DE69519124T2

DE69519124T2 - Matrizen auf Basis von Kollagen und synthetischem Polymer hergestellt unter Verwendung einer mehrstufigen Reaktion

Info

Publication number: DE69519124T2
Application number: DE69519124T
Authority: DE
Inventors: Richard A. Berg; Woonza M. Rhee
Original assignee: Collagen Corp
Current assignee: Surgical Specialties US Corp
Priority date: 1994-05-02
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2015-03-17
Also published as: JP4213723B2; DE69519124D1; JP2005320552A; US5475052A; ATE197058T1; CA2143923A1; JPH0853548A; EP0680990B1; AU1507595A; JP2008110229A; JP2006257428A; EP0680990A1; AU698233B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Kollagen-synthetisches Polymer- Matrices, die unter Einsatz einer Mehrschrittreaktion hergestellt werden. Der erste Schritt der Reaktion umfaßt allgemein die Herstellung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix durch Umsetzen von Kollagen mit einem funktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer. Nachfolgende Schritte umfassen eine chemische Modifizierung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix durch Umsetzen der Matrix mit verschiedenen chemischen Substanzen abhängig von der gewünschten Endverwendungsanwendung. Solche Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices und die Verfahren zu deren Herstellung werden hier offenbart.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

WO-A-94/03155 offenbart die Herstellung eines biokompatiblen Hydrogels durch Umsetzen eines Grundgerüsts, wie Kollagen, und eines Vernetzungsmittels, wie einem mehrwertigen Derivat von Polyalkylenglykol, beispielsweise Bis(N-hydroxysuccinimidyl)polyethylenglykoldisuccinat. Das Hydrogel kann nachfolgend mit einer Reportergruppe, die z. B. therapeutisch wirksame Arzneimittel mit umfaßt, beladen werden. Die Hydrogelzusammensetzungen finden eine Vielzahl von chemischen und biomedizinischen Anwendungen. Sie können für eine Arzneimittelabgabe, zum Überziehen von medizinischen Vorrichtungen oder für die Synthese von Kathetern verwendet werden.
Darüber hinaus ist aus US-A-5141747 bekannt, künstliche Membranen herzustellen, indem in einem Schritt Kollagen vernetzt wird und die verbleibenden verfügbaren Aminogruppen des Lysins für eine Umsetzung mit einer anderen Amino-reaktiven Gruppe in einem zweiten Schritt verwendet werden.
Daniels et al., U.S.-Patent Nr. 3,949,073, offenbart die Herstellung von löslichem Kollagen, indem Gewebe in wäßriger Säure gelöst wird, gefolgt von einem enzymatischen Verdau. Das resultierende Atelopeptid-Kollagen ist löslich und wesentlich weniger immunogen als unmodifiziertes Kollagen. Es kann in geeignete Stellen eines Subjekts zusammen mit einer die Fibrillenbildung fördernden Substanz (in dem Patent als Polymerisationspromotor beschrieben) injiziert werden, um faserförmige Kollagen-Implantate in situ zu bilden, um hartes Gewebe oder weiches Gewebe/Weichteile zu verstärken. Dieses Material ist jetzt von Collagen Corporation (Palo Alto, CA) unter der Handelsmarke Zyderm® Collagen Implant kommerziell erhältlich.
Miyata et al., U.S.-Patent Nr. 4,164,559, offenbarten ein ophthalmisches Arzneimittelabgabesystem, das einen dünnen Membranträger aus chemisch modifiziertem Kollagen umfaßt.
Davis et al., U.S.-Patent Nr. 4,179,337, offenbarten eine physiologisch wirksame, wasserlösliche Polypeptidzusammensetzung, die ein physiologisch wirksames Polypeptid, gekoppelt mittels eines Kopplungsmittels an Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol, umfaßt.
Luck et al., U.S.-Patent Nr. 4,488,911, offenbarten ein Verfahren zum Herstellen von Kollagen in Lösung (CIS), wobei natives Kollagen aus tierischem Gewebe in verdünnter wäßriger Säure extrahiert wird, gefolgt von einem Verdau mit einem Enzym, wie Pepsin, Trypsin oder Pronase (eine Handelsmarke von American Hoechst Corporation, Somerville, NJ). Der enzymatische Verdau entfernt die Telopeptidabschnitte der Kollagenmoleküle, wodurch "Atelopeptid"-Kollagen in Lösung bereitgestellt wird. Das so hergestellte Atelopeptid-Kollagen in Lösung ist im wesentlichen nicht-immunogen und ist auch aufgrund des Verlusts der primären Vernetzungsregionen im wesentlichen nicht-vernetzt. Das Kollagen in Lösung kann dann durch Dialyse in einer Umgebung moderater Scherung ausgefällt werden, wodurch Kollagenfasern, die nativen Kollagenfasern ähneln, erzeugt werden. Die präzipitierten, rekonstituierten Fasern kön nen zusätzlich unter Verwendung eines chemischen Mittels (beispielsweise von Aldehyden, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd), von Wärme oder Strahlung vernetzt werden. Die resultierenden Produkte sind aufgrund ihrer Biokompatibilität und verringerten Immunogenität für eine Verwendung in medizinischen Implantaten geeignet.
Chu, U.S.-Patent Nr. 4,557,764, offenbarte ein "zweite Kristallkeimbildung" ("second nucleation") -Kollagenpräzipitat, das eine wünschenswerte Verformbarkeit und kittähnliche Konsistenz aufweist. Kollagen wird in Lösung (z. B. in einer Konzentration von 2 bis 4 mg/ml) bereitgestellt und ein "erstes Kristallkeimbildungsprodukt" ("first nucleation product") wird durch schnelle Titrierung und Zentrifugation ausgefällt. Der zurückbleibende Überstand (der die Hauptmenge des ursprünglichen Kollagens enthält) wird dann dekantiert und über Nacht stehengelassen. Das präzipitierte Produkt der zweiten Kristallkeimbildung wird durch Zentrifugation gesammelt.
Chu, U.S.-Patent Nr. 4,600,533; 4,655,980; 4,689,399; und 4,725,617, offenbarte Verfahren zum Herstellen von Kollagenmembranen mit hoher Zugfestigkeit durch Verdichten und Trocknen von Kollagengelen.
Nguyen et al., U.S.-Patent Nr. 4,642,117, offenbarten ein injizierbares Kollagenmaterial, das aus rekonstituierten, mechanisch gescherten Atelopeptid-Kollagenfasern gebildet wird, die durch wiederholtes Hindurchleiten von rekonstituierten Kollagenfasern durch ein Sieb mit starren Maschen, bis eine substantielle Verringerung an Fasergröße und Größenheterogenität erzielt wird, hergestellt werden. Die mechanisch gescherten Fasern können nachfolgend vernetzt werden.
Ramshaw et al., U.S.-Patent Nr. 4,980,403, offenbarten die Ausfällung von Rinder-Kollagen (Typen I, II und III) aus wäßrigen PEG-Lösungen, wobei keine Hindung zwischen Kollagen und PEG vorliegt.
Miyata et al., Japanische Patentanmeldung 4-227265, veröffentlicht am 17. August 1992, offenbaren eine Zusammensetzung, die Atelopeptid-Kollagen gebunden an eine Polyepoxyverbindung umfaßt. Die Zusammensetzung wird in den Körper injiziert, um länger anhaltende Haut-Lifting-Effekte zu erzielen.
Das U.S.-Patent Nr. 5,162,430 offenbart Kollagensynthetisches Polymer-Konjugate und Verfahren zum kovalenten Binden von Kollagen an synthetische hydrophile Polymere. Dieses Patent offenbarte weiter, biologisch aktive Mittel an synthetische Polymermoleküle zu binden, dann eine Umsetzung mit Kollagen auszuführen, um ein dreiteiliges Kollagensynthetisches Polymer-aktives Mittel-Konjugat zu bilden. Das U.S.-Patent Nr. 5,292,802 offenbart Verfahren zum Herstellen von Röhren oder Schläuchen, die Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugate umfassen. US-A-5, 328,955 offenbart verschiedene aktivierte Formen von Polyethylenglykol und verschiedene Bindungen, die verwendet werden können, um Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugate, die ein Spektrum von physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen, herzustellen. EP-A-0 648 239 offenbart Verfahren zum Überziehen von Implantaten mit Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugaten.
US-A-5,510,418 offenbart Konjugate, die verschiedene Glykosaminoglykan-Spezies kovalent gebunden an synthetische hydrophile Polymere, die gegebenenfalls ebenfalls an Kollagen gebunden sind, umfassen. US-A-5,565,519 offenbart Kollagen- Polymer-Konjugate, die chemisch modifizierte Kollagene, wie beispielsweise succinyliertes Kollagen oder methyliertes Kollagen, kovalent gebunden an synthetische hydrophile Polymere umfassen, um optisch klare Materialien für eine Verwendung in ophthalmischen oder andersartigen medizinischen Anwendungen herzustellen.
EP-A-0 668 081 offenbart Kollagen-synthetisches Polymer- Konjugate, die unter Verwendung von Kollagenen mit kontrollierten Fasergrößenverteilungen, die beispielsweise durch Manipulation des pH des Kollagens erhalten werden können, hergestellt werden.
Alle oben und hier zitierten Veröffentlichungen werden in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen, um den Gegenstand, aufgrund dessen sie zitiert wird, zu beschreiben und zu offenbaren.
Wir offenbaren jetzt Kollagen-synthetisches Polymer- Konjugat-Zusammensetzungen, die unter Einsatz einer Mehrschrittreaktion hergestellt werden.

