DE60114420T2

DE60114420T2 - Abgeschwächter Mutantenstamm eines Virus der Newcastle-Krankheit für eine in Ovo Impfung und dessen Benutzung

Info

Publication number: DE60114420T2
Application number: DE60114420T
Authority: DE
Inventors: Jan Mast; Guy Meulemans
Original assignee: CT VOOR ONDERZOEK IN DIERGENEE; Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie CODA
Current assignee: CT VOOR ONDERZOEK IN DIERGENEE; Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie CODA
Priority date: 2001-10-04
Filing date: 2001-10-04
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: DE60114420D1; US20040258713A1; US7252984B2; WO2003030932A1; WO2003030932A9; ATE307606T1; EP1300157A1; EP1300157B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue abgeschwächte mutante Virenstämme der Newcastle-Krankheit. Die Erfindung schließt auch die Verwendung des abgeschwächten mutanten Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota in einem Vakzin zur In-Ovo-Vakzinierung von Vogelarten, vorzugsweise Hühnern, mit ein.
Antikörper sind leistungsstarke Werkzeuge bei der Analyse von Mutationen in Antigenen (Pollock et al. 1987) und sie sind auch erfolgreich für die Selektion antigener Varianten, die auch als Fluchtmutanten bekannt sind, von Influenzavirus (Gerhard und Webster 1978, Lubeck et al. 1980, Yewdel et al. 1986) vom Tollwutvirus (Wiktor und Koprowski 1980) und vom Masernvirus (Birrer et al. 1981) verwendet worden. NDV-Flucht-Mutanten wurden von Russel (1983), Abenes et al. (1986), Meulemans et al. (1987) und Yussof et al. (1989) hergestellt. Meulemans et al. (1987) zeigten, dass NDV-Flucht-Mutanten stärker oder schwächer pathogen sein können als die Ausgangsvirusstämme (Meulemans et al. 1987).
Die Herstellung antikörperresistenter Virusstämme durch absichtliche Abschwächung des parentalen Virus und derartige Anpassung, dass es als In-Ovo-Vakzin geeignet ist, wurde nie vorgeschlagen. Benejean et al. ( EP 0583998 ) schwächten das Tollwutvirus durch Herstellung einer Flucht-Mutante ab und verwendeten dieses als ein Vakzin. Die Verwendung dieser Technik zur Herstellung von Flucht-Mutanten von Vogelviren wurde von ihnen weder vorgeschlagen noch als möglicherweise nützlich für die In-Ovo-Vakzinierung nahe gelegt.
Die In-Ovo-Vakzinierungstechnik mittels eines zugelassenen Vakzins ist ein sicheres, effizientes, und bequemes Verfahren zur Vakzinierung von Geflügel (Ricks et al. 1999, US 6032612 , AO 1K45/00C). Im Jahr 1999 waren mehr als 80 % der US-Hähnchenindustrie zum In-Ovo-Vakzinierungsprozess übergegangen, um die Marek-Erkrankung unter Kontrolle zu bringen (Ricks et al. 1999).
Studien der letzten paar Jahre haben gezeigt, dass nur wenige Lebend-Vakzine, die routinemäßig an geschlüpfte Hühner verabreicht werden, auch in Eier mit Embryo in den späten Stadien der Embryonalentwicklung injiziert werden können ohne einen toxischen Effekt zu zeigen.
Das Truthahnherpesvirus (HVT, Sharma und Burmester, 1982), und infektiöse Bursitisvirus(IBDV)-Stämme mit niedriger Virulenz (Sharma, 1985) können als Embryovakzine verwendet werden, um einen aktiven Schutz gegen die homologen Stämme zu induzieren.
IBDV-Stämme moderater Virulenz, z. B. 2512 (Sharma 1985), kommerziell erhältliche Stämme des infektiösen Bronchitisvirus (IBV), z. B. Massachusetts 41 (Wakenell und Sharma 1986) und Stämme des Newcastle-Krankheitvirus wie der B1 (Ahmad und Sharma, 1992, 1993) und der La Sota Stamm können in ihrer derzeitigen Form aufgrund der embryonalen Toxizität nicht für die In-Ovo-Vakzinierung angewendet werden. Die Abschwächung von Virusstämmen, die z. Zt. für Vakzinierungen nach dem Schlüpfen verwendet werden, ist daher notwendig, um Stämme mit einer reduzierten Pathogenität gegenüber dem Vogelembryo zu erhalten.
Wakenell und Sharma (1986) reduzieren die Pathogenität des Massachusetts 41 IBV-Stamms gegenüber dem Embryo mittels eines Abschwächungssystems in Gewebekultur. Mit der 40. Passage in einer Nierengewebekultur des Huhns wurde das Virus apathogen für die Embryonen und embryonale Vakzinierung induzierte die IBV-spezifische Antikörperproduktion und den Schutz gegenüber dem virulenten Massachusetts 41 IBV in einem Alter von 4 Wochen.
Die Behandlung des B1-Stamms des NDV mit dem alkylierenden Wirkstoff Ethylmethansulfonat reduzierte die Virulenz dieses Stamms für den 18 Tage alten Hühnerembryo deutlich und eine In-Ovo-Vakzinierung mit diesem Stamm führte zu NDV-spezifischer Antikörperherstellung und zum Schutz gegenüber dem Texas GB-Stamm (Ahmad und Sharma 1992). Des Weiteren wurde behauptet ( EP 0848956 A1 ), dass eine Vakzinzubereitung, die das Newcastle-Krankheitvirus des NDW-Stamms enthält, besonders für die In-Ovo-Anwendung geeignet ist.
Schließlich stellten Mebatsion und Schrier ( EP 1074614 A1 ) eine NDV La Sota Mutante her, die als Vakzinkandidat für die In-Ovo-Vakzinierung geeignet ist. Die Mutante exprimiert reduzierte Mengen an V-Protein und kann in sicherer Form an Hühnerembryos vor dem Schlüpfen verabreicht werden. Um diese Stämme zu erhalten wurde keine antikörper-basierte Selektion verwendet.
Die Bildung eines Komplex zwischen einer gemessenen Menge Antikörper mit IBDV neutralisierender Aktivität und einer spezifischen Menge an IBDV neutralisierte die Pathogenität des IBDV und machte es als In-Ovo-Vakzin nützlich ( US 5871748 , Whithfill et al. 1992, 1995, Haddad et al. 1997).
Um die wirtschaftlichen Verluste aufgrund der Newcastle-Krankheit in der kommerziellen Geflügelindustrie zu reduzieren, müssen z. Zt. die Hühner gegen das Newcastle-Krankheitvirus vakziniert werden. Es kann vorteilhaft sein, Embryovakzinierung für diesen Zweck zu verwenden, insbesondere weil die In-Ovo-Injektion mittels semiautomatischer Maschinen mit multiplen Injektionsköpfen durchgeführt werden kann, die eine individuelle Vakzinierung erlauben.
Viele der Vakzine, die konventionell für die Vakzinierung von Vögeln nach dem Schlüpfen verwendet werden, können jedoch nicht für die In-Ovo-Vakzinierung verwendet werden. Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, abgeschwächte Newcastle-Krankheitvirusstämme zur Verfügung zu stellen, die tatsächlich als Vakzin bei Vogelarten verwendet und nach dem Schlüpfen oder In-Ovo verabreicht werden können.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota, geeignet für die In-Ovo-Vakzinierung von Vogelspezies, wobei der Virusstamm eine Mutation in den Gensequenzen aufweist, die für die HN- und/oder F-Glycoproteine des Virus kodieren, was zu einer veränderten Expression dieser Glycoproteine führt, dadurch gekennzeichnet, dass der Virusstamm eine Mutation umfasst, die ausgewählt ist aus:

– einer Asp72Gln-Substitution im F-Glycoprotein;
– einer Leu160Gln-, einer Leu193Ser- oder einer Leu229Arg-Substitution im HN-Glycoprotein;
– einer Asp72Tyr-Substitution des F-Glycoproteins und einer Leu229Arg-Substitution im HN-Glycoprotein.

