle dieses pUCpolyASfi wurde ein 36-bp-KpnI-BamHI-Fragment von pGTPs, das in Beispiel 4 (1) beschrieben ist, inseriert, um pMCSpolyASfi zu konstruieren.
In die HindIII-PstI-Stelle dieses pMCSpolyASfi wurde die synthetische DNA 5 (ACTGCCAAGT CTGCAGTTTA CC; SEQ ID Nr. 15) wie in Beispiel 2 inseriert, um pGIMCSpolyASfi zu konstruieren.
Beispiel 5. Konstruktion von pRSV und pCMV
Ein etwa 600 bp großes NsiI-NheI-Fragment, das den durch doppelten Verdau mit NsiI und NheI aus pBK-RSV (hergestellt von Stratagene) herausgeschnittenen RSV-Promotor enthielt, wurde wie in Beispiel 2 in die PstI-XbaI-Stelle von pGIMCSpolyASfi, das in Beispiel 4 erhalten wurde, inseriert, um pRSV zu konstruieren.
Ähnlich wurde ein NsiI-NheI-Fragment, das den CMV-Promotor von pBK-CMV (hergestellt von Stratagene) enthielt, herausgeschnitten und wie in Beispiel 2 in die PstI-XbaI-Stelle von pGIMCSpolyASfi, das in Beispiel 4 erhalten wurde, inseriert, um pCMV zu konstruieren.
Beispiel 6. Konstruktion von pCMV-HN (BglI^–)
(1) Deletion von BglI-Stellen aus dem CMV-Promotor von pCMV
Da sich im CMV-Promotor von pCMV drei BglI-Stellen befinden, wurde eine PCR durchgeführt, wie es unten beschrieben ist, um eine Mutation einzuführen und dadurch die BglI-Stellen zu deletieren. Die Mutation wurde in der folgenden Weise durchgeführt.
Unter Verwendung des in Beispiel 5 konstruierten pCMV (100 ng) als Matrize wurde eine PCR unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei man einen Primersatz E, der aus Primer 7 (SEQ ID Nr. 12) und Primer 8 (SEQ ID Nr. 15) bestand, und einen Primersatz F, der aus M13P7-Primer (hergestellt von Toyo Boseki Co., Ltd.) und Primer 9 (SEQ ID Nr. 13) bestand, verwendete. Es wurden jeweils etwa 10 μg der amplifizierten Produkte erhalten.
Amplifizierte Produkte (jeweils 100 ng), die unter Verwendung der obigen beiden Primersätze erhalten wurden, wurden in einem Mischungsverhältnis von 1:1 miteinander gemischt. Mit dem Gemisch als Matrize wurde eine PCR wie in Beispiel 2 unter Verwendung von M13P7-Primer und Primer 8 durchgeführt, wobei man etwa 10 μg PCR-Produkt (1) erhielt.
Ähnlich wurde mit pCMV (100 ng) als Matrize eine PCR wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei man einen Primersatz E, der aus Primer 10 (SEQ ID Nr. 14) und Primer 11 (GGCATAATGC ATGGCGGGCC AT; SEQ ID Nr. 17) bestand, sowie Primer 12 (ATGGCCCGCC ATGCATTATGCC; SEQ ID Nr. 16) und M13P7-Primer (hergestellt von Toyo Boseki Co., Ltd.) verwendete.
Ähnlich wurde mit dem 1:1-Gemisch von jeweils 100 ng der Produkte dieser beiden Primersätze als Matrize eine PCR durchgeführt, diesmal unter Verwendung von Primer 10 und M13P8-Primer, wobei man etwa 10 μg des PCR-Produkts (2) erhielt.
Weiterhin wurden das PCR-Produkt (1) und das PCR-Produkt (2) miteinander gemischt. Dann wurde unter Verwendung von M13P7-Primer und M13P8-Primer eine PCR wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei man einen CMV-Promotor erhielt, bei dem die BglI-Stellen deletiert waren.
(2) Konstruktion von pUCCMV
Außerdem wurde ein etwa 600 bp großes NsiI-NheI-Fragment, das den CMV-Promotor von pBK-CMV (Stratagene) enthielt, wie in Beispiel 2 in die PstI-XbaI-Stelle von pUC19 eingeführt, um pUCCMV zu konstruieren.
(3) Konstruktion von pNZ87
(3-1) Konstruktion eines Plasmids (pNZ76), in dem das β-Galactosidase-Gen mit dem 7.5-K-Promotor ligiert ist
Nach dem Verdauen von 10 μg pMA001 (Shirakawa et al., Gene 28: 127-(1984)) mit BamHI wurde mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert, und anschließend erfolgte eine Ethanolfällung, um das β-Galactosidase-Gen (etwa 3,3 kb) zu gewinnen.