DEFINITIONEN

Es muß festgehalten werden, daß, wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Singularformen "ein/eine", "ein/eine" und "der/die/das" pluralische Verweise mit umfassen, sofern der Kontext nicht eindeutig anderes angibt. Beispielsweise umfaßt ein Verweis auf "ein Konjugat" ein oder mehrere Konjugatmoleküle, ein Verweis auf "eine Veröffentlichung" umfaßt einen oder mehrere unterschiedliche Typen von Veröffentlichungen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, und ein Verweis auf "das Kollagen" umfaßt Mischungen unterschiedlicher Typen von Kollagenen u. s. w.
Nachfolgend wird spezielle Terminologie von besonderer Bedeutung für die Beschreibung der Erfindung definiert:
Der Begriff "wäßrige Mischung" von Kollagen umfaßt flüssige Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Kolloide und ähnliches, die Kollagen und Wasser enthalten.
Der Begriff "Atelopeptid-Kollagen" bezieht sich auf Kollagene, die chemisch behandelt oder in anderer Weise verarbeitet worden sind, um die Telopeptidregionen, die bekanntermaßen dafür verantwortlich sind, eine Immunreaktion in Menschen auf Kollagene aus anderen tierischen Quellen, wie vom Rind, hervorzurufen, zu entfernen.
Der Begriff "verfügbarer Lysinrest", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf auf der äußeren Oberfläche von Kollagenmolekülen exponierte Lysinseitenketten, die primäre Aminogruppen aufweisen, die in der Lage sind, mit aktivierten poly meren Glykolen zu reagieren. Die Anzahl von verfügbaren Lysinresten kann durch Umsetzung mit Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat (TNBS) bestimmt werden.
Der Begriff "biologisch aktive Moleküle" wird verwendet, um Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und aktive Peptide (die entweder in der Natur vorkommen oder synthetisch sein können), die zum Heilen oder erneuten Wachstum von normalem Gewebe beitragen, zu beschreiben. Die Funktion von biologisch aktiven Molekülen, wie Zytokinen und Wachstumsfaktoren, ist zweifach: 1) sie können lokale Zellen dazu anregen, neues Gewebe zu produzieren, oder 2) sie können Zellen an den Ort, der eine Korrektur benötigt, anziehen. Als solche dienen biologisch aktive Moleküle dazu, eine "biologische Verankerung" eines Implantats innerhalb des Wirtsgewebes zu fördern. Biologisch aktive Moleküle, die in Verbindung mit den Kollagensynthetisches Polymer-Konjugaten der Erfindung nützlich sind, umfassen Zytokine, wie Interferone (IFN), Tumornekrosefaktoren (TNF), Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs) und Wachstumsfaktoren, wie osteogener Faktorextrakt (OFE), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor (TGF) alpha, TGF-β (einschließlich jeder beliebigen Kombination von TGF-βs), TGF-β1, TGF-β2, Thrombozyten-Wachstumsfaktor ("platelet derived growth factor"; PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB), saurer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), basischer FGF, bindegewebsaktivierende Peptide (CTAP), β-Thromboglobulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Erythropoietin (EPO) und Nervenwachstumsfaktor (NGF), sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Der Begriff "biologisch aktive Moleküle", wie er hier verwendet wird, soll ferner Arzneimittel, wie Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Antithrombotika und ähnliches umfassen.
Die Begriffe "chemisch konjugiert" und "konjugiert", wie sie hier verwendet werden, bedeuten angeheftet über eine kovalente chemische Bindung. In der praktischen Ausführung der Erfindung können ein hydrophiles synthetisches Polymer und ein Kollagenmolekül direkt miteinander mittels einer funktionell aktiven Gruppe an dem synthetischen hydrophilen Polymer kovalent konjugiert werden oder das Kollagen und das synthetische Polymer können unter Verwendung einer Verbindungsgruppe kovalent konjugiert werden, so daß das hydrophile synthetische Polymer und das Kollagen jeweils an die Gruppe, aber nicht direkt aneinander gebunden sind.
Der Begriff "Kollagen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Formen von Kollagen, die als Ausgangsmaterialien verwendet werden können, einschließlich jenen, die rekombinant erzeugt worden sind, aus natürlich vorkommenden Quellen (wie Rindercorium oder menschlicher Placenta) extrahiert worden sind, verarbeitet oder in anderer Weise modifiziert worden sind.
Der Begriff "Kollagen in Lösung" oder "CIS" bezieht sich auf Kollagen in einer sauren Lösung, die einen pH von ungefähr 3 oder weniger hat, so daß das Kollagen sich in der nicht- fibrillären Form befindet.
Der Begriff "Kollagensuspension" bezieht sich auf eine Suspension von Kollagenfasern in einem wäßrigen Träger, wie Wasser oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Der Begriff "Kollagen-synthetisches Polymer" bezieht sich innerhalb der Bedeutung dieser Erfindung auf Kollagen, das chemisch an ein synthetisches hydrophiles Polymer konjugiert ist. Beispielsweise bezeichnet "PEG-Kollagen" eine Zusammensetzung der Erfindung, worin Moleküle von Kollagen kovalent an Moleküle von Polyethylenglykol (PEG) konjugiert sind.
"vernetztes Kollagen" bezieht sich auf eine Kollagenzusammensetzung, in der Kollagenmoleküle durch kovalente Bindungen an multifunktionell aktivierte synthetische hydrophile Polymere, wie difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol, gebunden sind.
Der Begriff "dehydratisiert" bedeutet, daß das Material luftgetrocknet oder lyophilisiert ist, um im wesentlichen alles ungebundene Wasser zu entfernen.
Der Begriff "difunktionell aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymere, die chemisch derivatisiert worden sind, so daß sie zwei funktionelle Gruppen aufweisen, die in der Lage sind, mit verfügbaren Lysinresten auf Kollagenmolekülen zu reagieren. Die zwei funktionell aktivierten Gruppen an einem difunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer befinden sich im allgemeinen an den beiden Enden der Polymerkette. Jede funktionell aktivierte Gruppe an einem difunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymermolekül ist in der Lage, eine kovalente Bindung mit einem Kollagenmolekül einzugehen, wodurch eine Vernetzung zwischen den Kollagenmolekülen bewirkt wird.
Der Begriff "effektive Menge" bezieht sich auf die Menge einer Zusammensetzung, die benötigt wird, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Folglich bezieht sich eine "das Gewebewachstum fördernde Menge" einer Zusammensetzung, die ein biologisch aktives Molekül enthält, auf die Menge von biologisch aktivem Molekül, die benötigt wird, um Gewebewachstum in einem nachweisbaren Ausmaß zu stimulieren. In diesem Kontext umfaßt Gewebe ein jegliches Gewebe des Körpers. Die tatsächliche Menge, die als eine wirksame Menge bestimmt wird, wird abhängig von Faktoren, wie der Größe, dem Zustand, Geschlecht und Alter des Patienten, variieren und kann durch den Sorgeberechtigten leichter bestimmt werden.
Der Begriff "fibrilläres Kollagen" bezieht sich auf Kollagene, in denen die dreifachhelikalen Moleküle aufgrund von intermolekularen Ladungswechselwirkungen unter Bildung von dicken Fasern aggregieren, so daß eine Zusammensetzung, die fibrilläres Kollagen enthält, mehr oder weniger undurchsichtig sein wird.
Der Begriff "funktionell aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymere, die chemisch derivatisiert worden sind, so daß sie eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, die in der Lage ist bzw. sind, mit verfügbaren Ly sinresten auf Kollagenmolekülen an verschiedenen Stellen entlang der Polymerkette zu reagieren.
Die Begriffe "Implantat" und "festes Implantat" beziehen sich auf einen jeglichen halbfesten oder festen Gegenstand, der für eine Insertion und Langzeit- oder Kurzzeitverwendung innerhalb des Körpers gedacht ist.
Der Begriff "in situ", wie er hier verwendet wird, bedeutet am Verabreichungsort.
Der Begriff "in situ-Vernetzung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Vernetzen eines Kollagenimplantats mit dem eigenen Kollagen eines Patienten unter Verwendung von multifunktionell aktivierten synthetischen Polymeren, wobei ein funktionell aktiviertes Ende des synthetischen Polymers kovalent mit einem Kollagenmolekül in dem Kollagenimplantat konjugiert ist und das andere funktionell aktivierte Ende des Polymers frei ist, um kovalent an Kollagenmoleküle innerhalb des eigenen Gewebes des Patienten zu binden.
Der Begriff "Molekulargewicht" oder "Molekülmasse", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die massegemittelte Molekülmasse einer Anzahl von Molekülen in einer jeglichen gegebenen Probe, wie er in diesem Fachgebiet üblicherweise verwendet wird. So könnte beispielsweise eine Probe von PEG 2000 eine statistische Mischung von Polymermolekülen, die hinsichtlich des Gewichts von beispielsweise 1500 bis 2500 reichen, wobei ein Molekül sich von dem nächsten geringfügig über einen Bereich unterscheidet, enthalten. Die Angabe eines Molekulargewichts- oder Molekülmassenbereichs weist darauf hin, daß die durchschnittliche Molekülmasse ein jeder Wert zwischen den angegebenen Grenzen sein kann, und kann Moleküle außerhalb dieser Grenzen umfassen. Folglich gibt ein Molekulargewichts- oder Molekülmassenbereich von ungefähr 800 bis ungefähr 20000 eine durchschnittliche Molekülmasse von mindestens ungefähr 800, die bis zu ungefähr 20000 reicht, an.
Der Begriff "monofunktionell aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymere, die chemisch derivatisiert worden sind, so daß sie eine funktionelle Gruppe aufweisen, die in der Lage ist, mit einem verfügbaren Lysinrest auf einem Kollagenmolekül zu reagieren. Die funktionell aktivierte Gruppe an einem monofunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer befindet sich im allgemeinen an einem Ende der Polymerkette. Da sie immer nur an ein Kollagenmolekül binden können, sind monofunktionell aktivierte synthetische hydrophile Polymere nicht in der Lage, eine Vernetzung zwischen Kollagenmolekülen zu bewirken.
Der Begriff "multifunktionell aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymere, die chemisch derivatisiert worden sind, so daß sie zwei oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, die in der Lage sind, mit verfügbaren Lysinresten auf Kollagenmolekülen an verschiedenen Stellen entlang der Polymerkette zu reagieren. Jede funktionell aktivierte Gruppe an einem multifunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymermolekül ist in der Lage, eine kovalente Bindung mit einem Kollagenmolekül auszubilden, wodurch eine Vernetzung zwischen den Kollagenmolekülen bewirkt wird. Typen von multifunktionell aktivierten hydrophilen synthetischen Polymeren umfassen difunktionell aktivierte, tetrafunktionell aktivierte und sternförmig verzweigte Polymere.
Der Begriff "Mehrschrittreaktion", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine spezielle Serie von Reaktionsschritten, die verwendet werden, um eine Matrix, die Kollagen kovalent gebunden an ein hydrophiles synthetisches Polymer umfaßt, herzustellen und nachfolgend zu modifizieren. Solche Mehrschrittreaktionen umfassen im allgemeinen mindestens zwei Reaktionsschritte, wobei der erste von diesen umfaßt, Kollagen kovalent an ein synthetisches hydrophiles Polymer zu binden. Nachfolgende (zweite, dritte, vierte u. s. w.) Reaktionsschritte sind auf eine weitere Modifizierung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix gerichtet. Solche nachfolgenden Schritte werden gemäß den speziellen chemischen und biologischen Eigenschaften, die für die angestrebte Endverwendungsanwendung der Kol lagen-synthetisches Polymer-Matrix benötigt werden, variieren und dementsprechend dadurch festgelegt.
Der Begriff "nicht-fibrilläres Kollagen" bezieht sich auf Kollagene, in denen die dreifachhelikalen Moleküle nicht unter Bildung dicker Fasern aggregieren, so daß eine Zusammensetzung, die nicht-fibrilläres Kollagen enthält, optisch klar sein wird.
Der Begriff "optisch klar", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Gegenstand, der mindestens 90% des sichtbaren Lichts, das auf diesen bei einer Dicke von 1 mm gerichtet wird, hindurchläßt.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbarer fluider Träger" bezieht sich auf fluide Träger für eine Verwendung in injizierbaren oder implantierbaren Formulierungen, die biologisch verträglich oder biokompatibel sind (d. h. keine abträgliche Reaktion hervorrufen, wenn sie injiziert oder in anderer Weise in den menschlichen Körper implantiert werden) und die entweder wäßrig, wie Wasser oder PBS, oder nicht-wäßrig, wie ein biologisch verträgliches Öl, sein können.
Der Begriff "ausreichende Menge", wie er hier verwendet wird, wird auf die Menge von Säure, Base oder Salz angewendet, die der Kollagenzusammensetzung hinzugefügt werden muß, um den gewünschten pH und/oder die gewünschte Fasergröße zu erzielen.
Die Begriffe "synthetisches hydrophiles Polymer" oder "synthetisches Polymer" beziehen sich auf Polymere, die synthetisch erzeugt worden sind und die hydrophil, aber nicht notwendigerweise wasserlöslich sind. Beispiele von synthetischen hydrophilen Polymeren, die in der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden können, sind Polyethylenglykol (PEG), Polyoxyethylen, Polymethylenglykol, Polytrimethylenglykole, Polyvinylpyrrolidone, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen- Blockpolymere und -Copolymere und Derivate davon. Natürlich vorkommende Polymere, wie Proteine, Stärke, Cellulose, Heparin, Hyaluronsäure und Derivate davon, sind ausdrücklich von dem Umfang dieser Definition ausgenommen.
Die Begriffe "behandeln" und "Behandlung", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf ein Ersetzen, eine Verstärkung, Reparatur, Prävention oder Linderung von Schäden in Verbindung mit Weichteilen und/oder hartem Gewebe. Zusätzlich beziehen sich "behandeln" und "Behandlung" auch auf die Prävention, Pflege oder Linderung von Störungen oder Erkrankungen unter Verwendung eines biologisch aktiven Moleküls, das an die Konjugate der Erfindung gekoppelt oder mit diesen gemischt ist.
Mit Ausnahme von jenen, die oben in anderer Weise definiert worden sind, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleichen Bedeutungen, wie sie üblicherweise von einem gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl bei der praktischen Ausführung oder der Untersuchung der Erfindung jegliche Methoden und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu jenen, die hier beschrieben werden, sind, nützlich sein können, werden nachfolgend nur die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, daß die Erfindung auf diese bevorzugten Ausführungsformen beschränkt wird. Die Erfindung soll den durch die beigefügten Ansprüche definierten Umfang haben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt eine Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix, wie in Anspruch 1, 2 und 3 definiert, bereit. Die resultierenden Zusammensetzungen haben eine geringe Immunogenität und können als solche in verschiedenen medizinischen Anwendungen, wie in Arzneimittelabgabesystemen oder bei der Herstellung von verschiedenen geformten Implantaten, verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Herstellen einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, wie in den Ansprüchen 25, 26 und 29 definiert, wie auch einen Implantat überzug, der eine Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix umfaßt, wie in Anspruch 49 definiert, bereit.
Ein Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht darin, daß Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices in einer stärker kontrollierten und reproduzierbaren Weise unter Verwendung einer speziellen Abfolge von Reaktionsschritten (d. h. einer "Mehrschrittreaktion") hergestellt werden können.
Ein anderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices abhängig von der speziellen Serie von eingesetzten Reaktionsschritten speziell maßgeschneidert werden können, so daß sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen, die für eine Verwendung in verschiedenen therapeutischen Anwendungen gewünscht werden.
Noch ein anderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices, die biologisch aktive Mittel enthalten, in einer effizienten, stärker kontrollierten Weise hergestellt werden können, um eine Matrix bereitzustellen, die eine maximale Ausnutzung von biologisch aktiven Mitteln ermöglicht.
Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung können verwendet werden, um synthetische Implantate oder Prothesevorrichtungen zu überziehen zu dem Zweck, die biologische Verträglichkeit des Implantats zu verbessern oder dem Implantat biologische Aktivität zu verleihen in dem Falle, wo biologisch aktive Moleküle an die Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix gebunden sind.
Die Erfindung ermöglicht ferner, implantierbare Vorrichtungen so herzustellen, daß biologisch aktive Mittel entlang der Oberfläche des Implantats, wo sie ihre größte therapeutische Wirkung ausüben können, verteilt sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die relativen Mengen von nicht umgesetztem PEG und gebundenem PEG als Prozentsatz der gesamten Menge von PEG, die dem Kollagen für PEG-Kollagen-Matrices, die eine PEG Konzentration von 1,5 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen, zugesetzt worden ist.
Fig. 2 zeigt die relativen Mengen von nicht umgesetztem PEG und gebundenem PEG als Prozentsatz der gesamten Menge von PEG, die dem Kollagen für PEG-Kollagen-Matrices, die eine PEG- Konzentration von 5,0 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen, zugesetzt worden ist.
Fig. 3 zeigt die relativen Mengen von nicht umgesetztem PEG und gebundenem PEG als Prozentsatz der gesamten Menge von PEG, die dem Kollagen für PEG-Kollagen-Matrices, die eine PEG- Konzentration von 10,0 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen, zugesetzt worden ist.
Fig. 4 zeigt die tatsächliche Menge von gebundenem PEG in Milligramm, die in PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Zweischrittreaktion hergestellt worden sind, gefunden wird im Vergleich zu PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Einschrittreaktion hergestellt worden sind, für Matrices, die eine ursprüngliche PEG-Konzentration von 1,5 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen.
Fig. 5 zeigt die tatsächliche Menge von gebundenem PEG in Milligramm, die in PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Zweischrittreaktion hergestellt worden sind, gefunden wird im Vergleich zu PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Einschrittreaktion hergestellt worden sind, für Matrices, die eine ursprüngliche PEG-Konzentration von 5,0 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen.
Fig. 6 zeigt die tatsächliche Menge von gebundenem PEG in Milligramm, die in PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Zweischrittreaktion hergestellt worden sind, gefunden wird im Vergleich zu PEG-Kollagen-Matrices, die unter Einsatz einer Einschrittreaktion hergestellt worden sind, für Matrices, die eine ursprüngliche PEG-Konzentration von 10,0 mg S- PEG pro ml Kollagen aufweisen.
Fig. 7 zeigt die Gelfestigkeit in Newton (gemessen unter Verwendung des Instron Model 4202) für PEG-Kollagen-Matrices, die PEG-Konzentrationen von 1,5, 5,0 und 10,0 mg S-PEG pro ml Kollagen aufweisen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

