DE69302262T2

DE69302262T2 - Kollagenmikrokapseln enthaltende injezierbare zusammensetzung

Info

Publication number: DE69302262T2
Application number: DE69302262T
Authority: DE
Inventors: Alain Huc; Isabelle Orly
Original assignee: Coletica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 1992-01-16
Filing date: 1993-01-14
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2013-01-15
Also published as: FR2686250A1; DE69302262D1; ATE136773T1; EP0621776B1; EP0621776A1; ES2090969T3; FR2686250B1; CA2127885A1; JPH07503001A; WO1993013755A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist im wesentlichen auf injizierbare Zusammensetzungen, welche eine Suspension von Mikrokapseln auf der Basis von Kollagen enthalten, ihre biomedizinische Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf die Herstellung eines injizierbaren Trägers gerichtet, der das Erhalten von Füllungen für Substanzverluste oder das einfache Einführen aktiver Substanzen in den Organismus eines Lebewesens, insbesondere eines Menschen, ermöglicht.

STAND DER TECHNIK

Zahlreiche Untersuchungen wurden über die Herstellung von Füllmaterialien durchgeführt. Hinsichtlich der Füllung von Weichgeweben können angegeben werden:
- Injektionen von Silikon, Gelatine, autologem und heterologem Kollagen,
- die Implantation von Fäden (Catgut, Gore-Tex oder Kollagen).
Heute zeigt sich klar, daß das leistungsfähigste Material hinsichtlich Biokompatibilität und Stabilität in vivo heterologes (von Rindern) Kollagen (injizierbar und Fasern) ist.
Die häufigsten Anwendungen von Füllmaterialien für Weichgewebe betreffen im wesentlichen die Behandlung von Hautvertiefungen und Substanzverlusten im Gesicht aufgrund des Alters (Falten) oder aus anderen Gründen (Krankheiten, Traumata, chirurgische Eingriffe, ...), die sich als Narben, Atrophien, Unregelmäßigkeiten, etc. ... zeigen.
In bestimmten dieser Fälle ist die Verwendung vernetzter Kollagenfasern, wie im Dokument Nr. 91 04518, eingereicht von BIOETICA, aufgrund der biokompatiblen Eigenschaften, der Stabilität in vivo und des erhöhten Füllvermögens dieses Biomaterials bes onders angezeigt.
Wenn sich die Verwendung dieser Fasern auch perfekt zum Füllen tiefer Falten eignet, erweist sie sich jedoch in anderen Situationen (beispielsweise oberflächliche Falten, Hautdefekte die nicht in Form einer Furche auftreten) als weniger geeignet. In diesem Fällen ist es notwendig, auf eine injizierbare Form zurückzugreifen.
Außerdem gibt es außerhalb der kosmetischen Chirurgie medizinische Gebiete (Otorhinolaryngologie, Urologie, Orthopädie, ...), für welche die Beschaffenheit der durchzuführenden Füllungen und/oder die Zugänglichkeit der Implantationsstellen die Verwendung einer injizierbaren Form unbedingt erfordert.
- Die neuesten bestehenden Erfindungen sind in den Dokumenten EP-83 868 A1, EP-A-0 196 197 und EP-89 145 A2, eingereicht von COLLAGEN CORPORATION, EP-132 979 A2, eingereicht von KOKEN CO. LTD, und US-A-3 949 073 beschrieben.
- Bestehende injizierbare Kollagene sind Kollagen-Lösungen. In den meisten Fällen ist es zweckmäßig, daß das Implantat mit feinen Nadeln (allgemein mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,5 mm) injiziert werden kann. Um diese Anforderung zu erfüllen, müssen die Lösungen relativ flüssig und daher wenig konzentriert sein (2 bis 6,5 %). Diese Einschränkung führt zum Problem der Bioabbaubarkeit und der Haltbarkeit derartiger Implantate mit der Zeit, wobei die Mengen der verabreichten aktiven Stoffe relativ gering sind.
