DE69614391T2

DE69614391T2 - Gelzusammensetzung auf basis von polysacchariden

Info

Publication number: DE69614391T2
Application number: DE69614391T
Authority: DE
Inventors: Uppsala Q-Med Ab
Original assignee: Q Med AB
Current assignee: Q Med AB
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2002-02-14
Anticipated expiration: 2016-05-29
Also published as: PL188071B1; HU220257B; MX9800484A; CZ12998A3; DE839159T1; KR100314488B1; KR19990029034A; GR3037065T3; BRPI9609534B8; US5827937A; SI0839159T1; CA2226488C; JPH11509256A; AU6371896A; CN1190974A; EP0839159B1; NO980213D0; EA001500B1; AU700215B2; HUP9901714A3

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet biokompatibler Polysaccharidgelzusammensetzungen und insbesondere ein neues Verfahren zur Vernetzung solcher Zusammensetzungen, wobei eine neue Gelstruktur erhalten wird. Die neue Struktur verleiht den bisher bekannten Gelzusammensetzungen verbesserte Eigenschaften und ermöglicht ebenfalls neue Anwendungen der Zusammensetzungen sowohl als solcher als auch mit enthaltenen wirksamen Bestandteilen.

Hinterrund der Erfindung

Wasserbindende Gele werden im biomedizinischem Bereich viel verwendet. Sie werden im allgemeinen durch chemische Vernetzung von Polymeren zu unendlichen Netzwerken hergestellt. Wenn biokompatible Polymere verwendet werden, muss im allgemeinen ein niedriger Vernetzungsgrad eingesetzt werden, um die Biokompatibilität aufrecht zu erhalten. Jedoch ist oft ein dichteres Gel erforderlich, um eine ordnungsgemäße Wirkung des verwendeten wirksamen Bestandteils zu erzielen, und in einem solchen Fall geht die Biokompatibilität oft verloren.
Eine weitere wertvolle Eigenschaft der wasserbindenden Gele oder Hydrogele ist, dass Peptide und größere biologisch wirksame Stoffe darin unter Bildung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen werden können. Jedoch waren praktische Probleme mit dem Erreichen einer ausreichenden Verweilzeit des wirksamen Bestandteils verbunden, da im allgemeinen der wirksamen Bestandteil mit der gleichen Geschwindigkeit freigesetzt wird, mit der er in der erwähnten Zusammensetzung aufgelöst oder eingeschlossen wurde. Wenn weiterhin ein derartiges Gel in dem Bemühen, den wirksamen Bestandteil längere Zeit festzuhalten, verdichtet wird, wird es in tierischem Gewebe, wo freier Zutritt von Wasser besteht, schnell quellen.
Eines der am häufigsten verwendeten biokompatiblen Polymere zur medizinischen Anwendung ist Hyaluronsäure. Da diese in jedem lebenden Organismus in identischer Zusammensetzung vorhanden ist, verursacht sie ein Minimum an Reaktionen und erlaubt anspruchsvolle medizinische Anwendungen. Als Folge davon ist sie Gegenstand vieler Bemühungen zu ihrer Modifikation gewesen. So wurde sie mit Mitteln wie Aldehyden, Epoxiden, Polyaziridylverbindungen und Divinylsulfonen vernetzt (Laurent et al., Acta Chem. Scand. 18 (1964), Nr. 1, Seite 274; EP 0161887B1; EP 0265116A2; sowie US 4,716,154).
In WO 87/07898 wird eine Umsetzung eines Polysaccharids mit einem polyfunktionellen Epoxid, Entfernung des überschüssigen Epoxids und ein abschließender Trocknungsvorgang zur Vernetzung des Polysaccharids zu einem Film, einem gepulverten Material oder einem ähnlichen Trockenprodukt offenbart. Jedoch ist dort kein Vorschlag enthalten, das aktivierte Polysaccharid zu verdünnen und anschließend wieder zur gewünschten Dichte oder Konsistenz, die dann im wesentlichen dauerhaft ist, zu konzentrieren.
US 5,128,326 offenbart eine Anzahl modifizierter Hyaluronsäuren zur Anwendung als Depotarzneimittel. Die offenbarten Verfahren zur "Beladung" der Gelzubereitungen basieren alle auf einer Diffusion des wirksamen Bestandteils in das Gel und danach einer Freisetzung daraus mit der gleichen Diffusionskonstante. Im Gegensatz dazu umfasst die vorliegende Erfindung eine Auflösung des wirksamen Bestandteils, gefolgt von einer Verdichtung oder Konzentration der Gelzusammensetzung, bis keine oder eine sehr geringe Diffusion des wirksamen Bestandteils stattfindet.
US 5,399,351 offenbart Gemische eines Gels mit polymeren Lösungen, wobei die Lösungen zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften des Gels verwendet werden. Jedoch werden auch in diesem Fall reversibel verdichtete Gele offenbart, wie beispielsweise aus Spalte 6, Zeilen 53-58 gefolgert werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß vorliegender Erfindung wurde unerwartet festgestellt, dass Polysaccharidgelzusammensetzungen mit einer neuen Struktur und dadurch neuen hervorragenden Eigenschaften durch Anwendung eines neuen Verfahrens zu deren Vernetzung erhalten werden können. Das neue Vernetzungsverfahren ermöglicht eine flexible Steuerung von Struktur und Eigenschaften der hergestellten Polysaccharidgelzusammensetzung, die es dann ermöglicht, die endgültige Zusammensetzung für die vorgesehenen Zwecke maßzuschneidern.
