DE69016956T2

DE69016956T2 - Rekombinantes Truthahn-Herpesvirus und davon abgeleiteter Lebendimpfstoffvektor.

Info

Publication number: DE69016956T2
Application number: DE69016956T
Authority: DE
Inventors: Johannes Antonius Jo Claessens; Albert Philip Adrian Mockett; Paulus Jacobus An Sondermeijer
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-11-21
Publication date: 1995-07-20
Anticipated expiration: 2010-11-22
Also published as: AU633663B2; KR910012233A; EP0431668A1; HU214904B; HUT57264A; BR1100637A; CN1056878C; ZA909570B; AU6769890A; US5470734A; JP3194751B2; EP0431668B1; ES2070997T3; CA2031164A1; JPH05103667A; CA2031164C; US5187087A; HU908031D0; DE69016956D1; KR0179994B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Truthahnherpesvirus (HVT), das eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die in eine Insertionsregion des HVT-Genoms eingeführt wird, eine Nukleinsäuresequenz, die ein heterologes Gen umfasst, welches von DNA-Sequenzen flankiert wird, die von besagter Insertionsregion des HVT-Genoms stammen, ein die besagte Nukleinsäuresequenz umfassendes Plasmid, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten HVT, eine mit einem rekombinanten HVT infizierte Zellkultur, ein das rekombinante HVT umfassender Impfstoff als auch ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Impfstoffes und ein Antiserum, das gegen ein rekombinantes HVT gerichtete Antikörper umfasst.
Die Marek'sche Krankheit (MD) ist eine oncogene, lymphoproliferative Funktionsstörung bei Hühnern, die in T-Zellymphomen und peripherer Demyelinisierung von Nerven resultiert und ein Hauptgrund für wirtschaftliche Verluste der Geflügelindustrie darstellt.
Das Virus der Marek'shen Krankheit wurde als das ätiologische Agens von MD identifiziert.
Ein Prototyp eines MD-Impfstoffes besteht aus dem Truthahnherpesvius (HVT), einem MD-Virus vom Serotyp 3, der ursprünglich aus Truthühnern isoliert wurde. Sein Mangel an Pathogenität, Oncogenität, seine gute in vivo- und in vitro-Replikationsfähigkeit, seine Verfügbarkeit als zellfreies und zellassoziiertes Präparat und seine hohe Schutzwirkung haben HVT zu einem verbreitet angewendeten sicheren Impfstoff zur wirksamen Kontrolle der Marek'schen Krankheit bei Geflügel gemacht.
Gegenwärtig können Tiere im allgemeinen gegen Infektionen durch pathogene Mikroorganismen mit lebenden oder inaktivierten Impfstoffen oder durch Impfstoffe, die von Untereinheiten des relevanten Krankheitserregers stammen, geschützt werden.
Diese Arten von Impfstoff können jedoch einige Nachteile besitzen. Das Verwenden von abgeschwächten, lebenden, viralen Impfstoffen schliesst immer das Risiko ein, Tiere mit nicht ausreichend abgeschwächten Mikroorganismen zu impfen. Ausserdem können die abgeschwächten Viren in ein virulentes Stadium zurückfallen, was in einer Erkrankung und möglicher Ausbreitung des Krankheitserregers auf andere Tiere resultiert.
Inaktivierte Impfstoffe verursachen im allgemeinen nur ein niedriges Immunitätsniveau, das zusätzliche Immunisierungen erfordert. Darüberhinaus können sich die neutralisationsinduzierenden, antigenen Determinanten der Viren durch die Inaktivierungsbehandlung verändern, wodurch die schützende Potenz des Impfstoffs verringert wird.
Darüberhinaus stellt der gegenseitige Einfluss der antigenen Komponenten eines kombinierten lebenden viralen Impfstoffes ein Problem dar, dass in einer Abnahme der Potenz eines oder mehrerer der zusammensetzenden Komponenten resultiert.
Ein rekombinanter oder natürlicher Untereinheitsimpfstoff besitzt auch einige Nachteile. Erstens, eine Polypeptiduntereinheit, die dem Immunsystem als nicht-replizierende Struktur dargeboten wird, löst oftmals keine langanhaltende Immunität aus, auch wird die Anwesenheit eines Adjuvans benötigt. Zweitens, die Darbietung als replizierende Struktur kann die Immunität wirksamer auslösen als es die Darbietung als eine Untereinheitsstruktur kann.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes HVT zur Verfügung zu stellen, das nicht nur zur Herstellung eines Impfstoffes gegen MD, sondern auch gegen andere infektiöse Geflügelkrankheiten verwendet werden kann, was jedes potentielle Risiko vermeidet, das mit der Verwendung eines lebenden abgeschwächten Krankheitserregers einhergeht, der sowohl das humorale als auch zelluläre Immunsystem ohne die ausdrückliche Verwendung eines Adjuvans stark stimuliert, und der die Möglichkeit eines multivalenten Impfstoffes ohne das Risiko einer ungünstigen, gegenseitigen Beeinflussung der verschiedenen antigenen Komponenten bietet.
Ein rekombinantes HVT, das eine heterologe Nukleinsäursequenz enthält, ist in der Patentanmeldung WO 88/07088 offenbart. Das Gen, das von Interesse ist, ist in die Region inseriert, die für das virale Thymidinkinase-Gen codiert, was zeigt, dass dieser Teil des viralen Genoms für virale Replikation nicht essentiell ist. Das Thymidinkinase-Gen befindet sich in der U1- Region des Genoms. Es wurden keine weiteren nicht-essentiellen Teile des HVT-Genoms identifiziert.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist ein solches rekombinantes HVT dadurch gekennzeichnet, dass es eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die für ein zu HVT heterologes Polypeptid codiert, besagte Nukleinsäuresequenz wird in eine Insertionsregion des HVT-Genoms eingeführt, die der genomischen Region des Endes von ORF-1 bis zu und einschliesslich ORF-5 entspricht, wie in Figur 1 dargestellt ist und sich innerhalb eines DNA- Fragments des HVT-Genoms befindet, das im wesentlichen eine durch Figur 1 definierte Restriktionsenzymkarte besitzt.
Das rekombinante HVT gemäss der Erfindung kann von jedem HVT- Stamm stammen, z.B. PB-THV1 (im Handel erhältlich von Intervet International) oder Stamm FC126.
Die hier verwendete Bezeichnung "rekombinantes HVT" bezeichnet infektiöses Virus, das durch den Einbau einer heterologen Nukleinsäuresequenz in das Virusgenom, d.h. einer DNA, die für ein Gen oder einen Teil davon codiert, der nicht der natürlich in HVT vorkommenden Nukleinsäuresequenz eines Gens entspricht, genetisch modifiziert wurde.
Bei Infektion einer Zelle mit dem rekombinanten HVT, exprimiert das HVT das heterologe Gen in Form eines heterologen Polypeptids.
Die Bezeichnung "Polypeptid" bezieht sich auf eine molekulare Kette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität, sie bezieht sich nicht auf auf eine spezifische Länge des Produkts und kann, falls erforderlich, in vivo oder in vitro modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykosilierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phophorylierung; daher sind unter anderem Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition des Polypeptids eingeschlossen.
Die Voraussetzung eines nützlichen rekombinanten HVT besteht darin, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz in eine permissive Position oder Region der genomischen HVT-Sequenz eingebaut wird, d. h. eine Position oder Region, die für den Einbau einer heterologen Sequenz verwendet werden kann, ohne wesentliche Funktionen des HVT, wie solche, die für Infektion oder Replikation notwendig sind, zu zerstören. Solch eine Region wird als Insertionsregion bezeichnet.
Die Insertionsregion, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, ist zuvor noch nicht zum Einbau von heterologer DNA ohne Störung wesentlicher Funktionen des HVT beschrieben worden. Darüberhinaus stand keine Information zur Verfügung, bezüglich der Restriktionsenzymkarte der genomischen Region des HVT, die verwendet wird, um eine heterologe DNA- Sequenz, wie hierin beschrieben, einzubauen.