Andererseits wurde nach dem Verdauen von 0,3 μg pUC19 mit BamHI mit Phenol:Chloroform extrahiert, und anschließend erfolgte eine Ethanolfällung. Das Produkt wurde mit dem wie oben hergestellten β-Galactosidase-Gen ligiert, wobei ein Hybridplasmid pNZ66 entstand.
40 μg pUWP-1 (ein Plasmid, das den Promotor von DNA enthält, die ein 7,5-Kilodalton-Peptid eines Vacciniavirus-WR-Stamms codiert) wurden mit HpaII und EcoRI verdaut, einer Gel-Elektrophorese mit 1,5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (70 V, 6 Stunden) unterzogen, und es wurde ein Fragment von etwa 0,26 kb, das den 7.5-K-Promotor enthielt, abgetrennt und dann mit Phenol Chloroform (1:1) extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt, um DNA zu gewinnen. Das klebrige Ende des DNA-Fragments wurde mit Hilfe von DNA-Polymerase in ein glattes Ende verwandelt.
Nach dem Verdauen von 0,3 μg pNZ66 mit HincII wurde mit Phenol:Chloroform extrahiert, und anschließend erfolgte eine Ethanolfällung, um ein Fragment zu gewinnen, an das etwa 0,26 kb des oben erwähnten 7.5-K-Promotor-Gens ligiert wurden, und das erhaltene Hybridplasmid wurde als pNZ76 bezeichnet.
(3-2) Konstruktion des Hybridplasmids pNZ87, in dem ein Promotor von einem Hybridphagen mp10-HN180 und die DNA des HN-Gens von NDV unter der Kontrolle des Promotors miteinander ligiert sind
pNZ76 wurde mit BamHI verdaut und dann einer Gel-Elektrophorese auf 0,8% Agarose unterzogen, wobei man ein etwa 2,9 kb großes Fragment gewann, das kein β-Galactosidase-Gen enthielt.
Andererseits wurde nach dem Verdauen des Hybridphagen mp10-HN180 mit BglII und BamHI ein etwa 1,8 kb großes DNA-Fragment des NH-Gens aus einem 0,8%-Agarose-Gel gewonnen.
Beide Fragmente wurden durch Ligase miteinander ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde verwendet, um einen kompetenten E.-coli-TG-1-Stamm zu transformieren, und ein Plasmid wurde mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens extrahiert. Ein Hybridplasmid, das das HN-Gen enthielt, wurde nachgewiesen und als pNZ87 bezeichnet.
(4) Konstruktion von pNZ87CMV
Dann wurde ein etwa 1,8 kb großes BamHI-SacI-Fragment, das das HN-Gen von NDV enthielt, aus dem in (3) konstruierten pNZ87 herausgeschnitten. Das Fragment wurde wie in Beispiel 2 in die BamHI-SacI-Stelle von pUCCMV inseriert, um pNZ87CMV zu konstruieren.
Da pNZ87CMV BglI-Stellen im Promotorbereich hat, wurde das HindIII-BamHI-Fragment, das den CMV-Promotorbereich enthält, durch ein HindIII-BamHI-Fragment des in (1) beschriebenen PCR-konstruierten CMV-Promotors ohne die BglI-Stellen ersetzt, um pCMV-HN (BglI^–) zu konstruieren.
Beispiel 7. Konstruktion von pRSV-F
(1) Konstruktion von pUCRSV-pA
Ein etwa 600 bp großes NsiI-NheI-Fragment, das den RSV-Promotor von pBK-RSV enthielt (Stratagene), wurde wie in Beispiel 2 in die PstI-XbaI-Stelle von pUC19 inseriert, um pUCRSV zu konstruieren.
Getrennt davon wurde mit pBK-RSV (Stratagene, 100 ng) als Matrize eine PCR wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Primer 13 (CGGGAGCTCT AATTGTTTGT G; SEQ ID Nr. 18) und Primer 14 (CGGGAATTCG CTTACAATTT; SEQ ID Nr. 19) (jeweils 50 pmol) durchgeführt, wobei ein Fragment erhalten wurde, das das pA-Additionssignal des in pBK-RSV enthaltenen SV40-Promotors aufwies.
Das PCR-amplifizierte Fragment wurde doppelt mit SacI und EcoRI verdaut und wie in Beispiel 2 in die SacI-EcoRI-Stelle von pUCRSV inseriert, um pUCRSV-pA zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pNZ98
Ein Plasmid XLIII-10H (Virus Research, 7: 214–255 (1987)), das das F-Gen und das HN-Gen enthielt, wurde verwendet.