Hintergrund der Erfindung

In unseren früheren Anmeldungen haben wir Kollagensynthetisches Polymer-Konjugat-Zusammensetzungen offenbart, die biologisch aktive Mittel, wie Wachstumsfaktoren, enthalten. Es wurden in diesen Anmeldungen zwei Verfahren zum Inkorporieren von Wachstumsfaktoren in die Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat-Zusammensetzungen offenbart: Zumischen der Wachstumsfaktoren zu dem Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat oder kovalentes Binden der Wachstumsfaktoren an das Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat, um ein dreiteiliges Kollagen-synthetisches Polymer-Wachstumsfaktor-Konjugat zu bilden.
Das U.S.-Patent Nr. 5,162,430 offenbarte zwei Verfahren, durch die diese dreiteiligen Konjugate hergestellt werden konnten. Das erste von diesen bestand darin, den Faktor in das Kollagen vor einer Behandlung mit einem aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer zu inkorporieren. Das zweite Verfahren umfaßte, den Faktor mit einem molaren Überschuß eines difunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymers umzusetzen, dann den konjugierten Faktor einer wäßrigen Kollagenmischung zuzusetzen und diesen unter Bildung eines Kollagen-synthetisches Polymer-Wachstumsfaktor-Konjugats reagieren zu lassen.
Seither haben wir entdeckt, daß es möglich ist, zuerst eine vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, indem man Kollagen mit einem aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer umsetzt, dann die Matrix weiter mit verschiedenen chemischen Substanzen, einschließlich biologisch aktiven Mitteln, wie Wachstumsfaktoren, und auch einschließlich, ohne Einschränkung, zusätzlichen synthetischen hydrophilen Polymeren, Glykosaminoglykanen, anderen chemischen Vernetzungsmit teln, Veresterungsmitteln, Amidierungsmitteln, Acylierungsmitteln, Aminosäuren oder Peptiden, umsetzt. Diese chemischen Substanzen können an die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix als ein zweiter Schritt nach der Matrixbildung gebunden werden, entweder mittels verfügbarer Aminogruppen an restlichen Lysinresten auf dem Kollagen in der Matrix oder restlichen nicht umgesetzten funktionellen Gruppen auf Molekülen des synthetischen Polymers, die an die Matrix gebunden sind. Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix wird zuerst gebildet, indem man Kollagen mit einem multifunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer umsetzt, dann wird die Matrix mit einem zweiten funktionell aktivierten synthetischen Polymer (das das gleiche wie das erste Polymer oder davon verschieden sein kann) umgesetzt, um verfügbare funktionelle Gruppen bereitzustellen, an die zusätzliche chemische Substituenten, wie biologisch aktive Mittel oder Glykosaminoglykane, in einer einen dritten Schritt darstellenden Reaktion gebunden werden. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der resultierenden Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix werden selbstverständlich von der speziellen Serie von Reaktionen und den eingesetzten Typen von Reaktanten abhängen.
Die Verfahren der Erfindung ermöglichen die effiziente Herstellung von Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices, die gewünschte Eigenschaften aufweisen, wie biologisch aktive Moleküle, die an die Oberflächen der Matrix gebunden sind, wo sie ihre größte biologische Wirkung ausüben können. Gemäß einem bevorzugten Verfahren zum Herstellen der Kollagensynthetisches Polymer-Matrices der Erfindung wird (a) ein funktionell aktiviertes hydrophiles synthetisches Polymer hergestellt oder in anderer Weise bereitgestellt, (b) Kollagen kovalent an das synthetische hydrophile Polymer gebunden, um eine Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix bereitzustellen, dann wird (c) die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix durch eine oder mehrere von verschiedenen chemischen Reaktionen modifiziert und (d) die modifizierte Kollagen-Polymer-Matrix weiter verändert, indem beispielsweise biologisch aktive Moleküle oder Glykosaminoglykane kovalent an die Matrix mittels verfügbarer funktioneller Gruppen auf der Oberfläche der modifizierten Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix gebunden werden.

Aktivierung von synthetischen hydrophilen Polymeren

Ein kritischer Schritt bei der Bildung der Kollagensynthetisches Polymer-Matrices der Erfindung umfaßt eine Funktionalisierung oder Aktivierung des synthetischen hydrophilen Polymers. Die in der Erfindung nützlichen synthetischen Polymere sind hydrophil, haben mindestens eine und vorzugweise zwei oder mehr funktionelle Gruppen, die in der Lage sind, eine kovalente Bindung mit den Lysinresten auf einem Kollagenmolekül einzugehen, und sind hochgradig rein oder bis zu einem hochgradig reinen Zustand aufgereinigt, so daß das Polymer pharmazeutisch rein ist oder behandelt worden ist, daß es pharmazeutisch rein wird, so daß es in einen menschlichen Patienten injiziert oder implantiert werden könnte. Die meisten hydrophilen synthetischen Polymere können wasserlöslich gemacht werden, indem eine ausreichende Anzahl von Sauerstoff- oder, weniger häufig, Stickstoff-) -atomen, die für eine Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen in wäßrigen Lösungen zur Verfügung stehen, inkorporiert wird. Bevorzugte synthetische Polymere sind hydrophil, aber nicht notwendigerweise wasserlöslich.
Alle geeigneten synthetischen Polymere werden bei einer subkutanen Verabreichung nicht-toxisch, nicht-entzündlich und nicht-immunogen sein und werden vorzugsweise in vivo über einen Zeitraum von zumindest mehreren Monaten im wesentlichen nicht-abbaubar sein. Das hydrophile synthetische Polymer kann die Hydrophilie des Konjugats erhöhen, macht es aber nicht wasserlöslich. Die synthetischen Polymere können linear oder mehrfach verzweigt sein, sind aber typischerweise nicht in wesentlichem Ausmaß vernetzt.
Obwohl verschiedene synthetische hydrophile synthetische Polymere in Verbindung mit einer Bildung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung verwendet werden können, muß das synthetische Polymer biologisch verträglich, hydrophil, aber relativ unlöslich in Wasser sein und ist vorzugsweise eine oder mehrere Formen von derivatisiertem polymerem Glykol, vorzugsweise Polyethylenglykol (PEG), aufgrund von dessen bekannter biologischer Verträglichkeit/Biokompatibilität. Verschiedene Formen von derivatisiertem PEG werden bei der Modifizierung von biologisch aktiven Molekülen umfassend verwendet, da PEG so formuliert werden kann, daß es ein breites Spektrum von Löslichkeiten aufweist, und da ihm Toxizität, Antigenität, Immunogenität fehlen und es typischerweise nicht mit den enzymatischen Aktivitäten und/oder Konformationen von Peptiden interferiert. Darüber hinaus ist PEG im allgemeinen nicht biologisch abbaubar und wird aus den meisten lebenden Organismen, einschließlich Menschen, leicht ausgeschieden.
Multifunktionell aktivierte synthetische Polymere sind für eine Verwendung in der Erfindung am meisten bevorzugt, wobei difunktionell aktivierte Polymere am meisten bevorzugt sind. Multifunktionell aktivierte polymere Glykole haben vorzugsweise eine durchschnittliche Molekülmasse zwischen ungefähr 3000 und 100000. Difunktionell aktivierte polymere Glykole haben vorzugsweise eine durchschnittliche Molekülmasse zwischen ungefähr 400 und ungefähr 40000, am meisten bevorzugt ungefähr 3000 bis ungefähr 10000. Monofunktionell aktivierte Polymere können ebenfalls bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden. Da jedoch monofunktionell aktivierte synthetische Polymere nur eine aktivierte funktionelle Gruppe aufweisen, sind sie in der Lage, kovalent an Kollagen zu konjugieren, aber nicht in der Lage, ein vernetztes Netzwerk zwischen Kollagenmolekülen zu bilden.
Multifunktionell aktivierte synthetische Polymere können unter Verwendung verschiedener in diesem Fachgebiet bekannter Techniken, die funktionelle Gruppen an verschiedenen Stellen entlang des Polymers bereitstellen, hergestellt werden. Difunktionell aktivierte polymere Glykole werden typischerweise hergestellt, indem reaktive Hydroxygruppen an den Enden des Polymers erzeugt werden. Multifunktionell aktivierte synthetische Polymere sind in der Lage, die Zusammensetzungen der Erfindung zu vernetzen, und können ferner verwendet werden, um biologisch aktive Moleküle an das Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat anzuheften.
Verschiedene funktionalisierte Polyethylenglykole sind in Gebieten, wie der Proteinmodifizierung (siehe Abuchowski et al., Enzymes as Drugs, John Wiley & Sons: New York, NY (1981), S. 367-383; und Dreborg et al., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 : 315), Peptidchemie (siehe Mutter et al., The Peptides, Academic: New York, NY 2 : 285-332; und Zalipsky et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1987) 30 : 740) und der Synthese von polymeren Arzneimitteln (siehe Zalipsky et al., Eur. Polym. J. (1983), 19 : 1177; und Ouchi et al., J. Macromol. Sci. -Chem. (1987) A24 : 1011), effektiv verwendet worden. Es sind verschiedene Typen von Konjugaten, die durch das Binden von speziellen pharmazeutisch aktiven Proteinen an funktionell aktiviertes Polyethylenglykol gebildet werden, offenbart worden und es wurde festgestellt, daß sie in medizinischen Anwendungen nützlich sind, teilweise aufgrund der Stabilität solcher Konjugate hinsichtlich eines proteolytischen Verdaus, verringerter Immunogenität und längeren Halbwertszeiten innerhalb von lebenden Organismen.
Eine Form von Polyethylenglykol ist Monomethoxypolyethylenglykol (mPEG), das durch die Zugabe einer Verbindung, wie Cyanurchlorid, aktiviert, dann an ein Protein gekoppelt werden kann (siehe Abuchowski et al., J. Biol. Chem. (1977) 252 : 3578). Obwohl solche Verfahren zum Aktivieren von Polyethylenglykol in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind sie nicht bevorzugt, da das Cyanurchlorid relativ toxisch ist und vollständig aus einem jeglichen resultierenden Produkt entfernt werden muß, um eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung bereitzustellen.
Aktivierte Formen von PEG können aus Reaktanten hergestellt werden, die kommerziell erworben werden können. Eine Form von aktiviertem PEG, die sich als besonders nützlich in Verbindung mit der Erfindung erwiesen hat, ist PEG-succinat-N- hydroxysuccinimidester (SS-PEG) (siehe Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biphys. (1984) 7 : 175). Aktivierte Formen von PEG, wie SS-PEG, reagieren mit Proteinen unter relativ milden Bedingungen und erzeugen Konjugate, ohne die spezifische biologische Aktivität und Spezifität des an das PEG angehefteten Proteins zu zerstören. Wenn jedoch solche aktivierten PEGs mit Proteinen umgesetzt werden, reagieren sie und bilden Verknüpfungen mittels Esterbindungen. Obwohl Esterbindungen in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind sie für eine Verwendung in geformten Implantaten, die für eine Langzeitverwendung innerhalb des menschlichen Körpers bestimmt sind, nicht besonders bevorzugt, da sie eine Hydrolyse durchlaufen, wenn sie physiologischen Bedingungen über längere Zeiträume hinweg unterworfen werden (siehe Dreborg et al., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 : 315; und Ulbrich et al., J. Makromol. Chem. (1986) 187 : 1131).
Es ist möglich, PEG an Proteine über Urethanbindungen zu binden, wodurch eine stabilere Anheftung bereitgestellt wird, die gegenüber einem hydrolytischen Verdau widerstandsfähiger als Esterbindungen ist (siehe Zalipsky et al., Polymeric Drug and Drug Delivery Systems, Kapitel 10, "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol" (1991)). Die Stabilität von Urethanbindungen ist unter physiologischen Bedingungen gezeigt worden (siehe Veronese et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1985) 11 : 141; und Larwood et al., J. Labelled Comnounds Radiopharm. (1984) 21 : 603). Ein anderes Mittel zum Anheften von PEG an ein Protein kann mittels einer Carbamatbindung sein (siehe Beauchamp et al., Anal. Biochem. (1983) 131 : 25; und Berger et al., Blood (1988) 71 : 1641). Die Carbamatbindung wird durch die Verwendung von Carbonyldiimidazol-aktiviertem PEG erzeugt. Obwohl solche Bindungen Vorteile aufweisen, sind die Reaktionen relativ langsam und benötigen bis zum Abschluß 2 bis 3 Tage.
Die verschiedenen oben beschriebenen Mittel zum Aktivieren von PEG und in Verbindung mit den Aktivierungsmitteln zitierten Veröffentlichungen werden in Verbindung mit dem Binden von PEG an spezielle biologisch aktive Proteine und nicht inerte, biologisch inaktive, natürliche Polymere, wie Kollagen, beschrieben (siehe Polymeric Drug and Drug Delivery Systems, Kapitel 10, "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol" (1991)). Solche aktivierten PEG-Verbindungen können bei der Herstellung von kovalent vernetzten Konjugaten verschiedener Kollagene, die bei der Herstellung einer Vielzahl von geformten Implantaten für eine Verwendung in medizinischen Anwendungen verwendet werden können, verwendet werden.

