DE69203950T2

DE69203950T2 - Rekombinanter Impfstoff gegen Marek's Krankheit.

Info

Publication number: DE69203950T2
Application number: DE69203950T
Authority: DE
Inventors: Johannes Antonius Jo Claessens; Robin Wilson Morgan; Paulus Jacobus An Sondermeijer
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1992-05-13
Publication date: 1995-12-21
Anticipated expiration: 2012-05-14
Also published as: HUT62330A; GR3017973T3; HU218102B; NZ242707A; HU9201590D0; JPH05227973A; DE69203950D1; EP0513921A2; US6051404A; EP0513921A3; AU1624292A; JP3375347B2; ES2078642T3; AU654186B2; CA2067469C; ZA923041B; ATE126274T1; EP0513921B1; CA2067469A1

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid des Virus der Marek'schen Krankheit codiert, ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst, ein Vektorvirus, das genannte Nukleinsäuresequenz umfasst, eine Wirtszelle, die mit einer solchen Nukleinsäuresequenz transformiert ist, ein Polypeptid des Virus der Marek'schen Krankheit, als auch ein Impfstoff gegen die Marek'sche Krankheit
Die Marek'sche Krankheit (MD) ist ein maligne, lympholiferative Erkrankung von domestiziertem Geflügel, die durch ein Herpesvirus verursacht wird: das Virus der Marek'schen Krankheit (MDV). MD kommt ubiquitär vor, tritt in Geflügel produzierenden Ländern auf der ganzen Welt auf, Hühner, die in intensiven Produktionssystemen aufgezogen werden, werden unweigerlich Verluste durch MD erleiden. MD befällt Hühner im Alter von ungefähr 6 Wochen, tritt am häufigsten im Alter von 12 bis 24 Wochen auf.
Drei Formen von MD werden klinisch erkannt, klassische MD, akute MD und transiente Paralyse.
Die klassische MD ist durch periphere Nervenvergrösserung gekennzeichnet, die durch Infiltration von Lymphe und Demyelinisierung verursacht wird und Paralyse ist das vorherrschende klinische Zeichen. Die Sterblichkeit variiert, ist jedoch normalerweise unter 10 - 15 Prozent.
Bei der akuten Form treten multiple und diffuse lymphomatöse Tumoren in den Eingeweideorganen auf. Die Sterblichkeit an dieser Form der MD ist gewöhnlich höher als von der klassischen Form. Eine Inzidenz von 10 bis 30 Prozent ist in ungeimpften Herden häufig und Ausbrüche, die 70% der Herde einschliessen, können angetroffen werden. Die pathologischen Läsionen sowohl bei der klassischen als auch bei der akuten MD sind im wesentlichen gleich, Proliferation und Infiltration von maligne transfomierten T-Lymphoblasten in normale Gewebe, periphere Nerven im Fall der klassischen Form und Eingeweideorgane im Fall der akuten Form einschliessend.
Darüber hinaus wurde die MD als verantwortlich für Enzephalitis in jungen Hühnern nachgewiesen, die durch plötzliche Paralyse gekennzeichnet ist.
Die serologische Klassifizierung der MD bezogenen Viren ergab drei Serotypen:
Typ I: natürlich auftretende virulente Stämme des Virus der Marek'schen Krankheit, die pathogen und tumorauslösend für Hühner sind und abgeschwächte, nicht pathogene Stämme, die von diesen abstammen;
Typ II: natürlich auftretende, nicht pathogene Stämme des Virus der Marek'schen Krankheit; und
Typ III: Herpesviren von Truthühnern ("HVT"), die für Hühner nicht pathogen sind.
Von Serienpassagen nicht pathogener MDV-Stämme vom Serotyp I wurde festgestellt, dass sie in einem Verlust der Pathogenität und Onkogenität, jedoch nicht der Immunogenität resultierten. Abgeschwächte Stämme, die von HPRS-16 und CVI-988- Stämmen stammen, wurden als Impfstoffe angewendet. Von den MDV-Stämme SB-I und HN-I (Serotyp 2) konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sie für die Impfung nützlich sind. HVT, das zuerst aus Truthähnen isoliert wurde, ist für Truthähne und Hausgeflügel apathogen, ist bezüglich seiner Antigenität mit den MD-Viren vom Serotyp 1 und 2 verwandt und wird in grossem Mass als ein Impfstoff gegen MDV eingesetzt.
Es gibt keine Behandlungsverfahren für MD und die Kontrolle basiert auf Handhabungsverfahren, die heranwachsende Hühner von Infektions- oder Krankheitsquellen isolieren, die Verwendung von genetisch resistentem Bestand und Impfung. Die Handhabungsverfahren sind jedoch normalerweise nicht kostenwirksam und der Fortschritt war hinsichtlich der Auswahl von Geflügelbestand mit erhöhter genetisch kontrollierter Resistenz enttäuschend. Heutzutage basiert die Kontrolle von MD nahezu ausschliesslich auf der Impfung.
Derzeitige Impfstoffe umfassen chemisch inaktivierte Virusimpfstoffe oder modifizierte Lebendvirusimpfstoffe. Inaktivierte Impfstoffe erfordern jedoch zusätzliche Immunisierungen, enthalten nachteiligerweise Adjuvantien, sind teuer herzustellen und aufwendig in der Verabreichung. Darüber hinaus können einige Viruspartikel das Inaktivierungsverfahren überleben und können im Tier nach der Impfung Krankheit hervorrufen.
Im allgemeinen werden abgeschwächte Lebendvirusimpfstoffe bevorzugt, weil sie eine Immunantwort hervorrufen, die häufig sowohl auf humoralen als auch zellulären Reaktionen beruht. Bis heute konnten solche Impfstoffe, die auf MDV-Stämmen vom Serotyp 1 basieren, nur durch Serienpassagen virulenter Stämme in Gewebekulturen hergestellt werden. Jedoch wurden aufgrund dieser Behandlung unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt, die in einer Population von Viruspartikeln resultierten, die bezüglich Virulenz und immunisierenden Eigenschaften heterogen waren. Zu grosse Abschwächung während der Passage in Zellkulturen kann auch ein Problem bei diesen Impfstoffen sein. Man muss ein ausgewogenes Gleichgewicht zwischen der Versicherung, dass der Impfstoff nicht virulent ist und dem Sichergehen, dass er noch schützend ist, erreichen. Ausserdem ist es hinreichend bekannt, dass solche traditionell abgeschwächten Lebendvirusimpfstoffe wieder virulent werden, was in einem Krankheitsausbruch in geimpften Tieren und der möglichen Ausbreitung des Krankheitserregers auf andere Tiere resultiert. Das Auftreten von ausgesprochen virulenten Feldstämmen des MD-Virus, gegen die lebende HVT-Impfstoffe einen schwachen Schutz darstellen, wurde nun berichtet und ist verantwortlich für übermässige Verluste in den verschiedenen Teilen der Welt. Bivalente Impfstoffe bestehen aus Serotyp 2- und Serotyp 3-Stämmen, die in einigen Fällen ganz wirksam gegen ausgesprochen virulente Feldisolate sind. Multivalente Impfstoffe, die Antigene vom Serotyp 1 umfassen, sollten noch wirksamer beim Auslösen von Immunität gegen diese ausgesprochen virulenten Stämme sein.
Verbesserte Impfstoffe können auf rekombinanter DNA-Technologie beruhend hergestellt werden. Diese Impfstoffe würden nur das notwendige und relevante immunogene MDV-Material, das fähig ist, eine schützende Immunantwort gegen die MDV-Krankheitserreger auszulösen oder die genetische Information, die für genanntes Material codiert, enthalten und würde die obengenannten Nachteile der Lebend- oder inaktivierten Impfstoffe nicht besitzen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit einer oder mehreren immunogenen Determinanten des MDV-Proteins MD06 codiert und die eine wie in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäurensequenz oder eine funktionelle Variante davon besitzt, zur Verfügung gestellt, die zur Herstellung eines Impfstoffpräparats zur Immmunisierung von Geflügel gegen MDV- Infektion oder -Krankheit angewendet werden kann.
Das Gen, das für das MD06-Polypeptid codiert, wurde neben der Verbindung der langen einzigartigen Region (UL) und dem internen strukturellen Wiederholungselement (IRL) im MDV-Genom kartiert, und es codiert für ein Polypeptid von einer Länge von 290 Aminosäuren, was einem Molekulargewicht von 32 kDA entspricht.
"Nukleinsäuresequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden jeglicher Länge, sowohl auf Ribonukleinsäuresequenzen als auf Desoxyribonukleinsäuresequenzen. Im Prinzip bezieht sich dieser Ausdruck auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher schliesst dieser Ausdruck Doppel- und Einzelstrang-DNA, als auch doppel- und einzelsträngige RNA und Modifikationen davon ein.
Im allgemeinen bezieht sich der Ausdruck "Polypeptid" auf Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität, bezieht sich nicht auf die spezifische Länge des Produkts und kann, falls erforderlich, in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosilierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung; daher sind unter anderem Peptide, Oligopeptide und Proteine eingeschlossen.
Der Ausdruck "Polypeptid mit einer oder mehreren immunogenen Determinanten eines MDV Proteins" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine oder mehrere Epitope besitzt, die fähig sind, eine Immunantwort in Geflügel gegen MDV-Infektion oder Krankheit hervorzurufen.
Ebenfalls im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, sind Nukleinsäuresequenzen, die für eine funktionelle Variante des in SEQ NO:2 gezeigten Polypeptids codieren. Diese funktionellen Varianten sind Polypeptide, die eine Aminosäurensequenz besitzen, die von der Aminosäuresequenz abstammt, welche speziell in SEQ NO: 2 offenbart ist, jedoch eine oder mehrere immunogene Determinanten des MDV- Proteins behalten, d.h. genannte Varianten besitzen ein oder mehrere Epitope, die fähig sind, eine Immunantwort in Geflügel gegen MDV-Infektion oder -Krankheit auszulösen.