Die Insertionsregion, die verwendet wird, um eine heterologe DNA-Sequenz zur Herstellung eines rekombinanten HVT gemäss der Erfindung einzubauen, befindet sich innerhalb eines 17,5 Kb grossen Restriktionsfragments, das durch teilweisen Verdau der genomischen HVT-DNA mit dem Enzym Sau3A hergestellt wurde.
Das besagte Fragment wird im Detail durch Restriktiktionsenzymkartierung (Figur 1) analysiert und entspricht im wesentlichen der Us-Region des HVT-Genoms, die flankierenden Teile der Irs- und TRs-Strukturen vermutlich einschliessend. Die relativen Positionen der Us-Region und der Irs- und TRs-Strukturen innerhalb des HVT-Genoms werden von Igarashi et al. (1987) gezeigt.
Die hier offenbarte Insertionsregion befindet sich innerhalb von drei aufeinanderfolgenden XhoI-Fragmenten von ungefähr 1,2 kb, 3,5 kb beziehungsweise 2,8 kb Grössse und beginnt am Ende eines offenen Leserasters (ORF-1), das bei einer Position links des 1,2 kb grossen XhoI-Fragments (Figur 1) beginnt. Die besagte, ungefähr 5 kb grosse Insertionsregion setzt sich durch ORF- 2, 3, 4 und 5, einschliesslich der dazwischenliegenden nichtcodierenden Regionen fort. DNA-Sequenzen, die der oben dargestellten Insertionsregion entsprechen, können zur Insertion von Genen in das HVT-Genom angewendet werden, ohne wesentliche Funktionen des Virus zu stören.
Insbesondere ORF-2 und ORF-3 können zum Einbau von Fremdgenen verwendet werden.
Bevorzugte Insertionsstellen für Fremdgene innerhalb von ORF-2 und ORF-3 sind die einzigartigen BglII-Restriktionsstellen, die in Figur 1 dargestellt sind.
Das β-Galactosidasegen ist in jeder der einzigartigen BglII- Restriktionsstellen in dem ORF-2 und ORF-3 inseriert, was in einem rekombinanten Virus resultiert, das lebensfähig und stabil ist und sich nicht nur in Gewebekulturen repliziert, sondern auch Hühner in einem mit dem HVT-Virus, von dem es abstammt, vergleichbaren Ausmass infiziert. E. coli, das mit Plasmiden transformiert wurde, die als pMD07gal oder pMD12gal bezeichnet (Figur 2) werden, durch Insertion des β-gal-Gens in die einzigartige BglII-Stelle von pMD07 und pMD12, die jeweils die XhoI-Fragmente, wie in Figur 1 gezeigt, tragen, sind bei dem C.N.C.M. des Institute Pasteur in Paris unter den Hinterlegungsnummern I-914 und I-915 hinterlegt.
In einem anderen Beispiel wurden bedeutende Teile von ORF-4 und ORF-5 des HVT-Genoms deletiert und durch das β-Galactosidasemarkergen ersetzt, in rekombinanten, mit rekombinanten HVT-Viren vergleichbaren Viren resultierend, die eine Insertion des Markergens in ORF-2 oder ORF-3 umfassen.
Es ist klar, dass von der DNA-Sequenz des HVT-Genoms natürliche Variationen zwischen einzelnen HVT-Viren bestehen können. Diese Variationen können in Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen, oder Additionen eines oder mehrerer Nukleotide resultieren, die möglicherweise die Position einer oder mehrerer Restriktionsstellen beeinflussen, somit die in Figur 1 gezeigte Restriktionsenzymkarte beeinflussend.
Darüberhinaus besteht die Möglichkeit Gentechnologie anzuwenden, um die oben genannten Variationen hervorzubringen, die in einer DNA-Sequenz mit einer Restriktionsenzymkarte resultieren, die der in Figur 1 gezeigten Karte ähnlich ist. Es ist klar, dass ein rekombinantes HVT, das ein heterologes Gen umfasst, welches in eine Insertionsregion eingebaut ist, die durch eine solche verwandte Restriktionsenzymkarte gekennzeichnet ist, auch in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist. Da die Insertionsregion, die gemäss der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, keine wesentlichen Funktionen besitzt, kann darüberhinaus die besagte Region teilweise oder vollständig deletiert werden, wonach ein heterologes Gen in besagte Deletion eingefügt werden kann. Es ist klar, dass ein rekombinantes HVT, das ein heterologes Gen umfasst, welches in eine Region des HVT-Genoms eingebaut ist, die der Insertionsregion der vorliegenden Erfindung entspricht und hierin gekennzeichnet ist, ebenfalls Teil der Erfindung ist.
Zusammenfassend kennzeichnet die oben im wesentlichen definierte Insertionsregion die Position einer Region in dem HVT-Genom, die verwendet werden kann, um eine heterologe Nukleinsäuresequenz einzufügen.
Es ist ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes HVT zur Verfügung zu stellen, das eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die in eine Insertionsregion eingefügt ist, die im wesentlichen durch die HVT-DNA- Sequenz gekennzeichnet ist, wie sie in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt ist, welche vier ORF enthält. ORF-2, ein kleines, offenes Leseraster von 209 Aminosäuren (SEQ ID Nr.: 2) befindet sich zwischen den Nukleotidpositionen 316 und 945 und enthält die BglII-Restriktionsstelle des pMD07, die für die Insertion von Genen in das HVT-Genom (Figur 1, SEQ ID Nr. 1) verwendet wird, dabei zeigend, dass das hypothetische, von ORF-2 codierte Polypeptid keine wesentliche Funktion zur Erhaltung des Virus in vivo oder in vitro besitzt. Das tifft auch für das 346 Aminosäuren umfassende ORF-3 zu (SEQ ID Nr.: 3), das in umgekehrter Orientierung zwischen den Nukleotidpositionen 1084 und 2124 (komplementär) translatiert wird und die BglII-Rstriktionsstelle enthält, die in pMD12 für die Insertion von Genen in das HVT-Genom verwendet wird (Figur 1, SEQ ID Nr.: 1). ORF-4 wird in Richtung IRS zwischen den Nukleotidpositionen 2322 und 3170 (komplementär, Figur 1, SEQ ID Nr.: 1) transkribiert und codiert für 282 Aminosäuren (SEQ ID Nr.: 4), während ORF-5 bei Nukleotidposition 3320 beginnt und sich bis zur Nukleotidposition 4504 (Figur 1, SEQ ID Nr.: 1) fortsetzt, für ein Polypeptid von 394 Aminosäuren codierend (SEQ ID Nr.: 5).
Gemäss der Erfindung kann ein fortlaufender DNA-Abschnitt des HVT-Genoms von ungefähr 5 kb, der nach dem Ende des ORF-1 bei Nukleotidposition 82 beginnt und im wesentlichen durch die in SEQ ID Nr.: 1 gezeigte DNA-Sequenz gekennzeichnet ist, die vier offene Leseraster und dazwischenliegende nichtcodierende Sequenzen umfasst, zur Insertion heterologer Gene in das HVT- Genom verwendet werden, ohne die wesentlichen Funktionen des Virus zu zerstören.
Insbesondere sind die DNA-Abschnitte zwischen den Nukleotidpositionen 316-945, 1084-2124, 2322-3170 und 3320-4504, die in SEQ ID Nr.: 1 dargestellt sind, zum Einbau von Fremdgenen definiert worden, wobei die einzigartige BglII-Restriktionsstellen die zur Insertion bevorzugten Stellen sind.
Es ist klar, dass es für die in SEQ I Nr.: 1 gezeigte DNA- Sequenz, die die Insertionsregion gemäss der vorliegenden Erfindung kennzeichnet, natürliche Varianten zwischen individuellen HVT-Viren gibt, die in Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen usw. von einem oder mehreren Nukleotiden resultieren. Diese Varianten können auch durch Gentechnologie hervorgebracht werden. Rekombinante HVT, die ein heterologes, in eine solche verwandte, aber nicht mit der oben beschriebenen Insertionsregion des HVT-Genoms identische Region eingefügtes Gen besitzen, sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel kann ein heterologes Gen in eine Deletion eingefügt werden, die in der in SEQ ID Nr.: 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz des HVT-Genoms verursacht wurde. Die HVT- Insertionsregion, die hierin durch die in SEQ ID Nr.: 1 gezeigten DNA-Sequenz definiert wird, kennzeichnet die Position einer Region in dem HVT-Genom, die verwendet werden kann, um eine heterologe Nukleinsäuresequenz einzufügen.