Spezielle Formen von aktiviertem PEG

Für eine Verwendung in der Erfindung wird Polyethylenglykol modifiziert, um funktionelle Gruppen an einer oder vorzugsweise zwei oder mehr Stellen entlang der Länge des PEG- Moleküls bereitzustellen, so daß eine kovalente Bindung zwischen dem PEG und den primären Aminogruppen an einem Kollagenmolekül auftreten kann. Einige spezielle aktivierte Formen von PEG werden mit ihrer Struktur nachfolgend gezeigt wie auch verallgemeinerte Reaktionsprodukte, die erhalten werden, indem man aktivierte Formen von PEG mit Kollagen umsetzt. In den Formeln 1-7 steht der Begriff COL für Kollagen. Der Begriff PEG steht für Polymere, die die sich wiederholende Struktur (OCH&sub2;CH&sub2;)n aufweisen.
Das erste aktivierte PEG ist difunktionell aktiviertes PEG-succinimidylglutarat, das hier als (SG-PEG) bezeichnet wird. Die Strukturformel dieses Moleküls und das Reaktionsprodukt, das erhalten wird, indem man dieses mit einem Kollagen umsetzt, sind in Formel 1 gezeigt.
SG-PEG: Difunktionell aktiviertes PEG-succinimidylglutarat

FORMEL 1

Eine andere difunktionell aktivierte Form von PEG wird als Succinimidyl-PEG (S-PEG) bezeichnet. Die Strukturformel für diese Verbindung und das Reaktionsprodukt, das erhalten wird, in dem man dieses mit Kollagen umsetzt, ist in Formel 2 gezeigt. In einer jeglichen allgemeinen Strukturformel für die Verbindungen ist das tiefgestellte Zeichen 3 durch ein "n" ersetzt. In der in Formel 1 gezeigten Ausführungsform ist n = 3, indem es drei sich wiederholende CH&sub2;-Gruppen auf jeder Seite des PEG gibt. Die Struktur in Formel 2 führt zu einem Konjugat, das eine "Ether"-bindung umfaßt, die keiner Hydrolyse unterliegt. Dies unterscheidet sich von dem in Formel 1 gezeigten Konjugat, in welchem eine Esterbindung Breitgestellt ist. Die Esterbindung unterliegt unter physiologischen Bedingungen einer Hydrolyse.
S-PEG, n = 3: Difunktionell aktiviertes Succinimidyl-PEG

FORMEL 2

Noch eine andere difunktionell aktivierte Form von Polyethylenglykol, in der n = 2, wird in Formel 3 gezeigt wie auch das Konjugat, das gebildet wird, indem man das aktivierte PEG mit Kollagen umsetzt.
S-PEG, n = 2: Difunktionell aktiviertes Succinimidyl-PEG

FORMEL 3

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ähnlich zu den Verbindungen der Formeln 2 und 3 wird bereitgestellt, wenn n = 1. Die Strukturformel und das resultierende Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat sind in Formel 4 ge zeigt. Es wird angemerkt, daß dieses Konjugat sowohl eine Ether- als auch eine Peptidbindung umfaßt. Diese Bindungen sind unter physiologischen Bedingungen stabil.
S-PEG, n = 1: Difunktionell aktiviertes Succinimidyl-PEG

FORMEL 4

Noch eine andere difunktionell aktivierte Form von PEG wird bereitgestellt, wenn n = 0. Diese Verbindung wird als PEG-succinimidylcarbonat (SC-PEG) bezeichnet. Die Strukturformel dieser Verbindung und des Konjugats, das gebildet wird, wenn man SC-PEG mit Kollagen umsetzt, ist in Formel 5 gezeigt.
SC-PEG, n = 0: Difunktionell aktiviertes PEG-succinimidylcarbonat

FORMEL 5

Alle in den Formeln 1 bis 5 abgebildeten aktivierten Polyethylenglykolderivate umfassen das Einschließen der Succinimidylgruppe. Jedoch können davon verschiedene Aktivierungsgruppen an Stellen entlang der Länge des PEG-Moleküls angeheftet werden. Beispielsweise kann PEG derivatisiert werden, um difunktionell aktiviertes PEG-propionaldehyd (A-PEG) zu bilden, das in Formel 6 gezeigt ist wie auch das Konjugat, das durch die Umsetzung von A-PEG mit Kollagen gebildet wird. Die in Formel 6 gezeigte Bindung wird als -(CH&sub2;)n-NH-Bindung, wobei n = 1-10, bezeichnet.
A-PEG: Difunktionell aktiviertes PEG-propionaldehyd

FORMEL 6

Noch eine andere Form von aktiviertem Polyethylenglykol ist difunktionell aktivierter PEG-glycidylether (E-PEG), der in Formel 7 gezeigt ist wie auch das Konjugat, das durch Umsetzen eines solchen mit Kollagen gebildet wird.
E-PEG: Difunktionell aktivierter PEG-glycidylether

FORMEL 7

Viele der oben beschriebenen aktivierten Formen von Polyethylenglykol sind jetzt kommerziell von Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, erhältlich. Die verschiedenen aktivierten Formen von Polyethylenglykol und die verschiedenen Bindungen, die verwendet werden können, um Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugate mit einem Spektrum von physikalischen und chemischen Eigenschaften herzustellen, sind noch detaillierter in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldung Serial-Nr. 07/922,541, eingereicht am 02. Juli 1992, hinsichtlich der eine "Notice of Allowance" ergangen ist, beschrieben.
Die spezielle verwendete Form von funktionell aktiviertem synthetischem hydrophilem Polymer hängt von der gewünschten Endverwendung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix ab. Der Bindungstyp, der zwischen dem Kollagen und dem funktionell aktivierten Polyethylenglykol benötigt wird, wird davon abhängen, ob die Matrix für eine Langzeit- oder Kurzzeitpräsenz innerhalb des Körpers des Patienten vorgesehen ist. Allgemein sind funktionell aktivierte Polyethylenglykole, die zu Etherbindungen führen, für Matrices, die für eine Langzeitverwendung gedacht sind, bevorzugt, da diese Bindungen dazu neigen, widerstandsfähiger als Esterbindungen gegen eine Hydrolyse zu sein. Polyethylenglykole, die zu der schwächeren Esterbindung führen, sollten verwendet werden, wenn gewünscht wird, eine kurzzeitige Präsenz der Matrix innerhalb des Körpers zu haben. Tatsächlich sind Esterbindungen für Matrices bevorzugt, die eine örtlich begrenzte Arzneimittelabgabe ermöglichen sollen. Das kovalent gebundene Arzneimittel wird aus der Kollagensynthetisches Polymer-Matrix in dem Maße freigesetzt, wie die Esterbindungen hydrolysiert werden. Kombinationen von synthetischen Polymeren, die zu unterschiedlichen Bindungen führen, können ebenfalls eingesetzt werden, wie nachfolgend weitergehend beschrieben wird.

Herstellung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix

Aus einer jeglichen Quelle erhaltenes Kollagen kann verwendet werden, um die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung herzustellen. Kollagen kann aus einer menschlichen Quelle oder andersartigen Säugetierquelle extrahiert und gereinigt werden oder kann rekombinant oder auf andere Weise hergestellt werden. Kollagen eines jeglichen Typs kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Typen I, II, III, IV, oder eine jegliche Kombination davon, obwohl Typ I im allgemeinen bevorzugt ist. Atelopeptid-Kollagen ist im allgemeinen gegenüber Telopeptid-enthaltendem Kollagen aufgrund seiner verringerten Immunogenität bevorzugt. Kollagene, die zuvor durch Strahlung, Wärme oder andere chemische Vernetzungsmittel, wie Glutaraldehyd oder Carbodiimid, vernetzt worden sind, sind im allgemeinen als Ausgangsmaterialien nicht bevorzugt. Das Kollagen sollte in einer pharmazeutisch reinen Form vorliegen, so daß es in einen menschlichen Körper eingebracht werden kann, ohne eine jegliche signifikante Immunantwort zu erzeugen.
Durch in diesem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestelltes fibrilläres Kollagen oder kommerziell erhältliche fibrilläre Atelopeptid-Kollagenzusammensetzungen, wie Zyderm® I Col lagen (Kollagen-Konzentration 35 mg/ml) oder Zyderm II Collagen (Kollagenkonzentration 65 mg/ml) sind bevorzugte Ausgangsmaterialien, um die Zusammensetzungen der Erfindung herzustellen. Die Kollagenkonzentration der Kollagensuspension sollte im allgemeinen innerhalb des Bereichs von ungefähr 10 bis ungefähr 120 mg/ml abhängig von der gewünschten Endverwendungsanwendung liegen. Die Kollagenkonzentration von kommerziell erhältlichen Kollagensuspensionen kann verringert werden, indem die Kollagenzusammensetzung mit einer geeigneten Menge von sterilem Wasser oder von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemischt wird. Im Gegensatz dazu kann die Kollagenzusammensetzung zur Erhöhung der Kollagenkonzentration durch Zentrifugation konzentriert, dann auf die gewünschte Kollagenkonzentration durch Mischen mit einer geeigneten Menge von sterilem Wasser oder PBS eingestellt werden.
Nichtfibrilläre Kollagene können ebenfalls bei der praktischen Ausführung der Erfindung verwendet werden. Nichtfibrilläre Kollagene für eine Verwendung in der Erfindung umfassen "Collagen-in-solution" (CIS; Kollagen in Lösung) bei pH 2 wie auch Kollagene, die chemisch modifiziert worden sind, um die Ladungsverteilung auf dem Kollagenmolekül zu verändern und folglich die Faserstruktur des Kollagens zu zerstören. Solche chemisch modifizierten Kollagene umfassen succinyliertes Kollagen und methyliertes Kollagen, die hergestellt werden können, wie von Miyata et al. im U.S.-Patent Nr. 4,164,559 offenbart. Chemisch modifizierte nicht-fibrilläre Kollagene sind mehr oder weniger optisch klar, abhängig von dem Ausmaß chemischer Modifizierung.
Kollagene mit kontrollierten Fasergrößenverteilungen, die hergestellt werden können, wie in EP-A-0 668 081 beschrieben, können ebenfalls verwendet werden, um die Kollagensynthetisches Polymer-Matrices der Erfindung herzustellen.
In einem allgemeinen Verfahren zum Herstellen der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung wird Kollagen zuerst mit einem synthetischen hydrophilen Polymer umgesetzt, um eine Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix herzustellen. Synthetische hydrophile Polymere reagieren mit primären Aminogruppen, die an Lysinresten in Kollagenmolekülen gefunden werden. Beispielsweise enthält Typ I-Kollagen insgesamt 89 Lysinreste. Jeder dieser Lysinreste enthält eine freie (ungebundene) Aminogruppe. Zusätzlich gibt es eine primäre Aminogruppe am N-Terminus von jeder der drei Ketten, die Typ T-Kollagen umfaßt. Dementsprechend enthält jedes Molekül von Typ I- Kollagen insgesamt 92 (89 + 3) Aminogruppen, die für eine Reaktion mit synthetischen hydrophilen Polymeren zur Verfügung stehen.
Die Reaktion zwischen Kollagen und dem synthetischen Polymer wird im allgemeinen in einer kontrollierten Weise ausgeführt (d. h. unter Verwendung eines relativ niedrigen Verhältnisses von synthetischem Polymer zu Kollagen-Molekülen), so daß das Vernetzungsausmaß je nach Wunsch begrenzt oder maximiert wird.
Das synthetische Polymer ist vorzugsweise ein funktionell aktiviertes polymeres Glykol und ist vorzugsweise ein multifunktionell aktiviertes Polyethylenglykol, am meisten bevorzugt ein difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol.
Die Konzentration von aktiviertem synthetischem Polymer, die in dem ersten Schritt der Reaktion verwendet wird, wird abhängig von der verwendeten Kollagenkonzentration, dem verwendeten Typ von aktiviertem Polymer (z. B. S-PEG, SG-PEG u. s. w.), der Molekülmasse des aktivierten Polymers und dem gewünschten Ausmaß an Vernetzung oder Konjugation variieren. Wenn beispielsweise eine Kollagensuspension mit einer Kollagenkonzentration von ungefähr 35 mg/ml mit einem difunktionell aktivierten S-PEG umgesetzt wird, liegt die Konzentration an S-PEG, die verwendet wird, um die kontrollierte Vernetzung zu erzielen, die in dem ersten Schritt der Reaktion gewünscht wird, im allgemeinen innerhalb des Bereichs von ungefähr 1 bis ungefähr 10 Milligramm von difunktionell aktiviertem S-PEG pro Milliliter Kollagensuspension. Bei einer Verwendung einer Kol lagensuspension mit einer Kollagenkonzentration von ungefähr 65 mg/ml liegt die Konzentration von difunktionell aktiviertem S-PEG, die in dem ersten Schritt der Reaktion verwendet wird, im allgemeinen innerhalb des Bereichs von ungefähr 1 bis ungefähr 20 Milligramm S-PEG pro Milliliter Kollagensuspension. Es bleibt nach der den ersten Schritt darstellenden Reaktion im allgemeinen eine Anzahl von primären Aminogruppen an dem Kollagen erhalten.