4 μg des Plasmids XLIII-10H wurden mit XbaI verdaut, und nachdem das resultierende klebrige Ende mit DNA-Polymerase in ein glattes Ende verwandelt worden war, wurde mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Die gewonnene DNA wurde mit BamHI verdaut und einer Gel-Elektrophorese auf 0,8% Agarose unterzogen, wobei ein Fragment gewonnen wurde, das etwa 2,1 kb des vollständigen F-Gens enthielt.
Andererseits wurde das wie oben geschaffene pNZ76 doppelt mit BamHI und SmaI verdaut, wobei man ein etwa 3,0 kb großes BamHI-SmaI-Fragment gewann, dem der lacZ-Gen-Teil fehlte. Das gewonnene Fragment und ein Fragment, das etwa 2,1 kb des vollständigen F-Gens enthielt, wurden durch Ligase miteinander ligiert, um einen kompetenten E.-coli-TGl-Stamm zu transformieren.
Ein Plasmid wurde durch ein ähnliches Verfahren wie das oben beschriebene aus einer Kolonie hergestellt, die auf einer 50 μg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatte gezüchtet wurde. Das Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen (BamHI und SmaI) gespalten, der gewünschte Klon wurde bestätigt und als pNZ98' bezeichnet. Dieses pNZ98' enthält das F-Gen in voller Länge und ein etwa 300 bp großes 5'-Ende des HN-Gens. Um diesen Teil zu entfernen, wurde pNZ98' doppelt mit SmaI und KpnI verdaut, und ein etwa 4150 bp großes SmaI-KpnI-Fragment wurde durch eine Gel-Elektrophorese auf 0,8% Agarose gewonnen. pNZ98' wurde ebenfalls doppelt mit SmaI und AvaII verdaut, und ein etwa 650 bp großes SmaI-AvaII-Fragment wurde durch eine Gel-Elektrophorese auf 1,5% Agarose gewonnen.
Diese beiden Fragmente wurden miteinander gemischt, und das resultierende klebrige Ende wurde mit DNA-Polymerase in ein glattes Ende verwandelt. Dann wurde das Produkt verwendet, um E. coli TG1 zu transformieren, wobei man eine Transformante erhielt. Die Transformante wurde auf einem LB-Agar-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Aus der resultierenden Kolonie wurde ein Plasmid erhalten, wie es oben erwähnt ist. Das Plasmid wurde erneut mit SmaI verdaut, und die Spaltprodukte wurden selektiert, wobei pNZ98 erhalten wurde.
(3) Aus pNZ98, das oben unter (2) konstruiert wurde, wurde ein etwa 1,8 kb großes BamHI-SacI-Fragment, das das F-Gen von NDV enthielt, herausgeschnitten und dann so, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, in die BamHI-SacI-Stelle von pUCRSV-pA inseriert, um pNZ98RSV3' zu konstruieren.
pNZ98 wurde ebenfalls mit PstI gespalten und mit BamHI partiell verdaut, wobei man ein 125-bp-Fragment erhielt.
Das gewonnene Fragment wurde an die Stelle eines in pNZ98RSV3' enthaltenen 75-bp-PstI-BamHI-Fragments gesetzt, um pNZ98RSVpA zu konstruieren.
Ein 2892 bp großes abgespaltenes MluI-SacI-Fragment des in Beispiel 5 konstruierten pRSV und ein 2262 bp großes abgespaltenes MluI-SacI-Fragment des F-Gens von NDV von pNZ98RSvpA wurden miteinander ligiert, um pRSV-F zu konstruieren.
Beispiel B. Konstruktion von pCMV-VP2S (Okayama)
(1) Konstruktion von pCMV/MCS
In die BamHI-KpnI-Stelle von pCMV-HN (BglI^–), das in Beispiel 6 konstruiert wurde, wurde ein 62-bp-BamHI-KpnI-Fragment von pBluescript SK+ inseriert, um pCMV/MCS zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pCMV/MCSpA
Getrennt davon wurde mit pBK-RSV (Stratagene) als Matrize eine PCR wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Primer 15 (CGGGGGCCCT AATTGTTTGT G; SEQ ID Nr. 20) und Primer 16 (CGGGGTACCG CTTACAATTT; SEQ ID Nr. 21) durchgeführt, wobei ein Fragment erhalten wurde, das das pA-Additionssignal von SV40 aufwies.
Das PCR-amplifizierte Fragment wurde doppelt mit ApaI und KpnI verdaut und wie in Beispiel 2 in die ApaI-KpnI-Stelle von pCMV/MCS inseriert, um pCMV/MCSpA zu konstruieren.
(3) Konstruktion von pCMV-VP2S
Weiterhin wurde RNA nach einem herkömmlichen Verfahren aus einem IBDV-Feldisolat-Okayama-Stamm extrahiert. Die RNA wurde verwendet, um cDNA zu erzeugen, wobei man Reverse Transcriptase und den cDNA-Synthesekit (hergestellt von Takara Shuzo) verwendete.