Genauer ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer vernetzten Polysaccharidgelzusammensetzung bereitzustellen, wobei die Biokompatibilität trotz des hohen Grades an Vernetzung oder Polymerisation erhalten bleibt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, eine Polysaccharidgelzusammensetzung mit viskoelastischen Eigenschaften bereitzustellen, obwohl sie in beträchtlichem Ausmaß vernetzt ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, eine Polysaccharidgelzusammensetzung bereitzustellen, die mehr oder weniger irreversibel verdichtet oder konzentriert ist, das heißt, die nicht wesentlich oder nur in begrenztem Ausmaß quillt, wenn sie mit Wasser in Kontakt kommt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, eine Polysaccharidgelzusammensetzung bereitzustellen, in die ein biologisch wirksamer Stoff zur Anwendung als Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung oder als Depotpräparat eingeschlossen ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, eine Polysaccharidgelzusammensetzung bereitzustellen, die eine Vielfalt von biologisch wirksamen Stoffen enthält, die als medizinische oder prophylaktische Mittel für unterschiedliche Zwecke verwendet werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, Anwendungen der erwähnten Zusammensetzungen für die Herstellung von medizinischen oder prophylaktischen Mitteln sowie für die Verabreichung an Säuger, besonders an Menschen, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, eine teilweise vernetzte aktivierte Polysaccharidgelzusammensetzung, wie sie als eine Zwischenstufe des oben erwähnten erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten wird, bereitzustellen, wobei die Zwischenstufe in situ an jeder gewünschten Stelle endgültig vernetzt werden kann.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden aus der nachstehend angegebenen ausführlicheren Beschreibung ersichtlich.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer vernetzten biokompatiblen Polysaccharidgelzusammensetzung bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:
Bilden einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen, vernetzbaren Polysaccharids;
Auslösen einer Vernetzung des Polysaccharids in Gegenwart eines polyfunktionellen vernetzenden Mittels;
sterisches Hindern der Vernetzungsreaktion, bevor sie beendet ist und Gelbildung erfolgt, wodurch ein aktiviertes Polysaccharid erhalten wird; und
Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Zustände für das aktivierte Polysaccharid, um so die Vernetzung bis zu einem viskoelastischen Gel durchzuführen.
Mit anderen Worten umfasst das neue Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eine Vernetzung eines wasserlöslichen, vernetzbaren Polysaccharids in mindestens zwei Schritten oder Stufen, wobei die Vernetzungsreaktion unterbrochen wird, bevor die Gelbildung ausgelöst wird und die Unterbrechung durch sterisches Hindern der Vernetzungsreaktion erfolgt. Die Vernetzungsreaktion wird in einem zweiten Schritt durch Wiedereinführen sterisch ungehinderter Zustände fortgesetzt.
Erstens wurde so unerwartet festgestellt, dass durch das sterische Hindern ein aktiviertes Polysaccharid erhalten wird, wobei dessen Vernetzung oder Polymerisation lediglich durch Wiedereinführen sterisch ungehinderter Zustände fortgesetzt werden kann. Zweitens würde ebenfalls unerwartet festgestellt, dass die dabei erhaltene Polysaccharidgelzusammensetzung keine kompakte, dichte Struktur bildet, wie sie erhalten würde, wenn die entsprechende Vernetzungsreaktion in einem einzigen Schritt zu einem vollständig vernetzten Gel durchgeführt würde, sondern vielmehr ein viskoelastisches Gel. Weiterhin ist die nach der vorliegenden Erfindung erhaltene neue Gelstruktur, wie vorstehend erwähnt, eine im wesentlichen irreversible Gelstruktur, die in Kontakt mit Wasser oder anderen wässrigen Medien nicht in nennenswertem Ausmaß quillt. Im allgemeinen bedeutet dies, dass das Aufquellen weniger als 10% des Volumens, bezogen auf das nach dem beanspruchten Verfahren erhaltene Volumen, beträgt.
Obwohl die Erfindung nicht durch eine Theorie besschränkt ist, kann es sein, dass die durch die vorliegende Erfindung erhaltene neue Struktur eher eine Kombination einer Vernetzung zwischen vorhandenen Polymerketten und einer Verlängerung bestehender Ketten ist, als ein sehr dichtes Netzwerk, das zu einer sehr starren Struktur führt. Was einen derartigen Mechanismus nahe legt, ist die Tatsache, dass bei der Erfindung ein viskoelastisches Produkt erhalten wird.
Der hierin verwendete Begriff "sterische Hinderung der Vernetzungsreaktion" sollte in einem weiten Sinne ausgelegt werden, das heißt, es muss nicht notwendigerweise eine vollständige Hinderung, sondern in vielen Fällen eher eine teilweise Hinderung der erwähnten Reaktion vorliegen. Das heißt, wichtig ist, dass die Vernetzungsgeschwindigkeit wesentlich vermindert ist, damit der endgültigen Vernetzungsreaktion ermöglicht wird, an neuen beteiligten Reaktionsstellen abzulaufen.
In ähnlicher Weise sollte der Begriff "Wiedereinführen sterisch ungehinderter Bedingungen" ebenfalls weit ausgelegt werden, was im allgemeinen bedeutet, dass die sterisch ungehinderten Bedingungen nicht notwendigerweise genau die gleichen sterischen Bedingungen sein müssen, wie sie beim Auslösen der Vernetzungsreaktion vorlagen. Somit ist im allgemeinen von Bedeutung, dass die sterisch ungehinderten Bedingungen einen schnelleren Reaktionsverlauf ermöglichen als die sterisch gehinderten Bedingungen.