Der Ausdruck „abgeschwächter Stamm" betrifft einen Stamm, der weniger virulent ist als der parentale Stamm.
La Sota ist ein lentogener Newcastle-Krankheit-Virusstamm. Mehrere Pathotypen des Newcastle-Krankheit-Virus sind identifiziert worden, d. h. velogene, mesogene und lentogene. Obwohl diese Ausdrücke Ergebnisse von Labortests sind, die sowohl in vivo als auch in vitro ausgeführt worden sind, werden diese Ausdrücke im Allgemeinen verwendet, um Viren mit hoher, mittlerer oder niedriger Virulenz für Hühner zu beschreiben. Die neurotrope velogene Form der Krankheit wird von hochgradig pathogenen Stämmen des Newcastle-Krankheit-Virus verursacht und ist gekennzeichnet durch ein plötzliches Auftreten schwerer respiratorischer Anzeichen gefolgt von neurologischen Anzeichen. In den meisten Fällen überleben die infizierten Tiere nicht. Viszerotrope velogene Newcastle-Krankheit-Virusstämme sind ebenfalls hochgradig pathogen und verursachen eine hohe Mortalität und schwere Läsionen am Gastrointestinaltrakt. Mesogene Stämme des Newcastle-Krankheit-Virus verursachen gewöhnlich eine schwere Erkrankung der Atemwege in völlig empfänglichen Vögeln, und verursachen in erwachsenen Vögeln einen markanten Abfall in der Eierproduktion. Lentogene Stämme des Newcastle-Krankheit-Virus verursachen im Allgemeinen eine schwache Krankheit, die gekennzeichnet ist durch respiratorische Anzeichen, vor allem in jungen völlig empfänglichen Vögeln.
Die abgeschwächten mutanten Newcastle-Krankheit La Sota Virenstämme der Erfindung sind geeignet für die In-Ovo-Vakzinierung jedes Vogels, egal ob domestiziert oder wild, und insbesondere für jene, die kommerziell zur Fleisch- oder Eierproduktion aufgezogen werden. Ohne Einschränkung dazu schließen beispielhafte Vogelarten Hühner, Truthähne, Tauben, Fasane und dergleichen ein. Vögel, die in Hochdichtebruträumen aufgezogen werden, wie Hähnchen und Legehennen, sind besonders anfällig für umweltbedingte Exposition gegenüber infektiösen Wirkstoffen und würden erheblich von einer Vakzinierung vor dem Schlüpfen profitieren. Vorzugsweise werden Hühner, Truthähne und Tauben verwendet.
Wie weiter unten in dieser Beschreibung und insbesondere in Bsp. 1 erklärt werden wird, wurden HN und F antigene variante Virusstämme vom lentogenen Newcastle-Krankheit-Virus vom Stamm La Sota mittels einer Immunoselektion genannten Prozesses erhalten, unter Verwendung der MAks 8C11 (Le Long et al. 1986) und 1C3 (Le Long et al. 1988), die gegen die F- bzw. die HN-Glycoproteine des Newcastle-Krankheit-Virus gerichtet sind. Insgesamt wurden 4 Stämme erhalten. Die F- und HN-Stämme wurden mit den monoklonalen Antikörpern 1C3 bzw. 8C11 ausgewählt. Zusätzlich wurden mittels Immunoselektion unter Verwendung der F- und HN-spezifischen monoklonalen Antikörper 1C3 und 8C11 ausgehend von den HN- bzw. F-mutanten Stämmen 2 Doppelmutanten hergestellt.
Diese 4 abgeschwächten Newcastle-Krankheit-Viren vom Stamm La Sota wurden weiter in Hämagglutinininhibierungs- und ELISA-Tests sowie über Sequenzanalyse der Gene, die für die F- und die HN-Glycoproteine kodieren, charakterisiert. Diese Ergebnisse sind in den Tabellen 3, 4 und 5 von Bsp. 2 beschrieben. Diese Charakterisierung ergab, dass die verschiedenen NDV-Stämme, die mit dem monoklonalen Antikörper 1C3 ausgewählt wurden, durch eine Substitution von Aminosäure 72 des F-Gens charakterisiert sind. Tatsächlich unterscheiden sich das F-Gen der F- und F+HN mutanten Stämme, die mittels des monoklonalen Antikörpers 1C3 ausgewählt worden sind, von dem La Sota Ausgangsstamm durch eine Punktmutation G-nach-T (GAT nach TAT), was zu einer Asp-72-Tyr-Substitution führt. Die Immunoselektion der HN-Mutante, gekennzeichnet durch eine Arg-101-Met-Substitution im F-Gen, mit 1C3, um eine HN+F Mutante zu erhalten, führte zu einer zusätzlichen Asp-Glu-Substitution an derselben Aminosäure 72. Die Asp-72-Tyr-Substitution war früher in einer 1C3-resistenten Mutante des Beaudette-Stamms beobachtet worden (Yusoff et al. 1989), während eine Asp-72-Gly-Transition für 1C3-resistente Mutanten des Italien NDV-Stamm (Neyt et al. 1989), des Beaudette C Stamms (Yusoff et al., 1989) und in einer antigenen Variante des Sato Stamms (Toyoda et al. 1988) beobachtet wurde. Die Bestimmung der 3-dimensionalen Struktur des Fusionsproteins des NDV zeigte, dass das beteiligte 1C3-Epitop an der Oberfläche exponiert ist und sich am Loop-Segment zwischen Strang III a und der Disulfidbrücke zwischen den Ketten (Chen et al. 2001) an den antigenen Stellen A1, II und 1 befindet. Die Stelle A1 ist so wie von Yusoff et al. (1989) definiert, II ist wie von Toyoda et al. (1988) definiert und 1 ist wie von Neyd et al. (1989) definiert. Tabelle 4 veranschaulicht, dass die F-, F+HN- und HN+F-Mutanten nicht nur das 1C3-Epitop verloren haben, sondern auch das 10F2-Epitop, das sich auf dem selben Loop befindet (Chen et al. 2001), wo hingegen ein nahe gelegenes, drittes Epitop auf diesem Loop, das durch den monoklonalen Antikörper 2C1 definiert wird, konserviert blieb. In keinem der F-NDV mutanten Stämme beeinflusste die Punktmutation Asp-72-Gly die Erkennung der antigenen Stellen A5, I, 2, die durch den monoklonalen Antikörper 12C4 definiert werden. Chen et al. (2001) zeigten ausgehend von ihrem 3-dimensionalen Modell des F-Proteins, dass dieses Epitop von oberflächen-exponierten Resten an einem entfernten Loop-Segment, das zwischen den Strängen If und Ig liegt, bestimmt wird.
Schließlich wurde eine Arg-101-Met Substitution in den HN- und den HN+F-Mutanten beobachtet, was nicht zu einer veränderten Erkennung durch den getesteten monoklonalen Antikörper im ELISA führte und ebenso wenig führten die Mutationen an Aminosäure 320 und 467 des F-Gens (Tabelle 5) dazu, da sie konservativ waren.
Die Immunoselektion mit dem HN-Protein spezifischen monoklonalen Antikörper 8C11 induzierte Punktmutationen im Gen dieses Proteins. Die Sequenzanalyse (Tabelle 5) zeigte Leu-193-Ser-Substitutionen in den HN- und HN+F-Stämmen, und eine Leu-160-Gln-Substitution im HN+F-Stamm. Darüber hinaus wurde eine konservative ACA nach ACG Mutation in Codon 41 in diesen beiden Stämmen beobachtet. Keine dieser Mutationen führte zu einem Verlust eines Epitops das von einem HN-Protein-spezifischen MAk erkannt wird, wie mittels ELISA (Tabelle 4) überprüft wurde.
Die durch die HN+F Mutante induzierte Hämagglutinierung wird jedoch nicht durch den monoklonalen Antikörper 8C11, der für die Selektion verwendet wurde, inhibiert, was andeutet, dass das 8C11 Epitop, obwohl es exprimiert wird, evtl. funktionell nicht mehr aktiv sein könnte. Die durch die HN-Mutante vermittelte Hämagglutinierung wird durch mehrere monoklonale Antikörper nicht inhibiert oder im Vergleich zum Original La Sota Stamm reduziert. Das deutet möglicherweise eine fehlerhafte Expression und Funktion des gesamten HN-Moleküls an.
