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DE69435081T2 - Rekombinanter adenovirusvektor für geflügel - Google Patents

Rekombinanter adenovirusvektor für geflügel Download PDF

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DE69435081T2
DE69435081T2 DE69435081T DE69435081T DE69435081T2 DE 69435081 T2 DE69435081 T2 DE 69435081T2 DE 69435081 T DE69435081 T DE 69435081T DE 69435081 T DE69435081 T DE 69435081T DE 69435081 T2 DE69435081 T2 DE 69435081T2
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adenovirus
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Katrina Erny
Richard North Balwyn McCOY
Wendy Burwood WERNER
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Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
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Description

  • Anwendungsgebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Übertragungsvektoren für Antigenproduzierende Gene (heterologe Gensequenzen), die eingesetzt werden, um bei kommerziellen Geflügelscharen, die anfällig dafür sind, durch Krankheiten dezimiert zu werden, eine Immunantwort zu erzeugen. Solche Vektoren sind besonders nützlich für die Herstellung von Impfstoffen, die einfach in großem Umfang verabreicht werden können, um Geflügelscharen vor Krankheit zu schützen. Diese Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung geeigneter Übertragungsvektoren, Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, die auf diesen Vektoren basieren, Verabreichungsstrategien und ein Verfahren, Geflügel vor Krankheit zu schützen.
  • Hintergrund
  • Die Produktivität intensiver Geflügelzuchtindustrie ist von der Kontrolle über Krankheiten abhängig. In Australien betragen die Kosten für Krankheit für die Industrie konservativ geschätzt jährlich $50 Millionen. Obwohl Krankheiten teilweise durch gute Hygiene und Quarantänemaßnahmen kontrolliert werden können, muss sich die Industrie dennoch auf Impfungen verlassen, um die Scharen zu schützen. In einer kommerziellen Situation werden die Schwierigkeiten und Kosten für die Verabreichung geeigneter vorbeugender und kurativer Hilfsmittel und Adjuvantien durch die bloße Anzahl an Geflügel verursacht, die behandelt werden muss. Dementsprechend müssen Impfstoffe billig, wirksam und einfach zu verteilen sein.
  • Konventionell werden Impfstoffe, die aus Lebendvirus-Partikeln bestehen, durch Viruspassage und Selektion attenuierter Formen hergestellt. Alternativ wurden abgetötete Impfstoffe aus virulenten Viren hergestellt.
  • Ein jüngerer Versuch, kommerzielle Vogelscharen gegen eine gewöhnliche virale Infektion zu impfen, ist in AU-A-34353/93 (VIROGENETICS CORPORATION) beschrieben. Diese Anwendung beschreibt ein rekombinantes Pockenvirus wie das Vacciniavirus oder das Geflügelpockenvirus, das heterologe DNA des Morbus- Marek-Virus enthält, welche benutzt wird, um eine Immunantwort in einem Wirtstier zu erzeugen. Dennoch hat die Verwendung von Pockenviren den Nachteil, dass die Immunantwort in Geflügel nicht lange genug anhält, um adäquaten Schutz zu erzeugen. Insbesondere kann die erhaltene Immunprotektion nicht ausreichend sein, um einen Vogel zu schützen, sobald die Rolle der mütterliche Antikörper in der Antikörper-vermittelten Immunität beendet ist.
  • Ein anderer Ansatz wurde von einer Gruppe bei Medisorb Technologies, Inc., in den USA unternommen, wie im Journal Genetic Engineering News, September 1993, berichtet. Dieser Ansatz verwendete einen konventionellen Salmonellen-Impfstoff, der in eine biologisch abbaubare, auf Polyacticoglycolsäure basierende Mikrosphäre eingekapselt war. Dieser Ansatz erfordert aber, dass die Mikrosphäre in den Vogel injiziert wird. Dieser Ansatz ist nicht notwendigerweise kommerziell an großen Scharen durchführbar.
  • Es ist daher ein Ziel dieser Erfindung, ein Übertragungsvehikel für heterologe Sequenzen genetischen Materials zu liefern, das besonders darauf zugeschnitten ist, in großem Umfang zur Anwendung zu kommen.
  • Im Besonderen ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein Mittel zur Herstellung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität zu liefern oder zu verbessern, um Schutz gegen Infektionen mit üblichen Vogelerkrankungen zu liefern, was bedeutet, dass er schnell und effektiv anzuwenden ist, besonders an großen Geflügelscharen. Es ist ein zusätzliches Ziel, ein Verfahren für die Herstellung eines geeigneten Mittels für die Herstellung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität zu liefern, um Schutz gegen Infektionen mit üblichen Vogelerkrankungen zu liefern. Es ist ein weiteres Ziel, eine Schutzstrategie zu liefern.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt in einer Ausführungsform einen rekombinanten Vogel-Adenovirusvektor zur Verfügung, der mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz einschließt und in der Lage ist, sie zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht essentielle Region an dem rechten terminalen Ende des Genoms des Vogel-Adenovirus eingefügt ist.
  • Vorzugsweise ist die heterologe Nukleotidsequenz zur Expression als antigenes Polypeptid in der Lage.
  • Das antigene Polypeptid, das durch mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz kodiert ist, ist dem Wirtsvektor vorzugsweise fremd.
  • Der rekombinante Vektor kann ein lebendes rekombinantes Vogel-Adenovirus einschließen, in dem die Virion-Strukturproteine unverändert zu jenen in dem nativen Vogel-Adenovirus sind, aus dem der rekombinante Vogel-Adenovirus hergestellt wurde.
  • Die Erfindung fußt auf der Erkenntnis, dass bestimmte Regionen des Geflügel-Adenovirus einzigartige Eigenschaften haben. Insbesondere unterscheiden sich die Major-Late-Promotor- und die Leader-Sequenzen ziemlich von entsprechenden Regionen bei Adenoviren, die zuvor charakterisiert worden sind. Man hat überraschenderweise entdeckt, dass die Leader-Sequenz eine zweigeteilte Leader-Sequenz ist. Basierend auf dem Wissen über Human-Adenoviren, ist ebenfalls überraschend, dass es nicht-essentielle Regionen im Geflügel-Adenovirusgenom gibt, die nicht mit jenen korrespondieren, die zuvor bei anderen Adenoviren charakterisiert worden sind, und daher dieses Virus besonders geeignet dafür machen, heterologe Sequenzen zu erzeugen.
  • Diese Erfindung fußt weiterhin auf der Erkenntnis, dass das Vogel-Adenovirus eine prolongierte Antwort im Geflügel generiert, was es außerdem als Impfstoffvehikel sehr tauglich macht. Desweiteren erlaubt die Existenz einer Zahl von Serotypen mit unterschiedlicher Virulenz die Auswahl eines Impfstoffvehikels, dass für den benötigten. Umfang der Immunantwort geeignet ist.
  • Adenoviren sind eine große und ungleiche Familie, die aus vielen lebenden Spezies isoliert wurden, einschließlich dem Menschen und anderen Säugetieren, sowie einer Vielzahl von Vögeln, insbesondere Hühnern (Wigand, R., Gelderblom, H. und Ozell, M. Biological and Biophysical characteristics of mouse adenovirus, strain FL. Arch, Virol. 54:131-142; 1977). Daraus resultierend hat man die Adenoviren in zwei verschiedene Spezies eingeteilt, eine Gruppe hat ein Säugetierwirtsspektrum (Mastadenoviridae) und die andere ein Vogelwirtsspektrum (Aviaadenoviridae). Weil die Vogel-Adenovirussubtypen den Säugetier-Adenoviren nur sehr entfernt verwandt sind, ist das Wissen über letztere nur teilweise aufschlussreich im Hinblick auf erstere. Die Vogel-Adenoviren weisen nur limitierte DNA-Homologie mit den Mensch-Adenoviren auf (Alestrom, P., Stenlund, A., Li, P., Bellet, A.J.D. und Pettersson, U. Sequence homology between avian and human adenoviruses. J. Virol. 42:306-310; 1982); so sind etwa Geflügel-Adenovirus(fowl adenovirus, FAV)-Genome um einige 10 Kilobasen größer als das Mensch-Adenovirusgenom. Die Klassifikation dieser Viren als Adenoviren basiert einzig auf morphologischen und strukturellen Übereinstimmungen.