Die sterische Hinderung der Vernetzungsreaktion sollte auf unterschiedliche Weise erhältlich sein, jedoch ist eine in dieser Hinsicht bevorzugte Ausführungsform der Erfindung der Fall, bei dem die sterische Hinderung eine Verdünnung des wässrigen Mediums umfasst, in dem die Vernetzungsreaktion durchgeführt wird, um eine geringere Konzentration des Polysaccharids in dem Medium zu erreichen.
Das Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Bedingungen sollte auf verschiedenen Wegen möglich sein, jedoch ist eine in dieser Hinsicht bevorzugte Ausführungsform der Fall, der das Verdampfen des wässrigen Mediums umfasst, in dem die Vernetzungsreaktion durchgeführt wird, um eine höhere Konzentration des Polysaccharids in dem Medium zu erreichen. Eine weitere in dieser Hinsicht bevorzugte Ausführungsform ist der Fall, der das Dialysieren des wässrigen Mediums, in dem die Vernetzungsreaktion abläuft, umfasst.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die sterische Hinderung der Vernetzungsreaktion durchgeführt, bevor das Vernetzungsmittel aufgebraucht worden ist. Dies bedeutet dann wieder im allgemeinen auch, dass das Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Zustände in Gegenwart des nicht verbrauchten Vernetzungsmittels ausgelöst wird.
Die sterische Hinderung der Vernetzungsreaktion kann im allgemeinen in einem Bereich von 50-90% der gesamten im erfindungsgemäßen Verfahren angewandten Gelbildungszeit begonnen oder durchgeführt werden, wobei auch eine für die vorgesehene Verwendung der Zusammensetzung geeignete Elastizität oder Konsistenz in Betracht zu ziehen ist.
Die erfinderische Idee sollte für jedes biokompatible Polysaccharid anwendbar sein, das in einem wässrigen Medium vernetzbar und löslich ist. Daher sollte die Bezeichnung "wasserlöslich" in einem weiten Sinne ausgelegt werden, wobei reines Wasser nicht unbedingt erforderlich ist. Wässrige Lösung bedeutet jede Lösung, in der Wasser der Hauptbestandteil ist. Eine bevorzugte Untergruppe der Polysaccharide im Zusammenhang mit der Erfindung ist jedoch ein Glucoseaminglucan, für das Hyaluronsäure ein besonders interessantes Beispiel ist.
Das in Verbindung mit der Erfindung zu verwendende Vernetzungsmittel kann jedes bisher bekannte Vernetzungsmittel sein, das in Verbindung mit Polysacchariden brauchbar ist, wobei die Gewährleistung der Biokompatibilitätserfordernisse im Auge behalten werden muss. Bevorzugt ist das Vernetzungsmittel jedoch aus Aldehyden, Epoxiden, Polyaziridylverbindungen, Glycidylethern und Divinylsulfonen ausgewählt. Davon stellen Glycidylether eine besonders bevorzugte Gruppe dar, wobei 1,4-Butandioldigycidylether als bevorzugtes Beispiel zu nennen ist. In diesem Zusammenhang sollte auch erwähnt werden, dass "polyfunktionell" bifunktionell einschließt.
Die anfängliche Vernetzungsreaktion in Gegenwart eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels kann bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt werden, die primär davon abhängen, ob Ether- oder Esterreaktionen gefördert werden sollen. Wenn Etherbildungen gefördert werden, bedeutet dies, dass die Vernetzungsreaktion bevorzugt bei einem alkalischen pH-Wert, besonders oberhalb von pH 9, zum Beispiel im Bereich von pH 9-12, durchgeführt wird. Wenn Esterbildungen gefördert werden, wird die Vernetzungsreaktion bevorzugt bei einem sauren pH-Wert, besonders bei pH 2-6, durchgeführt.
Eine interessante Ausführungsform der Erfindung ist der Fall, in dem die hergestellte vernetzte Polysaccharidgelzusammensetzung als solche verwendet wird, da die Erfindung die Herstellung einer viskoelastischen Zusammensetzung ermöglicht. Eine solche viskoelastische Zusammensetzung ist beispielsweise in der Augenheilkunde nützlich, als Tränenersatzflüssigkeit und als Augentropfen, und wie vorstehend angegeben, ermöglicht die vorliegende Erfindung, die viskoelastischen Eigenschaften für solche Anwendungen maßzuschneidern. Daher ist es durch Anwendung der sterischen Technologie gemäß vorliegender Erfindung möglich, Kettenverlängerungen, Kettenverzweigungen und.
Vernetzungen auf kontrollierterem Wege zu erhalten als durch die herkömmlichen Verfahren mit mehr oder weniger zufälligen Kupplungsstellen.
Weiterhin verursachen die neuen Produkte keine störenden oder negativen Volumeneffekte bei diesen oder anderen medizinischen Anwendungen, aufgrund der Tatsache, dass die erfindungsgemäß erhaltenen Gele in Gegenwart eines wässrigen Mediums ihr ursprüngliches Volumen nicht zurückbilden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es auch möglich, jeden biologisch wirksamen Stoff, für den ein Polysaccharidgelträger erwünscht oder üblich ist, innerhalb der Polysaccharidgelzusammensetzung einzuschließen. In diesem Zusammenhang ermöglicht die beim beanspruchten Verfahren angewandte Verdünnungs-Konzentrations-Technik das Einschließen des biologisch wirksamen Stoffes, bevor das Polysaccharid sterisch ungehinderten Bedingungen ausgesetzt wird. Das heißt, da sterisch gehinderte Bedingungen im allgemeinen einen Konzentrationsvorgang bedeuten, ein solcher Vorgang bedeutet, dass der biologisch wirksame Stoff in einer Phase vorliegt, die verdichteter ist, als zu dem Zeitpunkt, an dem der Stoff in dem Träger eingeschlossen wurde. Mit anderen Worten kann der biologisch wirksame Stoff im Vergleich zu bisher bekannten Gelvernetzungsreaktionen viel länger zurückgehalten werden. Dadurch ist für den wirksamen Stoff ein besseres Freisetzungsprofil bei der verzögerten Freisetzung erreichbar.