Eine Sequenzanalyse ergab weiterhin, dass die F- und die abgeleitete F+HN-Mutante sich durch Asn-115-Ser und Arg-124-Gly-Substitutionen im HN-Protein auszeichnen. Diese Mutationen beeinflussten nicht die Erkennung der F-Mutante durch den untersuchten monoklonalen Antikörper im ELISA (Tabelle 3) oder im Hämagglutinierungsinhibierungsassay (Tabelle 4). Die fehlende Reaktivität des monoklonalen Antikörpers 8C11 mit der F+HN-Mutante in diesen Assays muss folglich ausschließlich der beobachteten Leu-229-Arg-Substitution zugeordnet werden. Ebenso scheint die Substitution die Erkennung dieses mutanten La Sota Stamms durch einen Hichner-Stamm spezifischen monoklonalen Antikörper 10B12 im HI, aber nicht im ELISA Assay zu induzieren.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass seine Hämagglutinierung nicht durch den monoklonalen Antikörper 8C11, der spezifisch das Glycoprotein HN des Virus der Newcastle-Krankheit erkennt, inhibiert wird.
Hämagglutinierungsinhibierungsassays sind im Stand der Technik bekannt und erlauben es, die Expression funktionell aktiver Epitope auf den Virusstämmen zu untersuchen. Wie zuvor erwähnt wird die Charakterisierung der abgeschwächten mutanten Viren der Newcastle- Krankheit vom Stamm La Sota F, HN, HN+F und F+HN in solchen Hämagglutinierungsinhibierungsassays in Beispiel 2 und in Tabellen 2 und 3 beschrieben. Unter „keine Inhibierung der Hämagglutinierung" versteht man ein Signal von weniger als 2.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben definiert, dadurch gekennzeichnet, dass es nicht vom monoklonalen Antikörper 8C11 in einem indirektem ELISA-Assay erkannt wird, wobei der monoklonale Antikörper 8C11 spezifisch das Glycoprotein HN des Virus der Newcastle-Krankheit erkennt. Keine Bindung an den Antikörper deutet an, dass das im ELISA-Assay erhaltene finale Signal (O.D. oder Absorption) weniger als 0,120 beträgt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein abgeschwächtes mutiertes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass es von den monoklonalen Antikörpern 1C3 oder 10F2 im indirekten ELISA-Assay nicht erkannt wird, wobei die monoklonalen Antikörper spezifisch das Glycoprotein F des Virus der Newcastle-Krankheit erkennen.
Indirekte ELISA-Assays sind im Stand der Technik gut gekannt und die Bindung der Virusstämme HN, F, HN+F und F+HN in solchen Assays ist in Bsp. 2 und Tabelle 4 angegeben.
Gemäß noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben beschrieben und am 04. September 2001 als La Sota Mutante 1C3+8C11 unter der Registrierungsnummer CNCM I-2714 in der nationalen Sammlung von Kultur- und Mikroorganismen des Pasteur Instituts in Paris hinterlegt. Überraschenderweise stellten sich die abgeschwächten mutanten Viren der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota als geeignet für die In-Ovo-Vakzinierung heraus. Das wird genauer in Bsp. 3 beschrieben.
Die Pathogenität sowohl des HN- als auch des F-Virusstamms war im Vergleich mit dem parentalen lentogenen La Sota Stamm, von dem sie abgeleitet worden sind, erheblich verringert.
Darüber hinaus war die Pathogenität sowohl des HN+F als auch des F+HN mutanten Virusstamms im Vergleich mit dem parentalen La Sota Stamm sogar noch drastischer verringert.
Die Fähigkeit zu Schlüpfen und das neonatale Überleben waren für die mit den doppelmutierten Stämmen inokulierten Hühnern im Allgemeinen höher als mit den F- und HN-Stämmen.
In-Ovo-Vakzinierung schließt die Verabreichung der abgeschwächten Virenstämme an Eiern mit ein.
Die Eier sind fruchtbare Eier, die sich vorzugsweise im 4. Viertel der Bebrütung befinden.
Hühnereier werden um den 15. bis 19. Tag des Bebrütens behandelt, und werden besonders bevorzugt ungefähr am 18. Tag des Bebrütens behandelt. Truthahneier werden vorzugsweise ungefähr vom 21. Tag bis zum 26. Tag des Bebrütens behandelt, und werden besonders bevorzugt am 25. Tag des Bebrütens behandelt.
Das erfindungsgemäße Vakzin kann an die Eier mit jedem Mittel verabreicht werden, dass die Verbindung durch die Eischale transportiert. Das bevorzugte Verabreichungsverfahren ist jedoch die Injektion. Die Injektionsstelle liegt vorzugsweise innerhalb entweder des Bereichs, der durch das Amnion definiert wird, einschließlich des Fruchtwassers und des Embryos selbst, im Eidotter, oder in der Luftzelle. Besonders bevorzugt wird in den Bereich injiziert, der durch das Amnion definiert ist. Mit Beginn des 4. Viertels des Bebrütens ist das Amnion ausreichend vergrößert, so dass das Eindringen beinahe die ganze Zeit gewährleistet ist, wenn die Injektion von der Mitte des großen Endes des Eis entlang der longitudinalen Achse durchgeführt wird.
Der Injektionsmechanismus ist nicht besonders kritisch, vorausgesetzt, dass dabei Gewebe und Organe des Embryos nicht übermäßig beschädigt werden. Beispielsweise wird ein kleines Loch mit einer Nadel (1-1^1/2 inch, ca. Größe 22), die an einer Spritze angebracht ist, in das große Ende der Schale gebohrt und das Vakzin wird unter die Membran der inneren Schale und die chorioallantoide Membran injiziert. Anschließend werden die vakzinierten befruchteten Eier zum Schlüpfen in einen Brutkasten transferiert. Für die In-Ovo-Vakzinierung stehen mehrere Vorrichtungen zur Verfügung, beispielsweise jene, wie sie in US 4,681,063 ; US 4,040,388 ; US 4,469,047 und US 4,593,646 offenbart sind.
Obwohl die In-Ovo-Injektion der lebenden Virusstämme gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, können diese Viren auch mit den Massenapplikationstechniken, wie sie für die NK-Vakzinierung gewöhnlich verwendet werden, verabreicht werden. Diese Techniken schließen Trinkwasser- und Sprayvakzinierung mit ein. Wegen der extrem milden Eigenschaften des Vakzins wird insbesondere die Sprayverabreichung des Vakzins in Erwägung gezogen.
Die abgeschwächten Viren der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota der vorliegenden Erfindung können in einem Vakzin vorliegen. Daher betriff die vorliegende Erfindung auch eine Vakzinzusammensetzung, die eine schützende Immunität gegenüber der Newcastle-Krankheit vermittelt, umfassend ein abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben erwähnt.
In Bsp. 4 sind Ergebnisse beschrieben, die zeigen, dass die Verabreichung der mutanten Viren an SPF-Embryos eine virusspezifische Immunreaktion induziert.
Das erfindungsgemäße Vakzin kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter Form zubereitet und vermarktet werden und kann zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthalten, der/das für solche Zusammensetzungen angepasst ist. Träger schließen Stabilisatoren, Konservierungsstoffe und Puffer ein. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise SPGA, Kohlenhydrate (beispielsweise Sorbit, Mannitol, Stärke, Saccharose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (beispielsweise getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Geeignete Puffer sind beispielsweise Alkalimetall-Phosphate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthuilat und Gentamicin. Verdünnungsmittel schließen Wasser, wässrige Puffer (beispielsweise gepufferte Salzlösung) und Polyole (beispielsweise Glycerin) mit ein.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch für die In-Ovo-Vakzinierung als gemischtes Vakzin in Kombination mit wenigstens einem Vakzin verwendet werden, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vakzinen gegen andere Viren beispielsweise gegen das infektiöse Bronchitisvirus der Vögel, gegen das infektiöse Bursitisvirus der Vögel, gegen das Enzephalomyelitisvirus der Vögel, gegen das Egg-Drop-Syndrom-Virus, gegen das Influenzavirus, gegen das Reovirus, gegen das Adenovirus, etc.; Bakterien wie Hämophilus paragallinarum, Salmonella typhimurium, S. enteritidis, S. pullorum, S. gallinarum, E. coli, Clostridium spp., Campylobacter spp., Mycoplasma spp. etc.; und Protozoen wie Eimeria tenella, E. maxima, E. acervulina, E. brunetti, E. necatrix, Hühnermalaria, etc. Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen abgeschwächten mutanten Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben geschrieben für die Zubereitung eines Vakzins zur In-Ovo-Vakzinierung von Vogelarten gegen die Newcastle-Krankheit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota wie oben beschrieben auch für die Zubereitung eines Vakzins für Vogelarten für die Anwendung nach dem Schlüpfen verwendet werden.