- Aus Gründen der Löslichkeit und Biokompatibilität ist das verwendete Kollagen ein Atelokollagen, d.h. ein Kollagen, dessen terminale Regionen mit nicht-spiralförmiger Struktur, die als Telopeptide bezeichnet werden, eliminiert wurden. Diese Telopeptide sind tatsächlich der Ort intra- oder intermolekularer Bindungen vom TYP gekreuzter Bindungen, die das Kollagen unlöslich machen. Außerdem sind die Telopeptide die Träger der Haupt- Antigen-Determinanten des Kollagens. Bei den bestehenden Produkten wird das Atelokollagen durch eine Protease-Behandlung mit Pepsin erhalten, das vorzugsweise die Telopeptide angreift, ohne die spiralförmige Struktur zu zerstören. Pepsin hat jedoch den Nachteil, sich sehr fest an sein Substrat zu binden und daher schwer eliminiert werden zu können. Außerdem handelt es sich um ein stark antigenes Molekül, dessen Vorliegen, auch in geringer Menge, das Risiko mit sich bringt, die Biokompatibilität des so erhaltenen Produkts zu verändern.
- Um seine Füllfunktion sicherzustellen, ist es zweckmäßig, daß das Implantat nach der Injektion ein bestimmtes Volumen beibehält, und es nicht wesentlich in die Umgebungsgewebe diffundiert. So bildet es eine Art Matrize, die, wenn sie während einer ausreichenden Zeit aufrechterhalten wird, durch die Wirtsgewebe kolonisiert wird und eine Wiederherstellung der behandelten Zone ermöglicht. Bei den bestehenden Produkten wird diese Charakteristik durch die Verwendung von Atelokollagen-Lösungen erfüllt, die bei Körpertemperatur ausfallen, wodurch Fasern gebildet werden, die am Injektionsort zurückbleiben, während der Exzipient progressiv resorbiert wird (siehe US-A-3 949 073).
Daraus ergibt sich, daß das Produkt vor der Injektion unbedingt bei niedriger Temperatur (weniger als 10ºC) aufbewahrt werden muß, um seinen flüssigen Zustand beizubehalten, eine Eigenschaft, die für seine Verabreichung durch Injektion notwendig ist. Folglich erfordern injizierbare Kollagene, die auf diesem Prinzip basieren, besondere Aufbewahrungsmaßnahmen, die ihre Verwendung kompliziert machen.
- Die Haupt-Einschränkung bekannter injizierbarer Kollagene liegt in ihrer Resorbierbarkeit "in vivo".
Tatsächlich ist der Abbau von Kollagen ein normaler biologischer Prozeß, der einen Teil des Bindegewebe-Metabolismus bildet. Dieser Prozeß involviert eine bestimmte Anzahl von Enzymen, insbesondere die Kollagenasen, die für den anfänglichen Angriff auf das Kollagen verantwortlich sind. Die Bioabbaubarkeit von Kollagen führt zu einem besonders wichtigen Problem. Tatsächlich muß die Füllung von Vertiefungen und Substanzverlusten eine def initive oder auf jeden Fall annehmbar dauerhafte Behandlung sein, die mit einer raschen Resorption des Implantats schlecht vereinbar ist.
Es gibt verschiedene physikalische und chemische Behandlungen, welche die Resorbierbarkeit verringern, indem sie die Anzahl der Vernetzungsbindungen zwischen den Kollagen-Molekülen erhöhen. Glutaraldehyd ist das am häufigsten verwendete Vernetzungsmittel (wie in der EP-A-0 089 145 beschrieben).
Es ist besonders wirksam, hat jedoch den großen Nachteil, daß es in Lösung polymerisiert. So setzen die durch dieses Mittel vernetzten Materialien mit der Zeit Glutaraldehyd-Monomere frei, die über 10 bis 25 ppm cytotoxisch sind. Die gemäß diesem Prinzip hergestellten injizierbaren Kollagene (EP-89 154 A2) sind daher allgemein weniger abbaubar als nichtvernetzte Implantate (mittlere Stabilität von 1 bis 2 Jahren anstelle von 6 Monaten bis 1 Jahr hinsichtlich der Füllung von Falten). Sie können jedoch häufiger nachteilige Reaktionen hervorrufen, was ein bestimmtes Mißtrauen und eine geringere Verwendung bewirkt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist hauptsächlich auf das Vorsehen einer Lösung gerichtet, welche die Herstellung eines injizierbaren Materials ermöglicht, das sogar mit Hilfe einer feinen Nadel, deren Durchmesser in der Größenordnung von 0,3 bis 0,5 mm liegt, injiziert werden kann, mit einem erhöhten Kollägen-Gehalt, insbesondere zumindest 7 % M/V und vorzugsweise sogar ungefähr 10 %.