In Verbindung mit dem Einschließen des biologisch wirksamen Stoffes in die Zusammensetzung wird bevorzugt eine Einstellung der Bedingungen auf Bedingungen mit physiologischem pH-Wert und Salzkonzentration durchgeführt, um eine für die medizinischen Anwendung gebrauchsfertige Zubereitung zu erhalten. Eine solche physiologische Einstellung wird auch in bezug auf die Reaktionsbedingungen bevorzugt, da festgestellt wurde, dass der zweite Verfahrensschritt unter solchen Bedingungen gut abläuft.
Die Erfindung sollte im Hinblick auf den biologisch wirksamen Stoff in keiner Weise auf die Anwendung des Stoffes in früheren Fällen beschränkt werden. Mit anderen Worten sollten die zu behandelnden Beschwerden entscheidend für die Auswahl des jeweiligen Stoffes sein.
Jedoch können in Verbindung mit der Erfindung interessante Stoffe ausgewählt werden aus Hormonen, Cytokinen, Impfstoffen, Zellen und Gewebe verstärkenden Substanzen. So ist die einzigartige Kombination von Eigenschaften der neuen Gelzusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung in Verbindung mit diesen Stoffen außerordentlich vorteilhaft, das heißt in erster Linie wegen der hervorragenden Depot- oder verzögerten Freisetzungseigenschaften und der Eigenschaft, nicht zu quellen.
Eine interessante Gruppe von biologisch wirksamen Stoffen sind Gewebe verstärkende Substanzen, da ein Polysaccharidgel ein vorteilhafter Träger dafür ist. Nähere Einzelheiten über solche Produkte sind in WO 94/21299 zu finden. Genauer umfasst eine bevorzugte Gewebe verstärkende Substanz ein Polymer, ausgewählt aus Collagen, Stärke, Dextranomer, Polylactid und ihren Copolymeren, und Poly-β-hydroxybutyrat und seinen Copolymeren.
In Verbindung mit Hormonen sind Erythropoietin und Calcitonin besonders bevorzugt.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch das Einschließen des biologisch wirksamen Stoffes durch chemische Reaktion mit der Polysaccharidgelstruktur oder dem Vernetzungsmittel dafür, vorausgesetzt, dass der wirksame Stoff funktionelle Gruppen enthält, die damit reagieren können. Dadurch können einzigartige Eigenschaften oder Eigenschaftskombinationen erhalten werden, da in diesem Falle beispielsweise die Freisetzungsgeschwindigkeit des Wirkstoffes eher durch den Abbau oder die Zerstörung des Polymernetzwerks bestimmt wird als durch die Auflösungs- oder Migrationsgeschwindigkeit des erwähnten Stoffes aus dem Gelnetzwerk.
Eine Modifikation des zuletzt erwähnten erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die funktionellen Gruppen des wirksamen Stoffes mit einem Vernetzungsmittel für das Polysaccharid vorreagiert worden sein können. Bevorzugt wird das gleiche Vernetzungsmittel wie bei der Vernetzung des Polysaccharids verwendet.
Da das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine neue Polysaccharidgelzusammensetzung oder Struktur bereitstellt, ist eine andere Ausführungsform der Erfindung die hergestellte neue Polysaccharidgelzusammensetzung. In dieser Hinsicht umfasst der Schutzumfang nicht nur jede nach dem Verfahren hergestellte Polysaccharidgelzusammensetzung, sondern auch jede Polysaccharidgelzusammensetzung, die durch gleichartige Verfahren erhältlich ist.
Auf andere Weise ausgedrückt, stellt die vorliegende Erfindung auch eine vernetzte biokompatible Polysaccharidgelzusammensetzung bereit, die durch Vernetzung eines vernetzbaren Polysaccharids mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel in zwei Schritten erhältlich ist, wobei der erste Vernetzungsschritt durch sterisches Hindern der Vernetzungsreaktion beendet wird, bevor Gelbildung erfolgt, und der zweite Vernetzungsschritt durch Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Zustände für die Vernetzungsreaktion ausgelöst wird, um so die Vernetzung bis zu einem viskoelastischen Gel fortzuführen.
Alle jene Merkmale, die als bevorzugte oder interessante Merkmale in Verbindung mit dem beanspruchten Verfahren dargestellt wurden, sind auch auf die Polysaccharidgelzusammensetzung als solche anwendbar und brauchen nicht nochmals wiederholt zu werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung wird durch den Fall dargestellt, bei dem ein Zwischenprodukt durch Aufschieben des letzten Schritts der Vernetzungsreaktion mit sterisch ungehinderten Zuständen auf eine spätere Stufe oder Stelle, beispielsweise bei der endgültigen Verwendung der Zusammensetzung, erhalten wird. So wurde festgestellt, dass das nach dem sterischen Hindern der Vernetzungsreaktion erhaltene Zwischenprodukt eine derartige Stabilität besitzt, dass die Beendigung der Vernetzungsreaktion in einer späteren Stufe durchgeführt werden kann.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die oben definierte Zusammensetzung zur Verwendung als ein medizinisches oder prophylaktisches Mittel.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der Zusammensetzung zur Herstellung eines medizinischen oder prophylaktischen Mittels für jeden der vorstehend erwähnten speziellen medizinischen oder therapeutischen Zwecke, wobei Gewebeverstärkung und Hormonbehandlung eines Säugers, besonders eines Menschen, bevorzugte Anwendungen sind.