Es ist klar, dass für das spezielle Polypeptid, dem sich hier angenommen wird, das von dem GA-Stamm des Serotyps 1 stammt, natürliche Variationen unter individuellen Viren oder Stämmen des Virus der Marek'schen Krankheit existieren. Diese Variationen können durch (einen) Aminosäurenunterschied(e) in der gesamten Sequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäuresequenz(en) in genannter Sequenz dargestellt werden. Aminosäurensubstitutionen, von welchen erwartet werden kann, das sie die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht wesentlich verändern, wurden beschrieben. Aminosäureaustausch zwischen verwandten Aminosäuren oder Austausche, die häufig während der Evolution aufgetreten sind, sind unter anderen Ser/Ala, Ser/ Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val, siehe Dayhof, M.D., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nat. Biomed Res. Found., Washington, D.C., 1978, Band 5, Suppl. 3). Auf dieser Information basierend haben Lipman und Pearson ein Verfahren zum schnellen und empfindlichen Proteinvergleich (Science 227, 1435-1441, 1985) entwickelt und bestimmen die funktionelle Gleichheit zwischen homologen Polypeptiden. Nukleinsäuresequenzen, die für solche homologen, funktionellen Varianten codieren, sind im Geltungsbereich dieser Erfindung eingeschlossen. Darüberhinaus besteht die Möglichkeit rekombinante DNA-Technolgie zur Herstellung der Nukleinsäurensequenzen, die für diese verschiedenen funktionellen Varianten codieren, anzuwenden.
Nukleinsäurensequenzen gemäss der Erfindung können von Isolaten von MDV-Stämmen wie GA, JM, HPRS-16, Conn A, RB-IB, CVI- 988 oder MD-11 abstammen, wobei der GA-Stamm (Eidson und Schnitte, Avian Diseases 12, 467, 1968) der am meisten bevorzugte Stamm ist.
Ausserdem können Nukleinsäuresequenzen, die für das MD06-Polypeptid oder funktionelle Varianten davon, wie oben beschrieben, codieren, auch von MDV-Stämmem stammen, die dem Serotyp 2 oder dem Serotyp 3 angehören, z.B. HN, HPRS-24, SB- 1 oder FC126.
Die in SEQ ID NO: 1 und 2 zur Verfügung gestellte Information erlaubt dem Fachmann die Nukleinsäuresequenzen zu isolieren und zu identifizieren, die für die obengenannten verschiedenen funktionellen Polypetidvarianten codieren, welche dem speziell hierin offenbarten MD06-MDV-Protein entsprechende immunologische Eigenschaften besitzen. Die allgemein angewendete Southern Blot-Technik oder Koloniehybridisierung kann zu diesem Zweck angewendet werden (Experiments in Molecular Biology, Herausgeber R.J. Slater, Clifton, USA; Singer-Sam J. et al., Proc. Natl. Sci. 80, 802-806, 1983; Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA, 1989). Zum Beispiel werden mit Restriktionsenzymen verdaute DNA-Fragmente, die von einem bestimmten MDV-Stamm stammen, auf einem Gel aufgetrennt und transferiert, oder danach auf ein Stück Nitrocellulosefilter "geblottet". Es ist nun möglich die Nukleinsauresequenzen, die für die funktionellen Polypeptidvarianten codieren, durch Hybridisierung auf dem Filter mit einer definierten markierten DNA oder mit einer "Sonde", die von der in Seq ID NO: 2 gezeigten Aminosäure zurücktranslatiert wurde, zu identifizieren, unter bestimmten Bedingungen von Salzkonzenztration und Temperatur, die die Hybridisierung der Sonde mit jeder auf dem Filter anwesenden homologen DNA-Sequenz erlauben. Nach dem Waschen der Filter wird das hybridisierte Material durch Autradiographie nachgewiesen. Sind die relevanten Sequenzen erst einmal identifiziert, können die DNA- Fragmente, die für eine funktionelle Variante des in SEQ ID NO: 2 offenbarten Polynukleotids codieren, nach einer Agarosegelelektrophorese zurückgewonnen werden.
Auf eine andere Weise kann MDV-cDNA in einen λ-gt11-Phagen, wie von Huynh et al. beschrieben (in: D. Glover (Herausgeber), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press Oxford, 49-78, 1985) kloniert und in einem bakteriellen Wirt exprimiert werden. Screening der rekombinanten Phagen kann dann mit polyklonalem Serum, das gegen das in SEQ ID NO: 2 offenbarte MDV-Protein MD06 hergestellt wurde, durchgeführt werden, die Anwesenheit von entsprechenden immunologischen Regionen des Variantenpolypeptids bestimmend. Das oben genannte Verfahren wird im Beispiel 1 in Einzelheiten dargestellt. Die Herstellung des hierin zu verwendenden polyklonalen Serums, das gegen das MDV-Protein MD06 gerichtet ist, wird unten beschrieben.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung kann von einem speziellen MDV-Stamm isoliert werden und durch rekombinante DNA-Techniken, einschliesslich der Polymerasekettenreaktionstechnologie (PCR) vermehrt werden oder kann chemisch in vitro durch im Stand der Technik bekannte Verfahren synthetisiert werden.
Eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Sequenz mindestens einen Teil der in SEQ ID NO. 1 offenbarten Sequenz enthält.
Es ist im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass die Degeneration des genetischen Codes eine Substitution von Basen in einem Codon erlaubt, was in einem anderen Codon resultiert, das jedoch noch immer für die gleiche Aminosäure codiert, z.B. ist das Codon für die Aminosäure Glutaminsäure sowohl GAT als auch GAA. Folglich ist es klar, dass zur Expression eines Polypeptids mit der in SEQ NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz Gebrauch von einer Variantennukleinsäuresequenz mit einer solchen alternativen Codonzusammensetzung gemacht werden kann, die von der in der SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz verschieden ist.
Darüber hinaus sind auch Fragmente der Nukleinsäuresequenzen die für das speziell offenbarte MDV-Protein MD06 oder funktionelle Varianten davon, wie oben bemerkt, codieren, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die Bezeichnung "Fragment", wie hierin verwendet, bedeuted eine DNA oder eine Aminosäuresäuresequenz, die eine Subsequenz der Nukleinsäuresequenz oder des Polypeptids der Erfindung umfasst. Genanntes Fragment ist oder codiert für ein Polypeptid, das ein oder mehrere immunogene Determinante des MDV-Proteins MD06 besitzt, d.h. es besitzt ein oder mehrere Epitope des MD06-Proteins, die fähig sind, eine Immunantwort in Geflügel auszulösen. Verfahren zur Bestimmung geeigneter Polypeptidfragmente sind unten ausgeführt. Fragmente können unter anderem durch enzymatische Spaltung der Vorläufermoleküle hergestellt werden, unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen für die DNA und Proteasen für die Polypeptide. Andere Verfahren schliessen eine chemische Synthese der Fragmente oder die Expression der Polypeptidfragmente durch DNA- Fragmente ein.
Alle Modifikationen, die in den obengenannten funktionellen Varianten der speziell veranschaulichten Polypeptide resultieren, sind im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange, wie die resultierenden Polypeptide eine oder mehrere immunogene Determinante des MDV-Proteins MD06 behalten.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann mit verschiedenen, eine Replikation bewirkenden DNA-Sequenzen ligiert werden, mit denen sie natürlicherweise nicht assoziiert oder ligiert ist, in einem sogenannten rekombinanten Vektormolekül resultierend, das zur Transformation in einem geeigneten Wirt verwendet werden kann. Geeignete rekombinante Vektormoleküle stammen vorzugsweise, zum Beispiel von Plasmiden, Bakteriophagen, Cosmiden oder Viren ab.
Spezifische Vektoren oder Klonierungsvehikel, die verwendet werden können, um Nukleinsäuresequenzen gemäss der Erfindung zu klonieren, sind im Stand der Technik bekannt und schliessen unter anderem Plasmidvektoren, wie pBR322, die verschiedenen pUC, pGEM und Bluescript-Plasmide, Bakteriophagen, z.B. λgt-Wes-λB, Charon 28 und die von M13 stammenden Phagen oder viralen Vektoren wie SV40, Adenovirus oder Polyomavirus ein (siehe auch Rodriguez, R.L. und D.T. Denhardt, Herausgeber, Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J.A. et al., Arch. Virol. 110, 1-24, 1990). Die zur Konstruktion eines rekombinanten Vektormoleküls gemäss der Erfindung anzuwendenden Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind unter anderem in Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Ausgabe; Cold Spring Harbour Laboratory, 1989) dargestellt.
Zum Beispiel kann die Insertion der Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in einen Klonierungsvektor leicht erzielt werden, wenn sowohl die Gene als auch das gewünschte Klonierungsvehikel mit dem (den) gleichen Restriktionsenzym(en) geschnitten werden, wobei komplementäre DNA-Enden hergestellt werden.
Alternativ kann es notwendig sein, die Restriktionsstellen zu modifizieren, die in stumpfe Enden entweder durch Verdau der Einzelstrang-DNA oder durch Auffüllen der Einzelstrang-Enden mit einer geeigneten DNA-Polymerase verwandelt werden. Anschliessend kann eine Ligation der stumpfen Enden mit einem Enzym wie T4 DNA-Ligase durchgeführt werden.