Die in das HVT-Genom einzufügende heterologe Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann von jeder Quelle stammen, z.B. viral, prokaryotisch, eukaryotisch oder synthetisch. Besagte Nukleinsäuresequenz kann von einem Krankheitserreger, vorzugsweise einem aviären Krankheitserreger, stammen, der nach der Insertion in das HVT-Genom verwendet werden kann, um Immunität gegen eine Krankheit zu induzieren. Vorzugsweise werden Nukleinsäuresequenzen, die von dem Infektiösen Bronchitisvirus (IBV), dem Virus der Marek'schen Krankheit (MDV), dem Virus der Newcastle'schen Krankheit (NDV), dem Virus der Infektiösen Bursalen Krankheit (BDV), dem Hühneranemieagens (CAA), dem Reovirus, dem Aviären Retrovirus, dem Geflügeladenovirus, dem Rhinotracheitisvirus des Truthahns, Eimeria-Spezies, Salmonella-Spezies, Escherichia coli und Mycoplasma gallisepticum in Betracht gezogen.
Darüberhinaus können Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide zu pharmazeutischen oder diagnostischen Anwendungen codieren, insbesondere Immunmodulatoren wie Lymphokine, Interferone oder Cytokine, in besagte Insertionsregion eingefügt werden.
Ein wesentliches Erfordernis für die Expression der heterologen Nukleinsäuresequenz in einem rekombinanten HVT ist ein geeigneter Promotor, der funktionsfähig mit der heterologen Nukleinsäuresequenz verbunden ist. Es ist für Fachleute offensichtlich, dass die Wahl eines Promotors jeden eukaryotischen, prokaryotischen oder viralen Promotor einschliesst, der fähig ist, die Transkription eines Gens in mit dem rekombinanten HVT infizierten Zellen zu steuern, z.B. Promotoren, die von retroviralen, langen, terminalen Wiederholungen (long terminal repeats), SV40 oder in HVT vorhandenen Promotoren stammen.
Das Verfahren der in vivo-homologen Rekombination kann angewendet werden, um die heterologe Nukleinsäuresequenz in das HVT- Genom einzuführen. Dies wird erreicht, indem zuerst ein rekombinantes DNA-Molekül zur Rekombination mit HVT hergestellt wird. Solch ein Molekül kann von jedem geeigneten Plasmid, Cosmid oder Phagen stammen, Plasmide werden bevorzugt, und enthält eine heterologe Nukleinsäuresequenz, die, falls erwünscht, funktionsfähig mit einem Promotor vebunden ist. Besagte Nukleinsäuresequenz und Promotor werden in ein Fragment aus genomischer HVT-DNA inseriert, die wie hierin definierte Sequenzen der Insertionsregion enthält, welche in das rekombinante DNA- Molekül subkloniert sind. Die Sequenzen der Insertionsregion, die die heterologen Nukleinsäuresequenzen flankieren, sollten von geeigneter Länge sein, um homologe Rekombinationen mit dem viralen HVT-Genom in vivo zu ermöglichen. Falls erwünscht, kann eine Struktur hergestellt werden, die zwei oder mehrere verschiedene homologe Nukleinsäuresequenzen enthält, die z.B. von dem gleichen oder verschiedenen Krankheitserregern stammen, besagte Sequenzen werden von den Sequenzen des HVT der Insertionsregion, wie hierin definiert, flankiert. Solch ein rekombinantes DNA-Molekül kann angewendet werden, um rekombinantes HVT herzustellen, das zwei oder mehrere antigene Polypeptide exprimiert, um einen multivalenten Impfstoff zu liefern. Zweitens können Zellen, z.B. Hühnerembryofibroblasten (CEF) mit HVT-DNA in Anwesenheit des rekombinanten DNA-Moleküls, das von den geeigneten HVT-Sequenzen flankiert wird, transfiziert werden, wobei Rekombination zwischen den Sequenzen der Insertionsregion in dem rekombinanten DNA-Molekül und den Sequenzen der Insertionsregion des HVT auftreten. Rekombination kann auch durch Transfektion der infizierten Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz hevorgerufen werden, die die heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, die von geeigneten flankierenden Insertionssequenzen ohne rekombinante DNA-Molekülsequenzen flankiert wird. Rekombinante virale Nachkommen werden danach in der Zellkultur produziert und können zum Beispiel genotypisch oder phänotypisch selektioniert werden, z.B. durch Hybridisierung, Nachweisen von Enzymaktivität, die von einem Gen codiert wird, das zusammen mit der heterologen Nukleinsäuresequenz eingebaut ist oder durch Nachweisen der antigenen heterologen Polypeptide, die von dem rekombinanten HVT immunologisch exprimiert werden. Das selektionierte, rekombinante HVT kann in grossem Massstab in Zellkulturen gezüchtet werden, wonach rekombinantes, HVT enthaltendes Material oder heterologe Polypeptide, die von besagtem HVT exprimiert wurden, hieraus gesammelt werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung kann ein lebendes, rekombinantes HVT, das ein oder mehrere verschiedene heterologe Polypeptide eines spezifischen Krankheitserregers exprimiert, verwendet werden, um Tiere zu impfen, insbesondere aviäre Arten, wie Hühner, Truthühner, Wachteln und Perlhühner, die für solche Krankheitserreger anfällig sind. Der Impfung mit solch einem Impfstoff aus einem lebenden Vektor folgt vorzugsweise eine Replikation des rekombinanten HVT in dem geimpften Wirt, das heterologe Polypeptid zusammen den HVT-Polypeptiden in vivo exprimierend. Das heterologe, immunogene Polypeptid wird dann eine immunologische Antwort zu besagten Polypeptiden und auch zu HVT selbst auslösen. Wenn das von einem bestimmten Krankheitserreger stammende heterologe Polypeptid eine schützende Immunantwort auslösen kann, dann wird das mit dem rekombinanten HVT gemäss der Erfindung geimpfte Tier sowohl gegen nachfolgende Infektion durch diesen Krankheitserreger als auch gegen eine Infektion durch MDV immun sein. Daher kann eine heterologe, in die Insertionsregion des HVT-Genoms gemäss der Erfindung eingefügte Nukleinsäuresequenz kontinuierlich in vivo exprimiert werden, eine solide, sichere und langandauernde Immunität gegen einen Krankheitserreger vermittelnd.
Ein rekombinantes HVT gemäss der Erfindung, das ein oder mehrere verschiedene heterologe Polypeptide enthält und exprimiert, kann als monovalenter oder multivalenter Impfstoff dienen.
Ein rekombinantes HVT gemäss der Erfindung kann auch verwendet werden, um einen inaktivierten Impfstoff herzustellen.
Die Verabreichung des rekombinanten HVT an Tiere kann gemäss der Darlegung unter anderem durch Aerosol, Trinkwasser, oral, durch in ovo-Imokulation, intradermal, subcutan oder intramuskulär erfolgen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung einen Untereinheitsimpfstoff, pharmazeutische und diagnostische Präparate, die eine heterologes, von einem rekombinanten HVT gemäss der Erfindung exprimiertes Polypeptid umfassen, herzustellen. Dies kann durch Züchten von Zellen erreicht werden, die mit besagtem rekombinanten HVT unter Bedingungen infiziert werden, die die Expression des heterologen Polypeptids fördern.
Das heterologe Polypetid kann dann durch herkömmliche Verfahren bis zu einem bestimmten Mass, abhängig von seiner beabsichtigten Anwendung, gereinigt werden und weiter zu einem Präparat mit immunisierender, therapeutischer oder diagnostischer Aktivität verarbeitet werden.
Die oben beschriebene aktive Immunisierung gegen einen spezifischen Krankheitserreger wird als eine schützende Behandlung gesunder Tiere angewendet. Es ist selbstverständlich, dass Tiere, die bereits mit einem bestimmten Krankheitserreger infiziert sind, mit einem Antiserum behandelt werden können, das Antikörper umfasst, die durch ein rekombinantes HVT gemäss der Erfindung hervorgerufen werden, das ein heterologes, von einem bestimmten Krankheitserreger stammendes Gen umfasst, welches für ein antigenes Polypeptid codiert. Gegen ein HVT gemäss der Erfindung gerichtetes Antiserum kann durch Immunisieren von Tieren, zum Beispiel Geflügel, mit einer wirksamen, eine entsprechende Immunantwort auslösende Menge des besagten rekombinanten HVT hergestellt werden. Danach werden die Tiere ausgeblutet und das Antiserum kann hergestellt werden.