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf das Lösen des oben angegebenen, neuen technischen Problems gerichtet, indem eine Lösung vorgesehen wird, die das Vorsehen eines Vektorisierungssystems aktiver Substanzen ermöglicht, indem die therapeutische Optimierung aktiver Moleküle, beispielsweise durch die gesteuerte Freisetzung im Organismus, das Abzielen auf betreffende Gewebe oder Organe und den Schutz des aktiven Bestandteils, ermöglicht wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf das Lösen des oben angegebenen, neuen technischen Problems gerichtet, indem eine Lösung mit besserer Biokompatibilität vorgesehen wird, deren Abbauprodukte nicht zu Rückständen führen, die unerwünschte Reaktion hervorrufen können.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf das Lösen des oben angegebenen, neuen technischen Problems mit Hilfe einer Lösung gerichtet, welche die Modulation der Abbaugeschwindigkeiten des einem Lebewesen, insbesondere einem Menschen, injizierten Materials ermöglicht, um die Lebensdauer eines Implantats und ebenso die Kinetik der Freisetzung eines mit einem Träger versehenen aktiven Stoffs steuern zu können.
Die Erfindung ist auch auf das Vorsehen von Füllmaterialien gerichtet, deren Stabilität in vivo zumindest gleich jener von mit Glutaraldehyd behandelten Kollagen-Materialien sein kann.
Alle diese technischen Probleme werden gleichzeitig zufriedenstellend, sicher, dauerhaft und reproduzierbar, im industriellen und medizinischen Maßstab verwendbar gelöst, wobei dies auch kostengünstig erfolgt.
So sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt eine Zusammensetzung auf der Basis von Kollagen vor, welche leicht injizierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mikrokapseln aus Atelokollagen oder einer Mischung von Atelokollagen und einem Polysaccharid, insbesondere einem Glykosaminoglykan, in Suspension in einer viskosen biokompatiblen Träger-Lösung umfaßt. Vorzugsweise weist die Gesamtheit der Mikrokapseln und der viskosen Träger-Lösung eine Viskosität auf, die die Injektion der Zusammensetzung, insbesondere in Form einer kontinuierlichen Faser aus der Öffnung einer Nadel, ermöglicht.
Gemäß einer besonderen Ausführungsvariante umfaßt die Träger-Lösung zumindest eine Protein-Substanz, beispielsweise Atelokollagen, und/oder eine Polysaccharid-Substanz.
Wenn die Träger-Lösung eine Protein-Substanz umfaßt, ist diese vorteilhaft Atelokollagen, das auf enzymatischem Weg oder auf chemischem Weg, vorzugsweise durch chemische Behandlung insbesondere mit Soda, erhalten werden kann, welche chemische Behandlung besonders vorteilhaft ist, da sie es ermöglicht, daß jegliches verbleibende Vorliegen von Enzym vermieden werden kann, wie es im Rahmen der Verwendung einer Enzymbehandlung der Fall ist, üblicherweise Pepsin, wodurch die Biokompatibilität des Materials erhöht wird. Im Fall des Erhaltens von Atelokollagen durch eine Enzymbehandlung, insbesondere mit Pepsin, oder eine chemische Behandlung, insbesondere mit Soda, ist es möglich, den Entnetzungsgrad des Kollagens und daher die Viskosität des Trägermaterials zu modulieren.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsvariante wird die Polysaccharid-Substanz, gegebenenfalls in Mischung mit der Protein-Substanz im Trägermaterial, verwendet und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Glykosaminoglykan, einem Alginat, einem Dextran, einer Cellosose oder einem Cellulose-Derivat, einem Xanthan-Gummi, einem Akäziengummi und ihrer (ihren) Mischung (Mischungen).