Chemische Modifizierung der Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix

Nachfolgende (d. h. zweite und/oder dritte) Schritte der Mehrschrittreaktion werden im Großen und Ganzen von der gewünschten Endverwendung der resultierenden Zusammensetzung bestimmt. Jedoch umfaßt der zweite Schritt der Reaktion im allgemeinen eine Modifizierung der verbleibenden primären Aminogruppen an Kollagenmolekülen in der Matrix. Beispielsweise kann die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix weiter mit einem zweiten multifunktionell aktivierten Polymer umgesetzt werden, um ein stärker vernetztes Kollagen-synthetisches Polymer-Netzwerk zu erzeugen oder um ein Netzwerk bereitzustellen, in dem es eine Anzahl von synthetisches Polymer-Molekülen gibt, die freie funktionelle Gruppen aufweisen, die für eine weitere Konjugation mit beispielsweise biologisch aktiven Mitteln oder Glykosaminoglykanen zur Verfügung stehen. Das zweite synthetische Polymer kann vom gleichen oder von einem unterschiedlichen Typ als das erste synthetische Polymer, das verwendet wurde, um die ursprüngliche Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu erzeugen, sein. Wenn beispielsweise ein synthetisches Polymer, das zu der Bildung einer Etherbindung zwischen dem Kollagen und dem Polymer führt, in der ersten Reaktion verwendet wird, kann es wünschenswert sein, ein synthetisches Polymer zu verwenden, das zu der Bildung einer Esterbindung in der zweiten Reaktion führt, oder umgekehrt, wenn die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix im Verlauf der Zeit ab gebaut oder teilweise abgebaut werden soll, wie beispielsweise wenn die Matrix als ein Arzneimittelabgabesystem verwendet wird.
Die Konzentration von aktiviertem synthetischen Polymer, die in dem zweiten Schritt der Reaktion benötigt wird, ist im allgemeinen ungefähr gleich oder im Überschuß zu der Menge, die benötigt wird, um eine vollständige Konjugation aller primären Aminogruppen an dem Kollagen, die abhängig von der verwendeten Kollagenkonzentration und dem Typ und der Molekülmasse des verwendeten aktivierten synthetischen Polymers variieren werden, zu erzielen. Beispielsweise enthält Typ I-Kollagen 92 primäre Aminogruppen pro Molekül und hat eine Molekülmasse von ungefähr 300000 Dalton. Theoretisch wären 92 Moleküle von aktiviertem synthetischem Polymer erforderlich, um alle grimären Aminogruppen auf einem Molekül von Typ I-Kollagen zu konjugieren. Wenn beispielsweise eine Suspension von Typ I- Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 35 mg/ml mit einem synthetischen hydrophilen Polymer mit einer Molekülmasse von 3755 Dalton umgesetzt wird, wären 40,3 Milligramm Polymer pro Milliliter Kollagen erforderlich, um (theoretisch) eine Konjugation aller primären Aminogruppen an jedem Kollagenmolekül zu erzielen, wie folgt:
Polymerkonz. (mg/ml) / Polymer-Molekülmasse (Dalton) · 300000 Dalton / Kollagenkonz. (mg/ml) = 92 oder Polymerkonz. = 92 (Polymer-Molekülmasse) (Kollagenkonz.) / 300000 Dalton
Beispielsweise:
Polymerkonz. = 92 (3.755 Dalton) (35 mg/ml) / 300000 Dalton = 40,3 mg/ml
Dementsprechend würde in diesem speziellen Fall eine Konzentration von synthetischem Polymer von mindestens ungefähr 40 Milligramm synthetisches Polymer pro Milliliter Kollagensuspension (mit einer Kollagenkonzentration von 35 mg/ml) in der zweiten Reaktion verwendet. (Die obige Formel kann auch verwendet werden, um zu bestimmen, welcher Prozentsatz der primären Aminogruppen an dem Kollagen konjugiert worden ist, beruhend auf der Menge von synthetischem Polymer, die tatsächlich an das Kollagen gebunden ist, wie beispielsweise durch HPLC bestimmt wird).
Eine andere Möglichkeit für eine zweite Reaktion besteht darin, die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer zu konjugieren. Obwohl eine Konjugation mit einem monofunktionell aktivierten Polymer das Vernetzungsausmaß in der Matrix nicht erhöhen wird, kann die Verwendung eines monofunktionell aktivierten Polymers mit einer niedrigen Molekülmasse dazu dienen, das Kollagen zu "überziehen", indem es eine Bindung mit primären Aminogruppen eingeht, die in der ersten Reaktion nicht konjugiert worden sind, was zu einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix mit verringerter Immunogenität verglichen mit früheren Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat-Zusammensetzungen führen kann. Wenn dementsprechend ein Implantat mit einer extrem geringen Immunogenität das angestrebte Ziel ist, sollte ein Konjugieren der vernetzten Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer der zweite Schritt in der Reaktion sein.
Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die in dem ersten Schritt der Reaktion gebildet wird, kann auch mittels eines jeglichen einer Anzahl von herkömmlichen chemischen Vernetzungsmitteln, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Glutaraldehyd, Divinylsulfon, Epoxiden, Carbodiimiden und Imidazol, weiter vernetzt werden. Die benötigte Konzentration an chemischem Vernetzungsmittel hängt von dem speziellen verwendeten Mittel und dem gewünschten Ausmaß an Vernetzung ab.
Noch eine andere Möglichkeit für eine Modifizierung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix besteht darin, Aminosäuren oder Peptide an das Kollagen in der Matrix zu binden, indem zuerst die Aminosäure oder das Peptid an ein difunktionell aktiviertes synthetisches Polymer gekoppelt wird, dann dieses mit der vorab gebildeten Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix umgesetzt wird. Alternativ kann die Aminosäure oder das Peptid chemisch modifiziert werden, so daß sie bzw. es funktionelle Gruppen aufweist, die in der Lage sind, mit verfügbaren Aminogruppen an Kollagenmolekülen in der Matrix zu reagieren. Diese Aminosäuren oder Peptide können als Anheftungspunkte dienen, um andere Polymere, die chemisch derivatisiert worden sind, so daß sie direkt mit Aminosäureresten reagieren, an die Matrix zu binden. Solche Polymere umfassen, ohne Beschränkung, Glykosaminoglykane, Poly(N-acetylglycosamin) und Poly(alkylenoxide), wie Polyethylenglykol, Polypropylenoxid, Polybutylenoxid u. s. w.
Eine andere Option besteht darin, das Kollagen in der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix mittels verschiedener chemischer Reaktionen, wie beispielsweise Veresterung, Amidierung oder Acylierung, abhängig von der gewünschten Endverwendung der Matrix zu modifizieren. Eine Veresterung kann bewerkstelligt werden, indem die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix mit einem jeglichen geeigneten Veresterungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Butanol, umgesetzt wird. Eine Amidierung kann bewerkstelligt werden, indem die Matrix mit einem jeglichen geeigneten Amidierungsmittel, wie Glutarsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid, umgesetzt wird. Eine Acylierung kann bewerkstelligt werden, indem die Matrix mit einem geeigneten Acylierungsmittel, wie Benzoylchlorid oder Butyrylchlorid, umgesetzt wird. Eine jegliche Umsetzung, die zu einer Veränderung der Ladungsverteilung auf dem Kollagen führt, wird eine Zerstörung der Kollagenfaserstruktur verursachen, was zu Biomaterialien führt, die mehr oder weniger transparent sind, abhängig von dem Ausmaß, bis zu welchem das Kollagen chemisch modifiziert worden ist.
Die gleichzeitig anhängige U.S.-Anmeldung Seriah-Nr. 08/147,227 ebenfalls im Namen der gegenwärtigen Anmelder offenbarte die Konjugation von synthetischen hydrophilen Polymeren an Kollagene, die zuvor chemisch modifiziert worden sind, so daß sie nicht-fibrillär waren, wie methyliertes Kollagen oder succinyliertes Kollagen. Jedoch ist nicht-fibrilläres Kollagen sehr viskos. Aufgrund seiner hohen Viskosität kann ein Mischen des nichtfibrillären Kollagens mit synthetischen hydrophilen Polymeren ziemlich schwierig sein, was zu einer nicht gleichförmig vernetzten Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix führt, die nicht wünschenswert ist, wenn beispielsweise vorgeformte oder in situ-vernetzte Linsen(kern)prothesen für eine Langzeitverwendung auf dem Auge hergestellt werden. Andererseits ist fibrilläres Kollagen weniger viskos, elastischer, im allgemeinen leichter zu handhaben und wird leichter mit synthetischen hydrophilen Polymeren gemischt als nicht- fibrilläres Kollagen. Es ist dementsprechend vorteilhaft, bei der Herstellung einer ophthalmischen (oder einer jeglichen anderen optisch klaren) Vorrichtung, fibrilläres Kollagen als Ausgangsmaterial zu verwenden, das Kollagen mit einem synthetischen hydrophilen Polymer zu mischen, um eine Kollagensynthetisches Polymer-Matrix zu bilden, dann die resultierende Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix chemisch zu modifizieren, wie beispielsweise durch Veresterung oder Amidierung, um ein optisch transparentes Implantat herzustellen.
In einem anderen Verfahren zum Herstellen von optisch klaren Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices wird nicht-fibrilläres Kollagen, wie CIS, mit einem pH von ungefähr 3 oder weniger auf pH 7 neutralisiert, dann unverzüglich mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer umgesetzt, um das Auftreten einer Faserbildung zu verhindern, was zu der Bildung eines optisch klaren Kollagen-synthetisches Polymer- Konjugats führt. Das resultierende Kollagen-synthetisches Po lymer-Konjugat kann durch eine feine Gauge-Nadel extrudiert werden, da es die intermolekularen Vernetzungen nicht enthält, die erhalten werden, wenn ein multifunktionell aktiviertes Polymer verwendet wird. Das klare Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat kann nachfolgend unter Verwendung eines multifunktionell aktivierten synthetischen Polymers vernetzt werden, um eine optisch klare Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix bereitzustellen.

Weitere (in einem dritten Schritt erfolgende) Modifizierung der Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix

Eine Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die gemäß einer oder mehreren der oben beschriebenen Reaktionen modifiziert worden ist, kann einer einen dritten Schritt darstellenden Reaktion unterworfen werden, in der biologisch aktive Moleküle oder Glykosaminoglykane kovalent an die Matrix gebunden werden mittels der restlichen aktiven Gruppen an den synthetisches Polymer-Molekülen, die kovalent an die Matrix gebunden sind.
Das U.S.-Patent Nr. 5,162,430 ebenfalls im Namen der gegenwärtigen Anmelder offenbarte das Binden von biologisch aktiven Mitteln an synthetisches Polymer-Moleküle, dann Umsetzen mit Kollagen, um ein dreiteiliges Kollagen-synthetisches Poly- mer-aktives Mittel-Konjugat zu bilden. Bei einem Binden des biologisch aktiven Mittels an das synthetische Polymer mußte jedoch ein großer Überschuß von Polymermolekülen eingesetzt werden, um eine Hauptmenge von Konjugaten zu erhalten, die aktives Mittel-synthetisches Polymer-X (wobei X eine freie funktionelle Gruppe an dem synthetisches Polymer-Molekül ist) zu erhalten und die Möglichkeit zu verringern, aktives Mittelsynthetisches Polymer-aktives Mittel-Konjugate zu erhalten, die inaktiv sind und darüber hinaus keine restlichen aktiven Gruppen aufweisen, um an die Kollagenmatrix zu binden. Die aktives Mittel-synthetisches Polymer-X-Konjugate wurden nachfol gend mit Kollagen gemischt, um aktives Mittel-synthetisches Polymer-Kollagen-Konjugate zu bilden.
Das obige Verfahren war ineffizient, da einige der aktiven Mittel nach wie vor aktives Mittel-synthetisches Polymeraktives Mittel-Konjugate bildeten. Ebenso war es schwierig, Matrices mit hoher biologischer Aktivität herzustellen, da die Konzentration von aktivem Mittel bezogen auf die Konzentration von synthetischem Polymer niedrig sein mußte, um eine Bildung der aktives Mittel-synthetisches Polymer-aktives Mittel- Konjugate zu verhindern. Ein Zusammengeben des biologisch aktiven Mittels, synthetischen Polymers und Kollagens zur gleichen Zeit erwies sich als sogar noch ineffizienter aufgrund der relativ großen Anzahl von aktives Mittel-synthetisches Polymer-aktives Mittel-Konjugaten, die sich bildeten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Kollagen kovalent an ein synthetisches hydrophiles Polymer, das vorzugsweise ein difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol ist, gebunden, vorzugsweise mittels einer Etherbindung, um eine vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix zu bilden. Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix wird weiter modifiziert, indem, vorzugsweise mittels einer Esterbindung, ein zweites synthetisches hydrophiles Polymer, das vorzugsweise ein difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol ist, kovalent an die restlichen primären Aminogruppen an dem Kollagen gebunden wird. (Jegliches nicht umgesetztes synthetisches Polymer kann zu diesem Zeitpunkt von der Kollagensynthetisches Polymer-Matrix fortgewaschen werden). In einem dritten Schritt werden biologisch aktive Mittel (oder Glykosaminoglykane oder deren Derivate) kovalent an jegliche restlichen aktiven Enden von synthetischen Polymeren, die über eine funktionelle Gruppe an die Kollagen-synthetisches Polymer- Matrix gebunden sind, gebunden.
Ein Koppeln von biologisch aktiven Molekülen an die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix stellt ein wirksames Abgabesystem für eine länger andauernde Arzneimittelfreisetzung be reit oder kann dazu dienen, die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix biologisch mit Wirtsgewebe zu "verankern". Die Menge von biologisch aktivem Mittel, die benötigt wird, um therapeutisch wirksam zu sein, hängt von dem speziellen verwendeten Mittel ab. Ein Koppeln von Glykosaminoglykanen oder deren Derivaten an die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix führt zu Implantatzusammensetzungen mit neuen physikalischen und chemischen Eigenschaften abhängig von dem verwendeten Typ von Glykosaminoglykan und den relativen Mengen von Kollagen und Glykosaminoglykan in der Zusammensetzung. Glykosaminoglykane für eine Verwendung in der Erfindung umfassen Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Dermatansulfat, Keratansulfat, Keratosulfat, Chitin, Chitosan, Heparin und Derivate davon. Beispielsweise haben Glykosaminoglykane, wie Heparin, einzigartige gerinnungshemmende Eigenschaften, die diese für eine Verwendung in oder auf einem jeglichen mit Blut in Kontakt kommenden Implantat oder einer jeglichen mit Blut in Kontakt kommenden Vorrichtung, wie einem Gefäßtransplantat oder künstlichen Organ, sehr wünschenswert machen.
Das obige Verfahren ist eine sehr effiziente Methode, um biologisch wirksame Matrices herzustellen, indem die Möglichkeit, aktives Mittel-synthetisches Polymer-aktives Mittel- Konjugate zu erhalten, vermieden wird, da mindestens ein Ende jedes Polymermoleküls bereits an ein Kollagenmolekül gebunden ist.