  • Die Gattung Adenovirus wird derzeit in 5 Speziesgruppen unterteilt: Geflügel-, Truthahn-, Gans-, Fasan- und Enten-Adenoviren. Geflügel-Adenoviren wurden erstmals in den 1950er. Jahren erkannt in Folge der Verwendung von embryonisierten Eiern und Zellkulturen, die mit FAV infiziert waren (Van Den Ende, M., Don, P.A. und Kipps, A. The isolation in eggs of a new filterable agent which may be the cause of bovine lumpy skin disease. J. gen. Micro. 3:174-182; 1949; Yates, V.J. and Fry, D.E. Observations an a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus (serotype 1). AM. J. Vet. Res. 18:657-660; 1957). Dennoch ist das einzige Geflügel-Adenovirus, an dem einige molekulare Studien unternommen wurden, das onkogene FAV, CELO (chicken embryo lethal orphan). Das CELO-Virusgenom ist fast 30% länger als das des Mensch-Adenovirus (HAV) (Lauer, W.G., Bandfield-Younghusband, H. und Wrigley, N.G. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). Virol. 45:598-614; 1971). Das CELO-Virus ist aus mindestens 11-14 Strukturproteinen zusammengesetzt (Yasue, H, und Ishibashi, M. Chick embryo lethal orphan (CELO) virusinduced early and late polypeptides. Virol. 78:216-233; 1977; Li, P., Bellet, A.J.D. und Parish, C.R. DNA-binding Proteins of chick embryo lethal orphan virus: Lack of complementation between early Proteins of avian and human adenoviruses. J. gen. Virol. 65:1817-1825; 1984a) und ist strukturell dem Mensch-Adenovirus ähnlich, welches aus 10-14 Strukturproteinen zusammengesetzt ist (Maizel, J.V. (Jr.), White, D.O. und Scharff, M. The polypeptides of adenovirus. I. Evidence for multiple Protein components in the virion and a comparison of types 2, 7A und 12. Virol. 36:115-125; 1968; Ishibashi, M. und Maizel, (Jr.), J.V. The polypeptides of adenovirus. V. Young virions, structural intermediate between top components and aged virions. Virol. 57:409-424; 1974). Der einzige offensichtliche morphologische Unterschied zwischen ihnen ist die zusätzliche FAV-Faser. Auch wenn ein zweites Gen für die FAV-Faser in Betracht gezogen würde, bleibt eine beträchtliche Menge an ,extra' DNA im FAV-Genom im Vergleich zum HAV zu erklären.
  • DNA-Kreuzhybridisierungsstudien haben nur sehr begrenzte Homologie zwischen HAV und FAV gezeigt (Alestrom, P., Stenlund, A., Li, P., Bellet, A.J.D. und Petterson, U. Sequence homology between avian and human adenoviruses. J. Virol. 42:306-310; 1982). Trotzdem und trotz des Fehlens immunologischer Verwandtschaft, fand man aber heraus, dass die Aminosäurezusammensetzung des CELO-Virus und des HAV-Hexons ähnlich sind, nicht aber die Gensequenz (Lauer, W.G., Bandfield-Younghusband, H. und Wrigley, N.G. Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). Virol. 45:598-614; 1971) Andere entdeckte Ähnlichkeiten betreffen das Vorhandensein von terminalen Repeat-Sequenzen an jedem Ende des Genoms (Alestrom, P., Stenlund, A., Li, P., Bellet, A.J.D. und Petterson, U. Sequence homology between avian and human adenoviruses. J. Virol. 42:306-310; 1982; Sheppard, M. und Erny, K.M. DNA sequence analysis of the inverted terminal repeats of a nononcogenic avian adenovirus. Nuc. Acids Res. 17:3995; 1989), die Synthese von Virus-assoziierten ("VA")-RNAs von niedrigem Molekulargewicht (Larsson, S., Ballet, A. und Akusjarvi, G. VA RNAs from avian and human adenoviruses: dramatic differences in length, sequence, and gene location. J.Virol. 58:600-609; 1986) und die Übereinstimmung von mindestens einem Nicht-Strukturprotein; dem DNA-bindenden Protein (DBP) (Li, P., Bellet, A.J.D. und Parish, C.R. DNA-binding Proteins of chick embryo lethal orphan virus: Lack of complementation between early Protein of avian and human adenoviruses. J. gen. Virol. 65:1817-1825; 1984a).
  • Auf den ersten Blick lassen diese Befunde starke Ähnlichkeiten zwischen FAV und HAV vermuten. Aber die terminalen Repeat-Sequenzen des FAV sind viel kürzer, und anders als das HAV unterschied sich die Länge der terminalen Repeats nicht im Vergleich zu einem onkogenen und einem nichtonkogenen FAV (Sheppard, M. und Erny, K.M. DNA sequence analysis of the inverted terminal terminal repeats of a nononcogenic avian adenovirus. Nuc. Acids Res. 17:3995; 1989). Zweitens unterscheiden sich die VA-RNA-Gene von ihren HAV-Gegenstücken in ihrer Lokalisation auf dem Chromosom, ihrer Transkriptionsrichtung und in der Primärsequenz (Larsson, S., Bellet, A. und Akusjarvi, G. VA RNAs from avian and human adenoviruses: dramatic differences in length, sequence, and gene location. J.Virol. 58:600-609; 1986). Schließlich kann das DBP des FAV, welches die Transkription initiiert, in dem es mit den E1A-Genen interagiert, die E1A-Gene des HAV nicht erkennen (Li, P., Bellet, A.J.D. und Parish, C.R. DNA-binding Proteins of chick embryo lethal orphan virus: Lack of complementation between early Protein of avian and human adenoviruses. J. gen. Virol. 65:1817-1825; 1984a).
  • Geflügel-Adenoviren kommen innerhalb von Vogelscharen häufig vor, und bis heute hat man 11 verschiedene Serotypen bestimmt (McFerran, J.B. und Connor, T.J. Further studies an the classification of fowl adenoviruses. Av.Dis. 21:585-595; 1977). Alle diese Serotypen scheinen zwar in der ganzen Welt verbreitet zu sein, epidemiologische Surveys zeigen jedoch, dass jeweils bestimmte Serotypen in einer bestimmten geografischen Region vorherrschen. Zum Beispiel sind die Serotypen, die in Amerika am häufigsten angetroffen werden 1,4,5,7 und 9 (Cowen, B. Mitchell, G.B. und Calnek, B.W. An adenovirus survey of poultry flocks during the growing and laying periods Av. Dis. 22:115-121; 1978; Yates, V.J., Rhee, Y.O., Fry, D.E., El Mishad, A.M. und McCormick, K.J. The presence of avian adenoviruses and adeno-associated viruses in healthy chickens. Av. Dis. 20:146-152; 1976). Surveys über klinisch erkrankte australische Scharen haben die Typen 1 und 4 (Boyle, D.B. und McFerran, J.B. Avian adenoviruses isolated from poultry in Queensland. Aus. Vet. J. 52:587-589;1976) und später die Typen 6, 7 und 8 (Reece, R.L., Barr, D.A., Grix, D.C. Forsyth, W.M., Condron, R.J. und Hindmarsh, M. Observations an naturally occurring inclusion body hepatitis in Victorian Chickens. Aust.Vet.J. 63:201-202; 1986) als die prävalentesten Serotypen identifiziert.