Virusstämme mit verringerter embryonaler Pathogenität können hergestellt werden mittels eines Selektionsverfahrens, das auf spezifischen Antikörpern oder Fragmenten davon basiert. Indem man das Virus in Anwesenheit von Antikörpern kultiviert, können Viruspartikel mit einer veränderten Erkennung durch die angewendeten Antikörper ausgewählt werden. Durch serielle Wiederholung dieser Selektion können antikörperresistente Virusstämme erhalten werden. Die Multiplikation der ausgewählten Viren zwischen den Selektionen kann notwendig sein.
Das System zur Kultivierung des Virus in Anwesenheit von Antikörpern ist nicht kritisch. Systeme zur Kultivierung des Virus können aus vollständigen oder Teilen von Geweben, isolierten Vögel- oder Säugerzellen, oder befruchteten Eiern bestehen. Zellen können Primärkulturen oder etablierte Zelllinien sein.
Die bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper sind virusspezifische Antikörper. Virusspezifische Antikörper sind jene, die mit dem Virus interagieren, wenn das Virus und die Antikörper miteinander für eine ausreichende Zeitspanne reagieren können. Die Quelle für die virusspezifischen Antikörper ist nicht kritisch. Sie können von jedem Tier abstammen einschließlich Säugetieren (Maus, Ratte, Kaninchen) und Vögeln (z. B. Huhn, Truthahn).
Das oben erwähnte Verfahren ist besonders deutlich bei der Prävention von tödlichen Erkrankungen, die Vögel früh in ihren Leben bedrohen. Eine der verbreitetsten und wirtschaftlich zerstörerischsten Erkrankungen in der Geflügelindustrie ist die Newcastle-Krankheit.
Das Verfahren abgeschwächte mutante Virusstämme auszuwählen mittels virusspezifischer Antikörper kann jedoch ausgeweitet werden auf andere immunisierbare virale Erkrankungen der Vögel.
Die mittels der Immunoselektion erhaltenen Virusstämme können in Gewebekultursystemen vervielfältigt werden, z. B. einer in vitro-Zellkultur, oder in einem in vivo-System, z. B. befruchteten Hühnereiern.
Die anschließende Durchmusterung mittels Inokulation von Vogelembryos gestattet es, jene Virusstämme mit reduzierter Pathogenität auszuwählen. Wenn die hergestellten Virusstämme eine aktive Immunreaktion induzieren, die schützend sein kann, dann können sie als Vakzin verwendet werden. Ausgehend von Unterschieden in den Immunreaktionen, die durch die antigenen Varianten, die wie oben beschrieben hergestellt werden, induziert werden, können Probanden, die mit diesen Varianten vakziniert wurden, unterschieden werden. Ein Beispiel dafür ist die Unterscheidung von Hühnern, die mit den abgeschwächten Viren der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota vakziniert worden sind, von Hühnern, die mit dem parentalen La Sota Stamm vakziniert worden sind, ausgehend von Unterschieden in den virusspezifischen Antikörpern.
Das Prinzip der Zubereitung von abgeschwächten Virusstämmen der Newcastle-Krankheit mittels Immunoselektion ist im Detail in Beispiel 1 erklärt. In diesem Beispiel wird die Selektion mittels der monoklonalen Antikörper 8C11 und 1C3 durchgeführt, die gegen das HN- bzw. F-Glycoproteine gerichtet sind.
In dem oben beschriebenen Verfahren können die virusspezifischen Antikörper spezifisch sein für virale Vogelkrankheiten, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Newcastle-Krankheit, infektiöse Bronchitis, infektiöse Bursitis, Adenovirus-Erkrankungen, Reovirus, Pocken, Laryngotracheitis und Influenza.
Vogelviren, die die Krankheiten verursachen sind hier mit eingeschlossen, beispielsweise Vogelherpesviren (z. B. infektiöse Laryngotracheitis der Vögel, Marek-Krankheitsvirus, ...), Vogelkoronaviren (z. B. infektiöse Bronchitis der Vögel Virus, Truthahninteritisvirus, ...), Vogelbirnaviren (z. B. infektiöser Bursitisvirus), Vogelenteroviren (z. B. Enzephalomyelitis der Vögel Virus), Vogelastroviren, Vogeladenoviren der Gruppen I, II und III, Vogelpneumoviren (z. B. Vogelrhinotracheitisvirus), Vogelreovirus (z. B: virales Arthritisvirus), Vogelzirkoviren (z. B. Hühneranämievirus) und Vogelpockenviren.
Im Prinzip kann das Verfahren auf alle Vogelviren angewendet werden, für die neutralisierende monoklonale Antikörper oder ein polyklonales Antiserum verfügbar ist.
Wie oben erwähnt wurden im Falle der Newcastle-Krankheit neutralisierende Antikörper, die gegen das virale F- oder HN-Glycoprotein gerichtet sind, in den Beispielen verwendet, die weiter unter in dieser Beschreibung beschrieben sind.
In dem oben erwähnten Verfahren können virusspezifische Antikörper auch spezifisch ein Epitop auf den Glycoproteinen HN und/oder F des Virus der Newcastle-Krankheit erkennen.
Abgeschwächte mutante Virusstämme der Newcastle-Krankheit, die durch die Antikörper ausgewählt wurden, können vom parentalen Virusstamm neben anderen durch ihre Reaktivität mit MAk im ELISA und im Hämagglutinierungsassays oder durch die Nukleotidsequenz ihrer Gene unterschieden werden. Die mangelnde Neutralisation mittels homologer MAk nach jeder Passage in Relation zu nicht-behandeltem Kontrollvirus kann als Kriterium verwendet werden, um eine antigene Variante oder ein mutantes Virus von revertierten Virus zu unterscheiden (Fleming et al. 1986).
Im oben erwähnten Verfahren können die virusspezifischen Antikörper auch spezifisch ein Epitop auf dem Glycoprotein HN des Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota erkennen.
Im oben erwähnten Verfahren können die virusspezifischen Antikörper auch spezifisch ein Epitop auf dem Glycoprotein F des Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota erkennen.
Die oben erwähnten virusspezifischen Antikörper sind die monoklonalen Antikörper 8C11 oder 1C3.
Antikörper, die spezifisch ein Epitop auf den HN- und/oder F-Glycoproteinen erkennen oder dazu ähnlich Proteine auf lentogenen Virusstämmen, können verwendet werden, um einen abgeschwächte mutanten Virusstamm zu selektionieren.
Antikörper wie oben erwähnt, die spezifisch ein Epitop auf HN- und/oder F-Glycoproteinen auf dem Virus der Newcastle-Krankheit erkennen, können zur Selektion eines abgeschwächten mutanten Virusstamms der Newcastle-Krankheit verwendet werden.
Antikörper, die wie oben erwähnt spezifisch ein Epitop auf den HN- oder F-Glycoproteinen des Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota erkennen, können verwendet werden, um ein abgeschwächten mutantes Virus vom Stamm La Sota zu selektionieren.
Die o. e. Verwendung kann die Verwendung der monoklonalen Antikörper 8C11 und/oder 1C3 umfassen. Die folgenden Beispiele sind nur gedacht, um die Erfindung weiter zu verdeutlichen und sind nicht dazu gedacht, den Rahmen der Erfindung zu limitieren, der durch die Patentansprüche definiert wird.