Beispiel 1

1. Isolierung von Subfragmenten der Us-Region des HVT-Genoms

Hühnerembryofibroblasten (CEF) wurden mit Virus des HVT- Impfstamms PB-THV1 (käuflich erhältlich bei Intervet International, Holland) infiziert und 48 Stunden in Rollkulturflaschen inkubiert, bis die Kulturen einen cytopathischen Effekt (CPE) von 90% erreichten. Die Zellen wurden geerntet, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, zentrifugiert und in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA bis zu einer Dichte von 5 x 10&sup8; Zellen pro ml resuspendiert. SDS wurde bis zu einer Endkonzentration von o,5% und Proteinase K (Boehringer) bis 200 ug/ml zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 37ºC wurden weitere 100 ug/ml Proteinase K zugegeben und die Inkubation 1 Stunde fortgesetzt. Die Lösung wurde zweimal mit einer Mischung aus Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und die Nukleinsäuren mit Äthanol gefällt. Die Gesamt-DNA der infizierten Zellen wurde in TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) in einer Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Zehm Mikrogramm der DNA wurde mit 0,5 Einheiten Sau3A (Promega) 10 Minuten bei 37ºC in einem 100 ul- Reaktionsvolumen gemäss den von dem Enzymhersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel getrennt und die Grössenfraktion zwischen 16 und 20 kb isoliert. Hundert Nanogramm dieser DNA-Fragmente wurden über Nacht bei +4ºC mit 1 ug BamHI/EcoRI-verdauter λEMBL3-DNA (Promega) in 10 ul 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,1 mM ATP, nach Zugabe von 1 Einheit T4-DNA- Ligase (Boehringer) ligiert. Nach der Ligasierung wurde ein Zehntel der Reaktionsmischung mit BamHI in einem 10 ul-Volumen verdaut und die DNA wurde in vitro unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Extrakts (Promega) verpackt. Rekombinante Phagen wurden auf geeignete E.coli-Wirtsstämme wie LE392 oder K802 in einer Dichte von ungefähr 100 PbE/Platte ausplattiert. Replikas der Schalen wurden im Doppel unter Verwendung von Nitrocellulosefiltern gemäss Benton & Davis (1978) hergestellt.
Der erste Satz wurde mit ³²P-markierter DNA aus nicht-infizierten Zellen hybridisiert und der zweite mit ³²P-markierter DNA aus HVT-infizierten Zellen. Nach dem Waschen und der Belichtung eines Röntgenfilms wurden die Abbilder der Duplikatfilter in der richtigen Orientierung aufgelegt und mehrere der Phagen, die ein für die von infizierten Zellen hergestellten Sonde spezifisches Signal ergaben, wurden isoliert und der Phage vermehrt. Einer dieser Kandidaten, als λHVT04 bezeichnet, wurde im Detail durch Restriktionskartierung der 17,5 kb grossen Insertion analysiert (Figur 1). Die in diesem Fragment vorhandene Sequenz entsprach im wesentlichen der Us-Region des HVT-Genoms, einschliesslich flankierender Teile der Wiederholungsstrukturen (Igarashi et al., 1987).

2. Insertion des (3-Galactosidasegens in das HVT-Genom unter Verwendung von Subfragmenten der US-Region

Zwei der in XHVT04 enthaltenen XhoI-Fragmente enthielten eine einzigartige BglII-Restriktionsstelle an der geeigneten Position um ein in vivo-Rekombinationsereignis mit intakter viraler genomischer DNA stattfinden zu lassen. Diese zwei Fragmente wurden aus XHVT04 durch XhoI-Verdau subkloniert und mit dem mit SalI-verdauten Plasmid-Vektor pGEM3Z (Promega) ligiert. Die daraus resultierenden Plasmidstrukturen pMD07 und pMD12, die die XhoI-Fragmente, wie in Figur 1 dargestellt, tragen, wurden mittels der einzigartigen BglII-Restriktionsstelle linearisiert und mit einer 4,0 kb grossen Expressionskassette, die von Bam-HI-Stellen flankiert wird und das von dem frühen SV40-Promotor kontrollierte β-Galaktosidasegen enthalten, ligiert. Diese Expressionskassete stammte von pCH110, einem von Pharmacia käuflich erhältlichen Plasmid, durch Ersetzen eines 72 bp grossen SphI-Fragments nahe des SV40-Replikationsursprungs (origin of replication), wie er in pCH110 vorhanden ist, durch ein doppelsträngiges synthetisches Oligonukleotid mit der folgenden Struktur:

5'-GGATCCGTCGACCATG-3'

3'-GTACCCTAGGCAGCTG-5'

Die Insertion des Verbindungsstücks (linkers) zwischen den zwei SphI-Restriktionsstellen des pCH110 stellt die Erkennungssequenz für SphI auf beiden Seiten nicht wieder her und schafft sowohl eine BamHI- als auch eine SalI-Stelle stromaufwärts des frühen SV40-Promotors. Anschliessender Verdau dieser Struktur mit BamHI lässt eine 4,0 kb grosse Expressionskassette entstehen, die oben zur Insertion in die BglII-Stelle von pMD07 und pMD12 verwendet wurde, dabei in den Plasmiden pMD07gal und pMD12gal resultierend, deren Restriktionskarten in Figur 2 dargestellt ist. Linearisierte DNA der Plasmide pMD07gal und pMD12gal wurde zusammen mit der Gesamt-DNA, die von HVT- infizierten Zellen hergestellt wurde, in CEF mittels eines Verfahrens eingebracht, das auf dem Calciumphosphat-DNA-Niederschlagverfahren gemäss Graham und v.d. Eb (1973) basiert. Zwei Mikrogramm Plasmid-DNA der Struktur, die das von homologen HVT- Sequenzen flankierte β-Galactosidasegen enthalten, wurde mit 15 ug DNA von HVT-infizierten Zellen in einem Endvolumen von 560 ul H&sub2;O gemischt und zu 750 ul HBSP (20 mM KCl, 560 mM NaCl, 24 mM Glukose, 3 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 100 mM HEPES, pH 7,0) gegeben. Niederschläge wurden durch schrittweise Zugabe von 190 ul einer 1 M CaCl&sub2;-Lösung und 30-minütiger Inkubation der Mischungen bei Raumtemperatur hergestellt. In der Zwischenzeit werden 15 ml einer Suspension sekundärer CEF von 10 Tage alten Embryonen in 6/B8-Medium, dessen Zusammensetzung auf Glasgows Modifikation des Eagle's Minimal Essential Medium basiert, das mit 2% foetalem Kälberserum ergänzt wird, in ∅ 10 cm-Schalen in einer Dichte von 5 x 10&sup5; Zellen ausgesät. Mit Calciumphosphat niedergeschlagene DNA wurde vorsichtig zu der Zellsuspension gegeben und die Schalen wurden bei 37ºC in einem befeuchteten, 5% CO&sub2; enthaltenden Wärmeschrank inkubiert. Nach 5 Stunden wurde das Medium entfernt und 10 ml einer Lösung, die gleiche Volumen HBSP und 30% Glycerin enthielt, wurde auf die Zellen geschichtet. Nach ein oder zwei Minuten Inkubation wurde die Lösung entfernt, die Zellen mit 6/B8-Medium gespült und die Schalen mit frischem Medium 3 bis 5 Tage inkubiert, bis sich ein viraler CPE entwickelte. Plaques, die rekombinantes, β- Galactosidaseaktivität exprimierendes HVT-Virus enthielten, wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, das Substrat Bluogal (Gibco, BRL) ein chemisches Derivat von 5-Bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-galactosid, in ein blaues Reaktionsprodukt umzuwandeln. Die Platten wurden mit 0,2 mg/ml frisch in Dimethylsulfoxid gelöstem Bluogal gefärbt und so lange inkubiert, bis blaue Plaques nachgewiesen wurden. Transfektion mit den β- Galactosidasederivaten von pMD07 und pND12 resultierten alle in einer signifikanten (> 5) Prozentzahl blauer Plaques. Positive Plaques der Transfektionsreihe mit pMD07 und pMD12 wurden makroskopisch gestochen und mit frischen CEF gemischt, um das Virus zu vermehren. Die Zellen wurden geerntet, wenn ein CPE sichtbar wurde und die Lysate wurden in Calstab-Puffer (74,35 g Saccharose, 0,52 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,58 g Na&sub2;HPO&sub4; 2 H&sub2;O und 0,92 g Natriumglutaminat pro Liter H&sub2;O) einschliesslich 1% bovines Serumalbumin durch Ultrabeschallung des den Extrakt enthaltenden Plastikröhrchen mit einem Vibracell 300 cup horn-Gerät 3 Minuten bei 15 ºC hergestellt. Zellfreies Virus wurde zur Titration auffrischen CEF ausplattiert und Plaques, die blaufärbende rekombinante HVT-Viren enthielten, wurden nachgewiesen und wie oben beschrieben vermehrt. Dieser Zyklus wurde wiederholt, bis mehr als 95% der viralen Plaques positiv waren, wenn die Kulturen mit Bluogal gefärbt wurden. Vor allem vier Klone, als A4- 1/A10-4 bezeichnet, die beide von pMD07 stammten und E1/E2, die von pMD12 stammten, wurden zur Herstellung von Virusstammlösungen ausgewählt, die Impfversuchen in Hühnern dienten. Ausserdem wurde ein Teil der Stammlösung zur Herstellung von Gesamt-DNA aus infizierten CEF verwendet. Mit XhoI verdaute DNA wurde auf Agarose-Gelen aufgetrennt und auf Nitrozelluloseblätter gemäss Maniatis et al. (1982) übertragen. Hybridisierungen der Proben von A4-1/A10-4 und E1/E2 im Vergleich zu XhoI-vedauter DNA des nichtrekombinanten HVT-Virus unter Verwendung der unzerstörten Xho-Fragmente als Sonden, zeigten die erwartete Grössenzunahme der ursprünglichen Fragmente aus pMD07 und pMD12 aufgrund der Insertion der β-Galaktosidasekassette.
Das β-Galactosidasemarkergen wurde verwendet, um zu zeigen, dass auch ORF-4 und 0RF-5 eine potentielle Insertionsregion darstellen. Zu diesem Zweck wurde das 1117 bp grosse SpeI- Fragment in pMD12 zwischen Nukleotidposition 2311 im ORF-4 und 3428 im ORF-5 durch ein synthetisches, 16 Basen langes doppelsträngiges Oligomer ersetzt, das eine neue und einzigartige SalI-Stelle in pMD12 geschaffen hat, wobei ein bedeutender Teil sowohl von ORF-4 als auch von ORF-5 deletiert wurde. Die Restriktionskarte dieses Plasmids, das als pMD40 bezeichnet wird, ist in Figur 3A dargestellt. Das zur Insertion verwendete β- Galactosidasemarkergen stammte von pCH110 (Pharmacia) durch ein erstes Austauschen der einzigartigen BamHI-Stelle gegen SalI und anschliessendes Ersetzen des 72 bp grossen SphI-Fragments durch ein doppelsträngiges synthetisches Verbindungsstück (linker), das sowohl eine BamHI- als auch eine SalI- Restriktionsstelle, wie oben beschrieben, enthielt.
Das β-Galactosidasemarkergen befindet sich nun auf einem 4,0 kb grossen DNA-Fragment, das von SalI-Stellen flankiert wird und kann als solches in die neu geschaffene SalI-Stelle des pMD40 übertragen werden, in dem Plasmid pMD44 resultierend (siehe Figur 3B).
Linearisierte DNA des pMD44 wird mit DNA HVT-infizierter Zellen in sekundäre CEF-Zellen, wie oben beschrieben, cotransfiziert. Die Platten werden inkubiert bis sich ein CPE ausgebildet hat. Färben der Kulturschalen mit Bluogal indentifizierte einen wesentlichen Prozentsatz an β-Galactosidaseaktivität exprimierender HVT-Plaques.
Diese Ergebnisse waren vergleichbar mit anfänglichen Beobachtungen, die nach Insertion des Markergens in ORF-2 und ORF-3 gemacht wurden.