Daher wird gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante das Atelokollagen der Mikrokapseln mit einem für die gewünschte Anwendung geeigneten Entnetzungsgrad entnetzt.
Als Polysaccharid, das in Mischung mit dem Atelokollagen zur Herstellung der vorstehend angegebenen Mikrokapseln verwendet werden kann, kann insbesondere ein Glykosaminoglykan verwendet werden, das ausgewählt ist der Gruppe bestehend aus Glykosaminoglykanen mit einer Struktur, ausgewählt aus Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat sowie Heparin und seinen Derivaten, insbesondere Heparinen mit niedriger Molmasse mit einer Molmasse zwischen ungefähr 2 000 und ungefähr 10 000, und einem Stärkehydrolysat, und insbesondere Dextran.
Das Verfahren zur Herstellung der Mikrokapseln basiert auf dem im früheren Patent der Anmelderin FR-A-2 642 329 beschriebenen, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Es ist vorteilhaft, daß das Verhältnis des Polysaccharids zum Atelokollagen zwischen 10 und 10 Masse-%, bevorzugter zwischen 15 und 50 Masse-%, liegt.
Im Rahmen der Herstellung der Mikrokapseln wird eine Vernetzung des Atelokollagens und gegebenenfalls der Polysaccharide durch Grenzflächenvernetzung durchgeführt, indem eine Emulsion der Lösung von Atelokollagen und Polysacchariden als dispergierte Phase in einer hydrophoben Flüssigkeit, welche die kontinuierliche Phase bildet, in der das Atelokollagen und/oder die Polysaccharide im wesentlichen unlöslich sind, hergestellt wird.
Zur Vernetzung wird der Emulsion der Lösung von Atelokollagen und gegebenenfalls Polysacchariden ein Vernetzungsmittel zugesetzt, das reaktive Gruppen umfaßt, die mit den acylierbaren Gruppen des Atelokollagens und der Polysaccharide reagieren können, um eine Grenzflächenvernetzungsreaktion zu bewirken. Als bevorzugtes Vernetzungsmittel wird ein Säuredichlorid oder ein Säureanhydrid oder eine di- oder polybasische Carbonsäure verwendet. Als bevorzugte Vernetzungsmittel werden Terephtaloylchlorid, Phthalsäurechlorid, Sebacinsäurechlorid, Bernsteinsäurechlorid, ein Chlorid einer Tricarbonsäure, wie Zitronensäure, oder ein Säureanhydrid, wie Bernsteinsäureanhydrid, verwendet.
Als hydrophobe Flüssigkeit, in der das Atelokollagen und/oder die Polysaccharide unlöslich sind, werden vorzugsweise Fettsäureester verwendet, vorzugsweise ausgewählt aus jenen, die üblicherweise parenteral verabreicht werden können, wie Triglyceride, Ethyloleat; oder jenen ohne toxische Eigenschaften, wie Isopropylmyristat, Ethyl-2-hexylcocoat.
Die Konzentration der Polysaccharide in der Polysaccharid- Lösung liegt vorzugsweise zwischen 0,5 und 4 %, bevorzugter zwischen 0,5 und 2 % und auch vorzugsweise bei ungefähr 1 %.
Die Atelokollagen-Lösung zur Herstellung der Mikrokapseln ist eine wässerige Lösung von Atelokollagen mit einer Konzentration zwischen 0,5 und 2 Masse-%.
Zur Herstellung der Mikrokapseln kann das Atelokollagen durch Enzymverdau von Kollagen, insbesondere mit Pepsin, oder auch durch chemische Behandlung mit Soda erhalten worden sein.