Falls erwünscht, kann jede Restriktionsstelle durch Ligation von Verbindungsstücken (Linker) an die DNA-Enden hergestellt werden. Solche Linker umfassen spezifische Oligonukleotidsequenzen, die für Sequenzen von Restriktionsstellen codieren. Der mit einem Restriktionsenzym geschnittene Vektor und die Nukleinsäuresequenz können auch durch homopolymeres Tailen (Ligation von gleichen Nukleinsäuren) modifiziert werden.
"Transformation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, irrespektiv des angewendeten Verfahrens, zum Beispiel direkte Aufnahme oder Transduktion. Die heterologen Nukleinsäuresequenzen können durch autonome Replikation erhalten werden oder alternativ in das Wirtsgenom integriert werden. Falls erwünscht, können die rekombinanten Vektormoleküle mit geeigneten Kontrollsequenzen ausgestattet werden, die mit dem bestimmten Wirt kompatibel sind, die die Expression der inserierten Nukleinsäuresequenz regulieren. Ausser Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von multizellulären Organismen abstammen, als Wirte verwendet werden.
Die rekombinanten Vektormoleküle gemäss der Erfindung enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Markeraktivitäten, die zur Selektion der gewünschten Transformanten verwendet werden können, wie zum Beispiel Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in pBR322, Ampicillinresistenz und β-Galactosidaseaktivität in pUC8.
Eine geeignete Wirtszelle ist eine pro- oder eukaryotische Zelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert werden kann, die für ein Polypeptid codiert oder durch ein rekombinantes Vektormolekül, das eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst und die, falls erwünscht, verwendet werden kann, um genanntes Polypeptid, das von genannter Nukleinsäuresequenz codiert wird, zu exprimieren. Die Wirtszelle kann von prokaryotischem Ursprung sein, z.B. Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonas-Spezies; oder von eukaryotischem Ursprung wie Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae oder höheren eukaryotischen Zellen, wie Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen, einschliesslich HeLa-Zellen und Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO). Insektenzellen schliessen die Sf9-Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47-55, 1988) ein. Information hinsichtlich des Klonierens und der Expression der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in eukaryotischen Klonierungssystemen kann in Esser, K. et al. (Plasmids of Eukaryotes, Springer- Verlag, 1986) gefunden werden.
Im allgemeinen werden Prokaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen bei der Konstruktion von Vektoren, die in der Erfindung anwendbar sind, bevorzugt. Zum Beispiel sind E.coli K12 und davon abstammende Stämme, wie DH5α und JM101 besonders geeignet.
Zur Expression werden Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in einen Expressionsvektor eingeführt, d.h. die genannten Sequenzen sind mit den Expressionskontrollsequenzen operabel verbunden. Solche Kontrollsequenzen können Promoter, Verstärker (enhancer), Operatoren, Induktoren, Ribosomenbindungsstellen, usw. umfassen. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Vektormolekül zur Verfügung, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für das MDV-Protein MD06 codiert, welche mit den Expressionskontrollsequenzen operabel verbunden ist, die in der Lage sind, die darin enthaltenen DNA-Sequenzen in (einer) transformierten Wirtszelle(n) zu exprimieren.
Es ist natürlich klar, dass die an der ausgewählten Stelle des Klonierungsvektors inserierten Nukleotidsequenzen Nukleotide enthalten können, die nicht Teil des eigentlichen strukturellen Gens des gewünschten Polypeptids sind oder die nur ein Fragment des vollständigen strukturellen Gens des gewünschten Proteins enthalten, so lange der transformierte Wirt ein Polypeptid produziert, das mindestens eine oder mehr immunogene Determinante des MDV-proteins MD06 herstellt.
Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, schliessen die verwendbaren Expressionskontrollsequenzen zum Beispiel den Trp-Promoter und -Operator (Goedell et al., Nucl. Acids Res. 8, 4057, 1980); den lac-Promoter und Operator (Chang et al., Nature 275, 615, 1978); den Promoter des äusseren Membranproteins (Nakamura K. und Inouge, M, EMBO J. 1- 771-775, 1982); die Bakteriophagen λ-Promoteren und -Operatoren (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688, 1983); den α-Amylase- (B. subtiltis) Promoter und -Operator, Terminationsequenzen und andere Expressionsverstärker- und Kontrollsequenzen, die mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sind, ein. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, schliessen die verwendbaren Expressionskontrollsequenzen z.B. den α-Paarungsfaktor ein. Für Insektenzellen kann der Polyhedrin- oder der p10-Promoter der Baculoviren verwendet werden (Smith, G.E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Wenn die Wirtszelle von einem Säugetier stammt, schliessen die verwendbaren Expressionskontrollsequenzen zum Beispiel den SV40-Promoter (Berman, P.W. et al., Science 222, 524-527, 1983) oder z.B. den Metallthionin- Promoter (Brinster, R.L., Nature 296, 39-42, 1982) oder einen Hitzeschockpromoter (Voellmy et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 4949-53, 1985) ein. Alternativ sind auch in MDV Expressionskontrollsequenzen vorhanden, insbesondere können solche angewendet werden, die die Expression des MD06-Proteins regulieren. Zur Maximierung der Genexpression siehe auch Roberts und Lauer (Methods in Enzymology 68, 473, 1979).
Daher umfasst die Erfindung (eine) Wirtszelle(n), die mit einer Nukleinsäuresequenz oder einem rekombinanten Expressionsvektormolekül wie oben beschrieben, transformiert wurde(n), die fähig ist (sind), das MD06-Protein durch Expression der Nukleinsäuresequenz zu produzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein gereinigtes Polypeptid zur Verfügung, das eine oder mehrere immunogene Determinante eines MDV-Proteins MD06 besitzt, welches eine in SEQ NO. 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine funktionelle Variante davon hat, das im wesentlichen frei von ganzem Virus oder anderen Proteinen ist, mit denen es normalerweise assoziiert ist.
Es ist klar, dass Derivate von genannten Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen die gleichen immunologischen Eigenschaften besitzen, d.h. funktionelle Variante, auch innerhalb des Geltungsbereichs der Erfindung liegen.
Hierin offenbarte funktionelle Variante des MD06-Polypeptids schliessen die in Viren der anderen Stämme vom MD-Serotyp 1 (oder in Viren der Stämme, die zu den Serotypen 2 oder 3 gehören) vorhandenen entsprechenden Polypeptide mit ein. Genannte Äquivalente können durch die Expression der für das genannte Äquivalent codierenden Gene hergestellt werden, wobei die Gene unter Anwendung der hierin zur Verfügung gestellten Information, wie oben beschrieben, identifiziert und isoliert werden.
Ausserdem ist ein Polypeptid, das zur Immunisierung von Geflügel gegen MDV-Infektion oder Krankheit oder zu Diagnosezwecken verwendet werden kann, das im wesentlichen ein immunogenes Fragment des MDV-proteins MD06 umfasst, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Verschiedene Verfahren zum Nachweis solcher geeigneter Polypeptidfragmente in einer Aminosäuresequenz sind bekannt.
Geeignete immunochemisch aktive Fragmente eines Polypeptids gemäss der Erfindung, die (ein) Epitop(e) enthalten, können mittels dem in der Patentanmeldung WO 86/06487, Geysen, H.M. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. et al. (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden, das auf dem sogenannten Pep-Scan-Verfahren basiert, worin eine Serie von teilweise überlappenden Polypeptiden, die Teilsequenzen des vollständigen in Frage stehenden Polypeptids entsprechen, synthetisiert werden und ihre Reaktionsfähigkeit mit Antikörpern untersucht wird.
Ausserdem kann eine Anzahl von Regionen des Polypeptids mit der dargelegten Aminosäuresequenz auf der Basis von theoretischen Betrachtungen und struktureller Übereinstimmung mit bereits bekannten Epitopen als Epitope bestimmt werden. Die Bestimmung dieser Regionen basiert auf einer Kombination der Hydrophilitätskriterien gemäss Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828, 1981) und den Sekundärstrukturaspekten gemäss Chou und Fasman (Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987).
T-Zellepitope, die notwendig sein können, können gleichermassen von theoretischen Gründen mit Hilfe des Berzofsky'schen Amphiphilitätskriterium (Science 235, 1059-62, 1987) abgeleitet werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, die von der obengenannte Nukleinsäuresequenz codiert wird, verwendet.