  • Bei der Auswahl passender FAV für die Entwicklung von Lebendvektoren, die Impfstoffe auf Vogelscharen übertragen, ist es wichtig, die natürliche Prävalenz der Serotypen zu berücksichtigen. Jene Serotypen, die nicht verbreitet angetroffen werden, sind offensichtlich vorteilhafter gegenüber jenen, denen Scharen häufig ausgesetzt sind, und gegen die sie Immunität entwickelt haben könnten.
  • Eine weitere Überlegung betrifft die Fähigkeit des Vektors, im Vogel über den Zeitraum hinaus wirksam zu bleiben, währenddem mütterliche Antikörper den Vogel unmittelbar nach dem Ausbrüten schützen.
  • Andere wichtige Überlegungen bei der Auswahl potentieller FAV-Vektoren sind die Pathogenität und die Immunogenität. Vorzugsweise sollten Lebendvektorviren hochinfektiös aber nicht pathogen (oder zumindest stabil attenuiert) sein, so dass nicht sie selbst auf die Zielspezies nachteilig wirken.
  • Die onkogene Eigenschaft von Serotyp-1-FAV wurde gezeigt (Sarma, P.S., Huebner, R.J. und Lane, W.T. Induction of tumors in hamsters with an avian adenovirus (CELO). Science 149:1108; 1965) und aus diesem Grund wird diese Gruppe von FAV für die Vektorentwicklung nicht favorisiert.
  • Bevorzugte Kandidaten für die Verwendung als Impfstoffvektoren sind die nicht-pathogenen Isolate FAV CFA20 (Serotyp 10) und CFA15 (Serotyp 10). Der CFA20-Virus ist der bevorzugtere, weil er klinisch sicher ist und weil er einen Serotypen repräsentiert, der in australischen und amerikanischen Geflügelscharen offensichtlich unüblich ist. Das ist eine wichtige Überlegung, weil sie mögliche Probleme, die mit einer vorausgegangenen Exposition assoziiert sein können, reduziert. FAV CFA15 und CFA19 (Serotyp 9) sind ebenfalls geeignete Kandidaten, die einer Betrachtung in Hinblick auf Vektorentwicklung wert sind. Andere Serotypen können auch nützlich sein. Es ist erwähnenswert, dass virulentere Stämme auch eine größere Antikörperantwort erzeugen.
  • Heterologe Nukleotidsequenzen, die in nicht-essentielle Regionen des Virusgenoms eingefügt werden, und die die antigenen Determinaten infektiöser Organismen kodieren, gegen die die Generation von Antikörpern oder die zellvermittelte Immunantwort wünschenswerter Weise gerichtet ist, können solche sein, die antigene Determinanten von durch Parasiten verursachte intestinale Infektionen exprimieren; zum Beispiel Kokkzidien-Infektionen oder Atemwegsviren, wie zum Beispiel das infektiöse-Bronchitis-Virus. Andere infektiöse Organismen, gegen die Immunität wünschenswert wäre, schließen jene eine, die innere Organe wie die Bursa Fabricii befallen, zum Beispiel das infektiöse-Bursitis-Virus (infective bursal disease virus, IBDV).
  • Heterologe Nukleotidsequenzen, die eingefügt werden können, schließen die antigenen Determinaten der Erreger von/der/des
    Newcastle-Krankheit
    Morbus Marek
    Egg Drop Syndroms
    Einschlusskörperchen Hepatitis
    Infektiösen Laryngotracheitis
    Mykoplasmen
    Hühneranämieerreger (aplatische Anämie)
    Vogelgrippe
    Vogel-Enzephalomyelitis
    ein.
  • Diejenigen heterologen Nukleotidsequenzen, die antigene Determinanten der infektiösen Bursitis (VP2) und der Kokkzidose exprimieren, werden für das Einfügen in die Vektoren der Erfindung bevorzugt.
  • Es wurde außerdem ins Auge gefasst, dass die eingefügten heterologen Nukleotidsequenzen Immunpotentiatormoleküle wie etwa Zytokine oder Wachstumspromotoren sein können, zum Beispiel Huhn-Myelomonozytischer-Wachstumsfaktor (chicken myelomonocytic growth factor, cMGF) oder Insulin-like Growth Factors (IGF).
  • Die Art der durch die Kandidatenvektoren stimulierten Immunantwort kann die Selektion der heterologen Nukleotidsequenzen, welche darin eingefügt werden sollen, beeinflussen. Die FAV-Isolate CFA20 und CFA15 können Immunität an den Schleimhäuten induzieren und sind daher geeigneter gegen Infektionen des intestinalen und des respiratorischen Systems. FAV-Isolate wie das CFA19, welche eine starke Serum-Antikörper-Antwort induzieren, können aufgrund ihrer Fähigkeit, in den Darm einzudringen, geeigneter für die Verwendung gegen Erkrankungen der Organe des Geflügels sein.
  • Die interessierende DNA, die heterologe Gene einschließt, die für antigene Determinanten oder Immunpotentiatormoleküle kodieren, ist in wenigstens einer nicht-essentiellen Region des Virusgenoms lokalisiert.
  • Nicht-essentielle Regionen des Virusgenoms, die zum Zweck des Ersetzens mit oder Einfügens von heterologen Nukleotidsequenzen geeignet sind, sind nicht-kodierende Regionen an dem rechten terminalen Ende des Genoms bei den Karteneinheiten 97 bis 99,9.
  • Die heterologe Gensequenz kann mit einer Promotor- und Leadersequenz assoziiert sein, um die Nukleotidsequenz in situ so effizient wie möglich exprimieren zu können. Vorzugsweise wird die heterologe Gensequenz mit dem Vogel-Adenovirus-Major-Late-Promotor- und der Splice-Leader-Sequenz assoziiert. Der Major-Late-Promotor liegt in der Nähe der Karteneinheiten 16-17 auf der genetischen Karte des Adenovirus und enthält ein klassisches TATA Sequenzmotiv. (Johnson, D.C., Gosh-Chondhury, G., Smiley, J.R., Fallis, L. und Graham, F.L. (1988). Abundant expression of herpes simplex virus glycoprotein gB using an adenovirus vector. Virology 164, 1–14).
  • Die Splice-Leader-Sequenz der Vogel-Adenovirus-Isolate, die in Betracht gezogen werden, ist eine zweigeteilte Sequenz, die in späte Gene gespleisst ist.
  • Die heterologe Gensequenz kann auch mit einer Polyadenylierungssequenz assoziiert sein.
  • An Stelle des Vogel-Adenovirus-Major-Late-Promotors kann jeder andere geeignete eukaryotische Promotor verwendet werden.
  • Zum Beispiel können jene des SV40-Virus, des Cytomegalie-Virus oder des Human-Adenovirus verwendet werden.
  • Andere Prozessierungs- und Polyadenylierungssignale als diejenigen von Vogel-Adenoviren können in Betracht gezogen werden, zum Beispiel die von SV40.
  • Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein rekombinanter Impfstoff zur Herstellung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität zur Bereitstellung oder Verbesserung von Schutz gegen Infektion durch einen infektiösen Organismus bei Vögeln bereitgestellt, wobei der Impfstoff mindestens einen rekombinanten Vogel-Adenovirusvektor, der mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz einschließt und in der Lage ist, sie zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht essentielle Region an dem rechten terminalen Ende des Genoms des Vogel-Adenovirus eingefügt ist und geeignete Träger und/oder Hilfsstoffe umfasst. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz zur Expression als ein antigenes Polypeptid in der Lage.
  • Das durch mindestens eine Nukleotidsequenz kodierte antigene Polypeptid ist vorzugsweise dem Wirtsvektor fremd. Mindestens eine Nukleotidsequenz kann mit einer Promotor/Leader- und einer Poly-A-Sequenz assoziiert sein.
  • Der rekombinante Impfstoff kann lebenden rekombinanten Vogel-Adenovirusvektor einschließen, in dem das Virion-Strukturprotein gegenüber demjenigen im nativen Vogel-Adenovirus, aus dem das rekombinante Vogel-Adenovirus hergestellt ist, unverändert ist.