Für das eigentliche Verfahren zur Herstellung der Mikrokapseln wird auf die FR-A-2 642 329 bezuggenommen, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, und insbesondere auf die Beispiele 1 bis 6.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Größe der Mikrokapseln kleiner oder gleich ungefähr 500 µm. In bestimmten Fällen ist die Größe der Mikrokapseln kleiner als 250 µm und kann zwischen 20 und 50 µm liegen, insbesondere in dem Fall, in dem es gewünscht wird, die Zusammensetzung durch eine feine Nadel mit einem Durchmesser zwischen 0,3 und 0,5 mm zu injizieren.
Gemäß einer besonderen Variante beträgt das relative Verhältnis der Mikrokapseln zur viskosen biokompatiblen Träger-Lösung zwischen 0,5 bis 15/99,5 bis 85 M/V.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform enthalten die Mikrokapseln zumindest eine aktive Substanz, entweder eingekapselt im Inneren oder in der Masse der Wände der Mikrokapseln, oder gepfropft auf die innere und/oder äußere Oberfläche. Diese aktive Substanz kann biologisch, kosmetisch oder pharmazeutisch aktiv sein. Biologisch aktive Substanz bedeutet eine Substanz, die eine biologische Wirkung auf den Organismus ausübt, die nicht unbedingt kosmetisch oder therapeutisch ist. Eine derzeit bevorzugte aktive Substanz ist Hydroxyapatit, insbesondere in Teilchenform, beispielsweise mit einer Größe von ungefähr 50 µm.
Gemäß einem zweiten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehend angegebenen Zusammensetzung als Vektormittel einer biologisch, kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Substanz vor.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine leicht injizierbare Zusammensetzung auf der Basis von Kollagen, wie vorstehend definiert, umfaßt.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Implantat, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer vorstehend definierten, injizierbaren Zusammensetzung hergestellt ist.
Andererseits betrifft die Erfindung auch besondere Herstellungen der Zusammensetzungen. Als besondere Herstellung wird eine Herstellung bevorzugt, gemäß der die Mikrokapseln auf der Basis von Atelokollagen gegebenenfalls mit einem Glykosaminoglykan, wie Chondroitin-4-sulfat, gemischt werden, wobei diese Mikrokapseln Hydroxyapatit-Granula in Suspension in einer viskosen biokompatiblen Träger-Lösung eines Atelokollagen-Gels, gegebenenfalls gemischt mit einem Glykosaminoglykan, insbesondere Chondroitin-4-sulfat, enthalten. Wenn die Hydroxyapatit-Granula eine Größe von ungefähr 50 µm aufweisen, haben die Mikrokapseln eine Größe von ungefähr 200 µm.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die viskose biokompatible Träger-Lösung für physiologische pH und osmotische Druckbedingungen geeignet, und hat vorzugsweise einen pH zwischen 6,8 und 7,5 und einen osmotischen Druck zwischen 260 und 320 mOsm/l H&sub2;O. Ein derartiger pH und eine derartige Osmolarität der Träger-Lösung können erhalten werden, indem sie mit einem Phosphatpuffer, der beispielsweise eine Mischung von Monound Di-Natrium- und/oder -Kaliumphosphaten umfaßt, oder einer Mischung von Phosphatpuffer und Natriumchlorid eingestellt wird, um die Träger-Lösung der Mikrokapsel-Suspension zu vervollständigen.
Aufgrund der Beschaffenheit der Bestandteile der Mikrokapseln aus Atelokollagen, gegebenenfalls gemischt mit Polysacchariden, sind die Mikrokapseln weich, verformbar, so daß in Suspension in der viskosen biokompatiblen Träger-Lösung gemäß der Erfindung die Zusammensetzung in ihrer Gesamtheit derartige Fließeigenschaften aufweist, daß mit einer feinen Nadel mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,5 mm ein bis zu 10 % M/V Kollagen enthaltendes Material leicht injiziert werden kann. Diese Möglichkeit ist eine Erhöhung von 35 % in bezug auf frühere höchstkonzentrierte Produkte (6,5 %).