Immunisierung von Geflügel gegen MDV-Infektion oder -Krankheit kann zum Beispiel durch Verabreichen eines Polypeptids an die Tiere gemäss der Erfindung in einem immunologisch relevanten Kontext als ein sogenannter Untereinheitsimpfstoff erzielt werden. Der Untereinheitsimpfstoff gemäss der Erfindung kann ein Polypeptid in reiner Form umfassen, gegebenenfalls in Anwesenheit eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Das Polypeptid kann gegebenenfalls an ein nicht-verwandtes Polypeptid kovalent gebunden sein, was zum Beispiel bei der Reinigung des Fusionsprodukts von Vorteil sein kann. Beispiele sind β-Galaktosidase, Protein A, Prochymosin, der Blutgerinnungsfaktor Xa, usw.
In einigen Fällen kann die Fähigkeit neutralisierende Antikörper gegen diese Polypeptide zu bilden, an sich sehr niedrig sein. Kleine Fragmente werden vorzugsweise an Trägermoleküle gebunden, um ihre Immunogenität zu erhöhen. Für diesen Zweck geeignete Träger sind Makromoleküle, wie natürliche Proteine (Proteine wie Haemocyanin der Napfschnecke, Albumin, Toxine), synthetische Polymere wie Polyaminosäuren (Polylysin, Polyalanin) oder Micellen amphiphiler Komponente wie Saponine. Alternativ können diese Fragmente als Polymere, vorzugsweise lineare Polymere, zur Verfügung gestellt werden.
Polypeptide, die in solchen Untereinheitsimpfstoffen verwendet werden sollen, können gemäss im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Isolieren genannter Polypeptide aus MDV, durch rekombinante DNA- Techniken oder durch chemische Synthese.
Falls erforderlich, können die in einem Impfstoff zu verwenden Polypeptide gemäss der Erfindung in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosilierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung.
Eine Alternative zu Untereinheitsimpfstoffen sind Lebendvektorimpfstoffe. Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung wird auf solche Weise durch rekombinante DNA-Techniken in einen Mikroorganismus (z.B. ein Bakterium oder Virus) eingeführt, dass der rekombinante Mikroorganismus noch fähig ist sich zu replizieren und dabei ein Polypeptid zu exprimieren, das von der inserierten Nukleinsäuresequenz codiert wird und eine Immunantwort in dem infizierten Wirtstier auszulösen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinantes Vektorvirus, das eine wie oben beschriebene heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, das fähig ist, die DNA-Sequenz in (einer) mit dem rekombinanten Virus infizierten Wirtzelle(n) oder Wirtstier zu replizieren. Die Bezeichnung "heterolog" indiziert, dass die Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in der Natur in dem Vektorvirus normalerweise nicht vorkommt oder in dem gleichen genetischen Kontext wie in dem natürlich vorkommenden Virus nicht vorkommt.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung auch (eine) Wirtszelle(n) oder Zellkultur, die mit dem rekombinanten Vektorvirus infiziert ist, die fähig ist, das MDV-Protein durch Expression der Nukleinsäuresequenz herzustellen.
Das hinreichend bekannte Verfahren der homologen Rekombination in vivo kann angewendet werden, um eine heterologe Nukleinsäuresequenz, z.B.eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in das Genom des Vektorvirus einzuführen.
Zuerst wird ein DNA-Fragment, das einer Insertionsregion des Vektorgenoms entspricht, d.h. eine Region, die zum Einbau von einer heterologen Sequenz verwendet werden kann, ohne wesentliche Funktionen des Vektors, wie solche, die zur Infektion oder Replikation notwendig sind, zu zerstören, in einen Klonierungsvektor gemäss Standard-recDNA-Verfahren, inseriert. Insertionsregionen wurden für eine grosse Zahl von Mikroorganismen beschrieben (z.B. EP 80.806, EP 110.385, EP 83.286, EP 314.569, WO88/02022 und WO88/07088).
Zweitens kann, falls erwünscht, eine Deletion in die Insertionsregion, die in dem rekombinanten, beim ersten Schritt erhaltenen Vektormolekül vorhanden ist, eingeführt werden. Dies kann zum Beispiel durch geeigneten Exonuklease III-Verdau oder Restriktionsenzymbehandlung des rekombinanten Vektormoleküls aus dem ersten Schritt erzielt werden.
Drittens wird die heterologe Nukleinsäuresequenz in die Insertionsregion, die in dem Vektormolekül des ersten Schrittsvorhanden ist oder anstelle der von dem genanntem rekombinanten Vektormolekül deletierten DNA, inseriert. Die DNA-Sequenz der Insertionsregion sollte von geeigneter Länge sein, um zu ermöglichen, das eine homologe Rekombination mit dem Vektorgenom auftreten kann. Danach können geeignete Zellen mit dem Wildtypvektorvirus infiziert werden oder mit genomischer Vektor-DNA in Anwesenheit des rekombinanten Vektormoleküls, das die von geeigneten Vektor-DNA-Sequenzen flankierte Insertion enthält, transformiert werden, wobei eine Rekombination zwischen den korrespondierenden Regionen des rekombinanten Vektormoleküls und dem Vektorgenom auftritt. Rekombinante Vektornachkommen können nun in Zellkulturen produziert werden und können zum Beispiel genotypisch oder phänotypisch selektioniert werden, z.B durch Hybridisierung, Nachweis von Enzymaktivität, die durch ein Gen, das zusammen mit der heterologen Nukleinsäuresequenz kointegriert ist, codiert wird oder durch Nachweis des antigenen heterologen Polypeptids, das immunologisch wirksam von dem rekombinanten Vektor exprimiert wird.
Als nächstes kann dieser rekombinante Mikroorganismus dem Wirtstier zur Immunisierung verabreicht werden, wonach er sich selbst für einige Zeit erhält oder sich sogar in dem Körper des geimpften Tieres repliziert, wobei er in vivo ein Polypeptid exprimiert, das von der inserierten Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung codiert wird, in der Stimulierung des Immunsystems des geimpften Tieres resultierend. Geeignete Vektoren zum Einbau einer Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung können von Viren, wie (aviäre) Pockenviren, z.B. Vaccinia Virus oder Geflügelpockenvirus (EP 314.569 und WO 88/02022), Herpesviren, zum Beispiel Impfstämme von Viren der Marek'schen Krankheit, wie HVT (WO 88/07088) oder MDV- Stämme der Serotypen 1 oder 2, Adenovirus oder Influenzavirus, oder Bakterien, wie E. coli oder bestimmte Salmonella Spezies stammen. Diese Vektoren können auf eine solche Weise gestaltet sein, die eine wirksame Erkennung des Polypeptids durch das Immunsystem des Wirtstieres bewirkt. In diesem Zusammenhang ist die Fusion des genannten Polypeptids mit synthetischen Signal- oder Ankersequenzen oder mit einem Antigen von einem anderen viralen oder bakteriellen Krankheitserreger, z.B. dem Haemagglutinin- Neuraminidaseprotein der Viren der Newcastle'schen Krankheit, denkbar. Es ist auch möglich, dass das genannte immunogene Polypeptid, falls erwünscht als Teil eines grösseren Ganzen, im Innern des zu immunisierenden Tieres frei gegeben wird. In all diesen Fällen ist es auch möglich, dass ein oder mehrere immunogene Produkte zur Expression gelangen, die einen Schutz gegen verschiedenen Krankheitserreger und/oder gegen verschiedene Antigene eines gegebenen Krankheitserregers entstehen lassen.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann durch Züchten von Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Vektorvirus infiziert sind, der eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung umfasst, hergestellt werden, wonach Virus enthaltende Zellen und/oder rekombinante Vektorviren, die in den Zellen gewachsen sind, gesammelt werden können, gegebenenfalls in reiner Form. Eine andere Möglichkeit einen Vektorimpfstoff herzustellen ist der Einbau einer Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in ein infektiöses Bakterium oder Parasiten und ein solches modifiziertes Agens zu züchten. Nach dem Sammeln, gegebenenfalls in reiner Form, kann ein Impfstoff, gegebenenfalls in einer lyophilisierten Form, hergestellt werden.
Wirtszellen, die mit einem rekombinanten Vektormolekül gemäss der Erfindung transformiert wurden, können ebenfalls unter Bedingungen, die für die Expression eines Polypeptids, das von besagter Nukleinsäuresequenz codiert wird, von Vorteil sind, gezüchtet werden. Impfstoffe können unter Verwendung der rohen Kultur, Wirtszelllysaten oder Wirtszellextrakten hergestellt werden, obwohl in einer anderen Ausführungsform mehr gereinigte Polypeptide gemäss der Erfindung zu einem Impfstoff verarbeitet werden, je nach der beabsichtigten Verwendung. Um die hergestellten Polypeptide zu reinigen, werden Wirtszellen mit einem rekombinanten Vektor gemäss der Erfindung in einem angemessenen Volumen gezüchtet und die produzierten Polypeptide werden von solchen Zellen oder aus dem Medium isoliert, falls das Protein ausgeschieden wird.
Polypeptide, die in das Medium ausgeschieden werden, können mittels Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, z.B durch Salzfraktionierung, Zentrifugation, Ultrafiltration, Chromatographie, Gelfiltration oder Immunoaffinitätschromatographie, wohingegen interzelluläre Polypeptide zunächst durch Sammeln der genannten Zellen, Zerstören der Zellen, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung oder durch andere mechanisch zerstörende Mittel wie die Französische Presse isoliert werden können, gefolgt vom Trennen der Polypeptide von anderen interzellulären Komponenten und Herstellen eines Impfstoffes aus den Polypeptiden. Zellzerstörung kann auch durch chemische (z.B EDTA-Behandlung) oder enzymatische Mittel wie Lysozym-Verdau erzielt werden.