VERWENDUNG UND VERABREICHUNG

Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung können verwendet werden, um Implantate für eine Verwendung in verschiedenen medizinischen Anwendungen, wie beispielsweise Gefäßtransplantate, künstliche Organe und Herzklappen, herzustellen. In einem allgemeinen Verfahren zum Herstellen von geformten Implantaten werden Kollagen und ein multifunktionell aktiviertes synthetisches Polymer gemischt und in die gewünschte Größe und Gestalt gegossen oder geformt, bevor eine substantielle Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem Polymer stattgefunden hat. Man läßt das Kollagen und das synthetische Polymer inkubieren und vernetzen, um die gewünschte Größe und Gestalt zu erzielen. Ist einmal der erste Schritt der Vernetzungsreaktion abgeschlossen, kann das geformte Implantat weiter unter Verwendung von multifunktionell aktivierten synthetischen Polymeren oder herkömmlichen chemischen Vernetzungsmitteln weiter vernetzt, unter Verwendung von monofunktionell aktivierten synthetischen Polymeren konjugiert und/oder an biologisch aktive Mittel gekoppelt werden. Die den zweiten Schritt darstellende Reaktion kann beispielsweise bewerkstelligt werden, indem das Implantat in eine Lösung des gewünschten Mittels eingetaucht wird. Bei einer Herstellung von Implantaten für eine Verwendung in Kontakt mit Blut, wie Gefäßtransplantaten oder künstlichen Herzklappen, kann es beispielsweise vorteilhaft sein, ein antithrombotisches Mittel oder ein Mittel, das eine Anheftung von Plättchen an das Implantat verhindert, anzukoppeln. Ein Konjugieren von biologisch aktiven Mitteln an das Implantat auf eine solche Weise führt dazu, daß die meisten der biologisch aktiven Mittel entlang der Oberflächen des Implantats verteilt werden, wo sie ihre größte therapeutische Wirkung entfalten können. Ein Konjugieren des Implantats mit monofunktionell aktivierten synthetischen Polymeren kann dazu dienen, Thrombosen oder eine Plättchenanheftung zu verringern, indem die Oberfläche des Implantats "geglättet" ("smoothing out") und allgemein weniger immunogen oder reaktiv gemacht wird.
Schläuche, die aus Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung hergestellt werden, können als Gefäßtransplantate oder Stents oder als Ersatzmaterialen für jegliche andere beschädigte oder schadhafte nicht-vaskuläre Lumen innerhalb des Körpers, wie in den reproduktiven oder urologischen Systemen, beispielsweise beschädigte Eileiter oder Harnröhren, verwendet werden. Verfahren zum Herstellen von Kollagensynthetisches Polymer-Schläuchen für eine Verwendung in ver- schiedenen Anwendungen werden eingehender in dem U.S.-Patent Nr. 5,292,802 beschrieben.
Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung können auch verwendet werden, um synthetische Implantate für eine Implantierung innerhalb des Körpers, einschließlich, ohne Beschränkung, Knochen- und Gelenkprothesen, spiralförmig gewundenen Platindrähten zum Behandeln von Aneurysmen, Brustimplantaten, Kathetern, künstlichen Organen, Gefäßtransplantaten (wie Dracon®- oder Teflon®-Transplantate) und -stents, Nahtmaterialien und künstlichen Bändern oder Sehnen, zu überziehen. Das Implantat wird mit einer Lösung, die Kollagen und synthetisches Polymer enthält, überzogen, bevor eine substantielle Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem Polymer erzielt worden ist. Man läßt das Kollagen und das synthetische Polymer auf der Oberfläche des Implantats vernetzen. Ist einmal der erste Schritt der Vernetzungsreaktion abgeschlossen, kann das Implantat unter Verwendung von multifunktionell aktivierten synthetischen Polymeren oder herkömmlichen chemischen Vernetzungsmitteln weiter vernetzt, unter Verwendung von monofunktionell aktivierten synthetischen Polymeren konjugiert und/oder an biologisch aktive Mittel gekoppelt werden. Beispielsweise kann ein synthetisches Gefäßtransplantat zuerst mit einer Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat-Zusammensetzung überzogen werden, die nachfolgend an antithrombotische Mittel, Anti-Plättchen-Anheftungsmittel oder Glykosaminoglykane mit gerinnungshemmenden Eigenschaften, wie Heparin, gekoppelt werden kann. Im Falle eines Knochenimplantats kann es vorteilhaft sein, an den Kollagen-synthetisches Polymer-Überzug auf dem Implantat Knochen-morphogene Proteine oder osteogene Faktoren zu koppeln, die das Wachstum von neuem Knochen um das Implantat herum fördern und/oder in anderer Weise die Inkorporation des Implantats innerhalb des Wirtsgewebes vereinfachen. Verfahren zum Überziehen von Implantaten mit Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugaten werden detaillierter in der gleichzeitig anhängigen U.S.-Anmeldung Serial-Nr. 07/984,933, eingereicht am 02. Dezember 1992, beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Mischung von Kollagen und einem synthetischen hydrophilen Polymer in einer Menge, die ausreicht, um zuzlassen, daß eine begrenzte Vernetzung auftritt, auf die Oberfläche des zu überziehenden Gegenstands aufgetragen, bevor eine substantielle Vernetzung stattgefunden hat. Man läßt eine Vernetzung des Kollagens und des synthetischen Polymers auf der Oberfläche des Implantats auftreten, wonach das Implantat in eine Lösung eines zweiten synthetischen hydrophilen Polymers eingetaucht wird. In einer einen dritten Schritt darstellenden Reaktion läßt man eine Substanz, wie ein biologisch aktives Mittel oder ein Glykosaminoglykan, mit restlichen funktionellen Gruppen auf synthetischen Polymeren, die an die als Beschichtung auf das Implantat aufgebrachte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix gebunden sind, reagieren. Dieses Verfahren erlaubt, Implantate effizient herzustellen, so daß biologisch aktive Mittel auf den Oberflächen des Implantats verteilt werden, wo sie ihre größte therapeutische Wirkung entfalten können.
Beispielsweise werden in einer speziellen bevorzugten Ausführungsform zum Herstellen von überzogenen Gefäßtransplantaten oder Stents Kollagen und ein aktiviertes synthetisches Polymer in einem relativ niedrigen Verhältnis von synthetischem Polymer zu Kollagen zusammengegeben, um eine teilweise vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, und vor dem Auftreten einer substantiellen Vernetzung in die Gestalt eines Schlauchs gegossen, um einen teilweise vernetzten Kollagen-synthetisches Polymer-Schlauch zu bilden. Der resultierende Schlauch wird dann in das Innere eines synthetischen Stents, wie beispielsweise eines solchen, der aus einem Metalldraht gebildet worden ist, eingepaßt. Es wird ein zweiter teilweise vernetzter Kollagen-synthetisches Polymer-Schlauch gebildet und auf der äußeren Oberfläche des Stents angeordnet.
Die zwei Kollagen-synthetisches Polymer-Schläuche müssen nicht die gleichen Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise könnte in einer einen zweiten Schritt darstellenden Reaktion nach dem Bilden der teilweise vernetzten Kollagensynthetisches Polymer-Matrix der äußere Schlauch kovalent an ein biologisch aktives Mittel, wie einen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise TGF-β, gebunden werden, um die Inkorporation des Stents in das umgebende Gewebe zu unterstützen. Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix des inneren Schlauchs könnte kovalent an ein Antithrombosemittel, wie Heparin, gebunden werden, um Blut an einer Gerinnung an der inneren Oberfläche des Stents zu hindern. Dementsprechend könnten synthetische hydrophile Polymere, die bei einer Bindung an Kollagen unterschiedliche Typen von Bindungen ausbilden, verwendet werden, um die inneren und äußeren Schläuche zu bilden. Beispielsweise kann die Kollagenmatrix des äußeren Schlauchs mittels eines synthetischen Polymers gebunden sein, das zu der Bildung einer Esterbindung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer führt. Als solche werden die Bindungen zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer mit der Zeit in dem Maße langsam hydrolysieren, wie die äußere Oberfläche des Stents in das umgebende Gewebe inkorporiert wird. Im Gegensatz dazu kann die Kollagenmatrix des inneren Schlauchs mittels eines synthetischen Polymers gebunden sein, die zu der Bildung einer Etherbindung führt, da es wichtig ist, daß die innere Oberfläche des Stents für eine lange Zeitdauer stabil und unreaktiv bleibt.
Die gesamte mit Kollagen-synthetisches Polymer überzogene Stentstruktur wird dann in eine Lösung eines funktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymers, das vom gleichen oder einem unterschiedlichen Typ sein kann wie jenes, das verwendet wird, um einen der zwei Kollagen-synthetisches Polymer- Schläuche zu bilden, gelegt oder eingetaucht. Man läßt die inneren und äußeren Kollagen-synthetisches Polymer-Schläuche dann mittels der Öffnungen im Stent miteinander vernetzen, um eine einzelne kontinuierliche Oberfläche zu bilden.
Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices der Erfindung können ferner spezifisch als Systeme für eine örtliche/lokalisierte Arzneimittelabgabe verwendet werden. Das gewünschte therapeutische Mittel kann direkt an die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix gekoppelt werden, die dann in den Körper an der Stelle, die einer Therapie bedarf, wie einer Wunde oder einem Tumor, implantiert werden kann. Die therapeutischen Mittel werden aus der Matrix in dem Maße freigesetzt, wie die kovalenten Bindungen zwischen den Mitteln und der Matrix langsam durch enzymatischen Abbau aufgelöst werden. In einer solchen Situation kann es vorteilhaft sein, ein synthetisches Polymer zu verwenden, das zu einer Etherbindung führt, wenn in der ersten Reaktion die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix gebildet wird, so daß die Matrix selbst relativ stabil und widerstandsfähig gegen einen hydrolytischen Abbau ist. Das therapeutische Mittel selbst kann in der zweiten Reaktion mittels eines synthetischen Polymers, das eine Esterbindung bildet, an die Matrix gekoppelt werden, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des Mittels in dem Maße führt, wie die Esterbindungen zwischen dem Mittel und dem synthetischen Polymer im Verlauf der Zeit hydrolysieren. Alternativ kann eine Mischung von synthetischen Polymeren, einigen, die zu der Etherbindung führen, und einigen, die zu der Esterbindung führen, verwendet werden, um die Mittel an die Matrix zu koppeln, so daß einige der Mittel über längere Zeit hinweg freigesetzt werden und einige der Mittel an die Matrix angeheftet bleiben, wobei sie aktiv bleiben und eine biologische Wirkung auf das natürliche Substrat für das aktive Zentrum des Proteins bereitstellen.
Optisch klare Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices können ebenfalls hergestellt werden, indem die Mehrschrittreaktionen der Erfindung angewendet werden. Solche Matrices können in verschiedenen ophthalmischen Anwendungen verwendet werden, wie detaillierter unten beschrieben wird, oder in einer jegli chen therapeutischen Anwendung, wo ein optisch klares Material wünschenswert ist. In einem Verfahren zum Herstellen einer optisch klaren Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix wird Kollagen zuerst mit einem multifunktionell aktivierten synthetischen Polymer umgesetzt, um eine optisch klare vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix herzustellen, die formgepreßt oder in anderer Weise geformt werden kann, um ein ophthalmisches Implantat, wie eine vorgeformte Linsen(kern)prothese oder eine künstliche Hornhaut oder Linse, zu bilden. Die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix kann dann, beispielsweise durch Veresterung oder Amidierung, chemisch modifiziert werden, um die ionischen Wechselwirkungen zwischen Kollagenmolekülen zu verringern, was zu einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix führt, die mehr oder weniger transparent ist, abhängig von dem Ausmaß chemischer Modifizierung der Matrix.
Alternativ kann nicht-fibrilläres Kollagen, wie CIS, mit einem pH von ungefähr 3 oder weniger auf pH 7 neutralisiert, dann unverzüglich mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer umgesetzt werden, um zu verhindern, daß eine Faserbildung auftritt, was zu der Bildung eines optisch klaren Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat führt. Das resultierende Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat kann durch eine feine Gauge-Nadel extrudiert werden, da es die intermolekularen Vernetzungen, die erhalten werden, wenn ein multifunktionell aktiviertes Polymer verwendet wird, nicht enthält. Das klare Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat kann nachfolgend unter Verwendung eines multifunktionell aktivierten synthetischen Polymers vernetzt werden, wie beispielsweise bei der Bildung einer in situ-polymerisierbaren Linsen(kern)prothese auf der Hornhaut eines Auges.
Die oben beschriebenen Mehrschritttechniken zur Herstellung von optisch klaren Kollagen-synthetisches Polymer-Matrices können auch verwendet werden, um Membranen für eine Verwendung in verschiedenen Anwendungen, wie der Wundheilung, Arzneimittelabgabe oder Adhäsionsprävention, herzustellen.
Beispielsweise wird eine Suspension von fibrillärem Kollagen mit einem multifunktionell aktivierten synthetischen Polymer gemischt, dann als eine dünne Schicht auf den Boden eines flachen Folienbehälters gegossen, bevor eine substantielle Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem Polymer stattgefunden hat. Die resultierende dünne Membran wird weiter mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer umgesetzt, um jegliche restlichen reaktiven Gruppen an dem Kollagen mit synthetischem Polymer zu überziehen, und dann gegebenenfalls lyophilisiert. Verschiedene Wundheilungsmittel, wie TGF-β, oder Arzneimittel, wie entzündungshemmende Mittel oder Antibiotika, können an die Kollagen-synthetisches Polymer-Membran gekoppelt werden. Faktoren, die ein Einwachsen von Gewebe zwischen Organe verhindern, können an Membranen für eine Verwendung zur Adhäsionsprävention gekoppelt werden.
In einem alternativen Verfahren zum Bilden von Membranen wird Kollagen zuerst mit einem monofunktionell aktivierten synthetischen Polymer umgesetzt. Das resultierende Kollagensynthetisches Polymer-Konjugat kann extrudiert werden, um in situ eine Membran zu bilden, dann nachfolgend unter Verwendung eines multifunktionell aktivierten synthetischen Polymers vernetzt werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden angegeben, um den gewöhnlichen Fachleuten auf diesem Gebiet eine vollständige Offenbarung und Beschreibung, wie die bevorzugten Ausführungsformen der Konjugate, Zusammensetzungen und Vorrichtungen herzustellen sind, bereitzustellen, und sind nicht dazu gedacht, den Umfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, zu beschränken. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Genauigkeit hinsichtlich der verwendeten Zahlenangaben (z. B. Mengen, Temperatur, Molekülmasse u. s. w.) sicherzustellen, aber es sollte mit einigen experimentellen Irrtümern und Abweichungen gerechnet werden. Sofern nicht anders angegeben, sind Teilangaben Gewichtsteile, ist die Molekülmasse die massegemittelte Molekülmasse, wird die Temperatur in Grad Celsius angegeben und liegt der Druck bei oder nahe Atmosphärendruck.