Daher sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besonders geeignet, um als Füllmaterialien verwendet zu werden, entweder um Füllungen von Weichgeweben oder Knochenfüllungen zur Knochenrekonstruktion durchzuführen. Bei diesen Anwendungen ist es klar, daß jede Erhöhung der Konzentration der aktiven Substanz de facto die Lebensdauer des Implantants und die Effizienz der Füllung erhöht.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung vereint somit die biologischen Eigenschaften von Kollagen in seiner Atelokollagenform mit jenen anderer, gegebenenfalls verwendeter Substanzen (Polysaccharide, covernetzt mit Atelokollagen, aktive Substanzen in Lösung oder in Suspension in Sphären, auf ihre Oberfläche gepfropfte Moleküle).
Auf diese Weise finden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein breites Anwendungsgebiet als Vektorisierungssysteme aktiver Substanzen. Diese galenische Form ist besonders interessant, da sie gemäß den Verwendungen ermöglicht:
- die therapeutische Optimierung aktiver Moleküle durch gesteuerte Freisetzung in den Oranismus, das Abzielen auf betreffende Gewebe und Organe, den Schutz des aktiven Stoffes;
- den Zugang auf perkutanem Weg zu üblicherweise nur auf chirurgischem Weg zugänglichen Stellen (beispielsweise Knochenstellen), wodurch das vom Patienten erlittene Trauma und die Kosten und Dauer der Hospitalisierung begrenzt werden.
Es ist klar, daß auch eine bestimmte Anzahl von Anwendungen vorgesehen werden kann, in denen gleichzeitig die Füllfunktion und die Verwendung einer besonders vorteilhaften galenischen Form vorgesehen werden können.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist besonders geeignet zur Verwendung als Vektor in dem Maße, in dem ihr Abbau nicht zur Rückständen führt, die unerwünschte Reaktionen hervorrufen können. Dies ist ein Hauptvorteil gegenüber bestimmten synthetischen Polymeren des Standes der Technik.
Der Abbau der Mikrokapseln kann innerhalb sehr breiter Grenzen einerseits durch einen variablen Entnetzungsgrad des Atelokollagens auf chemischem oder enzymatischem Weg und andererseits durch die Steuerung des Grenzflächenvernetzungsgrads moduliert werden. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit der Resorbierbarkeit von einer raschen Geschwindigkeit zu einer Stabilität reguliert werden, die der von mit Glutaraldehyd vernetzten Materialien erhaltenen überlegen ist, wobei mit der Toxizität dieses Mittels verbundene Nachteile vermieden werden.
Auf diese Weise wird das Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erweitert, indem die Lebensdauer der Zusammensetzung, insbesondere in Form eines Implantants, gemäß der sie dazu bestimmt ist, so lange wie möglich auf der Ebene der Implantationsstelle zu verbleiben oder resorbiert zu werden und mehr oder weniger rasch durch die Wirtsgewebe ersetzt zu werden, und die Kinetik der Freisetzung des aktiven Stoffs beeinflußt werden.
Somit ist klar, daß die vorliegende Erfindung eine technische Lösung liefert, die wichtige technische Vorteile in bezug auf den Stand der Technik bietet.
In den Beispielen beziehen sich alle Prozentsätze auf die Masse, wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1: Suspension von 20 bis 50 µm Atelokollagen-Mikrokapseln in einem Atelokollagen-Gel