Tabelle 1. Neutralisation antigener Varianten nach Neutralisation mittels homologer MAk.
Tabelle 2. Charakterisierung von NDV La Sota Stämmen mittels Hämagglutinierungsinhibierungsassay unter Verwendung von NDV-spezifischer MAk.
Tabelle 3. Charakterisierung von NDV La Sota Stämmen mittels Hämagglutinierungsinhibierungsassay unter Verwendung von NDV-spezifischer MAk.
Tabelle 4. Reaktivität des NDV-spezifischen MAk mit verschiedenen NDV-Stämmen im indirekten ELISA.
Tabelle 5. Sequenzanalyse der Gene, die für die F- und HN-Glyoproteine der NDV La Sota Stämme kodieren.
Tabelle 6. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota Stamm auf die Fähigkeit zu Schlüpfen von SPF-Eiern.
Tabelle 7. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota HN-Stamms (Exp. 1 – 3) und des F-mutanten Stamms (Exp. 4) auf die Fähigkeit zu Schlüpfen und neonatales Überleben.
Tabelle 8. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota 1C3+8C11 (F+HN)-Stamms auf die Fähigkeit zu Schlüpfen und neonatales Überleben.
Tabelle 9. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota Doppelmutantenstamms auf die Fähigkeit zu Schlüpfen von NDV negativen Eiern.
Tabelle 10. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota HN+F-Stamms auf die Fähigkeit zu Schlüpfen von SPF-Eiern.
Tabelle 11. Einfluss der Inokulation am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota Doppelmutanten F+HN auf die Fähigkeit zu Schlüpfen von Eiern und auf die Mortalität nach dem Schlüpfen von kommerziellen Hähnchen.
Tabelle 12. In-Ovo-Vakzinierung mit den angedeuteten Dosen des F+HN-mutanten Stamms und Effekt auf das Überleben kommerzieller Hähnchen nach intramuskulärer Verabreichung von 10⁵ EID₅₀ des Texas GB-Stamms am Tag 43 nach dem Schlüpfen.