Antikörper oder Antiserum, die gegen ein Polypeptid gemäss der Erfindung gerichtet sind, haben eine potentielle Verwendung in der passiven Immuntherapie, diagnostischen Immunassays und der Herstellung von anti-Idiotyp-Antikörpern.
Das wie oben charakterisierte MDV-Protein MD06 kann zur Herstellung von Antikörpern, sowohl polyklonalen, monospezifischen und monoklonalen, verwendet werden. Falls polyklonale Antikörper erwünscht sind, sind Verfahren zur Herstellung und Verarbeitung polyklonaler Seren im Stand der Technik bekannt (z.B. Mayer und Walter, Herausgeber, Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). In Kürze, einem ausgewählten Säugetier, z.B. einem Hasen werden (multiple) Injektionen mit obengenanntem Immunogen verabreicht, ungefähr 20 ug bis ungefähr 80 ug Protein pro Immunisierung. Eine Immunisierung ist mit einem annehmbaren Adjuvans gegeben, im allgemeinen mit gleichen Volumen an Immunogen und Adjuvans. Annehmbare Adjuvantien schliessen Freund'sches vollständiges, Freund'sches unvollständiges, Alaunpräzipitat oder Wasser-in-Öl-Emulsionen ein, wobei Freund'sches volständiges Adjuvans für die initiale Immunisierung bevorzugt wird. Freund'sches unvollständiges Adjuvans wird für alle Booster-Immunisierungen bevorzugt. Die initiale Immunisierung besteht aus der Verabreichung von 1 ml einer Emulsion an multiplen subcutanen Stellen des Hasenrückens. Booster-Immunisierungen, die ein gleiches Volumen an Immunogen verwenden, werden in Intervallen von ungefähr einem Monat gegeben und werden fortgesetzt bis angemessene Spiegel an Antikörpern in einem individuellen Hasenserum vorhanden sind. Das Blut wird gesammelt und Serum wird mittels dem Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert.
Monospezifische Antikörper gegen das Immunogen werden von polyspezifischen Antiseren durch eine Modifikation des Verfahrens von Hall et al., (Nature 311, 379-387, 1984) affinitätsgereinigt, hergestellt wie oben beschrieben durch Immunisieren von Hasen mit dem gereinigten Protein. Monospezifische Antikörper, wie hierin verwendet, wird als einzelne Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für das relevante Antigen definiert. Homogenes Binden, wie hierin verwendet, bezieht sicht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden.
Monoklonale Antikörper, die gegen das MDV-Immunogen MD06 reaktionsfähig sind, können durch Immunisierung von Inzuchtmäusen, vorzugsweise Balb/c, mit dem geeigeten Protein hergestellt werden. Die Mäuse werden intraperitoneal mit ungefähr 100 ng bis ungefähr 10 ug Immunogen pro 0,5 ml Dosis in einem gleichen Volumen eines annehmbaren Adjuvans immunisiert. Solche annehmbaren Adjuvantien schliessen Freund'sches vollständiges, Freund'sches unvollständiges, Alaunpräzipitat und Wasser-in-Öl-Emulsionen ein. Den Mäusen werden intravenöse Booster-Immunisierungen ohne Adjuvans ungefähr 14, 21 und 63 Tagen nach der ersten Immunisierung verabreicht. Ungefähr am Tag drei nach der letzten Booster-Immunisierung werden einzelne Mäuse serologisch auf anti-Immunogen-Antikörper getestet. Milzzellen von Antikörper-produzierenden Mäusen werden isoliert und mit murinen Mäusemyelomazellen, wie SP-2/0 oder ähnlichen, gemäss im Stand der Technik bekannten Verfahren fusioniert (Kohler und Milstein, Nature 256; 495-497, 1975). Hybridoma-Zellen werden durch Wachstum in Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin in einem geeigneten Zellkulturmedium, wie Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) selektioniert. Antikörper-produzierende Hybridomas werden kloniert, vorzugsweise unter Anwendung des Weichagarverfahrens von Macpherson (Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Herausgeber, Academic Press, 276, 1973). Diskrete Kolonien werden in individuelle Vertiefungen von Kulturplatten zur Züchtung in einem geeigneten Kulturmedium überführt. Antikörper-produzierende Zellen werden durch Screening mit dem geeigneten Immunogen identifiziert. Immunogen-positive Hybridomazellen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten. Spezifische anti-monoklonale Antikörper werden durch Züchten der Hybridomas in vitro oder Herstellung von Ascites-Flüssigkeit in Mäusen, einer Hybridoma-Injektion durch im Stand der Technik bekannten Verfahren folgend, hergestellt.
Anti-Idiotyp-Antikörper sind Immunglobuline, die ein "inneres Bild" des Antigens des Krankheitserregers, gegen den Schutz erwünscht ist, tragen und können als ein Immunogen in einem Impfstoff verwendet werden (Dreesman et al., J. Infect. Disease 151, 761, 1985). Verfahren zum Züchten von anti-Idiotyp-Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (MacNamara et al., Science 226, 1325, 1984).
Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann in einem konventionellen aktiven Immunisierungsschema verabreicht werden: einzelne oder wiederholte Verabreichungen auf eine Art, die mit der Dosisformel kompatibel ist und in solch einer Menge, wie es prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam und immunogen sein wird, d.h. die Menge des immunisierenden Antigens oder rekombinanten Mikroorganismus, der fähig ist genanntes Antigen zu exprimieren, das Immunität gegen einen Challenge durch ein virulentes MDV in einem Tier induziert. Immunität ist als die Induktion eines grösseren Ausmass an Schutz in einer Population von Tieren nach der Impfung im Vergleich mit einer ungeimpften Gruppe definiert.
Für lebende virale Vektorimpfstoffe kann die Dosisrate pro Tier zwischen 1 x 10² - 1 x 10&sup6; Injektionseinheiten betragen.
Ein typischer Untereinheitsimpfstoff gemäss der Erfindung umfasst 10 ug - 1 mg des Polypeptids gemäss der Erfindung.
Die Verabrreichung des Impfstoffs kann z.B. intradermal, subcutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, oral oder intranasal erfolgen.
Ausserdem kann der Impfstoff auch ein wässriges Medium oder eine Wasser enthaltende Suspension enthalten, die oft mit anderen Bestandteilen gemischt ist, z.B. um die Aktivität und/oder Lagerungsfähigkeit zu erhöhen. Diese Bestandteile können Salze, ph-Puffer, Stabilisatoren (wie Magermilch oder Caseinhydrolysat), Emulgatoradjuvantien zur Verbesserung der Immunantwort (z.B Öle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydoxid, Saponin, Polyanionen und amphipatische Substanzen) und Konservierungsstoffe sein.
Es ist klar, dass ein Impfstoff gemäss der Erfindung auch Immunogene enthalten kann, die sich auf andere Krankheitserreger von Geflügel beziehen oder Nukleinsäuresequenzen enthalte, die für dieses Immunogen codieren, wie Antigene vom Virus der Infektiösen Bronchitis (IBV), Viren der Newcastle'schen Krankheit (NDV), Viren der Infektiösen bursalen Krankheit (IBDV) oder Viren der Marek'schen Krankheit, die verschieden von den hier offenbarten sind, um einen multivalenten Impfstoff herzustellen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein "immunochemisches Reagens", wobei dieses Reagens ein Polypeptid gemäss der Erfindung umfasst.
Die Bezeichnung "immunochemisches Reagens" zeigt an, dass das Polypeptid gemäss der Erfindung an einen geeigneten Träger gebunden ist oder mit einer markierenden Substanz ausgestattet ist.
Die Träger, die verwendet werden können, sind zum Beispiel die innere Wand einer Mikrotestvertiefung oder einer Küvette, eines Reagenzglas oder einer Kapillare, Teststreifen oder die Oberfläche von einem Partikel wie zum Beispiel ein Latexpartikel, ein Erythrozyt, ein Farbsol, ein Metallsol oder Metallkomponente als Solpartikel.
Markierende Substanzen, die verwendet werden können sind unter anderem ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Komponente, ein Enzym, ein Farbsol, Metallsol oder Metallverbindung als Solpartikel.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung kann auch verwendet werden um spezifische Sonden für Hybridisierungsexperimente zum Nachweis von MDV-verwandten Nukleinsäuren in jeder Gewebeart zu entwerfen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Testgarnitur zur Verfügung, die die genannte, für die Diagnose einer MDV- Infektion oder Krankheit verwendbare Nukleinsäuresequenz umfassend.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine in einem Immunassay zu verwendende Testgarnitur, wobei diese Testgarnitur mindestens ein immunochemisches Reagens gemäss der Erfindung enthält.
Die immunochemische Reaktion, die bei Verwendung dieser Testgarnitur stattfindet, ist vorzugsweise eine Sandwich-Reaktion, eine Agglutinationreaktion, eine Kompetitionsreaktion oder eine Inhibitionsreaktion.
Zur Ausführung einer Sandwich-Reaktion kann die Testgarnitur zum Beispiel aus einem an einen festen Träger gebundenen Polypeptid gemäss der Erfindung, zum Beispiel der inneren Wand einer Mikrotestplattenvertiefung und entweder einem markierten Polypeptid gemäss der Erfindung oder einem markierten anti-Antikörper bestehen.