Mit dieser cDNA als Matrize wurden der Primer 17 (GCAAGCTTGC GATGACGAAC CTGC; SEQ ID Nr. 22) und der Primer 18 (GCGTCGACTC ACCTCCTTAG GGCCC; SEQ ID Nr. 23) auf der Basis eines Bereichs gestaltet, der dem VP2 der Sequenz des Gens entsprach, wie es in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 62-503006 dargelegt ist.
Unter Verwendung dieser beiden Primer wurde eine PCR wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei man einen Bereich erhielt, der dem VP2 von IBDV entsprach.
Getrennt davon wurde pCMV/MCSpA mit HindIII partiell verdaut und dann mit SalI partiell verdaut, wobei man ein 3687-bp-Fragment erhielt. Das durch die obige PCR erhaltene Fragment von IBDV wurde doppelt mit HindIII und SalI verdaut und dann wie in Beispiel 2 in ein 3687-bp-Fragment inseriert, um pCMV-VP2S (Okayama) zu konstruieren.
Beispiel 9. Konstruktion von pUC18Xlac
Das BamHI-SacI-Fragment von lacZ (Yanagida et al., J. Virol., 66: 1402–1408 (1992)) wurde wie in Beispiel 2 in die BamHI-SmaI-Stelle des in Beispiel 4 konstruierten pU18XG inseriert, um pUC18Xlac zu konstruieren.
Beispiel 10 Konstruktion von pNZ45/46RSVlac und pNZ44/45RSVlac
(1) Konstruktion von pNZ45/46RSVlac
In die SfiI-Stelle des in Beispiel 2 konstruierten pNZ45/46Sfi wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 5 konstruierten pRSV, das den RSV-Promotor enthielt, inseriert, um pNZ45/46RSV zu konstruieren.
In die SfiI-Stelle von pNZ45/46RSV wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 9 konstruierten pUC18Xlac, das lacZ enthielt, inseriert, um pNZ45/46RSVlac zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pNZ44/45RSVlac
Ähnlich wurde in die SfiI-Stelle des in Beispiel 3 konstruierten pNZ44/45Sfi das BglI-Fragment des in Beispiel 5 konstruierten pRSV, der den RSV-Promotor enthielt, inseriert, um pNZ45/46RSV zu konstruieren.
In die SfiI-Stelle von pNZ44/45RSV wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 9 konstruierten pUC18Xlac, das lacZ enthielt, inseriert, um pNZ44/45RSVlac zu konstruieren.
Beispiel 11 Konstruktion von pNZ45/46VP2S und pNZ44/45VP2S
(1) Konstruktion von pNZ45/46VP2S
In die SfiI-Stelle des in Beispiel 10 konstruierten pNZ45/46RSVlac wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 8 konstruierten pCMV-VP2S (Okayama), das das VP2-Gen von IBDV enthielt, wie in Beispiel 2 inseriert, um pNZ45/46VP2S zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pNZ44/45VP2S
Ähnlich wurde in die SfiI-Stelle des in Beispiel 10 konstruierten pNZ44/45RSVlac das BglI-Fragment des in Beispiel 8 konstruierten pCMV-VP2S (Okayama), das das VP2-Gen von IBDV enthielt, wie in Beispiel 2 inseriert, um pNZ44/45VP2S zu konstruieren.
Beispiel 12. Konstruktion von pNZ45/46HNF und pNZ44/45HNF
(1) Konstruktion von pNZ45/46HNF
In die SfiI-Stelle des in Beispiel 10 konstruierten pNZ45/46RSVlac wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 6 konstruierten pCMV-HN (BglI^–), das das HN-Gen von NDV enthielt, wie in Beispiel 2 inseriert, um pNZ45/46HN zu konstruieren. Weiterhin wurde in die SfiI-Stelle von pNZ45/46HN das BglI-Fragment des in Beispiel 7 konstruierten pRSV-F, das das F-Gen von NDV enthielt, inseriert, um pNZ45/46HNF zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pNZ44/45HNF
Ähnlich wurde in die SfiI-Stelle des in Beispiel 10 konstruierten pNZ45/45RSVlac das BglI-Fragment des in Beispiel 6 konstruierten pCMV-HN (BglI^–), das das HN-Gen von NDV enthielt, inseriert, um pNZ44/45HN zu konstruieren. Weiterhin wurde in die SfiI-Stelle von pNZ44/45HN das BglI-Fragment des in Beispiel 7 konstruierten pRSV-F, das das F-Gen von NDV enthielt, inseriert, um pNZ44/45HNF zu konstruieren.