BEISPIELE

Die Erfindung soll nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht werden.

Beispiel 1

Aktivierung des Polymers

a. unter alkalischen Bedingungen

Ein Polysaccharid in Form von 10 g Hyaluronsäure, durch Fermentation aus Streptococcus hergestellt, wurde in 100 ml 1%iger NaOH mit einem pH-Wert > 9 gelöst. Ein Vernetzungsmittel in Form von 1,4-Butandioldiglycidylether wurde in einer Konzentration von 0,2% zugegeben. Die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 40ºC inkubiert.

b. unter sauren Bedingungen

Der Versuch wurde wie bei 1a ausgeführt, jedoch bei einem sauren pH-Wert von etwa 2 bis 6 durch Zugabe von 1%iger Essigsäure zur Lösung anstatt von NaOH wie bei 1a.

Beispiel 2

Herstellung eines viskoelastischen Gels

Die Inkubate gemäß 1a und 1b wurden auf ein Volumen, das das zweifache des letztlich gewünschten Volumens betrug oder auf etwa 0,5 bis 1% verdünnt und neutralisiert. Das Gel wurde dann am Rotationsverdampfer zu einem viskoelastischen Gel eingedampft.

Beispiel 3

Herstellung eines Dextranomer-Teilchen enthaltenden Gels

Die Inkubate gemäß 1a und 1b wurden auf eine Stärke von 1% verdünnt und 20 g trockene Dextranomer-Teilchen (Sephädex®, Pharmacia) mit der Lösung gemischt, wobei die Teilchen durch Vernetzung des Hyaluronsäure-Polymers als Folge der Hyaluronsäure- Konzentrierung, die durch Wasserabsorption durch die Dextranomer-Kügelchen erfolgt, innerhalb weniger Minuten eingeschlossen werden.
Die erhaltenen viskoelastischen Gele waren stabil, autoklavierbar und mit dünnen Subkutan-Nadeln injizierbar.