1 Durchschnittliche NDV-spezifische Reaktionen von SPF-Hühnern (n=4) nach In-Ovo-Vakzinierung mit 100 EID50 der La Sota HN-Mutante als Funktion des Alters.
2 Durchschnittliche NDV-spezifische Reaktionen von SPF-Hühnern nach In-Ovo-Vakzinierung mit 105 EID50 der La Sota F+HN-Mutante als Funktion des Alters. Für 4- und 7 Tage alte Hühner, n=4, für 14- und 21 Tage alte Hühner, n=3.
3 Durchschnittliche NDV-spezifische Reaktionen von SPF-Hühnern nach In-Ovo-Vakzinierung mit 102 EID50 der La Sota F+HN-Mutante als Funktion des Alters. Für 4- und 7 Tage alte Hühner, n=4, für 14- und 21 Tage alte Hühner, n=3.
4 Durchschnittliche NDV-spezifische Hämagglutinierungsinhibierungsreaktionen nach In-Ovo-Vakzinierung mit der La Sota F+HN-Mutante als Funktion des Alters. Offene Symbole stellen kommerzielle Hähnchen dar, geschlossenen Symbole stellen nicht-vakzinierte SPF-Hühner dar, die im selben Brutkasten hausten. Die Reaktionen der letzteren sind ein Maß für die Ausbreitung des Vakzinvirus.
5 Durchschnittliche NDV-spezifische IgG-Reaktionen kommerzieller Hähnchen nach In-Ovo-Vakzinierung mit der La Sota F+HN-Mutante als Funktion des Alters.
6 Durchschnittliche NDV-spezifische IgM-Reaktionen kommerzieller Hähnchen nach In-Ovo-Vakzinierung mit der La Sota F+HN-Mutante als Funktion des Alters.
Beispiel 1. Zubereitung antikörper-resistenter NDV La Sota Stämme mittels Immunoselektion.
HN und F-antigene variante Viren wurden vom lentogenen La Sota NDV Stamm mittels Immunoselektion erhalten, wie von Meulemans et al. (1987) beschrieben unter Verwendung von MAk 8C11 bzw. 1C3, die gegen diese 2 viralen Glycoproteine gerichtet sind.
Nach Kultur auf embryonalen Hühnerhepatozyten in Anwesenheit eines dieser MAk, wurde der antikörper-resistente Virus auf 9 bis 11 Tage alten Hühner SPF-Embryos vervielfältigt. Diese Prozedur wurde 4 Mal nacheinander wiederholt. Nach jeder Passage wurde die Neutralisation mittels homologen MAk untersucht und zum nicht-behandelten Kontrollvirus zugesetzt.
Tabelle 1 zeigt, dass nach 4 Passagen die HN- und F-mutanten Stämme eine starke Resistenz gegenüber Neutralisation zeigen. Für diese antigenen Varianten unterschied sich der Virustiter nach Neutralisation unter Verwendung der homologen Antikörper annähernd um weniger als 1 log 10 von den unbehandelten Kontrollen. Das letztere Kriterium wurde von Fleming et al. (1986) als Kriterium definiert, um antigene Varianten vom revertiertem Virus zu unterscheiden.
Zusätzlich wurden wie oben beschrieben so genannte Doppelmutanten mittels Immunoselektion hergestellt, unter Verwendung F- und HN-spezifischer MAk 1C3 bzw. 8C11 und ausgehend von den HN- bzw. F-mutanten Stämmen. Diese Stämme wurden bezeichnet als F+HN-Mutante für den Doppelmutantenstamm, der aus dem F-mutanten Stamm mit dem HN-spezifischen MAk 8C11 selektioniert wurde, und wurde als HN+F-Mutante für den Doppelmutantenstamm bezeichnet, der aus dem HN-mutanten Stamm mit dem F-spezifischen MAk 1C3 selektioniert wurde. Tabelle 1 zeigt, dass diese Mutanten als echte variante Viren auf Basis der Neutralisationsergebnisse nach dem Kriterium von Fleming (1986) betrachtet werden können, weil für jede dieser antigenen Varianten der Virustiter nach Neutralisation mittels des homologen MAk sich um weniger als 1 log 10 von der unbehandelten Kontrolle unterschied.
Aus Tabelle 1 kann die Frequenz einer antikörper-resistenten Mutante in der parentalen Viruspopulation aus dem Verhältnis der TCID50-Wert/ml des Virus in Anwesenheit des MAk nach der 1. Passage und dem korrespondierenden TCID50-Wert/ml des Virus ohne MAk bestimmt werden. Die ungefähren Frequenzen der 1C3-resistenten Mutanten im parentalen La Sota Stamm und dem HN-mutanten Stamm sind daher 10^–5 bzw. 10^–6.
Die ungefähren Frequenzen der 8C11-resistenten Mutanten im parentalen La Sota Stamm und im HN-mutanten Stamm sind 10^–3 bzw. 10^–4. Die Auffindefrequenz der Doppelmutanten im parentalen La Sota Stamm wäre daher 10^–9 für sowohl die F+HN- als auch die HN+F-Mutante.
Beispiel 2. CHARAKTERISIERUNG DER NDV LA SOTA MUTANTENSTÄMME.
Die hergestellten La Sota Stämme wurden aufgrund der Inhibierung der Hämagglutinierung durch NDV-spezifische MAk in 2 unabhängigen Experimenten (Tabelle 2 und Tabelle 3) charakterisiert. Für alle getesteten NDV-Stämme wurde die Hämagglutinierung nicht durch MAk, die gegen das F-Protein von NDV gerichtet sind, oder durch den MAk gegen cIFNγ, der als Negativkontrolle fungierte, inhibiert. Ebenso wurde die Hämagglutinierung nicht durch den MAk inhibiert, der spezifisch für das HN-Protein des Ulsterstamms ist. Überraschenderweise inhibierte der MAk 10B12, der spezifisch für das HN-Protein des Hitchner-Stamms ist, die Hämagglutinierung, die durch den F+HN-Stamm induziert wird.
Für die anderen getesteten NDV-Stämme wurde die Hämagglutinierung durch diesen MAk wie erwartet nicht inhibiert.
Die HN-spezifischen MAk8C11, 4D6, 6C6, 7B7 und 12B7 inhibierten die Hämagglutinierung des parentalen La Sota und des F-mutanten Stamms. Der F-mutanten Stamm kann daher in diesem Hämagglutinierungsinhibierungsassay nicht vom parentalen NDV La Sota Stamm unterschieden werden. Für die F+HN- und HN+F-mutanten Stämme inhibierten ferner alle diese HN-spezifischen MAk mit Ausnahme von MAk 8C11, der für diese Selektion verwendet worden war, die Hämagglutinierung. Das deutet an, dass bei diesen Doppelmutanten die Immunoselektion mit 8C11 zum Verlust des 8C11-Epitops führte, während alle anderen Epitope, die untersucht wurden, konserviert blieben. Umgekehrt inhibierten diese HN-spezifischen MAk tatsächlich nicht (8C11, 4D6, 12B7 und 5A1) oder nur schwach (6C6, 7B7 und 7D4) die Hämagglutinierung, die durch die HN-Mutante induziert wurde (Tabelle 3), was andeutet, dass für diese Mutante die Immunoselektion mit 8C11 einen Effekt auf die Anzahl an Epitopen hatte, die das gesamte HN-Molekül umspannen.
Weil der Hämagglutinierungsinhibierungstest nur die Bestimmung der Expression von funktionell aktiven Epitopen auf dem HN-Molekül erlaubt, wurde die Expression NDV-spezifischer Epitope mittels der HN- und F-Moleküle der verschiedenen NDV-Stämme untersucht. Dafür wurde die Bindung von HN- und F-spezifischen MAk an verschiedene gereinigte NDV-Stämme, mit denen ELISA-Platten beschichtet worden waren, mittels indirektem ELISA bestimmt und als Absorption quantifiziert. Im Allgemeinen waren die Absorptionen der F+HN- und der HN+F-Stämme niedriger als die für andere Stämme, was man am wahrscheinlichsten mit einer verringerten Virusmenge erklärt, mit der die Platten beschichtet worden sind.
Wenn man das berücksichtigt, zeigt Tabelle 4, dass die Reaktivität der MAk bei fehlender Immunoselektion unverändert blieb, d. h. in den HN- bzw. F-Proteinen des F- und HN-mutanten Stamms. Die Stämme F, F+HN und HN+F reagieren zu dem identisch mit F-spezifischen MAk: In all diesen Fällen führt die Selektion mit dem MAk 1C3 daher zum Verlust der Epitope, die von 1C3 und 10F2 erkannt werden, während die Epitope, die von 2C1 und 12C4 erkannt werden, anscheinend konserviert sind.
Zwei verschiedene Selektionsarten wurden jedoch für die Selektion von Mutanten mit dem HN-spezifischen MAk 8C11 beobachtet. Auf der einen Seite sind die Reaktivitäten des HN-mutanten Stamms und der parentalen La Sota Stämme mit den HN-spezifischen Antikörpern identisch, was andeutet, dass das HN-, und daher das F-Protein, weitgehend unverändert blieb und dass in diesem Fall die Immunoselektion mit dem HN-spezifischen MAk 8C11 nicht zu einem Verschwinden des Epitops führte, das von 8C11 oder von einem der anderen MAk erkannt wird. Auch die Reaktivität des HN+F-mutanten Stamms mit den HN-spezifischen Antikörpern blieb bei dieser Selektion unverändert. Das war erwartungsgemäß, weil der letztere Stamm vom HN-Stamm abgeleitet ist.