  • Bevorzugte Vektorkandidaten für die Verwendung in dem rekombinanten Impfstoff sind die FAV-Isolate CFA20 (Serotyp 10), CFA15 (Serotyp 10) und CFA19 (Serotyp 9). Die Verwendung anderer Serotypen ist in Abhängigkeit vom Geflügeltyp, seiner vorhandenen Immunität und seiner Umgebung möglich.
  • Der Impfstoff kann sich gegen respiratorische und intestinale Infektionen richten, die durch eine Vielzahl an Erregern verursacht werden. Um den Impfstoff gegen einen spezifischen infektiösen Organismus zu richten, werden heterologe Gensequenzen, die die antigenen Determinanten dieser infektiösen Organismen kodieren, in nicht-essentielle Regionen des Genoms des Vogel-Adenovirus, das den Vektor enthält, eingefügt.
  • Wenn der Impfstoff verwendet wird, um Schutz gegen Krankheit zu optimieren, können geeignete heterologe Nukleotidsequenzen vielleicht solche von Immunpotentiatoren wie Zytokinen oder Wachstumspromotoren sein.
  • Die Impfstoffe können andere Bestandteile wie Stabilisatoren, Hilfsstoffe, andere pharmazeutisch akzeptable Inhaltstoffe oder jedes andere Antigen oder einen Teil davon einschließen. Der Impfstoff kann in Form einer lyophilisierten Zubereitung oder als Suspension vorliegen, alles was auf dem Gebiet der Impfstoffproduktion üblich ist.
  • Ein geeigneter Carrier für einen solchen Impfstoff kann isotonisch gepufferte Kochsalzlösung sein.
  • Die Art der Verabreichung kann die einer magensaftresistenten Dosierungseinheit, eines intraperitonealen Inokulums, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung, ein Aerosol-Spray, Augentropfen oder intranasale Applikation sein. Verabreichung im Trinkwasser, in Futterpellets oder in ovo ist ebenfalls möglich.
  • Die bevorzugtere Verabreichungsform ist die des Aerosol-Sprays.
  • Bei einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vogel-Adenovirusvektors zur Verwendung als Impfstoff bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man in eine nicht-essentielle Region an dem rechten terminalen Ende eines Vogel-Adenovirusgenoms mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in Verbindung mit einer effektiven Promotor-Sequenz einfügt. Besagte heterologe Nukleotidsequenz ist vorzugsweise zur Expression als antigenen Polypeptid in der Lage.
  • Das durch mindestens eine Nukleotidsequenz kodierte antigene Polypeptid ist vorzugsweise dem Wirtsvektos fremd.
  • Noch besser ist es, wenn die heterologe Nukleotidsequenz mit Promotor/Leader- und Poly-A-Sequenzen assoziiert ist.
  • In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffvektors, wird eine Restriktionsenzymstelle, die vorzugsweise nicht das für die Herstellung ausgewählte Wirtsgenom spaltet, in eine nicht-essentielle und vorzugsweise nicht-kodierende Region des Wirtsgenoms eingefügt. Das rekombinante Virusgenom wird daher mit einer einzigartigen Restriktionsenzymstelle in einer nicht-essentiellen Region ausgestattet, um das Einfügen heterologer Nukleotidsequenzen durch einfache Restriktionsenzymspaltung und Verbindung zu gestatten. Dieses Verfahren hat, wenn gewünscht, den zusätzlichen Vorteil der Deletion von Abschnitten in der nicht-essentiellen Region zu ermöglichen, um das Einfügen größerer DNA-Abschnitte zu gestatten.
  • Durch dieses Verfahren kann eine DNA-Expressionskassette, die einen geeigneten FAV-Promotor mit einer fremden Gensequenz, als auch Leader-Sequenzen und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen enthält, mit der einzigartigen Restriktionsenzymstelle, die die Kassette flankiert, hergestellt und damit leichtes Einfügen in das FAV-Genom ermöglicht werden.
  • Bei einem alternativen Herstellungsverfahren eines geeigneten Vektors kann die nicht-essentielle Region, die verändert werden muss, um fremde DNA einzufügen, durch homologe Rekombination hergestellt werden. Durch dieses Verfahren wird die nicht-essentielle Region kloniert, ein Abschnitt deleltiert und fremde DNA zusammen mit Promotor-, Leader- und Polyadenylierungssequenzen eingefügt, vorzugsweise durch homologe Rekombination zwischen flankierenden Sequenzen. Durch dieses Verfahren schafft man durch Deletion von Abschnitten der nicht-essentiellen Region zusätzlichen Platz für größere DNA- Inserts, welche die normale Verpackungsbeschränkung des Virus überschreiten.
  • Der Impfstoff wird vorzugsweise als Aerosol-Spray verabreicht, weil die Verbreitung über die Luft der natürliche Weg der FAV-Verteilung ist.
  • FAV-Vektor-basierte Impfstoffe können als ,Cocktails' verabreicht werden, die 2 oder mehr Virusvektoren einschließen, die verschiedene fremde Gene und Immunpotentiatoren übertragen.
  • Bei einer bevorzugten Impfstrategie, der ,Cocktail' oder Simultanstrategie, verwendet man einen Impfstoff, der auf beiden FAV-Isolaten CFA19 und CFA20 basiert.
  • Bei einer alternativen Strategie kann man FAV-Vektorbasierte Impfstoffe aufeinanderfolgend verabreichen, um entweder Booster-Impfstoffe oder neue Impfstoffe in einem gewissen Stadium nach der initialen FAV-Impfung zu verabreichen. Die verwendeten Impfstoffe basieren vorzugsweise auf heterologen FAV-Isolaten.
  • Bei einer bevorzugten Version der ,aufeinander folgenden' Strategie, werden serotypisch nicht verwandte Impfstoffe ausgewählt, um maximalen Schutz gegen Infektion zu erreichen. In einem Beispiel einer solchen Strategie verabreicht man einen Impfstoff, der auf dem FAV-Isolat CFA20 basiert, in Folge von oder vor der Impfung mit einem Impfstoff, der auf dem FAV-Isolat CFA19 basiert.
  • Geflügel kann mühelos in jedem Alter mit den Vektorimpfstoffen gemäß der Erfindung inokulieren werden. Was Hühner betrifft, kann man einen Tag alte Hähne impfen, Suppenhühner und Legehennen kann man regelmäßig bis zum Zeitpunkt der Eiablage und danach impfen.
  • Vorzugsweise wird Geflügel gemäß der ,aufeinanderfolgenden' Strategie oder der ,Cocktail'-Strategie geimpft, solange sie noch nicht vollständig immunkompetent sind. Noch bequemer können Eintagsvögel nach einer Zeitspanne von 4 Wochen nach der Erstimpfung zum Schutz gegen Reinfektion geimpft werden.
  • Bei einem Vogel kann eine Immunantwort erzeugt werden, in dem dem Vogel eine effektive Menge eines rekombinanten Impfstoffes gemäß der Erfindung verabreicht wird. Eine effektive Menge, ist eine Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen, vorzugsweise mindestens 104 TCID50 pro Dosis, aber innerhalb des Bereichs von 103–107 TCID50 pro Dosis abhängig von dem Verfahren der Anwendung und bezieht sich durchgängig auf die vorliegende Beschreibung.
  • Der Impfstoff der Erfindung kann mnatürlich auch mit Impfstoffen gegen andere Viren oder Organismen wie Morbus Marek, Newcastle-Krankheit oder infektiöse Bronchitis zum Zeitpunkt der Verabreichung kombiniert werden.
  • Ein bevorzugter Aspekt dieser Ausführungsform der Erfindung ist die Verabreichung als Aerosol.