Beispiel 4

Herstellung eines Erythropoietin (EPO) enthaltenden Gels zur Anwendung als Depotpräparat

Das in Beispiel 1a erhaltene Inkubat wurde auf eine Stärke von 1% verdünnt und der pH-Wert durch Zugabe eines Citratpuffers gemäß Anweisung des Herstellers (Ortho Biotech Inc., Raritan, USA) für eine gute Stabilität in wässriger Lösung eingestellt. 5 · 10&sup6; I.E. EPO wurden unter Rühren zugegeben. Nach dem Eindampfen der Lösung auf ¹/&sub4; ihres Volumens wurde das Polymer zu einem Depotpräparat vernetzt und eine Menge von 20000 I.E. EPO / ml wiedergefunden.

Beispiel 5

Herstellung eines Calcitonin enthaltenden Gels zur Anwendung als Depotpräparat

100 I.E. / ml Calcitonin vom Lachs (Miacalcic®, Sandoz) wurden mit einer gemäß Beispiel 1b hergestellten 2%igen Polymerlösung gemischt und die Lösung durch Rotationsverdampfen auf 5% (250 I.E. / ml) konzentriert. Ein Pferd mit chronischem Hinken des rechten Vorderbeins wurde zwei Wochen lang mit einer subkutanen Injektion von 2 ml pro Woche behandelt. In den darauf folgenden sechs Wochen war das Pferd schmerzfrei. Das Serum-Calcium war nur um 12% verringert.

Beispiel 6

Herstellung eines Heparin enthaltenden Gels mit verzögerter Freisetzung

In einem verdünnten aktivierten Polymer gemäß Beispiel 4 wurde Heparin in einer Menge von 5% des Polymers gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde eine Stunde lang äquilibriert und daraufhin auf 1/4 des Volumens eingedampft. Eine gerinnungshemmende Freisetzung daraus wurde während 16-tägiger Inkubation in physiologischer Kochsalzlösung beobachtet.

Beispiel 7

Herstellung eines Gels mit kovalent gebundenem Heparin in einer sterisch kontrollierten Position

Ein aktiviertes Polymer gemäß Beispiel 1 wurde unter kräftigem Rühren in Methanol ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag aus feinen Nadeln wurde über Nacht getrocknet. Heparin wurde gemäß Beispiel 1 aktiviert. Nach Inkubation (4 Stunden bei 40ºC) wurde der Polymerniederschlag mit der aktivierten Heparinlösung gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht inkubiert und die Gellösung am folgenden Tag neutralisiert, geteilt und Reaktionsrückstände wurden ausgewaschen.
Das gebildete Gel war in der Lage, Wachstumsfaktoren, unter anderem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), zu binden, zeigte jedoch keine Hemmung der Blutgerinnung.

Beispiel 8

Herstellung eines positiv geladene Gruppen von Chitosan enthaltenden Gels

Die Inkubation eines Gemisches von 7,5 g Hyaluronsäure-Polymer und 2,5 g Chitosan (See Cure®, Protan) wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Nach der Auflösung und Neutralisation wurde eine copolymerisierte viskoelastische Lösung erhalten. Die Lösung wies nach dem Auftragen auf eine langsam heilende Wunde heilungsfördernde Eigenschaften auf.

Beispiel 9

Herstellung eines sterisch gekuppelten Gels

7,5 g Hyaluronsäure wurde gemäß Beispiel 1a aktiviert. In gleicher Weise wurden 2,5 g Dextran aktiviert. Die Hyaluronsäure wurde in Methanol ausgefällt und der Niederschlag dann mit 500 ml einer aktivierten 0,5%igen Dextranlösung gemischt. Nach Rühren und Einstellung von pH-Wert und Salzkonzentration wurde eine viskoelastische Lösung erhalten. 5 ml der Lösung wurden in eine Achillessehnenscheide, die wiederholt Entzündungen in Form von Wundsein und "Knirschen" zeigte, infundiert. Nach vier Wochen waren die Achillessehnenprobleme verschwunden.

Beispiel 10

Herstellung eines GM-CSF enthaltenden Gels zur Anwendung als Depotpräparat

Das Produkt wurde gemäß Beispiel 5 hergestellt, jedoch wurde anstatt Calcitonin Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor, GM-CSF (Leucomax®), 1 mg/g Polymer, zugegeben.

Beispiel 11

Herstellung eines abgetötete Influenza A2-Viren enthaltenden Gels

Die Herstellung wurde wie in Beispiel 4 durchgeführt, jedoch wurden anstelle von EPO 40960 HA-Einheiten abgetötete Influenzaviren vom Pferd pro 100 ml verdünnter aktivierter 1%iger Polymerlösung zugegeben. Nach viermaliger Konzentration enthielt die Zubereitung 1600 HA-Einheiten pro ml. Bei einer Impfung von mehr als 100 Pferden im Zusammenhang mit einer Influenza-Epidemie erwies sich die Zubereitung als hochwirksamer Infektionsschutz, wobei der Schutz für einen langen Zeitraum aufrechterhalten wurde (mehr als 6 Monate).