Beispiel 2

Impfung von Hühnern mit rekombinantem, β-Galactosidaseaktivität exprimierendem HVT

Weisse, einen Tag alte Leghorn-Hühner wurden i.m. entweder mit 50 oder 1000 PbE der Virusstammlösungen A4-1 und E1 inokuliert. Eine gleiche Dosis des parenteralen HVT-Impfstammes PB-THVI wurde Kontrolltieren verabreicht. Am Tag 8 und 15 wurden Blutproben entnommen und weisse Blutzellen auf Ficoll/Hypaque- Gradienten abgetrennt. Weisse Blutzellen wurden auf sekundäre CEF gegeben und die Anzahl der Plaques im Verhältnis zu der Anzahl der beimpften Zellen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Titrationen sind in Tabelle 1 dargestellt und zeigen, dass rekombinantes HVT-Virus, das ein β-Galactosidasegen in eine der einzigartigen BglII-Restriktionsstellen innerhalb eines der XhoI-Subfragmente, die in pMD07 beziehungsweise pMD12 vorhanden sind, inseriert hat, in der Lage ist, Virämien in Hühnern in vergleichbaren Zeiten und Ausmassen relativ zu denen des nicht- rekombinanten PB-THVI-Impfstamms auszulösen. Färben mit Bluogal von einigen der weissen Blutzelltitrationen auf CEF zeigten, dass > 90% des aus den infizierten Vögeln gewonnene Virus immer noch das β-Galactosidasegen exprimierten. Ausserdem konnten wesentliche Antikörpertiter gegen β-Galactosidase in den Serumproben einzelner Tiere 35 Tage nach der Impfung im ELISA nachgewiesen werden. Daraus wurde geschlossen, dass eine besondere Region des Us des HVT-Genoms, wie durch die aneinandergrenzende, in pMD07 und pMD12 vorhandene Sequenz definiert ist, zur stabilen Integration von Fremdgenen verwendet werden kann, ohne wesentliche Funktionen des HVT-Virus wie solche, die für die Infektion und Replikation notwendig sind, zu beeinträchtigen. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass ein in diese Region inseriertes Fremdgen ein funktionelles Protein exprimiert, das hohe Antikörpertiter in dem Serum infizierter Tiere induzieren kann. Tabelle 1 Durch rekombinantes HVT induzierte Virämie weisser Blutzellen (WBC) Tage p.v. Virus Dosis (PbE) Ermittelte Plaques Anzahl geimpfter Zellen (x10&sup5;) * 5 Tage nach Inokulation der WBC auf CEF-Platten abgelesen, die anderen wurden 3 Tage post inoculationem abgelesen.

Beispiel 3

Sequenzanalyse eines Teils der Us-Region des HVT

Die Insertionen der Plasmide pMD07 und pMD12, die den jeweiligen XhoI-Restriktionsfragmenten des HVT-Genoms wie in Figur 1 dargestellt ist, entsprechen, wurden einer detaillierten Nukleotidsequenzanalyse unter Verwendung doppelsträngiger DNA- Präparationen in einer Dideoxykettenterminationsreaktion gemäss Sanger et al. (1977) unterzogen. Die Reaktion wurde ausgehend von den SP6 und T7-Promotorstellen in dem pGEM3Z-Plasmidvektor, die jeweils die genomischen HVT-Fragmente flankieren, gestartet. Die Analyse wurde durch Einführen fortschreitender Deletionen vervollständigt, die nur in einer Richtung der betreffenden Fragmente auftraten. Diese fortschreitenden Deletionen wurden unter Verwendung des Enzyms Exonuklease III, einer Einzelstrangexonuklease, eingeführt, die nur doppelsträngige DNA erkennt und nur einen Strang der Duplex in 3'- nach 5'-Richtung hydrolisiert. Das Wählen einer Restriktionsstelle, die ein 5~berhängendes oder stumpfes tousserstes Ende nahe dem Ende des zu analysierenden Fragments schafft, in Kombination mit einem zweiten Restriktionsenzym, das ein 3'-Einzelstrang-Ende bildet, das die Initiationsstelle des Startermoleküls (Primer) in dem Plasmidvektor vor dem Abbau durch die Exonuklease III schützt, zwingt das Enzym einen Strang des inserierten DNA-Fragments, soweit in pMD07 oder pMD12 vorhanden, zu entfernen. Der Reaktionsmischung wurden in Intervallen von 30 Sekunden Proben entnommen und gemäss den von Henikoff (1984) beschriebenen Verfahren behandelt, durch die die DNA-Moleküle, die in einen geeigneten E.coli Wirtsstamm transformiert werden, wieder ringförmig geschlossen werden. Minipräparationen von Plasmid-DNA einzelner Kolonien wurden durch Restriktionskartierung auf die Grösse ihrer Deletionen hin analysiert, die in die ursprünglichen 1,2 und 3,5 kb grossen Fragmente von pMD07 beziehungsweise pMD12 eingeführt worden waren. Eine Serie von Kandidaten, die fortschreitende Deletionen enthielten, die nur in einer Richtung in dem Fragment auftraten, wurden durch Nukleotidsequenzieren unter Verwendung der Doppelstrang-DNA aus den Minipräparationen in der Kettenabbruchreaktion (chain termination reaction) verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen getrennt und durch Autoradiographie auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht. Die Bandenmuster wurden mit einem Digitalisiergerät gelesen und die Daten wurden gesammelt und unter Verwendung des "shot-gun handlers" und anderer Software einer Gene-Master-Arbeitsstation (BioRad) zusammengetragen.
Das XhoI-Restriktionsfragment, das dem in pMD12 vorhandenen XhoI-Fragment benachbart ist, wurde von λHVT04 (Figur 1) in pMD36 subkloniert und teilweise, gemäss dem gleichen, wie oben beschriebenen Verfahren sequenziert.