Beispiel 1

(Herstellung von PEG-Kollagen-Matrices unter Verwendung einer Einschrittreaktion)
Proben wurden, wie folgt, hergestellt: Ein (1) Milliliter Zyderm I Collagen (Kollagenkonzentration 35 mg/ml, erhältlich von Collagen Corporation, Palo Alto, Kalifornien) wurde mit 1,5 mg, 5 mg oder 10 mg trockenem, difunktionell aktiviertem S-PEG (Molekülmasse 3.755) mittels Spritze-zu-Spritze-Mischens unter Verwendung von ungefähr 40 bis 50 Passagen, um sicherzustellen, daß das Mischen vollständig war, gemischt. Die Proben enthielten S-PEG-Konzentrationen von 1,5, 5,0 bzw. 10,0 mg PEG pro ml Kollagen. Die Proben wurden in ihren jeweiligen Spritzen bei 37ºC 16 h inkubiert. Die resultierenden vernetzten PEG-Kollagen-Matrices wurden aus dem breiten Ende der Spritzen ausgestoßen. Jede der drei zylindrischen 1 ml-Matrices wurde in zwei Hälften geschnitten. Eine Hälfte jeder PEG-Kollagen- Matrix wurde in ihre jeweilige Spritze für weitere Experimente zurückgegeben.
Jede der drei verbleibenden 0,5 ml-Matrices wurde mit Wasser gewaschen, um jegliches nicht umgesetztes PEG zu entfernen. Das Wasser, das nicht umgesetztes PEG enthielt, wurde für jede Probe zurückbehalten.
Die PEG-Kollagen-Matrices wurden dann 1 h in 1 M NaOH bei 65-70ºC gelegt, um das gebundene PEG zu hydrolysieren. Eine Hydrolyse wurde ausgeführt, um die kovalenten Bindungen zwischen dem Kollagen und dem gebundenen PEG aufzulösen, so daß die Menge von tatsächlich an das Kollagen gebundenem PEG nachfolgend durch HPLC quantifiziert werden konnte, wie in Beispiel 2 unten beschrieben. Das PEG wurde aus jeder der drei 0,5 ml-Proben unter Verwendung von CHCl&sub3; extrahiert. Das CHCl&sub3; wurde nachfolgend unter N&sub2; verdampft. Der PEG-Rückstand wurde dann in Wasser gelöst.

Beispiel 2

(Quantifizierung von gebundenem PEG in unter Verwendung einer Einschrittreaktion hergestellten PEG-Kollagen-Matrices)
Die Proben, die das nicht umgesetzte PEG und das zuvor gebundene (hydrolysierte) PEG, erhalten aus den PEG-Kollagen- Matrices, die unter Verwendung der Einschrittreaktion hergestellt worden waren, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, enthielten, wurden dreifach durch HPLC analysiert, um die Menge von PEG zu quantifizieren, die an das Kollagen gebunden worden war. Eine HPLC-Analyse von PEG-Proben wurde unter Verwendung einer isokratischen Elution ausgeführt. Die Bedingungen der HPLC-Analyse waren, wie folgt:
Säule: Waters Ultrahydrogel 250
Porengröße: 250 Angström
Säulengröße: 7,8 mm · 30 cm
Ausschlußgrenze: 8 · 104 Dalton
Injektionsvolumen: 20 ul
Mobile Phase: 5 mM Natriumacetatpuffer, pH = 5,5 bei 21ºC
Strömungsrate: 0,5 ml/min
Druck: 0,8 mPa
Detektor: Doppeldetektorsystem, Brechungsindex & UV bei 260 nm
Unter Verwendung von PEG-Lösungen verschiedener Konzentrationen wurde eine externe Standard-Kalibrierungskurve erhalten. Die Stammlösung wurde hergestellt, indem 10,0 mg difunktionell aktiviertes S-PEG in 1,000 ml entionisiertem Wasser gelöst wurden. Es wurden Reihenverdünnungen der Lösung auf 5,00, 2,50, 1,25, 0,625 und 0,3125 mg/ml hergestellt und durch HPLC analysiert. Nach Integration des Peaks mit einer Retentionszeit von 16 min wurde die Peakfläche gegen jede Konzentration des PEG-Standards aufgetragen.
Die Fig. 1-3 zeigen die relativen Mengen von nicht umgesetztem PEG und gebundenem PEG als Prozentsatz der Gesamtmenge von PEG, die dem Kollagen für die PEG-Kollagen-Matrices mit S-PEG-Konzentrationen von 1,5, 5,0 bzw. 10,0 mg/ml zugesetzt worden ist.
Wie in Fig. 1 gezeigt, enthielt die Probe mit einer S- PEG-Konzentration von 1,5 mg/ml kein nicht umgesetztes S-PEG. Wie in Fig. 2 gezeigt, enthielt die Probe mit einer S-PEG- Konzentration von 5,0 mg/ml eine geringe Menge (ungefähr 10- 15%) nicht umgesetztes S-PEG. Wie in Fig. 3 gezeigt, zeigte die Probe mit einer S-PEG-Konzentration von 10,0 mg/ml eine geringfügig höhere Menge von nicht umgesetztem S-PEG, ungefähr 20% der Gesamtmenge von S-PEG, die dem Kollagen ursprünglich zugesetzt worden war.

Beispiel 3

(Herstellung von PEG-Kollagen-Matrices unter Verwendung einer Zweischrittreaktion)
Die 0,5 ml-PEG-Kollagen-Matrices, die in ihre Spritzen zurückgelegt worden waren, wurden dann durch die Nadelenden ihrer jeweiligen Spritzen extrudiert, um die Matrices in kleine Stücke zu zerbrechen. Die zerbrochenen Matrices wurde in Teströhrchen eingebracht und 100 mg difunktionell aktiviertes S-PEG, gelöst in ungefähr 1-2 ml PBS, wurden jedem der drei Teströhrchen zugesetzt. Die Teströhrchen, die die zerbrochenen PEG-Kollagen-Matrices und PEG im Überschuß enthielten, wurden ungefähr 16 h bei 37ºC inkubiert.
Jede der drei PEG-Kollagen-Matrices wurde mit Wasser gewaschen, um jegliches nicht umgesetztes PEG zu entfernen. Die PEG-Kollagen-Matrices wurden dann 1 h in 1 M NaOH bei 65-70ºC gelegt, um das gebundene PEG zu hydrolysieren. Eine Hydrolyse wurde ausgeführt, um die kovalenten Bindungen zwischen dem Kollagen und dem gebundenen PEG aufzulösen, so daß die PEG- Menge, die tatsächlich an das Kollagen gebunden war, nachfolgend durch HPLC quantifiziert werden konnte, wie in Beispiel 4 unten beschrieben. Das PEG wurde aus jeder der drei Proben unter Verwendung von CHCl&sub3; extrahiert. Das CHCl&sub3; wurde nachfolgend unter N&sub2; verdampft. Der PEG-Rückstand von jeder Probe wurde dann in Wasser gelöst.

Beispiel 4

(Quantifizierung von gebundenem PEG in unter Verwendung einer Zweischrittreaktion hergestellten PEG-Kollagen-Matrices)
Die Proben, die das zuvor gebundene (hydrolysierte) PEG, erhalten aus den unter Verwendung der Zweischrittreaktion, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, hergestellten PEG-Kollagen- Matrices, enthielten, wurden dreifach durch HPLC unter Verwendung der gleichen Bedingungen, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, analysiert, um die PEG-Menge zu quantifizieren, die an das Kollagen gebunden worden war. Die Fig. 4-6 zeigen die tatsächlichen Mengen (in Milligramm) von gebundenem PEG, die in den unter Verwendung der Zweischrittreaktion hergestellten PEG-Kollagen-Matrices verglichen mit Matrices, die unter Verwendung der Einschrittreaktion hergestellt worden sind, für PEG-Kollagen-Matrices mit ursprünglichen S-PEG-Konzentrationen von 1,5, 5,0 bzw. 10,0 mg/ml gefunden werden.
Jedes Kollagenmolekül enthält 92 primäre Aminogruppen, die für eine Reaktion mit funktionell aktivierten synthetischen Polymeren zur Verfügung stehen. Theoretisch sollten dementsprechend 92 PEG-Moleküle in der Lage sein, mit den 92 primären Aminogruppenresten an einem Kollagenmolekül zu konjugieren. Bei einer S-PEG-Konzentration von 1,5 mg pro ml Kollagen sind ungefähr 3,6 Moleküle S-PEG pro Kollagen-Molekül vorhanden. Dementsprechend steht nach wie vor eine große Anzahl von Lysinresten für eine weitere Vernetzung mit dem im Überschuß vorliegenden (100 mg) PEG, das in dem zweiten Schritt der Vernetzungsreaktion zugesetzt worden war, zur Verfügung. Wie in Fig. 4 gezeigt, enthielt die PEG-Kollagen-Matrix mit einer ursprünglichen S-PEG-Konzentration von 1,5 mg/ml ungefähr 16- 17 mg S-PEG pro 0,5 ml-Matrix nach dem zweiten Schritt der Re aktion, was ungefähr 76-80 Moleküle S-PEG pro Kollagenmolekül repräsentiert.
Wie in Fig. 7 gezeigt, zeigen von den drei während dieses Experiments ausgewerteten S-PEG-Konzentrationen (1,5, 5,0 und 10,0 mg S-PEG pro ml Kollagen) PEG-Kollagen-Matrices mit einer S-PEG-Konzentration von 5,0 mg/ml die beste Gelfestigkeit (wie unter Verwendung des Instron Model 4202 gemessen), was anzeigt, daß ein optimaler Vernetzungsgrad zwischen dem PEG und dem Kollagen bei dieser S-PEG-Konzentration erzielt worden ist. Eine S-PEG-Konzentration von 5,0 mg pro ml Kollagen repräsentiert ungefähr 12 Moleküle S-PEG pro Kollagenmolekül. Wie in Fig. 5 gezeigt, enthielt die PEG-Kollagen-Matrix mit einer ursprünglichen S-PEG-Konzentration von 5,0 mg/ml ungefähr 10-11 mg S-PEG pro 0,5 ml-Matrix nach dem zweiten Schritt der Vernetzungsreaktion, was ungefähr 48-52 Moleküle S-PEG pro Kollagenmolekül repräsentiert. Aufgrund des eng vernetzten PEG-Kollagen-Netzwerks, das bei einer S-PEG-Konzentration von 5,0 mg/ml erzielt wird, könnte eine sterische Hinderung ein Binden von viel zusätzlichem S-PEG an die Kollagenmatrix verhindern, was erklären würde, warum die PEG-Kollagen- Matrices mit einer ursprünglichen S-PEG-Konzentration von 5,0 mg/ml eine geringere Menge von gebundenem S-PEG nach der zweiten Vernetzungsreaktion enthalten als die Matrices, bei denen eine ursprüngliche S-PEG-Konzentration von nur 1,5 mg/ml vorlag.
Wie in Fig. 6 gezeigt, enthielt die PEG-Kollagen-Matrix mit einer ursprünglichen S-PEG-Konzentration von 10,0 mg/ml ungefähr 24-25 mg S-PEG pro 0,5 ml nach dem zweiten Schritt der Vernetzungsreaktion, was ungefähr 96-100 Moleküle S-PEG pro Kollagenmolekl repräsentiert. Wie in Fig. 7 gezeigt, zeigen PEG-Kollagen-Matrices mit einer S-PEG-Konzentration von 10,0 mg/ml eine Gelfestigkeit, die ungefähr gleich ist zu jener von PEG-Kollagen-Matrices mit einer S-PEG-Konzentration von 1,5 mg/ml und signifikant geringer ist als jene von PEG- Kollagen-Matrices mit einer S-PEG-Konzentration von 5,0 mg/ml.
Eine S-PEG-Konzentration von 10,0 mg pro ml Kollagen repräsentiert ungefähr 24 Moleküle S-PEG pro Kollagenmolekül. Bei dieser S-PEG-Konzentration werden viele der difunktionell aktivierten S-PEG-Moleküle einfach jeweils an ein Kollagenmolekül konjugiert, wodurch verfügbare Vernetzungsstellen an dem Kollagenmolekül beseitigt werden und das S-PEG technisch monofunktionell (hinsichtlich einer weiteren Reaktion) gemacht wird. Dieses Phänomen verursacht die Erzeugung eines lockerer vernetzten PEG-Kollagen-Netzwerks.
Aufgrund dessen wurde zugelassen, daß viel zusätzliches S- PEG an das PEG-Kollagen-Netzwerk während der im zweiten Schritt erfolgenden Vernetzungsreaktion band trotz der großen Menge PEG, die bereits gebunden worden war. Das durch die hohe ursprüngliche PEG-Konzentration in der Matrix erzeugte lockerere Netzwerk verhinderte die sterische Hinderung, von der angenommen wurde, daß sie bei der optimaler vernetzten 5,0 mg/ml-PEG-Kollagen-Matrix aufgetreten ist. Da viele der S-PEG- Moleküle nur an ein Kollagenmolekül anstelle von zweien gebunden waren, stand nach wie vor eine große Anzahl von primären Aminogruppen für eine weitere Konjugation mit PEG zur Verfügung.
Locker vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer-Netzwerke sind bei verschiedenen Anwendungen wünschenswert. Beispielsweise sind diese Matrices ideal für eine Abgabe von biologisch aktiven Mitteln, da sie viele synthetisches Polymer-Moleküle enthalten, die an die Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nur über eine funktionelle Gruppe gebunden sind (anstatt zwei Kollagenmoleküle zu vernetzen, indem mit jeder seiner zwei funktionellen Gruppen ein Kollagenmolekül gebunden wird), und dementsprechend eine andere funktionelle Gruppe aufweisen, die für ein Binden eines biologisch aktiven Moleküls, wie eines Wachstumsfaktors oder eines anderen Arzneimittels, zur Verfügung steht. Umgekehrt können auch Glykosaminoglykane auf eine solche Weise an die PEG-Kollagen-Matrix gebunden werden.
Locker vernetzte Kollagen-synthetisches Polymer-Netzwerke, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, sind auch nützlich in Anwendungen, wo eine in situ-Vernetzung des Kollagensynthetisches Polymer-Implantats mit Wirtsgewebe gewünscht wird, aufgrund der vielen freien funktionellen Gruppen an den synthetisches Polymer-Molekülen, die für ein Binden an Kollagenmoleküle des Wirts zur Verfügung stehen.