Beispiel 12

Herstellung eines eine lebende Zellsuspension enthaltenden Frischgels

5 ml einer Fibroblasten-Kultur wurden mit 100 ml einer neutralisierten Lösung gemäß Beispiel 1a gemischt. Das Gemisch wurde oxygeniert und auf die Hälfte des Volumens getrocknet. Eine viskoelastische Lösung, die lebende Zellen enthielt, wurde erhalten.

Beispiel 13

Herstellung eines dichten mikronisierten Gels, das kleine Peptide enthält

Zu einem aktivierten neutralisierten Gel gemäß Beispiel 1a wurden 5 mg eines Peptids mit 12 Aminosäuren gegeben. Das Gel wurde unter Rühren auf 10% eingedampft und in Mineralöl suspendiert. Nach Zugabe von Methanol wurden die trockenen Gelpartikel abfiltriert und Ölrückstände ausgewaschen.

Beispiel 14

Herstellung eines Gels, das das dichte mikronisierte Gel mit kleinen Peptiden gemäß Beispiel 13 enthält

Zu einer 1%igen Lösung eines neutralisierten aktivierten Polymers gemäß Beispiel 1a wurden Microsphären aus Beispiel 13 gegeben. Das Gel wurde dann auf die Hälfte seines Volumens eingedampft. Es wurde ein homogenes injizierbares und stabiles Gel gebildet, das fein dispergierte Microsphären enthielt.

Beispiel 15

Herstellung eines Gels, das sphärische Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kügelchen mit einem Durchmesser von 40-120 um enthält

Zu 5 g eines Polymers, das auf 1% verdünnt und gemäß Beispiel 1a neutralisiert und aktiviert wurde, wurden 100 mg Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kugeln gegeben.
Eindampfen auf ein 3%iges polymeres Gel ergab ein stabiles injizierbares viskoelastisches Gel.

Beispiel 16

Herstellung eines Gels, das PMMA-Fragmente von 500 nm enthält, denen hydrophobes Antigen zugesetzt wurde

Gemäß Beispiel 11 aus A2-Viren hergestelltes Hämagglutinin-Antigen wurde durch hydrophobe Wechselwirkung an 500 nm PMMA-Teilchen adsorbiert. Die Teilchen wurden zu einer 1%igen Lösung gemäß Beispiel 15 gegeben und eine Reduktion des Volumens auf die Hälfte durchgeführt. Ein stabiles homogenes viskoelastisches Gel wurde gebildet, das als Impfstoff mit hoher adjuvanter Wirkung verwendbar war.

Beispiel 17

Vergleich des Quellungsvermögens von herkömmlich hergestellten Gelen und gemäß vorliegender Erfindung hergestellten Gelen bei freier Verfügbarkeit von Wasser

Hyaluronsäuregele, hergestellt nach Laurent et al. (1963) und gemäß obiger Beispiele 1 und 2 wurden auf die Hälfte ihres Quellungsvolumens getrocknet. Danach wurden sie wieder in ihre ursprünglichen Lösungen eingebracht. Die bisher bekannten Gele quollen auf ihr ursprüngliches Volumen, während die Gelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Beispiele 1 und 2 nur unwesentlich quollen (10%).

Beispiel 18

Vergleich zwischen der biologischen Aktivität von EPO, das mit Hyaluronsäure zu einem Gel copolymerisiert wurde, und dem Gel nach Beispiel 1 in das EPO durch Konzentration des Gels eingeschlossen wurde

Vier Patienten, die wegen ihrer durch chronische Urämie verursachten Anämie mit Eprex® (Cilag) behandelt wurden, wurden zwei Monate lang mit einer monatlichen Dosis gemäß folgendem Schema behandelt:
Direkt geliertes Depot: Epoxid-Vernetzung in Gegenwart von EPO unter milden Bedingungen gemäß Beispiel 11.
Kontrolle: EPO gelöst in 4% Hyaluronsäure, Molekulargewicht etwa 6x 106, aus Hahnenkämmen hergestellt gemäß US 4,141,973 (Healon®, Pharmacia).
Konzentrat: EPO in aktiviertes Gel eingeschlossen, das durch Konzentrierung geliert wurde.
Die Dosierung wurde als gesamte monatliche Dosis, die der Patient zur Aufrechterhaltung des Hämoglobinspiegels benötigte, gewählt. Der Serumspiegel von EPO wurde in regelmäßigen Abständen mit einem immunchemischen Verfahren bestimmt.

Ergebnisse

Ein gebräuchliches Verfahren, um die funktionelle Wirkung von Depotpräparaten auszudrücken, ist, die Fläche unter der Kurve zu berechnen (EPO-Einheiten x Tage). Diese Studie liefert auch die Bioverfügbarkeit in Form der Hämoglobinspiegel im Blut mit 0 = unverändert, + = erhöht und - = erniedrigt.