Beispiel 4

Nach der Identifikation und detaillierten Analyse einer Region in dem HVT-Genom, waren Geninsertion möglich, ein rekombinantes HVT-Virus kann mit jedem anderen Gen als demjenigen, das für β- Galactosidase codiert, hergestellt werden. Es sind jedoch insbesondere solche Gene von Interesse, die für relevante Antigene sowohl von verwandten, als auch von nichtverwandten aviären Krankheitserregern codieren. Ein Beispiel einer solchen Anwendung wird in den folgenden Abschnitten beschrieben. Das Gen, das von Interesse ist, codiert für das 157 kd grosse Vorläufermolekül des Peplomerproteins des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV), einen hochinfektiösen Hühnercoronavirus. Dieses glykolisierte Protein ist eine Hauptkomponente der typischen Oberflächenstrukturen, auch als "spikes" bekannt, die bei allen Coronaviren, einschliesslich IBV, vorhanden sind. Eine cDNA-Kopie dieses Gens wurde aus dem IBV-Stamm M41 isoliert, einem Stamm, der dem Serotyp Massachusetts angehört, und hinter ein Promotoelement plaziert, das von der langen, terminalen Wiederholungssequenz (long terminal repeat sequence) (LTR) des Rous'schen Sarkomvirus (RSV) stammt. Das Gen, einschliesslich Promotor wurde dann in die einzigartige BglII-Restriktionsstelle des pMD07 transferiert, die gleiche Stelle, die zuvor zur Insertion der β-Galactosidaseexpressionskassette verwendet wurde und in das virale HVT-Genom rekombiniert. Rekombinante Virusnachkommen wurden auf die Expression des "spike"-Gens hin untersucht und positive Kandidaten wurden isoliert und durch eine oder mehrere Ausplattierungen mit limitierender Verdünnung kloniert. Homogene Stammlösungen des rekombinanten IB/HVT-Virus wurden hergestellt und zur anschliessenden in vivo- und in vitro- Charakterisierung verwendet.

1. Isolierung des "spike"-Gens aus dem IBV-Stamm M41

Virus des IBV-Stamms M41 wurde in 10 Tage alten, embryonierten Eiern durch Inokulation der Allantoishöhle mit 10&sup4; infektiösen Dosen für mittlere Eier pro Ei, gezüchtet. Nach 24-stündieger Inkubation bei 37ºC wurden die Eier über Nacht bei 4ºC gekühlt. Die Allantoisflüssigkeit wurde unter Kühlhaltung auf Eis geerntet. Rote Blutzellen und Zelltrümmer wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4ºC und 6000 x g entfernt. Das Virus wurde aus dem Überstand 4 Stunden bei 54,000 x g in einem Beckmann Rotor vom Typ 19 pelletiert. Das Pellet wurde in kaltem TNE (10 mM Tris-HCL, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) durch wiederholte Passagen durch eine Spritzennadel resuspendiert und auf einen linearen 32 ml-Gradienten aus 20 - 60% Saccharose in TNE geschichtet. Nach der Zentrifugation über Nacht bei 4ºC in einen SW28-Rotor mit 24,000 UpM wurde die Virusbande durch Punktierung der Seitenwand des Röhrchens mit einer Spritze gesammelt. Nach der Verdünnung mit 2 Volumen TNE, wurde das Virus 90 Minuten bei 4ºC in einem SW28-Rotor mit 18,000 UpM pelletiert. Das Material wurde in einem kleinen Volumen TNE resuspendiert und Natriumdodecylsulfat wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben. Das Präparat wurde mit 200 ug/ml Proteinase K (Boehringer) 2 Stunden bei 37ºC verdaut und zweimal mit einer 1:1-Mischung aus Phenol/Chloroform extrahiert. Virale RNA in der wässrigen Phase wurde mit 2 Volumen Äthanol in Anwesenheit von 0,1 M Natriumacetat, pH 6,0 bei -20ºC gefällt. Nach der Zentrifugation und dem Ausspülen des Röhrchens mit Äthanol, wurde das Pellet unter Vakuum getrocknet und mit sterilem Wasser aufgenommen, um eine RNA-Konzentration von 0,5 mg/ml zu ergeben. Das Präparat enthielt > 90% an genomischer IBV-RNA, wie durch Agarosegelelektrophorese überprüft wurde und wurde bei -20ºC aufbewahrt. Die cDNA-Synthese des ersten Stranges wurde mit oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; in Anwesenheit von reverser AMV-Transkriptase unter Verwendung von 5 ug viraler RNA in einem 75 ul Reaktionsvolumen gestartet. Nach 30-minütigem Inkubieren bei 44ºC, wurden die DNA/RNA-Hybride durch 3-minütiges Erhitzen bei 100ºC denaturiert, gefolgt von der Synthese des zweiten Stranges in Anwesenheit des grossen Fragments der E. coli-DNA-Polymerase I während zweistündiger Inkubation der Reaktion bei 20ºC. Die cDNA wurde mit Äthanol gefällt und mit 10 Einheiten S1-Nuklease in einem Reaktionsvolumen von 200 ul 30 Minuten bei 37ºC verdaut. Die Reaktionsprodukte wurden auf 3,2 ml eines 5- 20%igen Saccharosegradienten in 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 7,5 geschichtet und in einem SW65-Rotor 16 Stunden bei 15ºC mit 30,000 UpM zentrifugiert. Das mit einer Grösse zwischen 500 und 5000 Basenpaaren sedimentierende Material wurde gesammelt, mit Äthanol gefällt und in 20 ul 0,1 SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat) gelöst. Die Enden der doppelsträngigen cDNA wurden mit 10 bis 15 dG-Resten durch eine zweiminütige Inkubation bei 37ºC mit 15 Einheiten terminaler Transferase (Gibco, BRL) in einem Reaktionsvolumen von 30 ul gemäss den von dem Enzymhersteller empfohlenen Bedingungen verlängert. Die Reaktion wurde mit 5 mM EDTA gestoppt. Zehn Nanogramm der verlängerten (tailed) cDNA wurden 2 Minuten bei 65ºC mit einem 25- molaren Überschuss des phosphorylierten, synthetischen Oligomers 5'-dAATTCCCCCCCCCCC-3' in einem Endvolumen von 10 ul TEN erhitzt und während einer Inkubation über Nacht bei 50ºC verbunden (annealed). Die Ligasierung von 10 ug mit EcoRI verdauter λgt10-DNA (Huynh et al., 1985) wurde in 20 ul 30 mM Tris- HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,1 mM ATP nach Zugabe einer Einheit T4-DNA-Ligase und Inkubation über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Die DNA wurde zu der in vitro-Verpackungsmischung (Promega) gegeben und eine cDNA-Genbibliothek des IBV-Stamms M41 wurde durch Selektionieren rekombinanter Phagen nach dem Ausplattieren auf einen hf1A-Stamm von E.coli hergestellt.
Die Genbibliothek wurde durch Ausplattieren von ein- bis zweihundert PbE in einer Petrischale auf einen E.coli-Rasen auf cDNA-Klone geprüft, die für Fragmente des "spike"-Proteins codieren. Filterduplikate aus Nitrocellulose wurden hergestellt (Benton und Davis, 1978) und über Nacht bei 42ºC mit ³²P- markierten, synthetischen Oligomeren in einer Hybridisierungslösung, die 10 mM Tris-HCl, pH7,5, 1 M NaCl, 0,1% SDS und 4 x Denhardt'sche Lösung (Maniatis et al., 1982) enthält, inkubiert.
Die drei als Sonden verwendeten, synthetischen Oligomere enthielten die folgenden Nukleotidsequenzstrukturen:
I. 5'-dTTAGGTGGTCTGAAGGCACTTTGGTAGTAGTA-3'
II. 5'-dTACCTACTAATTTACCACCAGAAACTACAAACTGCTG-3'
III. 5'-dTGGATCATTAAACAGACTTTTTAGGTCTGTATTGTT-3'
Rekombinante Phagen, die ein Signal mit einem oder vorzugsweise zwei dieser Sonden geben, wurden durch Standardverfahren plaquegereinigt (Maniatis et al., 1982). cDNA-Fragmente der λ- Phagenrekombinanten wurden von EcoRI-Restriktionsstellen flankiert und als solche in die EcoRI-Stelle des Plasmidklonierungsvektors pGEM3Z (Promega) übertragen. Restriktionsanalyse und teilweise Sequnezierung bei zwei Kandidaten zeigte, dass einer für die vollständige S1- und der andere für die S2-Hälfte des "spike"-Gens codieren. Die Sequenz dieser beiden DNA-Fragmente überlappten teilweise, insbesondere hinsichtlich der einzigartigen MluI-Restriktionsstelle nahe der S1/S2-Verbindung. Diese Stelle wurde dann verwendet, um die beiden oben genannten Fragmente zu vereinen und resultierte in einer Plasmidkonstruktion mit einer 3,7 kb grossen BamHI-Insertion, die das vollständige, den Vorläufer des Proteinpeplomers des IBV-Stamms M41 codierende Gen trägt.