Beispiel 13 Konstruktion von pNZ45/46HNF-VP2S und pNZ44/45VP2S-HNF
(1) Konstruktion von pNZ45/46HNF-VP2S
In die SfiI-Stelle des in Beispiel 12 konstruierten pNZ45/46HNF wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 8 konstruierten pCMV-VP2S (Okayama), das das VP2-Gen von IBDV enthielt, inseriert, um pNZ45/46HNF-VP2S zu konstruieren.
(2) Konstruktion von pNZ44/45VP2S-HNF
In die SfiI-Stelle des in Beispiel 11 konstruierten pNZ44/45VP2S wurde das BglI-Fragment des in Beispiel 6 konstruierten pCMV-HN (BglI^–), das das HN-Gen von NDV enthielt, inseriert, um pNZ44/45VP2S-HN zu konstruieren. Weiterhin wurde in die SfiI-Stelle von pNZ44/45VP2S das BglI-Fragment des in Beispiel 7 konstruierten pRSV-F, das das F-Gen von NDV enthielt, inseriert, um pNZ44/45VP2S-HNF zu konstruieren.
Beispiel 14 Reinigung von rekombinantem HVT
Eine Monoschicht von CEF, die mit Trypsin abgelöst wurde, wurde in Saline G (0,14 M Natriumchlorid, 0,5 mM Kaliumchlorid, 1,1 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1,5 mM Natriumdihydrogenphosphat und 0,5 mM Magnesiumchlorid- Hexahydrat, 0,011% Glucose) suspendiert, um eine Zellsuspension herzustellen. Die Zellsuspension (2 × 10⁷ Zellen) wurde mit jeweils 40 μg der rekombinanten Plasmide pNZ44/45VP2S, pNZ44/45HNF, pNZ45/46VP2S, pNZ45/46HNF, pNZ44/45VP2S-HNF und pNZ45/46HNF-VP2S und jeweils 100 μg der in Beispiel 1 hergestellten DNA von HVT gemischt.
Nach 10 Minuten Stehenlassen der Lösung bei Raumtemperatur wurde sie einer Elektroporation unter Verwendung des Gene Pulser (hergestellt von Bio-Rad) bei Raumtemperatur unter den Bedingungen 3,0 kVcm^–1, 0,4 ms und 25 °C unterzogen.
Die Zellen, in die das Plasmid und die DNA von HVT eingeführt wurden, wurden auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 9 cm (hergestellt von Falcon) ausgestrichen und dann etwa 4 bis 5 Tage lang bei 37 °C kultiviert, bis Plaques entstanden, die für HVT eigentümlich sind.
Zellen, die Plaques bildeten, wurden mit 1% Trypsin ausgekratzt und mit CEF-Zellen (2 × 10⁷ Zellen) gemischt, die ähnlich mit Trypsin ausgekratzt wurden, und die Mischung wurde einer Grenzverdünnung in zehn 96-Napf-Flachboden-Multikulturplatten (hergestellt von Falcon) unterzogen. Diese Platten wurden weiter etwa 4 bis 5 Tage lang bei 37 °C kultiviert, bis in jedem Napf Plaques entstanden, die für HVT eigentümlich sind. Dann wurden zur Hälfte der Näpfe in jeder Platte 100 μl/Napf des CEF-Kulturmediums gegeben, das 100 μg/ml Bluogal (hergestellt von Gibco) enthielt, bei dem es sich um ein chromogenes Substrat für β-Galactosidase handelt, und 0,8% Agar wurde hinzugefügt, und die Platten wurden etwa 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
Danach wurde die Zahl der blauen Plaques in jedem Napf bestimmt. Eine Platte mit der größten Zahl an blauen Plaques wurde ausgewählt, und 1% Trypsin wurde hinzugefügt, um CEF zu gewinnen, die rekombinante HVT-infizierte Zellen enthielten. Die CEF wurden mit 1 × 10⁶ Zellen gemischt, und das Gemisch wurde dann auf einer 96-Napf-Flachboden-Multikulturplatte ausgestrichen.
Screening-Schritte (ein Screening-Schritt umfasst einen Schritt der Passage von einer 96-Napf-Flachboden-Multikulturplatte zu einer neuen 96-Napf-Flachboden-Multikulturplatte) wurden wiederholt, bis alle Näpfe blaue Plaques zeigten, und wurden wiederholt, bis alle Plaques blau wurden, wenn Bluogal hinzugefügt wurde, und dadurch wurde das Virus gereinigt. Die Reinigung wird normalerweise bewerkstelligt, indem man das Screening etwa fünf- bis zehnmal durchführt.
Nachdem die infizierten Zellen auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 9 cm gezüchtet wurden, wurden die infizierten Zellen weiter auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 16 cm gezüchtet. Als der Titer des rekombinanten HVT bestimmt wurde, wurde für den Titer des rekombinanten HVT 1 bis 6 × 10⁵ TCID₅₀ gefunden.