Beispiel 1

Screening von bakeriellen Expressionsbibliotheken mit rekonvaleszentem Hühnerserum

Die für die Erstellung der Genbibliothek verwendeten Vektoren waren λgt11 (Young, R.A. und Davis, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1194-1198, 1983) und λEMBL-3. Das Genom des λgt11- Expressionsvektors enthält ein funktionelles LacZ-Gen, das für das Enzym β-Galaktosidase mit einer einzigartigen EcoRI- Restriktionsstelle nahe dem Carboxylterminus codiert. Insertionen von DNA-Fragmenten des MDV-Genoms an dieser Stelle resultieren potentiell in der Expression eines Proteins, das aus einem MDV-spezifischen, mit einem grösseren Teil des β- Galaktosidasegens fusionierten Polypeptid besteht. Genbibliotheken, die einen komplexen Bereich an DNA-Fragmenten repräsentieren, können mit hoher Dichte auf rekombinante Klone hin untersucht werden, die ein Fusionsprotein produzieren, das von einem Antikörpermarker wie dem Serum von infizierten Vögeln erkannt wird.
Eine Genbibliothek, die das Genom des MDV-Stamms GA repräsentiert, besteht aus 100 unabhängigen λEMBL-3-Rekombinanten, die eine Insertion der durchschnittlichen Grösse von 18 kBP enthalten. Diese Rekombinanten werden durch Hybridisierung einer Phagenbibliothek, die den gesamten DNA-Inhalt von mit dem MDV-Stamm GA infizierten Hühnerembryofibroblasten (CEF) darstellt, mit einer Sonde selektioniert, die aus einem Pool von BamHI-Plasmidklonen besteht, die MDV-spezifische Sequenzen enthalten (Fukuchi et al., J. Virol. 51, 102, 1984). DNA von der vermehrten GA-spezifischen EMBL-3-Bibliothek wurde durch teilweisen Verdau mit einer Mischung der Restriktionsenzyme AluI, RsaI und HaeIII fragmentiert. Fragmente mit einer Grösse zwischen 0,5 und 4,4 KB wurden isoliert, mit dG- Resten verlängert und mittels eines synthetischen Adaptors in die einzigartige EcoRI-Stelle des λgt10-Vektors inseriert (Le Bouc et al., FEBS Lett 196, 108, 1986; Huynh et al., in: Cloning Techniques, A Practical Approach, Herausgeber Glover, D., 49-78, 1985), in einer Genbibliothek mit einer effektiven Grösse von 4 x 10&sup4; PbE resultierend. Die Phagen wurden vermehrt und über CsCl-Gradienten gereinigt, die DNA wurde extrahiert und die Insertionen durch Verdau mit EcoRI erhalten. Schliesslich wurden diese Insertionen in die EcoRI-Stelle des λgt11-Vektors ligiert und auf rekombinante Phagen mit Hühnerserum gegen MDV untersucht.
Dieses rekonvaleszente Serum wurde durch Infizieren von Weissen Leghorn mit Einzelkamm (SPAFAS) mit einer virulenten Passage des von Dr. Calnek (Cornell University, NY, USA) erhaltenen GA-Stamms erhalten. Das Serum wurde über einen Zeitraum von 12 Wochen gesammelt und die Proben wurden einzeln durch indirekte Fluoreszenz auf Binden an MDV-Plaques in Gewebekulturen aus Hühnerembryofibroblasten (CEF) getestet.
Sechs der Seren wurden auf Titer und Spezifität basierend ausgewählt. Eine Mischung dieser Proben wurde in einer 1:100- Verdünnung verwendet, um ein Screening der λgt11-Genbibliothek auf Nitrocellulosefilter gemäss Young, R.A. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5283, 1985) durchzuführen. Der zweite Antikörper zur Inkubation der Filter war eine alkalische Phophatase, die mit einem Hasen-anti-Huhn-Serum (Sigma, St. Louis, USA) konjugiert war und positive Signale wurden durch die Nitroblau-tetrazol/5-Brom-4-chlor-3-indolyl- phosphat-Farbreaktion entwickelt (McGadey, Histochemie 23, 180, 1970). Serien von Kandidaten wurden selektioniert und Rekombinante wurden bis zur Homogenität plaquegereinigt.
Eine Hauptgruppe unter diesen λgt11-Kandidaten enthielten inserierte Sequenzen mit starken, auf Kreuzhybridisierungsexperimenten basierenden Ähnlichkeiten. Einer von diesen wurde selektioniert und die DNA-Insertion von ungefähr 500 BP wurde in pGEM3Z (Promega, Madison, USA) transferiert, in dem Plasmid pMD06 resultierend.

Beispiel 2

Klonierung und strukturelle Analyse des für das MD06-Antigen codierenden Gens.

Screening der früher erstellten, für den MDV-Stamm GA spezifischen Genbibliothek wurde auf Replikafilter unter Verwendung der markierten Insertion von pMDO6 als Sonde durchgeführt. Positive Signale wurden selektioniert, plaquegereinigt und die DNA wurde aus amplifizierten Phagenpräparationen extrahiert. Einer dieser Kandidaten, als λGA08 bezeichnet, wurde durch Restriktionskartierung und Southern Blot-Hybridisierung unter Verwendung der markierten Insertion von pMD06 als Sonde analysiert. Starke Hybridisierung wurde mit einem 5.0 KB grossen SalI-Fragment erhalten, das in der 17 KB grossen Insertion von λGA08 enthalten war. Subklonierung von diesem speziellen Fragment in pGEM3Z resultierte in pMD11, dessen Restriktionskarte in Figur 1 gezeigt ist. Relevante Fragmente von pMD11 wurden durch Subklonierung zweier Pst- Fragmente von 3,3 und 0,9 KB in pGEM5Z erhalten, in pMD23 beziehungsweise pMD24 resultierend. Nukleotidsequenzanalyse wurde in dem Bereich des 0,9 KB grossen EcoRI-Fragments, das in Figur 1 gezeigt ist, durchgeführt.
Beide Stränge wurden auf fortschreitend deletierten Subklonen basierend analysiert, die durch ExonukleaseIII-Behandlung entweder des Plasmid pMD11 oder pMD23 wie von Henikoff (Gene 28, 357, 1984) beschrieben, hergestellt wurden. Alle Reaktionen wurden mit doppelsträngigen DNA-Präparationen unter Verwendung einer T7-Polymerase-Sequenzierungsgarnitur (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) durchgeführt. Lesen der Gele wurde unter Verwendung des "Shotgun Handler" von einer Gene-Master- Arbeitsstation (Biorad, Richmond, CA) durchgeführt. Das Ergebnis dieser Analyse ist in der SEQ ID: 1 gezeigt und offenbart einen offenen Leserahmen von ungefähr 830 Nukleotiden, die im wesentlichen für das MD06-Antigen von ungefähr 290 Aminosäuren codieren, deren primärstruktur in SEQ ID: 2 gezeigt ist.

Beispiel 3

Expression des Antigen MD06 als ein Fusionspolypeptid mit dem Haemagglutinin-Neuraminidase (HN)-Protein des Virus der Newcastle'schen Krankheit (NDV) unter Verwendung des Truthahnherpesvirus (HVT) als lebender viraler Vektor.