2. Konstruktion des HVT-Rekombinationsplasmids pIB18, das für das von einem LTR-Promotor kontrollierte "spike"-Gen codiert

Ein starker Promotor, der die Expression von Fremdgenen nach ihrer Insertion in das Genom des HVT-Virus steuern könnte, wurde von der LTR-Sequenz des RSV gewählt. Der Promotor wurde auf einem 580 bp grossen NdeI/HindIII-Restriktionsfragment des pRSvcat (Gorman et al., 1982) lokalisiert und zwischen die HindIII- und PstI-Stellen von pGEM3Z (Promega) mittels doppelsträngigen, synthetischen Linkern auf beiden Seiten des Fragments inseriert. Die Verbindung zwischen der HindIII-Stelle des Vektors pGEM3Z und der NdeI-Stelle des RSV-Fragments, das den LTR-Promotor trägt, wurde mit einem 30 bp grossen Linker, der kohäsive, mit RindIII auf der einen Seite und NdeI auf der anderen Seite kompatible Enden enthält, durchgeführt. Jedoch werden nach der Ligasierung beide Restriktionsstellen aufgrund absichtlicher Modifikationen der äusseren Nukleotide der sechs Basenpaare grossen Erkennungssequenz nicht wiederhergestellt. Zusätzlich zu der Entfernung dieser beiden Stellen wurde eine neue, innerhalb des Linkers vorhandene Restriktionsstelle (BamHI) in der entsprechenden Position geschaffen. Ein zweiter 20 bp grosser Linker wurde synthetisiert, der die HindIII- Stelle des LTR-Fragments mit der PstI-Stelle von pGEM3Z verband, in diesem Fall ohne Zerstörung der Erkennungssequenzen auf beiden Enden und durch Zufügen der drei zweckmässigen, einzigartigen Restriktionsstellen BglII, XhoI und EcoRV zu den bereits in dem Polylinker von pGEM3Z vorhandenen, z.B. PstI, SalI, XhoI und BamHI. Die resultierenden pGEM3Z-Derivate, als pVEC01 bezeichnet, enthalten daher ein 650 bp grosses Restriktionsfragment, das die LTR-Promotorsequenz unmittelbar gefolgt von sieben, für die Insertion von Fremdgenen zur Verfügung stehenden Restriktionsstellen trägt. Das 650 bp-Fragment wird auf jeder Seite von einer BamHI-Restriktionsstelle flankiert und wurde als solches in die einzigartige BglII-Stelle übertragen, die sich in der 1,2 kb grossen HVT-Insertion des pMD07 befindet. Die von diesen beiden Restriktionsenzymen geschaffenen kohäsiven Enden sind kompatibel, jedoch stellt die Ligasierung keine der ursprünglichen Restriktionsstellen für BglII oder BamHI wieder her. Eine der resultierenden Konstruktionen, die die LTR in Richtung Trs trägt, wurde als pVEC04 bezeichnet und durch Restriktionskartierung geprüft (Figur 4). Die Struktur dieses universellen HVT-Rekombinationsvektors erlaubt die Insertion von Fremdgenen unmittelbar stromabwärts des LTR- Promotors und anschliessender Einbau der vollständigen Expressionskassette in das HVT-Genom durch in vivo-Rekombination. Die Positionen der verschiedenen Restriktionsstellen stromabwärts des LTR, insbesondere die der Enzyme BglII, XhoI und EcoRV, sind auf solche Weise entworfen, das selbt multiple Geninsertionen vorstellbar sind. Eine erste Anwendung von diesem Vektor bestand in der Konstruktion eines rekombinanten HVT-Virus, der das "spike"-Gen des IBV-Stamms M41 trägt, dessen Isolierung in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben worden ist. Ein 3,7 kb grosses, das "spike"-Gen von M41 tragende BamHI-Restriktionsfragment, wurde in die einzigartige BglII-Stelle des pVECO4 stromabwärts des LTR-Promotors inseriert. Auch diese Manipulation stellt die Restriktionstellen nach der Ligasierung nicht wieder her. Einer der Kandidaten, in den das Gen in der richtigen Orientierung relativ zum LTR-Promotor inseriert war, wurde durch Restriktionskartierung analysiert, die die erwartete, in Figur 5 dargestellte Struktur bestätigte. Dieses Plasmid wurde als pIB18 bezeichnet und anschliessend zur Cotransfektion von Hühnerembryofibroblasten (CEF) verwendet.

3. Genomische Insertion des IBV-"spike"-Gens in HVT und Expression des Peplomerproteins

Linearisierte DNA von pIB18 wurde zusammen mit der Gesamt-DNA von HVT-infizierten Hühnerzellen gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von β-Galactosidase-Rekombinanten transfiziert.
Der Nachweis der das "spike"-Protein exprimierenden HVT- Rekombinanten wurde durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von mono- oder polyvalenten Seren gegen IBV durchgeführt. Primärkulturen wurden nach der Transfektion einmal auffrische CEF gegeben, geerntet und ultraschallbehandelt wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben. Nach der Titrierung der zellfreien Lysate wurden Mikrotiterplatten mit CEF in limitierenden Verdünnungen unter Verwendung von weniger als einer PbE pro Vertiefung infiziert und inkubiert bis ein CPE nachweisbar war. Zellsuspensionen von jeder der Vertiefungen wurden jeweils auf Duplikatmikrotiterplatten zusammen mit frischen CEF aufgeteilt und nochmals zwei Tage inkubiert. Eine der Platten wurde dann fixiert, mit IBV-spezifischen Antiseren gefärbt und nach Immunfluoreszenz unter dem Mikroskop untersucht, solche Vertiefungen zählend, die die meisten IBV-positiven, gefärbten HCT-Plaques enthielten.
Lebende infizierte Zellen wurden den korrespondierenden Vertiefungen der Duplikatmikrotiterplatte entnommen und durch ein oder zwei Passagen auffrischen CEF vermehrt. Dieses auf limitierenden Verdünnungen basierende Klonierungsverfahren wurde mehrmals wiederholt und resultierte in verschiedenen, unabhängigen Isolaten des rekombinanten HVT-Virus, die sich alle positiv in dem IBV-spezifischen Immunfluoreszenzassay der infizierten Zellkulturen färbten.

Beispiel 5

1. Isolierung des für das Fusions- (F) und Hämagglutinationsprotein (HN) des Virus der Newcastle'schen Krankheit (NDV) codierenden Gens

Virus des NDV-Impfstamms Clone 30 (Intervet International, Holland) wurde 30 Stunden in embryonierten Eiern vermehrt und die Allantoisflüssigkeit nach Inkubation über Nacht bei +4ºC geerntet. Virus wurde über einen einzelnen Saccharosegradienten gereinigt und die genomische RNA durch Proteinaseverdau in Gegenwart von SDS extrahiert.
Die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurde mit reverser Transkriptase unter Verwendung von 20 ul/ml eines 10 Basen langen Zufallsoligomers (random oligomer) durchgeführt, um die Reaktion zu starten.
Die Synthese des zweiten Strangs, S1-Behandlung und die folgenden, die Insertion in den λgt10-Vektor einschliessenden Schritte wurden wie zuvor in Sektion 1 des Beispiels 4 beschrieben, durchgeführt.
Überprüfung der Genbibliothek nach F-genspezifischen Sequenzen wurde durch Plaquehybridisierung mit den ³²P-markierten Oligonukleotiden durchgeführt.
I. 5'GGCAGGCCTCTTGCGGCTGCAGGGATTGTGGTAACAGG 3'
II. 5'GCAAAAGGCGCAACAGAAGACCTTGTTGTGGCTTGGC 3'
erkennen 5'- beziehungsweise 3'-Enden der codierenden Region. Die Identifizierung des HN-Gens wurde mit den Oligonukleotiden durchgeführt.
III. 5'GAAAGAGAGGCGAAGAATACATGGCGCTTGGTATTCCGG 3'
IV. 5'GAAATATCTAATACTCTCTTCGGGGAATTCAGGATCGT 3'
Die Sequenz dieser Sonden wurde durch Vergleich mit veröffentlichten Daten der NDV-Stämme Australia-Victoria (McGinnes et al., 1986), Italien (Espion, et al., 1987 und Wemers et al., 1987), Beaudette (Chambers et al., 1986 und Millar et al., 1986) und D26 (Sato et al., 1987) erstellt.
Positive Kandidaten, die mit mindestens zwei der Sonden ein positives Signal ergeben, wurden isoliert und durch Restriktionskartierung charakterisiert. Aus dieser Serie wurden zwei ausgewählt, die das F beziehungsweise HN des NDV-Stammes Clone 30 umfassen.
Die DNA-Insertionen wurden in den Plasmidvektor pGEM4Z transferiert und mit der Exonuklease Bal 31 manipuliert, um überflüssige oder überhängende Sequenzen stromauf- oder stromabwärts der eigentlichen codierenden Region des F- und HN-Gens zu entfernen.
Dies resultierte in den Plasmiden pNDV01 und pNDV03, die das vollständige, für F beziehungsweise HN codierende Gen, von Bam-HI-Restriktionsstellen flankiert, enthielten.