Schlussfolgerung

Ein Einschließen von EPO in ein konzentriertes Depot ergibt während der Untersuchung die größtmögliche Freisetzung. Versuche, die Gelbildungsreaktion in Gegenwart von EPO durchzuführen, zerstörten die Hormone, so dass eine sehr geringe Freisetzung registriert wurde.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer vernetzten biokompatiblen Polysaccharidgelzusammensetzung, das umfaßt:

Bilden einer wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen, vernetzbaren Polysaccharids;

Auslösen einer Vernetzung des Polysaccharids in Gegenwart eines polyfunktionellen vernetzenden Mittels;

Sterisches Hindern der Vernetzungsreaktion bevor sie beendet ist und Gelbildung erfolgt, wodurch ein aktiviertes Polysaccharid erhalten wird;

und Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Zustände für das aktivierte Polysaccharid, um so die Vernetzung bis zu einem viskoelastischen Gel durchzuführen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polysaccharid aus Glucoseaminglucanen ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Glucoseaminglucan Hyaluronsäure umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel aus Epoxiden, Polyaziridylverbindungen und Glycidylethern ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Glycidylether 1,4-Butandioldiglycidylether umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das sterische Hindern der Vernetzungsreaktion Verdünnen des wäßrigen Mediums, in dem die Vernetzungsreaktion abläuft, umfaßt, um eine niedrigere Konzentration des Polysaccharids in dem Medium zu erreichen.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Wiedereinführen von sterisch ungehinderten Bedingungen Eindampfen des wäßrigen Mediums, in dem die Vernetzungsreaktion abläuft, umfaßt, um eine höhere Konzentration des Polysaccharids in dem Medium zu erreichen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Wiedereinführen von sterisch ungehinderten Bedingungen Dialysieren des wäßrigen Mediums, in dem die Vernetzungsreaktion abläuft, umfaßt.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die anfängliche Vernetzungsreaktion in Gegenwart eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels bei einem alkalischen ph-Wert abläuft, wodurch Ether vernetzende Reaktionen gefördert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der alkalische ph-Wert über ph 9 liegt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die anfängliche Vernetzungsreaktion in Gegenwart eines polyfunktionellen Vernetzungsmittels bei einem sauren pH-Wert abläuft, wodurch Ester vernetzende Reaktionen gefördert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der saure ph-Wert bei ph 2 bis 6 liegt.

13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die sterische Hinderung der Vernetzungsreaktion durchgeführt wird, bevor das Vernetzungsmittel aufgebraucht worden ist.

14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein biologisch wirksamer Stoff in der vernetzten Polysaccharidgelzusammensetzung während deren Herstellung eingeschlossen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der biologisch wirksame Stoff bei Bedingungen mit physiologischem pH-Wert und Salzkonzentration eingeschlossen wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 und 15, wobei der wirksame Stoff in der Gelzusammensetzung durch Lösen oder Dispergieren derselben in dem aktivierten Polysaccharid, bevor vorstehend erwähntes Polysaccharid in sterisch ungehinderte Bedingungen überführt wird, eingeschlossen wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei der biologisch wirksame Stoff aus Hormonen, Cytokinen, Impfstoffen, Zellen und Gewebe verstärkenden Substanzen ausgewählt ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Gewebe verstärkende Substanz ein Polymer, ausgewählt aus Collagen, Stärke, Dextranomer, Polylactid und Copolymeren davon, und Poly-β-hydroxybutyrat und Copolymeren davon, umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Hormon aus Erythropoietin und Calcitonin ausgewählt ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei der biologisch wirksame Stoff gegenüber dem Polysaccharid reaktive funktionelle Gruppen enthält und in die Gelstruktur durch chemische Reaktion eingeschlossen ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der funktionelle Gruppen enthaltende biologisch wirksame Stoff mit einem Vernetzungsmittel für das Polysaccharid vorreagiert worden ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Vernetzungsmittel dasselbe Vernetzungsmittel ist, wie es in der Vernetzung des Polysaccharids verwendet wird.

23. Vernetzte biokompatible Polysaccharidgelzusammensetzung, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22.

24. Teilweise vernetzte biokompatible aktivierte Polysaccharidgelzusammensetzung, wie durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 erhalten, bevor das Vernetzen des aktivierten Polysaccharids durch Wiedereinführen der sterisch ungehinderten Bedingungen für die Vernetzungsreaktion fortgeführt wird.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 23 zur Verwendung als ein medizinisches oder prophylaktisches Mittel.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, die als ein Depotpräparat eingestellt ist.

27. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 23 für die Herstellung eines medizinischen oder prophylaktischen Mittels zur Gewebeverstärkung eines Säugers, besonders eines Menschen.

28. Verwendung nach Anspruch 27 für die Herstellung eines medizinischen oder prophylaktischen Depotmittels, besonders für die Hormonbehandlung eines Säugers, besonders eines Menschen.