Die Expression des Antigens in einem Vektororganismus kann man sich so vorstellen, dass Aussetzung auf der Zelloberfläche die Effizienz erhöht, mit der das Immunsystem des Wirts die relevanten antigenen Epitope erkennt. Ein Beispiel für ein solches Trägerprotein ist das HN von NDV. Das für dieses Protein codierende Gen kann in das Genom eines aviären viralen Vektors, z.B. HVT, auf solche Weise inseriert werden, dass HN nach der Infektion einer Zelle mit dem rekombinanten Virus effizient synthetisiert wird. Das DNA-Fragment, das für einen substantiellen Teil von MD06 codiert, wird anschliessend in einer geeigneten Position innerhalb der für HN codierenden Region integriert, so dass die richtige Orientierung und der Leserahmen berücksichtigt werden. Das Fusionspolypeptid wird nun durch die infizierte Zelle synthetisiert und kann an die äussere Oberfläche dirigiert werden und korrekt in der Plasmamembran mittels der aminoterminalen Sequenz von HN verankert werden.

A. Vektor-Plasmid, den Einbau von Genen in das HVT-Genom vermittelnd

Auf der wie von Igarashi, T. et al., (Virology 157, 351, 1987) publizierten Genomstruktur von HVT basierend, wurde eine Region in dem einzigartigen kurzen Sequenzelement (US) des Virus für die Insertion von Fremdgenen ausgewählt. Das entsprechende DNA-Fragment wurde durch Screening einer λEMBL3-Genbibliothek erhalten, die durch teilweisen Verdau der Gesamt-DNA von HVT-infizierten CEF erhalten wurde. Die Insertion eines der λ-Isolate, das durch die Abwesenheit jeglicher BamHI-Restriktionsstellen gekennzeichnet ist, wurde als λHVT04 bezeichnet. Die in dem 17,5 KB grossen inserierten Fragment vorhandene Sequenz, stellte einen grossen Teil der US-Region dar, einschliesslich eines Teils der umgekehrten Wiederholungsstruktur (inverted repeat structure) (Igarashi, T. et al., 1987, ibd.). Eines der 1,2 KB gossen XhoI-Restriktionsfragmente von λHVT04 wurde in pGEM3Z subkloniert, das mit SalI verdaut wurde, in dem Plasmid pMD07 resultierend, das eine einzigartige BglII-Stelle enthielt, die für die Insertion von DNA-Fragmenten zur Verfügung stand (Figur 2). Ein starker Promoter, der die Expression von Fremdgenen nach ihrer Insertion in das Genom des HVT-Virus lenken konnte, wurde von der LTR-Sequenz des Rous-Sarcoma-Virus (RSV) gewählt. Der Promotor wurde auf einem 580 BP langen Nde/HindIII-Restriktionsfragment von pRSVcat kartiert (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777, 1982) und wurde zwischen die HindIII- und PstI-Stellen von pGEM3Z (Promega) mittels doppelsträngiger synthetischer Verbindungsstücke auf beiden Seiten des Fragments inseriert. Die Verbindung zwischen der HindIII-Stelle des Vektors pGEM3Z und der NdeI-Stelle des RSV-Fragments, die den LTR-Promoter trägt, wurde mit einem 30 BP langen Verbindungsstück hergestellt, das kohäsive, mit HindIII auf der einen Seite und NdeI auf der anderen Seite, kompatible Enden enthielt. Nach der Ligation werden jedoch beide Restriktionsstellen aufgrund von beabsichtigten Modifizierungen in den äusseren Nukleotiden der sechs Basenpaare langen Erkennungssequenz nicht wieder hergestellt. Zusätzlich zu der Entfernung dieser beiden Stellen, wurde eine neue Restriktionsstelle (BamHI) an der entsprechenden Position geschaffen, die innerhalb des Verbindungsstücks selbst vorhanden ist. Ein zweites 20 BP langes Verbindungsstück wurde synthetisiert, dass die HindIII-Stelle des LTR-Fragments mit der PstI-Stelle von pGEM3Z verband, in diesem Fall ohne Zerstörung der Erkennungssequenz an beiden Enden und Zufügen von den drei zweckmässigen, einzigartigen Restriktionsstellen BglII, XhoI und EcoRV zu den bereits in dem Polylinker von pGEM3Z vorhandenen, z.B. PstI, SalI, XhoI und BamHI. Das resultierende Derivat von pGEM3Z, als pVEC01 bezeichnet, enthält daher ein 650 BP langes Restriktionsfragment, das die LTR-Promotersequenz unmittelbar gefolgt von sieben Restriktionsstellen trägt, welche für die Insertion von Fremdgenen zur Verfügung stehen. Das 650 BP lange Fragment wird auf jeder Seite von einer BamHI-Restriktionsstelle flankiert und ist als solches in die einzigartige BGlII-Stelle übertragen worden, die in der 1,2 KB grossen HVT-Insertion von pMD07 vorhanden ist. Die kohäsiven Enden, die von diesen beiden Restriktionsenzymen gebildet werden, sind kompatibel, jedoch stellt die Ligation keine der ursprünglichen Erkennungssequenzen für BGlII oder BamHI wieder her. Eines der resultierenden Konstrukte, das die LTR in Richtung der TRs trägt, wurde als pVEC04 bezeichnet und durch Restriktionskartierung geprüft (Figur 3). Die Struktur dieses universellen HVT-Rekombinationsvektors erlaubt die Insertion von Fremdgenen unmittelbar stromabwärts des LTR-Promoters und anschliessenden Einbau der vollständigen Expressionskassette in das HVT-Genom durch in vivo-Rekombination. Die Position der verschiedenen Restriktionsstellen stromabwärts der LTR, insbesondere diejenigen für die Enzyme BglII, XhoI und EcoRV sind auf solche Weise entworfen, dass selbst eine multiple Geninsertion vorstellbar ist.

B. Insertion der HN-Gene von MDV in pVEC04

Das für HN codierende Gen wurde von einer cDNA-Genbibliothek des NDV-Stammes Clone 30 (Intervet Int., Holland) isoliert. Genomische RNA wurde von Virus hergestellt, das in embryonierten Hühnereiern gezogen wurde und Erststrang-DNA-Synthese wurde mit Reverser Transkriptase unter Verwendung eines willkürlichen 10-Basen- Oligomers zum Primen (Starten) der Reaktion durchgeführt. Die von BamHI-Restriktionsstellen flankierte und für das vollständige HN-Protein codierende DNA wurde in pGEM4Z (Promega, Madison, USA) kloniert und das resultierende Plasmid wurde als pNDV03 bezeichnet. Anschliessende Übertragung des 2,1 KB grossen BamHI-Fragments in die BglII-Stelle des Rekombinationsvektors pVEC04 resultierte in pVEC05. Die korrekte Orientierung des inserierten Gens im Verhältnis zu dem LTR-Promoter wurde durch Restriktionsanalyse auf der physikalischen, wie in Figur 4 gezeigten Karte überprüft.

C. Bildung einer Fusion zwischen den Genen, die für das MDV-Antigen MD06 und das HN von NDV codieren

Untersuchung der Sequenz der codierenden Region von HN zeigt, dass das GAA-Codon der EcoRI-Restriktionsstelle, die in dem 3'-terminalen Teil des Gens vorhanden ist, das gleiche Leseraster aufweist, wie das zweite Codon des Gens, das für MD06 wie in SEQ ID: 1 gezeigt, codiert. Der korrekt orientierte Einbau eines 0,9 KB grossen EcoRI-Fragments, das von pMD11 oder pMD23 stammt, in der relevanten EcoRI-Restriktionsstelle in pNDV05, resultiert in der Synthese eines Polypeptids, das beinahe das gesamte HN-Protein mit dem vollständigen MD06-Antigen fusioniert umfasst. Diese besondere, von pNDV05 stammende Plasmidkonstruktion wird als pNDV10 bezeichnet und die Restriktionskarte ist in Figur 5 dargestellt. Zusätzlicher Einbau eines Markergens kann sich an der EcoRV-Stelle vorgestellt werden, die am 3'-Ende des für das Fusionspolypeptid codierenden Gens vorhanden ist. Die Anwesenheit eines Markergens, wie das LacZ-Gen von E.coli, vereinfacht den Nachweis von rekombinantem HVT-Virus, das sowohl β-Galactosidaseaktivität als auch das Fusionspolypeptid von Interesse exprimiert.