Auf der anderen Seite führte die Selektion der F-Mutante mit 8C11, um die F+HN-Mutante herzustellen, zum Verlust des 8C11-Epitops, wohin gegen die anderen HN-spezifischen Epitope konserviert blieben.
Wenn wir Tabelle 3 und 4 kombinieren, können wir unzweideutig alle mutierten NDV-Stämme charakterisieren. Die HN-Mutante wies alle untersuchten Epitope als konserviert auf, aber die mangelnde Inhibierung der Hämagglutinierung durch mehrere MAk deutet eine möglicherweise defekte Expression und Funktion des HN-Moleküls an. Die F-Mutante ist nur durch eine Mutation im F-Protein gekennzeichnet. Die HN+F-Mutante wies ebenfalls alle untersuchten HN-Epitope als konserviert auf, aber die HI wird nur mit dem MAk 8C11 eliminiert, der für die Selektion verwendet wurde, was andeutet, dass das 8C11-Epitop, obwohl es exprimiert wird, funktionell nicht mehr aktiv ist. Sein F-Protein hat dieselbe Antikörperreaktivität wie die anderen mit den F-spezifischen MAk 1C3 selektionierten Stämme, nämlich dem F- und dem F+HN- mutanten Stamm. Typisch für den F+HN-Stamm ist neben dem mutanten F-Protein, dass er das 8C11 Epitop auf dem HN-Protein strukturell und funktionell verloren hat, wohingegen alle anderen untersuchten Epitope auf diesem Protein konserviert blieben.
Um alle mutierten NDV-Stämme weiter zu untersuchen, wurde die Sequenz der Gene, die ihre HN- und F-Proteine kodieren, wie bei Meulemans et al. (2001) beschrieben, sequenziert.
Tabelle 5 zeigt die nachgewiesenen Mutationen im Vergleich zum parentalen La Sota Stamm. Die Sequenz der HN- und F-Proteine des letzteren war verwandt zu den Sequenzen dieser Proteine, die in der EMBL-Datenbank unter der Zugangsnummer AF077761 (La Sota NDV, komplettes Genom) veröffentlicht sind.
Beispiel 3. Verringerung der pathogenen Wirkung der NDV La Sota Mutantenstämme auf Embryos
Tabelle 6 zeigt, dass der weithin für die Vakzinierung nach dem Schlüpfen verwendete La Sota NDV-Stamm toxisch für Embryos ist und in seiner momentanen Form für die In-Ovo-Verwendung ungeeignet ist. Sogar sehr geringe Dosen des Virus unterdrückten die Fähigkeit zu Schlüpfen stark, während die wenigen geschlüpften Hühner von schlechter Qualität waren, weil sie schwere Atemprobleme aufwiesen.
Tabelle 7 demonstriert, dass die pathogene Wirkung sowohl der HN- als auch der F-Mutante auf Embryos und junge Hühner im Vergleich zum parentalen La Sota Stamm wesentlich verringert war, obwohl die Prozentzahlen der Schlupfrate und das neonatale Überleben in Prozent zwischen den Gruppen tendenziell hohe Variabilität zeigte. Tabelle 6 zeigt, dass die Inokulation letzteren Stamms zu einer Fähigkeit zu Schlüpfen von 24 bis 0 % führte. Vakzinierungsdosen von 100EID₅₀ oder weniger tendierten dazu in Hühnern die mit der HN-Mutante behandelt wurden zu einer ähnlichen Schlupfrate und neonatalem Überleben zu führen wie in scheinbehandelten Hühnern.
In Tabelle 8, Tabelle 9 und Tabelle 10 ist der Einfluss der Inokulierung am ED18 mit verschiedenen Dosen des NDV La Sota F+HN-mutanten Stamms und des HN+F-mutanten Stamms auf die Fähigkeit zu Schlüpfen und neonatales Überleben zusammengefasst. Wie für die F+HN-mutanten Stämme, tendierten die prozentualen Schlupfraten und das neonatale Überleben dazu, eine hohe Variabilität innerhalb der Gruppen zu zeigen. Es kann jedoch geschlussfolgert werden, dass die pathogene Wirkung sowohl der F+HN- als auch der HN+F-Mutanten im Vergleich zum parentalen La Sota Stamm (Tabelle 6) drastisch verringert war. Darüber hinaus war die Schlupfrate und das neonatale Überleben der Hühner, die mit den Doppelmutantenstämmen wurden im Allgemeinen höher als für die, die mit den F- und HN-mutanten Stämmen inokuliert wurden.
BEISPIEL 4. VERABREICHUNG DER MUTANTEN VIREN AN SPF-EMBRYOS INDUZIERT EINE VIRUSSPEZIFISCHE IMMUNREAKTION.
Die In-Ovo-Verabreichung von 100EID₅₀ der La Sota HN-Mutante an SPF-Embryos führt zur Herstellung von NDV-spezifischen IgM und IgG Antikörpern, die die Hämagglutinierung inhibieren (1). Diese Antikörpertiter sind in derselben Größenordnung wie die Titer gleichaltriger Hühnern, die 10⁵ EID₅₀ La Sota beim Schlüpfen mittels Augentropfenvakzinierung erhalten haben (1).
Ebenso führte die In-Ovo-Verabreichung von 10⁵ (2) und 10² EID₅₀ (3) der La Sota F+HN-Mutante an SPF-Embryos zur Herstellung von NDV-spezifischen IgM- und IgG-Antikörpern, die die Hämagglutinierung inhibieren. Die Antikörpertiter im Serum scheinen unabhängig von den getesteten Dosen zu sein, weil ähnliche Kinetiken und IgM-Titer für beide Behandlungen beobachtet werden. Die IgG-Titer scheinen für 10² EID₅₀ sogar höher zu sein als für 10⁵ EID₅₀, aber das sollte wegen der geringen Anzahl an untersuchten Hühnern vorsichtig interpretiert werden (2 + 3).
BEISPIEL 5. EMBRYONALE VERABREICHUNG DER MUTANTEN VIREN INDUZIERT EINE VIRUS-SPEZIFISCHE SCHÜTZENDE IMMUNREAKTION IN ANWESENHEIT VON MATERNALEN ANTIKÖRPERN.
In Übereinstimmung mit Beispiel 3 führte die In-Ovo-Verabreichung der F+HN-Mutante an 18 Tage alte Embryonen von kommerziellen Hähnchen nicht zu einer deutlichen Verringerung der Schlupfrate (Tabelle 11). Ferner zeigten Hühner, die 0, 10² und 10³ EID50 erhielten, keine oder nur eine geringe Mortalität nach dem Schlüpfen. In dem Brutkasten mit den meisten Vögeln starben 6 von 46 Hühnern, die 10⁴ EID50 erhalten hatten, aus unbekannten Gründen. Diese Todesfälle traten später auf, als für eine möglich virus-induzierte Mortalität erwartet (Tag 8, 10, 11, 14, 18, 21 und 36), während keine klinischen Symptome mit Ausnahme von Federrupfen beobachtet wurden.
Man beobachtet eine NDV-spezifische IgM-Reaktion, die im Alter von 14 Tagen ihren Höhepunkt hat, in Hühnern, die am 18. Tag der Embryonalentwicklung mit 10³ und 10⁴ EID₅₀ der F+HN-Mutante vakziniert wurden, aber man beobachtet sie nicht in PBS-behandelten Hühnern und nicht in Hühnern, die 10² EID₅₀ dieser Mutante erhielten (6).
In den erstgenannten Hühnern steigen die NDV-spezifischen IgG und die HI-Titer graduell mit dem Alter an, was Klassenwechsel und eine aktive Produktion von NDV-spezifischem IgG andeutet (5). In der letztgenannten Gruppe sinken die HI-Titer und das NDV-spezifische IgG maternalen Ursprungs graduell ab um eine Hintergrundwert in einem Alter von ungefähr 3 Wochen zu erreichen. Maternale NDV-spezifische Antikörper werden daher nicht durch NDV-spezifische Antikörper, die von den Hühnern selbst hergestellt werden, ersetzt.
HI-Titer (4) und NDV-spezifisches IgM und IgG (nicht gezeigt) fanden sich im Serum von 14- und 21-Tage alten SPF-Hühnern (Sentinels), die in den selben Brutkästen untergebracht waren wie die Hühner, die mit 10³ und 10⁴ EID50 des F+HN-Stamms inokuliert wurden, aber nicht im Serum von 14- und 21 Tage alten SPF-Hühnern (Sentinel) die in den selben Brutkasten wie die Kontrollhühner und die Hühner, die mit 10² EID₅₀ des F+HN-Stamm inokuliert worden waren, untergebracht waren. Das zeigt, dass wenn adäquate Dosen verabreicht werden, das Vakzinvirus in Anwesenheit maternaler Antikörper proliferiert und sich von vakzinierten auf nicht-vakzinierte Hühner ausbreitet.
Die Induktion von NDV-spezifischen Antikörpern korreliert sehr gut mit dem Schutz gegenüber einer Exposition gegenüber dem sehr virulenten Texas GB-Stamm. Tatsächlich waren alle Hühner gegenüber einer intramuskulären Exposition mit 10⁵ EID₅₀ des Texas GB-Stamms in jenen Gruppen (die 10³ oder 10⁴ EID₅₀ erhielten) geschützt, wo virus-spezifische Antikörper im Serum nachgewiesen wurden (Tabelle 12). Im Gegensatz dazu waren alle Hühner tot oder todgeweiht, wenn keine Antikörper vorlagen (Kontrollhühner und Hühner, die 10² EID₅₀ des F+HN erhielten). Eine Zunahme der NDV-spezifischen IgM, IgG und HI-Titer wurde in Hühner beobachtet, die die Exposition überlebten (4, 5 und 6). Tabelle 1