Das rekombinante HVT, das aus jedem rekombinanten Plasmid hergestellt wurde, wurde wie in der folgenden Tabelle bezeichnet:
Tabelle 1
Beispiel 15. Southern-Hybridisierung
Rekombinante Virus-DNA (HF003, HF004), die in Beispiel 14 hergestellt wurde, wurde nach demselben Verfahren zum Extrahieren von HVT-DNA wie in Beispiel 1 extrahiert.
Die erhaltenen rekombinanten Virus-DNAs (HF003, HF004), die Plasmide für ihre Rekombination (pNZ/45/46VP2S, pNZ44/45HNF) und die DNA des Parentalvirusstamms wurden mit BamHI verdaut und dann einer Elektrophorese auf 0,8% Agarose-Gel unterzogen und durch Southern-Blot-Hybridisierung und Autoradiographie analysiert.
Die verwendete Sonde ist eine ³²P-markierte Sonden-DNA, die durch Verdauen von pNZ45/46VP2S oder pNZ44/45HNF mit EcoRI unter Bildung eines Fragments und dann Markieren des Fragments mit Hilfe des Multi-Prime Labeling System (hergestellt von Amersham) hergestellt wurde.
Das Ergebnis zeigte, dass zur Sonden-DNA homologe Sequenzen in rekombinanten HVTs vorhanden sind.
Beispiel 16. Bestätigung der Expression von fremdem Antigen in mit rekombinanten HVT infizierten Zellen (Verfahren des fluoreszenten Antikörpers)
Auf einem Chamber Slide für Gewebekultur wurden die obigen rekombinanten HVT-infizierten Zellen zusammen mit CEF bei 37 °C kultiviert, bis sich Plaques entwickelten, die dann in kaltem Aceton fixiert wurden.
Um das exprimierte Antigen nachzuweisen, wurden folgende als primäre Antikörper verwendet. Für den Nachweis von β-Galactosidase wurde Anti-β-Galactosidase-Kaninchen-Antiserum (polyklonaler Antikörper: hergestellt von Organon Teknica H.V.) verwendet, und für den Nachweis von NDV-NH-Protein und -F-Protein wurde Serum von mit NDV-Impfstoff immunisierten Hühnern verwendet, jeweils in 500facher Verdünnung in PBS. Für den Nachweis von IBDV-VP2-Protein wurde monoklonaler Anti-VP-2-Antikörper GK-5 (Yamaguchi T., et al., Avian Dis., 40: 501–509 (1996)) in 100facher Verdünnung in PBS verwendet.
Als markierter Antikörper wurden FITC-markierter Anti-Huhn-IgG-Antikörper, FITC-markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper und FITC-markierter Anti-Kaninchen- IgG-Antikörper (jeweils von Harlan Sera-Lab Ltd. hergestellt) vor der Verwendung jeweils 100fach in PBS verdünnt.
Jede Lösung, die den obigen Antikörper enthält, wurde mit in kaltem Aceton fixierten Zellen auf dem Chamber Slide in Kontakt gebracht, etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und 100% Luftfeuchtigkeit stehen gelassen und dann dreimal in PBS gewaschen. Dann ließ man jede Lösung etwa 1 Stunde lang bei Raumtemperatur zusammen mit Verdünnungen von FITC-markiertem Anti-Huhn-Immunglobulin-Antikörper oder Anti-Maus-IgG reagieren. Dann wurde jede Lösung dreimal in PBS gewaschen, und die Reaktivität wurde untersucht, indem man sie unter dem Mikroskop bei einer Fluoreszenzanregungswellenlänge von 493,5 nm untersuchte.
Als Kontrollvirus wurde ein HVT-Parentalstamm FC-126 infiziert, und die mit diesem Parentalstamm infizierten Zellen wurden als Kontrollzellen verwendet. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2. Reaktivität gegenüber dem primären Antikörper

In der Tabelle bedeutet mAb "monoklonaler Antikörper".
+: hat reagiert; -: hat nicht reagiert.

Das rekombinante HVT, in das das NDV-Antigen-Gen eingebaut war, reagierte mit monoklonalem Anti-NDV-Antikörper, während das rekombinante HVT, in das ein IBDV-VP2-Gen eingebaut ist, mit monoklonalem Anti-VP2-Antikörper reagierte.
Das Ergebnis bestätigte, dass jedes rekombinante HVT Protein exprimierte, das von dem inserierten Gen codiert wurde.
Beispiel 17. Experiment zur Wirkung von Hühnerimpfstoff auf NDV (SPF-Küken)
Ein Experiment zur Impfungswirkung wurde durchgeführt, um die Wirkungen des in Beispiel 14 erhaltenen rekombinanten HVT-Impfstoffs zu bestimmen.