Claims

1. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die ein biologisch aktives Mittel, ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat trägt, hergestellt durch das Verfahren eines:

Umsetzens von Kollagen oder einem Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat mit einem ersten multifunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer, um ein Kollagen-synthetisches Polymer-Matrixintermediat zu bilden,

weiteren Umsetzens des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einer ersten chemischen Substanz, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, wobei die erste chemische Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer, einem chemischen Vernetzungsmittel, einem Veresterungsmittel, einem Amidierungsmittel, einem Acylierungsmittel, einer funktionell aktivierten Aminosäure oder einem funktionell aktivierten Peptid und Kombinationen davon, und

Bindens einer zweiten chemischen Substanz an die modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, wobei die zweite chemische Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem biologisch aktiven Mittel, einem Glykosaminoglykan oder einem Glykosaminoglykanderivat.

2. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, hergestellt durch das Verfahren eines:

Umsetzens von Kollagen oder einem Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat mit einem ersten multifunktionel 1 (an mehreren funktionellen Gruppen) aktivierten Vernetzungsmittel, bestehend aus einem synthetischen hydrophilen Polymer, um ein Kollagen-synthetisches Polymer-Matrixintermediat zu bilden,

weiteren Vernetzens des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einem zweiten multifunktionell aktivierten Vernetzungsmittel, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, wobei das zweite multifunktionell aktivierte Vernetzungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer und einem chemischen Vernetzungsmittel, und

Bindens eines biologisch aktiven Mittels an das zweite multifunktionell aktivierte Vernetzungsmittel in der modifizierten Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix.

3. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die ein biologisch aktives Mittel, ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat trägt, hergestellt durch das Verfahren eines:

weiteren Umsetzens des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, und

Bindens einer Substanz an die modifizierte Kollagensynthetisches Polymer-Matrix, wobei die Substanzausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem biologisch aktiven Mittel, einem Glykosaminoglykan und einem Glykosaminoglykanderivat.

4. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Kollagen fibrilläres Atelopeptid-Kollagen ist.

5. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 3, wobei das erste synthetische hydrophile Polymer und/oder das zweite synthetische hydrophile Polymer ein funktionell aktiviertes polymeres Glykol ist.

6. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 5, wobei das funktionell aktivierte polymere Glykol ein difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol ist.

7. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 3, wobei das Kollagen und das erste und/oder das zweite synthetische hydrophile Polymer mittels einer Bindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Etherbindung, einer Esterbindung und einer Urethanbindung, kovalent gebunden sind.

8. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die erste chemische Substanz ein zweites synthetisches hydrophiles Polymer ist.

9. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 8, wobei das zweite synthetische hydrophile Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem difunktionell ak tivierten Polymerglykol und einem monofunktionell aktivierten Polyethylenglykol.

10. Modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 3, wobei die zweite chemische Substanz ein biologisch aktives Mittel ist.

11. Modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 3, wobei die zweite chemische Substanz ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat ist.

12. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die zweite chemische Substanz ein biologisch aktives Mittel ist.

13. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 12, wobei das biologisch aktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Wachstumsfaktor, einem Zytokin, einem Antibiotikum, einem entzündungshemmenden Mittel, einem Antithrombotikum und einem aktiven Peptid.

14. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die zweite chemische Substanz ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat ist.

15. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 14, wobei die chemische Substanz ein Glykosaminoglykan, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Dermatansulfat, Keratansulfat, Keratosulfat, Chitin, Chitosan und Heparin, ist.

16. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die erste chemische Substanz ein chemisches Vernetzungsmittel ist.

17. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 16, wobei das chemische Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glutaraldehyd, Formaldehyd, Divinylsulton, einem Carbodiimid, einem Epoxid und Imidazol.

18. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die erste chemische Substanz ein Veresterungsmittel ist.

19. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 18, wobei das Veresterungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol.

20. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die erste chemische Substanz ein Amidierungsmittel ist.

21. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 20, wobei das Amidierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glutarsäureanhydrid und Bernsteinsäureanhydrid.

22. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 1, wobei die erste chemische Substanz ein Acylierungsmittel ist.

23. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 22, wobei das Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Benzoylchlorid und Butyrylchlorid.

24. Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix nach Anspruch 3, wobei das Kollagen und das erste synthetische hydrophile Polymer mittels einer Etherbindung kovalent gebunden sind und das Kollagen und das zweite synthetische hydrophile Polymer mittels einer Esterbindung kovalent gebunden sind.

25. Verfahren zum Herstellen einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die ein biologisch aktives Mittel, ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat trägt, welches umfaßt:

Umsetzen von Kollagen oder einem Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat mit einem ersten multifunktionell aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer, um ein Kollagen-synthetisches Polymer-Matrixintermediat zu bilden,

weiteres Umsetzen des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einer ersten chemischen Substanz, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, wobei die erste chemische Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer, einem chemischen Vernetzungsmittel, einem Veresterungsmittel, einem Amidierungsmittel, einem Acylierungsmittel, einer funktionell aktivierten Aminosäure oder einem funktionell aktivierten Peptid und Kombinationen davon, und

Binden einer zweiten chemischen Substanz an die modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, wobei die zweite chemische Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem biologisch aktiven Mittel, einem Glykosaminoglykan oder einem Glykosaminoglykanderivat.

26. Verfahren zum Herstellen einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, welches umfaßt:

Umsetzen von Kollagen oder einem Kollagen-synthetisches Polymer-Konjugat mit einem ersten multifunktionell (an mehreren funktionellen Gruppen) aktivierten Vernetzungsmittel, bestehend aus einem synthetischen hydrophilen Polymer, um ein Kollagen-synthetisches Polymer-Matrixintermediat zu bilden,

weiteres Vernetzen des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einem zweiten multifunktionell aktivierten Vernetzungsmittel, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, wobei das zweite Vernetzungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer und einem chemischen Vernetzungsmittel, und

Binden eines biologisch aktiven Mittels, eines Glykosaminoglykans oder eines Glykosaminoglykanderivats an das zweite multifunktionell aktivierte Vernetzungsmittel in der modifizierten Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ein biologisch aktives Mittel an das zweite multifunktionell aktivierte Vernetzungsmittel gebunden wird.

28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat an das zweite multifunktionell aktivierte Vernetzungsmittel gebunden wird.

29. Verfahren zum Herstellen einer Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, die ein biologisch aktives Mittel, ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat trägt, welches umfaßt:

weiteres Umsetzen des Kollagen-synthetisches Polymer- Matrixintermediats mit einem zweiten synthetischen hydrophilen Polymer, um eine modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix zu bilden, und

Binden eines biologisch aktiven Mittels, eines Glykosaminoglykans oder eines Glykosaminoglykanderivats an die modifizierte Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei das Kollagen fibrilläres Atelopeptid-Kollagen ist.

31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das erste und/oder das zweite synthetische hydrophile Polymer ein funktionell aktiviertes polymeres Glykol ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das funktionell aktivierte polymere Glykol ein difunktionell aktiviertes Polyethylenglykol ist.

33. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Kollagen und das erste und/oder das zweite synthetische hydrophile Polymer mittels einer Bindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Etherbindung, einer Esterbindung und einer Urethanbindung, kovalent gebunden werden.

34. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die erste chemische Substanz ein zweites synthetisches hydrophiles Polymer ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das zweite synthetische hydrophile Polymer ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem difunktionell aktivierten Polyethylenglykol und einem monofunktionell aktivierten Polyethylenglykol.

36. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die zweite chemische Substanz ein biologisch aktives Mittel ist.

37. Verfahren nach Anspruch 27 oder 36, wobei das biologisch aktive Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem Wachstumsfaktor, einem Zytokin, einem Antibiotikum, einem entzündungshemmenden Mittel, einem Antithrombotikum und einem aktiven Peptid.

38. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die zweite chemische Substanz ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat ist.

39. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die zweite chemische Substanz ein Glykosaminoglykan, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat C, Dermatansulfat, Keratansulfat, Keratosulfat, Chitin, Chitosan und Heparin, ist.

40. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die erste chemische Substanz ein chemisches Vernetzungsmittel ist.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das chemische Vernetzungsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Glutaraldehyd, Formaldehyd, Divinylsulfon, einem Carbodiimid, einem Epoxid und Imidazol.

42. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die erste chemische Substanz ein Veresterungsmittel ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das Veresterungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol... und Butanol, ausgewählt wird.

44. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die erste chemische Substanz ein Amidierungsmittel ist.

45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Amidierungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Glutarsäureanhydrid und Bernsteinsäureanhydrid, ausgewählt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die erste chemische Substanz ein Acylierungsmittel ist.

47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Acylierungsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Benzoylchlorid und Butyrylchlorid, ausgewählt wird.

48. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Kollagen und das erste synthetische hydrophile Polymer mittels einer Etherbindung kovalent gebunden werden und das Kollagen und das zweite synthetische hydrophile Polymer mittels einer Esterbindung kovalent gebunden werden.

49. Implantatbeschichtung, umfassend eine Kollagen-synthetisches Polymer-Matrix, hergestellt durch das Verfahren eines:

50. Implantatbeschichtung nach Anspruch 49, wobei die zweite chemische Substanz ein biologisch aktives Mittel ist.

51. Implantatbeschichtung nach Anspruch 50, wobei die erste chemische Substanz ein zweites synthetisches hydrophiles Polymer ist.

52. Implantatbeschichtung nach Anspruch 49, wobei die erste chemische Substanz ein zweites synthetisches hydrophiles Polymer ist.

53. Implantatbeschichtung nach Anspruch 49, wobei die zweite chemische Substanz ein Glykosaminoglykan oder ein Glykosaminoglykanderivat ist.

54. Implantatbeschichtung nach einem der Ansprüche 49 bis 53, wobei die Beschichtung verwendet wird, um ein Implantat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Gefäßtransplantat, einem Gefäßstent und einer Gefäßstent-Transplantat-Kombination, zu überziehen.