  • Verfahren zur Herstellung und Testung rekombinanter Vektoren und Impfstoffe gemäß dieser Erfindung sind den Fachleuten wohl bekannt. Standardprozeduren für die Endonukleaseverdauung, -ligation und -elektrophorese wurden in Übereinstimmung mit den Anweisungen der Hersteller oder Zulieferer durchgeführt. Standardtechniken sind nicht im Detail beschrieben und werden von Fachleuten bestens verstanden.
  • Bevorzugte Ausführungsformen
  • Aspekte bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung basieren auf den FAV-Isolaten CFA15, 19 und 20 werden nun beschrieben. Während diese drei Isolate aufgrund ihrer geringen Pathogenität und hohen Immunität ausgewählt wurden, wird gewürdigt werden, dass andere Isolate des Vogel-Adenovirus ebenfalls für die Herstellung von Impfvektoren geeignet ist, vorausgesetzt, dass die Auswahlkriterien, die hierin beschrieben sind, erfüllt werden.
  • Tabelle 1 illustriert, die Angemessenheit einiger anderer Isolate unterschiedlicher Serotypen. Pathogenität wurde dadurch gemessen, dass 106 pfu des Virus in einem 0,5ml Volumen auf intraperitonealem Wege verabreicht wurden. Die überlebenden Hühner wurden nach 8–10 Tagen getötet und Gewebeproben für eine Histologie und Virus-Re-Isolation genommen.
  • CHARAKTERISIERUNG VIRALER GENOME
  • Tabelle 1. Pathogenität von 15 FAV stellvertretend für 8 verschiedene und 1 Zwischenserotypen, die bei Eintagsküken auf intraperitonealem Wege injiziert wurden
    Virus Serotyp Mortalitäta Virus-Ernteb % Gewichtsabnahme
    %
    CFA3 8 0 + 0
    CFA13 6 0 + 8
    CFA20 10 0 + 8
    CFA15 10 0 + 0
    CFA2 1 5 + 0
    CFA7 1 5 + 0
    CFA11 2 10 + 9
    CFA17 8 15 + 1
    CFA19 9 18 + 17
    CFA10 7 20 + 16
    CFA4 7 35 + 25
    CFA9 1 50 + 25
    CFA5 8 65 + 25
    CFA22 7/8 100 + .d
    CFA24 7/8 100 + .d
    • a. zwanzig Tage alte Hühner, von denen jedes 106 pfu Virus erhielt und deren Todesereignisse über eine 8 Tage-Zeitraum aufgezeichnet wurden
    • b. aus Zäkaltonsillengewebe wurde Virus-Ernte versucht
    • c. der Gewichtsverlust wurde durch den Vergleich des Durchschnittsgewichts infizierter Vögel mit dem nicht-infizierter Vögel kalkuliert
    • d. keines der Tiere überlebte lange genug, um einen Gewichtsverlust zu bestimmen
  • Die Genome der selektierten Isolate FAV CFA15, 19 und 20 wurden durch konventionelle Methoden charakterisiert. Die DNA-Restriktions-Endonuklease-Karten eines jeden gesamten Genoms sind in den 1, 2 und 3 illustriert. Die Karteneinheiten sind angegeben (1 m.u. = 0,45 kb) und die Genome sind von links nach rechts ausgerichtet. Der Übereinkunft zufolge sind Adenovirusgenome normalerweise so ausgerichtet, dass die terminale Region, von der keine späten mRNA-Transkripte mehr synthetisiert werden, am linken Ende lokalisiert ist. Das Enzym, das verwendet wird, um jede Karte zu erzeugen, ist am Rand jeder Karte aufgeführt.
  • CHARAKTERISIERUNG DER MAJOR-LATE-PROMOTOR-(MLP) UND DER SPLICE-LEADER-SEQUENZEN VON CFA20
  • Identifizierung und Klonieren des FAV-MLP
  • Durch die Verwendung des DNA-Restriktionsenzyms und genetischer Karten des FAV-Serotyp-10-(CFA20)-Genoms, wurde eine Region lokalisiert, von der man annimmt, dass sie die MLP- und die Leader-Sequenzen enthält. Drei DNA-Fragmente, DraI-Fragment 4 (3,0 kb); HpaI/DraI-Fragment (2,8 kb) und ein DraI/HpaI-Fragment (4,5 kb) wurden alle in Plasmid-Vektoren kloniert. Man subklonierte Diese DNAs wurden in MI3mp18 und mp19 subkloniert und sequenzierte sie (5).
  • Man fand heraus, dass die MLP-Promotorsequenz eine klassische TATA-Sequenz enthält, die einzige in der sequenzierten Region, als auch potentielle strangaufwärts liegende Faktoren und bestätigte sie folglich durch die Lokalisation der Leader-Sequenz und der Transkriptions-Startstelle.
  • 4 illustriert die Sequenzcharakterisierung und das Klonieren der Major-Late-Promotor- und der Splice-Leader-Sequenzen von CFA20: Insbesondere werden die HpaI und DraI Restriktions-Endonuklease-Karten von FAV CFA20 dargestellt. Die klonierten
    Figure 00170001
    und sequenzierten (–) Regionen sind ausgewiesen.
  • Um die Struktur und die Sequenz der zu später mRNA gespleissten Leader-Sequenz zu bestimmen, infizierte man Hühnernierenzellen mit FAV und lies die Infektion bis zu einem späten Zeitpunkt im Infektionszyklus voranschreiten (üblicherweise 24–32 Stunden p.i.). An diesem Punkt wurde unter Verwendung von RNAzol B-Lösung (Bresatec, Australien) die gesamte RNA von den infizierten Zellen gereinigt. Man fällte die isolierte RNA mit Isopropanol und bewahrte sie in 50 μl Aliquots bei – 70° bis sie zum Gebrauch auf. Poly A (mRNA) wurde aus der gesamten RNA unter Verwendung des Poly-AT-tract-Systems (Promega, USA) isoliert. Die isolierte mRNA wurde zur Herstellung von cDNA verwendet.
  • Für die cDNA-Herstellung stellte man Oligonukleotide zu dem komplementären Strang des Hexon-Gens und des Penton-Basis-Gens her, die beide MLP-Transkripten sind. Ein weiteres Oligo wurde hergestellt, welches die vorgesehene cap site des Starken-Späten-Transkripten (major late transkript) 24 Basen strangabwärts der TATA box gelegen bedeckte. Dieses Oligonukleotid wurde in Verbindung mit jenem benutzt, das zur DNA-Herstellung in der Taq-Polymerase-Kettenreaktion benutzt wurde. Die daraus resultierende DNA, die aus positiven Klonen hergestellt war, lies man von geeigneten Restriktionsenzymen verdauen, um die Größe der eingefügten Fragmente zu bestimmen. Unter Verwendung einer Modifikation der Kettenterminationstechnik (Sanger, F., Nicklen, S. und Gulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain terminating inhibitors PNAS USA 74:5463-5467) wurde eine DNA-Sequenzierung dieser eingefügten Fragmente durchgeführt, um T7 DNA-Polymerase Extension zu ermöglichen (Pharmacia, Sweden).
  • Um die Leader-Sequenz zu bestätigen, stellte wurde frische cDNA hergestelt und diesmal ein Schwanz aus dGTP-Residuen angefügt. Kurz dargestellt inkubierte man cDNA mit 1 mM dGTP und ungefähr 15 Einheiten terminaler Desoxynukleotidyltransferase (Pharmacia) in 2 mM CaCl2-Puffer bei 37°C für 60 Minuten. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 70°C für 10 Minuten gestoppt. Dann präzipitierte man die DNA mit Ethanol und resuspendierte sie in einem für die Polymerase-Kettenreaktion(PCR) geeigneten Volumen. Die PCR wurde, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung eines Poly- (dC)-Oligonukleotids durchgeführt, das eine XbaI-Stelle am 5'-Ende hat. Man verdaute die resultierenden Fragmente mit XbaI und SmaI und klonierte sie in einen pUCI9-Vektor. Die DNA-Herstellung und -Sequenzierung wurde, wie zuvor beschrieben, mit Klonen durchgeführt, für die man durch Hybridisierung gezeigt hatte, dass sie positiv sind.