2. Genomische Insertion des F- und HN-Gens von NDV in HVT

Das BamHI-Fragment der Plasmide pNDV01 und pNDV03, das das für das F- beziehungsweise HN codierende Gen enthält, wurde in die BglII-Stelle des HVT-Rekombinationsvektors pVEC04 inseriert, in pNDV04 und pNDV05 resultierend.
Die korrekte Orientierung der inserierten Gene relativ zu dem LTR-Promotor wurde durch Restriktionsanalyse, auf der in Figur 6 dargestellten physikalischen Karte dieser Konstruktionen basierend, bestätigt.
DNA von diesen Plasmiden wird zusammmen mit DNA von HVT- infizierten Zellen in CEF, wie in Sektion 2 des Beispiels 1 beschrieben, cotransfiziert.
Nach der Vermehrung der transfizierten Kulturen wurden zellfreie Lysate hergestellt und auf Mikrotiterplatten ausplattiert.
Der Nachweis von HVT-Rekombinanten, die F oder HN exprimieren, wurde durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung polyvalenter Seren oder monoklonaler Antikörper gegen spezifische NDV- Antigene durchgeführt.
Anreicherung von rekombinantem HVT-Virus wurde durch limitierende Verdünnung, wie in Sektion 3 von Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Herstellung eines homogenen, rekombinanten Viruspräparats wurde durch Einzelplaqueisolierung und Testen der Expression von F beziehungsweise HN in infizierten CEF durch Immunfluoreszenz durchgeführt.

Legenden zu den Figuren

Figur 1

Restriktionsenzymkarte eines DNA-Fragments, das im wesentlichen der Us-Region des HVT-Genoms entspricht. Die relative Position der Insertionsregion, die aus vier offenen Leserastern und dazwischenliegenden nichtcodierenden Sequenzen besteht, ist dargestellt.

Figur 2

A) Restriktionskarte von pMD07gal. Dieses Plasmid stammt von pMD07 durch Inserieren des β-Galactosidasegens in die einzigartige BglII-Restriktionsstelle, die sich in dem 1,2 kb grossen XhoI-Fragment des HVT-Genoms befindet.
B) Restriktionskarte von pMD12gal. Dieses Plasmid stammt von pMD12 durch Inserieren des β-Galactosidasegens in die einzigartige BglII-Restriktionsstelle, die sich in dem 3,5 kb grossen XhoI-Fragment des HVT-Genoms befindet.

Figur 3

A) Restriktionskarte von pMD40. Ein 1117 bp grosses SpeI- Fragment, das sich in pMD12 befindet, wurde durch ein synthetisches, eine SalI-Stelle enthaltendes Oligonukleotid ersetzt.
B) Restriktionskarte von pMD44. Von pMD40 durch Insertion eines 4,0 kB grossen, von SalI-Stellen flankierten β- Galactosidasemarkergens in die SalI-Stelle von pMD40 stammend.

Figur 4

Restriktionsenzymkarte von pVEC04, die den LTR-Promotor zeigt, der in die einzigartige BglII-Stelle des 1,2 kb grossen XhoI- Fragments von pMD07 inseriert ist.

Figur 5

Restriktionsenzymkarte von pIB18, die das 3,7 kb grosse BamHI- Fragment zeigt, das das "spike"-Gen des IBV-Stamms M41 in die BglII-Stelle des pVEC04 stromabwärts des LTR-Promotors inseriert trägt.

Figur 6

A) Restriktionskarte von pNDV04. Das Plasmid enthält das von BamHI-Stellen flankierte NDV-F-Gen, das in die BglII-Stelle von pVEC04 (siehe Figur 4) inseriert ist.
B) Restriktionskarte von pNDV05. Das Plasmid enthält das von BamHI-Stellen flankierte NDV-HN-Gen, das in die BglII-Stelle von pVEC04 (siehe Figur 4) inseriert ist.

Referenzen

1. Benton, W.D. and Davis, R.W. (1978), Science, 196, 180.
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14. Wemers et al. (1987), Arch. Virol. 97, 101.

Auflistung der Sequenzen

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 4527 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STPANDEDNESS: double
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Herpesvirus of turkey
(B) STRAIN: PB-THV1

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..81
(D) OTHER INFORMATION: /label= end_of_ORF1

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 316..945
(D) OTHER INFORMATION: /label= ORF2

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: complement (1084..2124)
(D) OTHER INFORMATION: /label= ORF3

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: complement (2322..3170)
(D) OTHER INFORMATION: /label= ORF4

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 3320..4504
(D) OTHER INFORMATION: /label= ORF5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 209 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE: ORF-2

(xi) SEQUENCE DESCPIPTION: SEQ ID NO:2:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 346 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE: ORF-3

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 282 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(ix) FEATURE: ORF-4

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 394 amino acids
(B) TYPE: amino acid
(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(ix) FEATURE: ORF-5

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

Claims

1. Rekombinantes Truthahnherpesvirus (HVT) dadurch gekennzeichnet, dass es eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, besagte Nukleinsäuresequenz ist in eine Insertionsregion des HVT-Genoms eingeführt, die der genomischen Region vom Ende des ORF-1 bis zu und einschliesslich ORF-5 entspricht, die sich innerhalb eines DNA-Fragments des HVT- Genoms befinden, welches eine durch Figur 1 definierte Restriktionsenzymkarte hat oder eine Variante der genomischen Region.

2. Rekombinantes HVT, dadurch gekennzeichnet, dass es eine heterologe Nukleinsäuresequenz enthält, besagte Nukleinsäuresequenz ist in eine Insertionsregion des HVT-Genoms eingeführt, die der DNA-Sequenz zwischen den Nukleotidpositionen 82 und 4505 entspricht, die durch die in SEQ ID NO:1 gezeigte DNA-Sequenz oder eine Variante besagter DNA-Sequenz definiert ist.

3. Rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionsregion ORF-2 oder ORF-3 entspricht.

4. Rekombinantes HVT gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz in die BglII-Schnittstelle eingebaut ist, die sich im ORF-2 oder ORF-3 befindet.

5. Rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Teil der HVT-Nukleinsäuresequenz innerhalb der Insertionsregion deletiert ist.

6. Rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz für ein Polypeptid codiert und unter Kontrolle eines Promotors steht, der die Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Zelle, die mit besagtem rekombinanten HVT infiziert ist, reguliert.

7. Rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz für ein Antigen eines aviären Krankheitserregers codiert.

8. Rekombinantes HVT gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen aus der Gruppe, die das Virus der Marek'schen Krankheit, des Infektiösen Bronchitis Virus, des Virus der Newcastle'schen Krankheit oder das Infektiöse Virus der Bursalen Krankheit umfasst.

9. Nukleinsäuresequenz, die mindestens ein zu HVT heterologes Gen oder einen Teil davon umfasst, unter Kontrolle eines Promotors, von DNA-Sequenzen flankiert, die von der wie in Anspruch 1 definierten Insertionsregion des HVT-Genoms abstammen.

10. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine Nukleinsäuresequenz gemäss Anspruch 9 umfasst.

11. Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz gemäss Anspruch 9 oder einem rekombinanten DNA-Molekül gemäss Anspruch 10 transformiert ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten HVT gemäss Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichet, dass eine entsprechende Zellkultur mit HVT und einem rekombinanten DNA- Molekül gemäss Anspruch 10 cotransfiziert wird.

13. Zellkultur, die mit einem rekombinanten HVT gemäss Ansprüchen 1-8 infiziert ist.

14. Impfstoff, der ein rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-8 umfasst.

15. Impfstoff, pharmazeutische oder diagnostische Verbindung, die ein Polypeptid, das von einem rekombinanten HVT gemäss Ansprüchen 1-8 exprimiert wird, umfassen.

16. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass das HVT enthaltende Material von einer Zellkultur gemäss Anspruch 13 gewonnen und zu einem Impfstoff verarbeitet wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, einer pharmazeutischen oder diagnostischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Polypeptid, das durch ein rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-8 exprimiert wird, zu einem Präparat mit immunisierender, therapeutischer oder diagnostischer Aktivität verarbeitet wird.

18. Antiserum, das Antikörper umfasst, die durch rekombinantes HVT gemäss Ansprüchen 1-8 hervorgerufen werden und die spezifisch daran binden.