Zehn spezifisch pathogenfreie (SPF) Testküken (Line M. Nippon Institute for Biological Science) pro Gruppe wurden mit einem rekombinanten HVT, das in Tabelle 2 gezeigt ist, geimpft. Mit einem kommerziellen Lebendimpfstoff wurde die positive Kontrollgruppe geimpft, und die negative Kontrolle erhielt keine Impfung.
Als SPF-Testküken schlüpften, wurde jedes rekombinante HVT subkutan auf dem Rücken des Kükens eingeimpft, wobei man eine 26er Nadel verwendete, was 10⁴ TDID₅₀ ergab. Der kommerzielle Lebendimpfstoff (Nippon Institute for Biological Science), der für die positive Kontrolle verwendet wurde, wurde 4 Tage alten Küken durch Tropfen in die Augen gemäß den Anweisungen eingeimpft.
Vier Wochen nach der Impfung wurden Küken aus jeder Gruppe mit virulentem NDV (Sato-Stamm) mit 10⁴ PFU in den rechten Schenkel provoziert. Etwa 2 Wochen nach der Provokation wurde beobachtet, ob die Küken überlebten und ob NDV einsetzte, um die Wirkungen zu bestimmen, wobei die Überlebensrate als Index verwendet wurde.
Bevor man die Küken mit dem ND-Virus provozierte, wurde jedem Küken Blut entnommen, und das daraus hergestellte Serum wurde getestet, um Antikörper nachzuweisen, die die Hämagglutinierungsaktivität von NDV unterdrücken. Die Bestimmung erfolgte gemäß den Anweisungen im kommerziell erhältlichen NDV-Hämagglutinin (Nippon Institute for Biological Science). Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3. Ergebnis des NDV-Provokationstests für rekombinantes HVT (Nr. 1)
Bei Küken, die rekombinantes HVT erhielten, wurde ein 100%iger Schutz vor Infektion für die Provokation durch NDV erreicht. Der HI-Antikörpertiter war in der mit FC126 geimpften Kükengruppe nur zweimal so groß oder weniger, während er in den anderen Gruppen bei allen Küken 128- bis 1024-mal so groß war.
Das obige Ergebnis zeigte, dass jedes rekombinante HVT den geimpften Küken Schutz vor Infektion durch NDV verlieh.
Beispiel 18 Experiment zur Wirkung des Kükenimpfstoffs auf IBDV (SPF-Küken)
Ein Experiment zur Impfwirkung wurde durchgeführt, um die Wirkungen des in Beispiel 14 erhaltenen rekombinanten HVT-Impfstoffs zu bestimmen.
Zehn SPF-Testküken (Line M. Nippon Institute for Biological Science) pro Gruppe wurden mit HF003 und FPV geimpft. Mit einem kommerziellen Lebendimpfstoff wurde die positive Kontrollgruppe geimpft, und die negative Kontrolle erhielt keine Impfstoffe.
Als SPF-Testküken schlüpften, wurde jedes rekombinante HVT subkutan auf dem Rücken des Kükens eingeimpft, wobei man eine 26er Nadel verwendete, was 104 TDID₅₀ ergab. Der kommerzielle NDV-Lebendimpfstoff (Kitasato Kenkyusho) als positive Kontrolle wurde 16 Tage alten Küken durch Tropfen in die Augen gemäß den Anweisungen eingeimpft.
17 Tage nach der Impfung wurden Küken aus jeder Gruppe durch orale Verabreichung eines abgeschwächten IBDV-Virus (Okayama-Stamm) mit 1,5 × 10^3,8 EID₅₀ provoziert. Etwa 3 Tage nach der Provokation wurde untersucht, ob die Küken lebten oder tot waren. Dann wurden die lebenden Küken getötet, und das Einsetzen von IBDV wurde untersucht, wobei man den Zustand der Läsionsbildung der Bursa Fabricii als Hinweis verwendete. Der Zustand der Läsionsbildung der Bursa Fabricii wurde auf der Basis der Einstufung von 4 Parametern beurteilt: Hämorrhagie (A), gelbliches Exsudat (B), Verfärbung (C) und gelatinöses Exsudat (D). Die Punktzahl für jede Läsion wurde durch die Zahl der Küken dargestellt, die Läsionen bildeten, und die Gesamtpunktzahl wurde verwendet, um die Wirkung des eingeimpften Impfstoffs zu bestimmen. Das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4. Ergebnis der IBDV-Provokation für rekombinantes HVT
Küken, die das rekombinante HVT erhielten, zeigten eine Fähigkeit zum Schutz vor Infektion bis zu einem Grad, der fast gleich dem des kommerziellen Impfstoffs für die IBDV-Provokation war.
Das Ergebnis zeigte, dass die Einimpfung von rekombinantem HVT Schutz vor Infektion durch IBDV verlieh.