D. Insertion von Genen in das HVT-Genom

DNA des Plasmids pNDV10 wird zusammen mit der von HVT- infizierten Zellen hergestellten Gesamt-DNA in CEF eingeführt, mittels eines Verfahrens, das auf der Calcium- Phosphat-DNA-Fällung gemäss Graham und v.d. Eb (Virology 52, 456, 1973) basiert, mit Modifikationen, die von Morgan et al. (Avian Diseases 34, 345, 1990) beschrieben wurden. Zwei Mikrogramm Plasmid-DNA der Konstrukte werden mit 15 ug DNA von HVT-infizierten Zellen in einem Endvolumen von 560 ul H&sub2;O gemischt und zu 750 ul HBSP (20 mM KCl, 560 mM NaCL, 24 mM Glukose, 3 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 100 mM HEPES, pH 7,0) gegeben. Präzipitate werden durch allmähliches Zugeben von 190 ul 1 M CaCl&sub2;-Lösung und 30-minütigem Inkubieren der Mischungen bei Raumtemperatur gebildet. In der Zwischenzeit werden 15 ml einer Suspension aus sekundären CEF von 10 Tage alten Embryonen in 6/B8-Medium, dessen Zusammensetzung auf Glasgow's Modifizierung von Eagle's Minimal Essential Medium basiert, das mit 2% foetalem Kälberserum supplementiert ist, in 80 cm²-Schalen in einer Dichte von 5 x 10&sup5; Zellen pro ml ausgesät. Calcium-Phosphatpräzipitierte DNA wird vorsichtig zu der Zellsuspension gegeben und die Schalen werden bei 37ºC in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2; in der Luft inkubiert. Nach 5 Stunden wird das Medium entfernt und 10 ml einer Lösung, die gleiche Volumen an HBSP und 30% Glycerin enthält, auf die Zellen geschichtet. Nach ein bis zwei Minuten Inkubation wird die Lösung entfernt, die Zellen mit dem Medium 6/B8 gewaschen und die Schalen mit frischem Medium 3 bis 5 Tage inkubiert, bis sich ein viraler CPE bildet. Nachweis von HVT-Rekombinanten, die das an das HN von NDV fusionierte MD06-Antigen exprimieren, wird durch Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, unter Verwendung von mono- oder polyvalenten Seren gegen die MDV-Antigene oder das HN-Protein von NDV.

Beispiel 4

Expression des nativen MD06-Antigens in HVT

Expression des Antigens MD06 als nicht-fusioniertes Polypeptid wird durch Einbau des vollständigen Gens von SEQ ID: 1 einschliesslich 5' nicht-translatierter Sequenzen stromabwärts des wie in Plasmid pVEC04 vorhandenen LTR-Promoters (beschrieben in Figur 3 und und Beispiel 3, Abschnitt A) und anschliessender Insertion in die Expressionskassette via in vivo-Rekombination in das Genom des HVT-Vektorvirus erzielt. Zu diesem Zweck wurde das Gen auf einem von pMD23 stammenden DNA-Fragment (siehe Beispiel 2) durch PCR-Amplifikation mit synthetischen Startermolekülen (primer), die 60 BP stromaufwärts des ATG-Initiators und 40 BP stromabwärts des TAA-Terminators (SEQ ID: 1) liegen, isoliert. Die Anwesenheit der neu geschaffenen GGATCC-Sequenz in beiden Primern ermöglicht die Isolierung eines 1,0 KB grossen BamHI-Restriktionsfragments, das in die BamHI-Stelle des Plasmids pGEM3Z subkloniert wurde, in pMD56 resultierend. Nach Bestätigung der korrekten Sequenzstruktur der Insertion, wurde das Fragment durch Verdau mit BamHI rückisoliert und anschliessend in die BGlII-Restriktionsstelle von pVEC04 inseriert, dabei in pMD58 resultierend (Figur 6). Die folgenden Schritte zur Integration in das HVT-Genom des für ein natives MD06-Antigen unter Kontrolle des LTR-Promoters codierenden Gens, wurde wie in Beispiel 3, Abschnitt D beschrieben, durchgeführt. Rekombinantes, das MD06-Antigen exprimierende HVT-Virus wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung infizierter CEF nachgewiesen, polyvalente Seren verwendend, die spezifisch gegen in E.coli exprimierte MD06-Fragmente gezüchtet wurden. Rekombinante wurden bis zur Homogenität durch limitierende Verdünnungsverfahren und wiederholte Einzelplaqueisolierung gereinigt.

Legenden

Figur 1

Restriktionsenzymkarte von pMD11 mit der Position des 0,9 KB grossen EcoRI-Fragments. Dieses Fragment zeigte starke Hybridisierung mit der Insertion von pMD06.

Figur 2

Restriktionsenzymkarte eines DNA-Fragments, das im wesentlichen der US-Region des HVT-Genoms entspricht. Die relative Position der aus vier offenen Leserastern und dazwischenliegenden nicht-codierenden Sequenzen bestehenden Insertionsregion ist angezeigt.

Figur 3

Restriktionsenzymkarte von pVEC04, die den LTR-Promoter zeigt, der in die einzigartige BglII-Stelle des 1,2 KB grossen Xho-HVT-Fragments von pMD07 inseriert ist.

Figur 4

Restriktionskarte von pNDV05. Das Plasmid enthält das HN-Gen von NDV, das von BamHI-Stellen flankiert, in die BglII-Stelle von pVEC04 inseriert ist (siehe Figur 3).

Figur 5

Restriktionskarte von pNDV10. Das Plasmid stammt von pNDV05 durch Einbauen eines 0,9 KB grossen EcoRI-Fragments, welches im wesentlichen für das MD06-Polypeptid an der EcoRI-Stelle codiert, die sich bei ungefähr 3200 Basen von pNDV05 befindet (siehe Figur 4).

Figur 6

Restriktionskarte von pMD58. Das Plasmid stammt von pVEC04 durch Einbau des vollständigen, für das Antigen MD06 codierenden Gens und Einschliessen von nicht-translatierten, flankierenden Sequenzen. Das Gen, das sich auf einem 1,0 KB grossen BamHI-Fragment befindet, wurde aus pMD23 (siehe Figur 1) durch PCR-Amplifikation isoliert.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATlON:

(i) APPLICANT :
(A) NAME: AKZO N.V.
(B) STREET: Velperweg 76
(C) CITY: Arnhem
(E) COUNTRY: the Netherlands
(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM
(ii) TITLE OF INVENTION: Recombinant vaccine against Marek's disease
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2
(vii) PRIOR APPLICATION DATA:
(A) APPLICATION NUMBER : USSN 07/699,467
(B) FILING DATE : 14-May-1991

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 975 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Mareks Disease Virus
(B) STRAIN: Georgia (GA)
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: pMD11
(ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 46..918
(D) OTHER INFORMATION: /label= MD06_antigen
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 290 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(xi) SEQUENCE DESCRIPTlON: SEQ ID NO:2:

Claims

1. Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, das eine oder mehrere immunogene Determinante eines MD06-MDV- Proteins besitzt, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:2 dargestellt, besitzt oder eine funktionelle Variante davon ist.

2. Nukleinsäuresequenz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz mindestens einen Teil der in SEQ ID NO:1 gezeigten DNA-Sequenz enthält.

3. Rekombinantes Vektormolekül, das eine Nukleinsäuresequenz gemäss Ansprüchen 1-2 umfasst.

4. Rekombinantes Vektormolekül gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz mit Expressionskontrollsequenzen operabel verbunden ist.

5. Rekombinantes Vektorvirus, das die heterologe Nukleinsäuresequenz gemäss Ansprüchen 1-2 enthält.

6. Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz gemäss Ansprüchen 1-2 oder mit einem rekombinanten Vektormolekül gemäss Anspruch 3 oder 4 transformiert ist oder mit einem rekombinanten Vektorvirus gemäss Anspruch 5 infiziert ist.

7. Polypeptid, das eine oder mehrere immunogene Determinante eines MD06-MDV-Proteins besitzt, das eine wie in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine funktionelle Variante davon besitzt.

8. MDV-Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäss Ansprüchen 1-2 codiert wird.

9. Verfahren zur Expression des Polypeptids gemäss Anspruch 7 oder 8, das das Züchten einer Wirtszelle gemäss Anspruch 6 umfasst.

10. Antikörper oder Antiserum, dass mit einem Polypeptid gemäss Anspruch 7 oder 8 immunreaktionsfähig ist.

11. Impfstoff zum Schutz von Geflügel gegen die Marek'sche Krankheit, dadurch gekennzeichnet, dass er einen rekombinanten Virusvektor gemäss Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäss Anspruch 6, ein Polypeptid gemäss Anspruch 7 oder 8 oder ein Polypeptid, das gemäss dem Verfahren von Anspruch 9 hergestellt wurde, zusammen mit einem annehmbaren Träger umfasst.

12. Immunochemisches Reagens, das ein Polypeptid gemäss Anspruch 7 oder 8 umfasst, das eine immunogene Determinante von MDV zur Verwendung in einem Immunassay umfasst.

13. Verfahren zur Herstellung eines MDV-Impfstoffes, das die Schritte des Züchtens einer infizierten Wirtszelle gemäss Anspruch 6, Sammeln des rekombinanten Vektorvirus und Verwandeln des viralen Materials in ein pharmazeutisches Präparat mit immunisierender Aktivität umfasst.

14. Verfahren zur Herstellung eines MDV-Impfstoffs, der das Verwandeln eines Polypeptids gemäss Anspruch 7 oder 8 oder ein Polypeptid, das gemäss dem Verfahren von Anspruch 9 hergestellt wurde, in ein pharmazeutisches Präparat mit immunisierender Aktivität umfasst.