  • 5 illustriert die DNA-Sequenz des Major-Late-Promotors, strangaufwärs liegender Enhancer-Sequenzen und der Splice-Leader 1 und 2, wobei die Anordnung des Splice-Leader-1 aus cDNA-Studien gezeigt ist.
  • CHARAKTERISIERUNG NICHT-ESSENTIELLER REGIONEN DES VIRUSGENOMS
  • Das rechte Ende identifizierte man durch Klonieren und vollständiges Sequenzieren des FAV (Serotyp 10 CFA 20) NdeI/3-Fragment aus 4249 bp. Die gesamte Organisation der Gene am rechten Ende (das NdeI/3-Fragment enthaltend) des FAV scheint sehr unterschiedlich zu anderen Adenoviren, die bisher charakterisiert wurden, zu sein. Diese Region enthält zwei Open-Reading-Frames, die durch die Base 3361 beendet wird (6). Das lässt eine relativ lange Region aus 824 bp frei, die für Deletion und Insertion fremder DNA verfühbar ist. Das ermöglicht mindestens 3,1 Karteneinheiten zuvor nicht identifizierter und unerwarteter DNA die Deletion und demnach die Insertion.
  • 6 illustriert einen gestreckten Ausschnitt der Karteneinheiten 92–100 für das EVA CFA20-Genom und zeigt die für die Deletion von Virus-DNA und Insertion von heterologer DNA verfügbare Region. Mögliche Kodierungsregionen sind ebenfalls markiert.
  • KONSTRUKTION DES FAV-VEKTORS
  • 7 illustriert eine bevorzugte Methode zur Herstellung eines FAV-Vektors. Das am rechten Ende des FAV CFA20 befindliche NdeI-Fragment 3 wird kloniert und eine einzigartige Restriktionsendonuklease (NotI)-Stelle eingefügt.
  • CK-Zellen wurden mit gereinigtem, verändertem NdeI-Fragment 3 und gereinigtem SpeI-Fragment 1 transfiziert, um ein funktionales Virus durch homologe Rekombination mit einer einzigartigen Restriktionsendonuklease (NotI)-Stelle im Genom herzustellen. Ein besonders bevorzugtes FAV-Isolat ist jenes als FAV-M11-NotI identifiziertes, welches am 11. März 1994 in den analytischen Labors der australischen Regierung (Australian Government Analytical Laboratories) unter der Zugangsnummer N94/8879 hinterlegt worden war.
  • 8 illustriert die Konstruktion einer Expressionskassette für FAV. Man fügt die Major-Late-Promotor- und die Splice-Leader-Sequenzen 1 und 2 in einen Plasmid-Vektor ein, sowie mehrere Klonierungsstellen (multiple cloning sites) für fremde DNA und eine Poly-A-Erkennungsstelle. Dies alles wird mit einzigartigen Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen (NotI) für die Insertion an der einzigartigen Restriktionsendonuklease-Stelle im FAV-Genom flankiert.
  • Beispiel für die Vektor-Konstruktion:
  • 1. Konstruktion eines FAV-vp2 Rekombinanten
  • Das IBDV-vp2-Gen wurde, wie in 8 beschrieben, in die Expressionskassette eingefügt. Man isolierte die Expressionskassette als ein NotI-Fragment und klonierte sie an die einzigartige NotI-Stelle, Das das vp2-Gen enthaltende Plasmid wurde linearisiert und zusammen mit FAV SpeI/1-DNA in CK-Zellen transfiziert. Dieses Plasmid wurde am 11.März 1994 bei den analytischen Labors der australischen Regierung hinterlegt, wo es im Bakterium E.Coli DH52 pFMLP 234 identifiziert werden kann. Diesem Bakterium wurde die Zugangsnummer N94/8878 gegeben.
  • 2. Konstruktion eines FAV-Thymidinkinase-Rekombinanten
  • Unter Verwendung des CMVIE-Promotors und eines SV40 Polyadenylierungssignals zur Regulierung der Expression, wurde, wie in 8 beschrieben, das Thymidinkinase(TK)-Gen des infektiöse-Laryngotracheitis-Virus (Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV) in eine Expressionskassette eingefügt. Die TK-Expressionskassette wurde als ein NotI-Fragment (8) isoliert und in die einzigartige NotI-Stelle kloniert, die zuvor in das FAV-NdeI/3-Fragment (7) eingebaut worden war. Das die TK-Expressionskassette enthaltende und durch FAV NdeI/3-Fragment flankierte Plasmid wurde durch Verdauung mit NdeI linearisert und zusammen mit FAV-genomischer DNA in CK-Zellen transfiziert. Man selektierte FAV-Vektoren, die das TK-Gen exprimieren, durch Passage unter Verwendung von Methotrexat, einem metabolischen Inhibitor der bei Viren, die keine TK-Aktivität aufweisen, die Replikation blockiert. Southern Blot-Hybridisierung, gefolgt von Plaquereinigung, bestätigten das Vorhandensein des TK-Gens innerhalb des NdeI/3-Fragments in dem verbleibenden FAV-Vektor. Die Tatsachen, dass es möglich ist, einen FAV-TK-Rekombinanten durch Passage mit Methotrexat zu isolieren, demonstriert deutlich das Potential, fremde Gene in diese Region des FAV-Genoms einzufügen und sie zu exprimieren.
  • EXPRESSION FREMDER GENE
  • 9 und 10 illustrieren die Verwendung von Expressionskassetten des FAV, um fremde Gene zu exprimieren. Man testete verschiedenen Konstruktionen, die entweder das FAV MLP/LS mit oder ohne strangaufwärts liegenden Sequenzen (upstream sequences, USS), eine Transkriptionsstartstelle, eine Multiple-Cloning-Site und eine Poly-A-Erkennungssequenz enthalten, auf Expression des Chloramphenicol-Acetylase(CAT)-Gens oder des vp2-Antigen-Gens des infektiöse-Bursitis-Virus (Azad, A.A., Fahey, K.J., Barret, S.A., Erny, K.M und Hudson, P.J. (1986) Expression in Escherichia coli of cDNA Fragments encoding the gene for the host protective antigen of infectious bursal disease virus. Virology 149 190–198). Es wird ein Vergleich mit einer Expressionskassette gemacht, die den Immediate-Early-Promotor-Enhancer des Mensch-Cytomegalievirus enthält. Die Figuren zeigen, dass die mit ganzem FAV-Virus koinfizierte FAV MLP/LS-Kassette zu messbaren Mengen an CAT-Aktivität oder vp2-Antigen führt. Diese Studien würden zeigen, dass Expressionskassetten. des. beschriebenen Typs die Basis für rekombinanten Geflügel-Adenovirus bilden, der in der Lage ist, eine Vielzahl fremder Gene zu exprimieren, einschließlich, wie zuvor hervorgehoben (Seite 6), wichtige Vakzine-Gene und andere Substanzen von kommerziellem Nutzen für die Geflügelindustrie.