Beispiel 19 Experiment zur Wirkung von Kükenimpfstoff (Küken mit maternalem Antikörper)
Das in Beispiel 14 erhaltene rekombinante HVT wurde kommerziellen Küken eingeimpft, um die Anwesenheit einer Impfwirkung auf Küken mit maternalem Antikörper zu untersuchen.
Die verwendeten Küken sind Primärküken, die von kommerziell erhältlichem Weißem Leghorn geboren wurden (Dekalb-Küken, Kanagawa Youkei Rengokai (Kanagawa-Geflügelfarmerverband)). HF004 und HF006 wurden wie in Beispiel 17 auf dem Rücken des Kükens subkutan eingeimpft.
Von 20 Küken derselben Charge wurde Blut durch Herzpunktion entnommen, und Serum wurde erhalten. Nach der 8. Woche, als die maternalen Antikörper vollständig verschwunden waren, wurde eine Provokation mit NDV wie in Beispiel 17 durchgeführt, und dann wurde der Schutz vor Infektion im Sinne der Überlebensrate bewertet. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5. Ergebnis des NDV-Provokationstests für rekombinantes HVT (Nr. 2)
Der Antikörpertiter der Primärküken betrug 97 (mittlerer Titer von 20 Küken).
Das Ergebnis zeigte eine fast perfekte Impfwirkung auf die NDV-Provokation für die Gruppe, die das rekombinante HVT erhielt. Der HI-Antikörpertiter zum Zeitpunkt der Provokation war auch offensichtlich höher als in der FC126-Impfungsgruppe (< 2) und der nicht geimpften Gruppe (< 2) (16 bzw. 15,5).
Zwischen HF004 und NF006 gab es keine signifikanten Unterschiede, was darauf hinweist, dass unabhängig von der Menge des eingefügten Antigens signifikante Immunisierungswirkungen auf die Küken ausgeübt werden können.
Wie man aus diesen Ergebnissen ersehen kann, ergaben alle hier beschriebenen rekombinanten HVT einen effektiven Impfstoff, der von dem inserierten Antigen-Gen abgeleitet ist. Außerdem ist er frei von den Wirkungen des maternalen Antikörpers.
Weiterhin wurde die Eignung als mehrwertiger rekombinanter HVT-Impfstoff bewiesen, da er unabhängig von der Menge des eingefügten Antigens Wirkungen zeigte.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Herpesvirus von Truthähnen, wobei ein Fremd-Gen in einen genetischen Bereich inseriert wurde, bei dem es sich um den untranslatierten Bereich im Genom des Herpesvirus von Truthähnen handelt, und ein Impfstoff, der das rekombinante Herpesvirus von Truthähnen umfasst, bereitgestellt. Sequenzprotokoll

Claims

Aviär-infektiöses rekombinantes Herpesvirus, das ein Fremd-Gen umfasst, das in einen genetischen Bereich eingefügt ist, bei dem es sich um einen untranslatierten Bereich im offenen Leseraster des Herpesvirus von Truthühnern oder im offenen Leseraster des Marek-Disease-Virus handelt, die jeweils dem offenen Leseraster von humanem Herpes-simplex-Virus entsprechen, wobei die Einfügungsstelle für ein Fremd-Gen wenigstens eine Einfügungsstelle ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Stellen (1) zwischen UL44 und UL45, (2) zwischen UL45 und UL46, (3) zwischen UL41 und UL42, (4) zwischen UL40 und UL41, (5) zwischen UL53 und UL54 und (6) zwischen UL36 und UL37 besteht.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 1, wobei das Fremd-Gen ein Gen ist, das von einem Erreger von Infektionen bei Vögeln stammt.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 2, wobei der Erreger von Infektionen bei Vögeln ein Erreger ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Viren, Bakterien, Pilzen und Protozoen besteht.
Rekombinantes Virus gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei der Erreger von Infektionen bei Vögeln ein Erreger ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Newcastle-Disease-Virus (NDV), Gumboro-Virus (Virus der infektiösen Bursitis, IBDV), Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), Mycoplasma (MG) und Coccidia besteht.
Rekombinantes Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das stromaufwärts des Fremd-Gens einen Promotor aufweist.
Vogelimpfstoff, der als Wirkstoff das obige rekombinante Virus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verwendung eines rekombinanten Herpesvirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verwendung bei der Prophylaxe einer Vogelinfektion.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Infektion aus einer Infektion mit Newcastle-Disease-Virus (NDV), Gumboro-Virus (Virus der infektiösen Bursitis, IBDV), Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV), Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), Mycoplasma (MG) und Coccidia ausgewählt ist.
Extrakorporales Verfahren zur Vermehrung eines Herpesvirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Wirtszellen mit dem rekombinanten Virus infiziert und die Zellen gezüchtet werden.