* Der Virustiter des parentalen NDV La Sota Stamms war 1,58 * 1010 EID50/ml.

* Log₂ der geringsten Verdünnung, die Inhibierung der Hämagglutinierung zeigte

* Log₂ der geringsten Verdünnung, die Inhibierung der Hämagglutinierung zeigt

* Die Bindung NDV-spezifischer Antikörper ist als Absorption quantifiziert

a Nummer des Codons beginnend mit dem Startcodon
b Zur Referenz wurden die Sequenzen der HN- und F-Proteine des in unseren Experimenten verwendeten La Sota Stamms verglichen mit Sequenzen der Proteine, die in der EMBL-Datenbank unter der Zugangsnummer AF077761 (La Sota NDV, komplettes Genom) veröffentlicht wurden.

a 4 Vögel wurden an D4 und D8 14/18 (78 %) getötet
b In 2 Fällen schlüpften nur 2 von 7 Hühnern
c In einem Fall (sac) der Dosis 10⁴ und 10² schlüpfte nur 1 Huhn
d In einem Fall (sac) der Dosis 10² schlüpften nur 3 von 7 Hühnern

A In einem Fall (sac) schlüpften nur 2 von 6 Hühnern

A Das überlebende Huhn war wegen einer Lähmung seiner Glieder todgeweiht.

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Claims

Abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota, geeignet für die in-ovo-Vakzinierung von Vogel-Spezies, wobei der Virusstamm eine Mutation aufweist in den Gen-Sequenzen, die für die HN- und/oder F-Glycoproteine des Virus kodieren, was zu einer veränderten Expression dieser Glycoproteine führt, dadurch gekennzeichnet, dass der Virusstamm eine Mutation aufweist, die ausgewählt ist aus: – einer Asp72Glu-Substitution im F-Glycoprotein; – einer Leu160Gln-, einer Leu193Ser- oder einer Leu229Arg-Substitution im HN-Glycoprotein; – einer Asp72Tyr-Substitution des F-Glycoproteins und einer Leu229Arg-Substitution im HN-Glycoprotein.
Abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hämagglutination durch den monoklonalen Antikörper 8C11, der das Glycoprotein HN des Virus der Newcastle-Krankheit spezifisch erkennt, nicht inhibiert wird.
Abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Virusstamm von dem monoklonalen Antikörper 8C11 in einem indirekten ELISA-Assay nicht erkannt wird, wobei der monoklonale Antikörper 8C11 das Glycoprotein HN des Virus der Newcastle-Krankheit spezifisch erkennt.
Abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Virusstamm von den monoklonalen Antikörpern 1C3 oder 10F2 in einem indirekten ELISA-Assay nicht erkannt wird, wobei die monoklonalen Antikörper das Glycoprotein F des Virus der Newcastle-Krankheit spezifisch erkennt.
Abgeschwächtes mutantes Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach Anspruch 1, wobei der Virusstamm ausgewählt ist aus den Stämmen, die als die mutante 1C3+8C11 La Sota am 4. September 2001 unter der Nummer CNCM I-2714 bei der National Collection of Cultures of Microorganisms des Pasteur-Instituts in Paris hinterlegt worden sind.
Vakzine-Zusammensetzung, die eine protektive Immunität gegen die Newcastle-Krankheit vermittelt und das abgeschwächte mutante Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verwendung des abgeschwächten mutanten Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung einer Vakzine für die in ovo-Vakzinierung von Vogel-Spezies gegen die Newcastle-Krankheit.
Verwendung des abgeschwächten mutanten Virus der Newcastle-Krankheit vom Stamm La Sota nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung einer Vakzine für die Vakzinierung gegen die Newcastle-Krankheit nach dem Schlüpfen.