  • BEISPIEL EINER IMPFSTRATEGIE
  • 1. Anwendung eines Impfstoffes, der einen Vektor enthält
  • In diesen Experimenten wurden Eintagesküken verwendet, um immuninkompetente Vögel zu repräsentieren und 3 Wochen alte Hühner als Repräsentanten nahezu vollständig immunkompetenter Hühner. Man infizierte Eintagshühner mit CFA20 über Aerosolspray. Das Virus wurde in steriler Kochsalzlösung suspendiert in einer Dosis von 5 × 107/Huhn. Die Hühner wurden in einem umschriebenen Bereich platziert und das Virus wurde auf Kopfhöhe der Vögel in die Luft gesprüht, so dass das Spray die Augen und Schnäbel der Hühner kontaktierte. Das grobtropfige Spray wurde unter Verwendung einer Pumpsprayflasche aus Plastik verteilt. Der Beginn der Antikörper-Antwort wurde per ELISA und Virusneutralisationsassays beobachtet. Die detaillierten Resultate sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2. Serum Antikörper Antwort und Virus-Clearance bei Eintagsküken, die mit einem Aerosol mit dem FAV CFA20 inokuliert waren
    Tage nach Impfung Neutralisationstiter (CFA20)a ELISA-Titer der Ernteb Virus-Erntec
    0 0 –
    7 0 0 +
    14 0 0 +
    21 0 0 +
    0 125 +
    0 70 –
    0 240 –
    0 360 –
    0 300 –
    0 400 –
    42d 0 160 –
    0 100 –
    0 200 –
    47 0 220 –
    0 110 –
    0 260 –
    54 0 100 –
    0 70 –
    • a – reziproker Wert des Virus-Neutralisationstiters im Serum gegen CFA20
    • b – reziproker Wert des ELISA-Titers gegen CFA20
    • c – Virus-Ernte aus Zäkaltonsillen von jeweils 3 Hühnern zu jedem Zeitpunkt
    • d – wiederholte Beimpfung mit CFA20
  • Das Virus wurde aus den Zäkaltonsillen über einen Zeitraum von 4 Wochen nach der Infizierung geerntet, das Verschwinden des Virus trat gleichzeitig mit der Bildung von zirkulierendem Antikörper auf, der durch ELISA aber nicht durch das Virusneutralisationsassay nachgewiesen werden konnte. Während der 7-wöchigen Dauer dieses Experiments konnten keine Virusneutralisierenden-Antikörper nachgewiesen werden. Trotzdem waren Versuche, die Hühner 6 Wochen nach der Primärinfektion erneut zu infizieren, nicht erfolgreich, wie das Scheitern, Virus zu ernten und die Abwesenheit einer anamnestischen ELISA-Antikörper-Antwort im Serum reflektieren.
  • Wenn Hühner im Alter von 3 Wochen infiziert wurden, konnte Virus nur für 1–2 Wochen nach der Infektion geerntet werden, und erneut fiel der Zeitpunkt der Clearance des Virus mit der Entwicklung von durch ELISA detektierbaren Antikörpern zusammen (Tabelle 3). Tabelle 3. Serum-Antikörper-Antwort und Virus-Clearance bei Eintagsküken, die im Alter von 3 Wochen durch ein Aerosol mit dem FAV CFA20 inokuliert wurden
    Tage nach Impfung Neutralisations-titer (CFA20) ELISA-Titerb CFA20 Virus-Erntec
    0 0 0 –
    7 0 0 +
    14 0 260 –
    0 400 –
    0 440 –
    21 0 120 –
    0 220 –
    0 200 –
    0 140 –
    40 240 –
    35 40 100 –
    80 280 –
    160 280 –
    42 640 560 –
    80 140 –
    160 240 –
    • a – reziproker Wert des Virusneutralisationstiters im Serum gegen CFA20
    • b – reziproker Wert des ELISA-Titers gegen CFA20
    • c – Virusernte aus den Zäkaltonsillen von jeweils 3 Hühnern zu jedem Zeitpunkt
  • Virus-neutralisierende-Antikörper konnten auch im Serum dieser Hühner detektieren werden, jedoch nicht vor Ablauf von 4 Wochen nach der Infektion (7 Alterswochen). Das war 2 Wochen nach Clearance des Virus aus den Zäkaltonsillen.
  • 2. Verabreichung von aufeinanderfolgenden Impfstoffen
  • Für die Überprüfung der Machbarkeit aufeinanderfolgender Impfungen mit dem Aerosol wurden zwei Kombinationen verwendet. Im Experiment war die initiale Impfung mit CFA19 (Serotyp 9), gefolgt von CFA20. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4. Aufeinanderfolgende Impfungen: Serumantikörperantwort von 3 Wochen alten Hühnern, die durch Aerosol mit FAV CFA19 infiziert und mit FAV CFA20 noch einmal inokuliert wurden.
    Tage nach Impfung Neutralisationstiter Virusb-rückgewinnung
    CFA19 CFA20
    0c 0 0 –
    3 0 0 –
    7 20 0 +
    20 0 +
    20 0 +
    14 640 0 –
    > 1280 0 –
    > 1280 0 –
    28d > 1280 0 –
    > 1280 0 –
    > 1280 0 –
    31 2400 80 +
    2400 40 +
    2400 80 +
    35 2400 160 +
    1200 60 +
    42 > 2400 320 –
    > 2400 320 –
    • a – Reziproker Wert des Virusneutralisationstiters gegen entweder CFA20 oder CFA19
    • b – Virus-Isolierung aus den Zäkaltonsillen
    • c – Inokulieren mit Aerosol mit CFA19
    • d – Inokulieren mit Aerosol mit CFA20
  • Impfung mit CFA19 schützte nicht vor einer Infektion mit CFA20 (Tabelle 4). Exposition mit CFA20 4 Wochen nach Impfung mit CFA19 resultierte in der Produktion CFA20-spezifischer Virus-neutralisierender Antikörper, und CFA20 konnte nach Exposition mindestens für 7 Tage geerntet werden. In den Invitro-Neutralisationsassays konnte keine Kreuzneutralisation zwischen CFA19 und CFA20 gefunden werden.
  • Man bestätigte Die Identität der aus diesen Hühnern geernteten Viren wurde durch Restriktionsendonuklease-Analyse in deren DANN bestätigt. Diese zeigte, dass nach Exposition von mit CFA19 geimpften Hühnern nur CFA20 geerntet werden konnte.
  • 3. Verabreichung von simultanen Impfstoffen
  • Es wurde auch simultane Impfung von Hühnern mit CFA20 und CFA19 durch Aerosol untersucht. Die in Tabelle 5 aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass weder der Zeitpunkt noch das Ausmaß der Antikörperantworten auf eines dieser Viren durch die Anwesenheit einer zweiten FAV-Infektion beeinträchtigt wurde. Tabelle 5. Simultane Impfungen: Serum-Antikörper-Antwort von 3 Wochen alten Hühnern, die simultan durch Aerosol mit FAV CFA20 und CFA19 geimpft wurden
    Tage nach Impfung Neutralisationstitera Virusb Isolierung
    CFA19 CFA20
    0c 0 0 –
    3 0 0 –
    7 0 0 +
    0 0 +
    0 0 +
    14 1280 0 –
    1280 0 –
    1280 0 –
    28 2400 20 –
    1280 40 –
    2400 20 –
    35 4800 1280 –
    4800 320 –
    9600 320 –
    42 > 20000 1280 –
    > 20000 320 –
    • a – Reziproker Wert des Virusneutralisationstiters gegen entweder CFA20 oder CFA19
    • b – Virusreisolierung aus den Zäkaltonsillen
    • c – Hühner, die mit CFA19 und CFA20 inokuliert wurden
  • Die Virus-neutralisierende-Antikörperantwort auf CFA19 konnte erstmalig 14 Tage nach Infektion detektiert werden und jene auf CFA20 nach 28 Tagen, wie es auch für die alleinige Verabreichung jedes Virus gefunden wurde (Tabelle 3). Die Restriktionsenzym-Analyse der geernteten Viren zeigte, dass 3 Tage nach Infektion nur CFA20 aus den Zäkaltonsillen isoliert werden konnte, aber nach 7 Tagen beide Viren geerntet wurden.
  • 4. Induktion einer Antikörperantwort auf ein fremdes, durch ein rekombinantes FAV übertragenes Antigen
  • Hühner wurden mit einem rekombinanten Geflügel-Adenovirus geimpft, das das Gen für VP2 des infektiöse-Bursitis-Virus(IBDV) oder CFA20 transportierte. Nach intraperitonealer Verabreichung des Impfstoffes am ersten Lebenstag, nahm man den Vögeln am Tag 0 und am Tag 14 und dann wöchentlich Blut ab. Die Seren wurden gesammelt und über ELISA auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen VP2 des IBDV und auf Adenovirus getestet.
  • Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, dass Antikörper gegen VP2 in der Gruppe, die mit der Rekombinanten geimpft wurde, erstmals 14 Tage nach der Impfung detektiert wurden und 28 Tage nach der Impfung am höchsten waren. Tabelle 6. Serum-Antikörper-Antwort (reziproker Wert des Titers) bei Hühnern, denen eine FAV-VP2-Rekombinante oder CFA20 gegeben worden war
    Impfstoff Antikörper Zeit nach Impfung (Tage)
    0 14 21 28 35 42
    FAV-VP2 VP2 < 100 > 400 400 1600 400 ND
    FAV-VP2 FAV < 100 100 100 400 400 200
    CFA20 VP2 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100
    CFA20 FAV < 100 100 100 200 800 800
    • ND = nicht durchgeführt
  • Die Vögel, die mit CFA20 geimpft worden waren, wiesen keine detektierbaren Antikörper gegen VP auf. Anti-Adenovirus-Antikörper wurde in beiden Gruppen 14 Tage nach Impfung detektiert.
  • 5. Induktion des Schutzes durch Verabreichung eines
  • rekombinanten Impfstoffes
  • Hühner wurden intravenös entweder mit dem rekombinanten Adenovirus, das das IBDV-VP2-Gen transportierte oder mit CFA20 geimpft. Beide Gruppen wurden 21 Tage nach der Impfung dem virulenten infektiöse-Bursitis-Virus ausgesetzt. Man tötete alle Vögel 4 Tage später und bestimmte IBDV in der Bursa Fabricii durch ELISA. Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, dass Vögel, die den rekombinanten Impfstoff erhalten hatten, alle gegen eine Infektion mit viralen Antigentitern in der Bursa von weniger als 1/4 geschützt waren. Im Gegensatz dazu hatten alle Vögel, die mit dem parentalen Adenovirus immunisiert worden waren, Antigentiter größer als 1/128. Tabelle 7. Durch Verabreichung von FAV-VP2 oder CFA20 induzierter Schutz gegen IBDV
    Impfstoff Infiziert/Total*
    Rekombinantes FAV-VP2 0/10
    FAV CFA20 10/10
    • * Vögel, die den rekombinanten Impfstoff erhielten, hatten alle Antigen-Titer, die kleiner als 1/4 waren. Vögel, die FAV erhielten, hatten Titergrößer als 1/128.
  • Obwohl sich die vorangehende Beschreibung spezifisch auf Geflügel-Adenovirus-Vektoren bestimmter Serotypen (4, 9 und 10) bezieht, wird man verstehen dass lebender infektiöser Vogel-Adenovirus jeden Typs bei dieser Erfindung verwendet werden könnten. Gleichermaßen können für die Zwecke der Herstellung eines FAV-Vektors eukaryontische Promotor- und Leadersequenzen ersetzt werden, als auch Mutanten und Varianten der hierin erwähnten spezifischen Sequenzen. Man kann sich vorstellen, dass trotz der Tatsache, dass die Erfindung nur im Hinblick auf Geflügel und auf eine aus dem infektiöse-Bursitis-Virus gewonnene, heterologe Sequenz erläutert wurde, die Immunisierung gegen eine Vielzahl von Krankheiten und eine Vielzahl verschiedener Vogelspezies in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen ist. Andere Vögel in denen der Vektor effektiv sein könnte schließen Truthähne, Enten, Fasane, Wachtel und Gänse ein.

Claims (22)

  1. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor, der mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz einschließt und in der Lage ist, sie zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht essentielle Region an dem rechten terminalen Ende des Genoms des Vogel-Adenovirus eingefügt ist.
  2. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das rechte terminale Ende an Karteneinheiten 92–100 lokalisiert ist.
  3. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in Anspruch 2 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht essentielle Region des Genoms eingefügt ist, die am rechten Ende des Genoms bei Karteneinheiten 97–99,9 eingefügt ist.
  4. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in Anspruch 1 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Vogel-Adenovirus einen lebendigen Vogel-Adenovirus umfasst, der strukturelle Virion-Proteine aufweist, die gegenüber denen in einem nativen Vogel-Adenovirus, von dem das rekombinante Vogel-Adenovirus abgeleitet ist, nicht verändert sind.
  5. Rekombinanter Vektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in der Lage ist, als antigenes Polypeptid exprimiert zu werden.
  6. Rekombinanter Vektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz eine antigene Determinante von infektiösem Bursitis-Virus kodiert.
  7. Rekombinanter Vektor wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Vogel-Adenovirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serotypen 4, 9 und 10.
  8. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in einem der vorherigen Ansprüche beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz für einen Immunpotentiator oder eine antigene Determinante einer infektiösen Vogelerkrankung kodiert.
  9. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die infektiöse Vogelerkrankung ausgewählt ist aus: von Parasiten verursachten Darminfektionen; virale Atemwegserkrankungen, Infektionen innerer Organe; Newcastle-Krankheit; Marek'sche Krankheit; Egg Drop-Syndrom; Inclusion body-Hepatitis; infektiöse Laryngotracheitis; Mykoplasmen; Hühneranämie; Vogelinfluenza; Coccidia; infektiöse Bronchitis; infektiöse Bursitis und Vogelencephalomyelitis.
  10. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunpotentiator aus Cytokinen und Wachstumspromotoren ausgewählt ist.
  11. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in Anspruch 8 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunpotentiator aus Huhn Myelomonozytischem Wachstumsfaktor und insulinartigen Wachstumsfaktoren ausgewählt ist.
  12. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Vogel-Adenovirus ein Geflügel-Adenovirus ist.
  13. Rekombinanter Vogel-Adenovirusvektor wie in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht zur Verwendung als Medikament.
  14. Verwendung von einem rekombinanten Vogel-Adenovirus, wie in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht, zur Herstellung eines Medikaments.
  15. Verwendung wie in Anspruch 14 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Medikament für Vögel ist.
  16. Verwendung wie in Anspruch 14 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Medikament für Hühner ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vogel-Adenovirusvektors zur Verwendung als Impfstoff, Schritte umfassend, bei denen man in eine nicht essentielle Region an dem rechten terminalen Ende eines Vogel-Adenovirusgenoms mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz in Verbindung mit einer effektiven Promotersequenz einfügt.
  18. Verfahren wie in Anspruch 17 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass man vor dem Einfügen der heterologen Nukleotidsequenz eine Restriktionsenzym-Stelle in die nicht essentielle Region des Vogel-Adenovirusgenoms einfügt.
  19. Verfahren wie in Anspruch 17 oder in Anspruch 18 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Vogel-Adenovirus wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert ist.
  20. Rekombinanter Impfstoff zur Herstellung und/oder Optimierung von Antikörpern oder zellvermittelter Immunität zur Bereitstellung oder Verbesserung von Schutz gegen Infektion durch einen infektiösen Organismus bei Vögeln, wobei der Impfstoff mindestens einen rekombinanten Vogel-Adenovirusvektor, der mindestens eine heterologe Nukleotidsequenz einschließt und in der Lage ist, sie zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz in eine nicht essentielle Region an dem rechten terminalen Ende des Genoms des Vogel-Adenovirus eingefügt ist, und geeignete Träger und/oder Hilfsstoffe umfasst.
  21. Rekombinanter Impfstoff wie in Anspruch 20 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass die Träger und/oder Hilfstoffe so ausgewählt sind, dass der Impfstoff in der Form eines Aerosol-Sprays verabreichbar ist.
  22. Rekombinanter Impfstoff wie in Anspruch 20 oder Anspruch 21 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Vogel-Adenovirus wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert ist.
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