Dieses Suspension bildet ein Produkt zur Sicherstellung der Füllfunktion, insbesondere von Weichgeweben.

a) Herstellung von Atelokollagen durch Behandlung mit Pepsin

Die Haut eines frisch geschlachteten Kalbes wird einer chemischen Enthaarung in einem Bad, enthaltend 3 % Natriumsulfid und 4 % Kalk, unterworfen, wobei das Verhältnis 100 g Haut für 200 ml Lösung beträgt. Die Lederhaut wird dann vom Rest der Haut durch einen Spaltvorgang mit einer Bandsäge isoliert.
Das erhaltene Gewebe wird zerkleinert und durch ein Gitter mit 4 mm Löchern extrudiert.
Das zerkleinerte Material wird in einer 0,5 M Essigsäure- Lösung dispergiert, die Pepsin im Verhältnis von 1 g Enzym pro 10 g trockenes Kollagen enthält, wobei der pH der Mischung erforderlichenfalls eingestellt wird, um einen pH zwischen 2 und 3 zu erhalten. Nach Rühren wird die Mischung 36 h lang bei 10ºC inkubieren gelassen. Nach Filtration wird das Kollagen durch den Zusatz von 0,7 M NaCl ausgefällt. Nach Rühren und Inkubieren (4 h) werden die ausgefällten Fasern durch Zentrifugieren (14 000 UpM) gewonnen. Der Überstand wird eliminiert und das Pepsin durch Dispersion des Rückstands in einem Puffer von 0,05 M Tris - 0,15 M NaCl inaktiviert, dessen pH nach Dispersion der Fasern auf 8,5 eingestellt wird. Nach 3 h Inkubieren bei 10ºC wird die Dispersion gegen entionisiertes und steriles Wasser mit Hilfe von Dialysemembranen dialysiert, die vorzugsweise aus Schläuchen mit einer Trenngrenze zwischen 6 000 und 8 000 Dalton bestehen.

b) Herstellung der Atelokollagen-Lösung in Puffermedium bei pH 8 bis 8,2

Atelokollagen aus Dialyseschläuchen wird mit einer Natriumbicarbonat-Lösung mit einem Volumen und einer Konzentration verdünnt, so daß die End-Konzentrationen die folgenden sind:
- Atelokollagen 1 %
- wasserfreies Natriumbicarbonat 4 %
Es wird überprüft, daß der pH der erhaltenen Lösung tatsächlich zwischen 8 und 8,2 liegt. 1 kg dieser Lösung wird hergestellt.

c) Herstellung des Vernetzungsmittels

100 g Terephthaloylchlorid werden zu 4 l eines hydrophoben Lösungsmittels, vorzugsweise Fettsäureestern, ausgewählt aus jenen, die üblicherweise parenteral verabreicht werden können (Triglyceride, beispielsweise Ethyloleat), oder ohne toxische Eigenschaften (beispielsweise Isopropylmyristat, Ethyl-2-hexylcocoat), zugesetzt. Das Ganze wird durch mechanisches Bewegen gerührt.

d) Veresterung

3 l eines hydrophoben Lösungsmittels, gemäß den oben angegebenen Kriterien ausgewählt, werden in einen Behälter eingebracht. Die gepufferte Atelokollagen-Lösung, die vorher hergestellt wurde, wird unter Rühren mit einer Ultra Turax -Vorrichtung bei 7 200 UpM zugesetzt.

e) Vernetzung

Die Lösung des Vernetzungsmittels wird der erhaltenen Emulsion zugesetzt. Das Rühren wird 30 min lang fortgesetzt.
So werden die Mikrokapseln erhalten.

f) Waschungen

Drei Waschungen werden mit 10 l hydrophobem Lösungsmittel durchgeführt, und die Mikrokapseln werden durch Dekantieren mit Hilfe einer Robatel-Dekantiervorrichtung bei 1 000 UpM vernetzt.
5 bis 8 Waschungen mit Ethanol (insgesamt 15 bis 20 l) werden auf die gleiche Weise durchgeführt, gefolgt von 3 bis 5 Waschungen mit entionisiertem und sterilem Wasser.

g) Lyophilisierung

Ein klassisches Lyophilisierungsverfahren des die Mikrokapseln enthaltenden, gewaschenen Produkts wird durchgeführt.

h) Sterilisierung

Nach der Konditionierung der getrockneten Sphären in einer geschlossenen Vorrichtung werden die Mikrokapseln durch das Aussetzen an Gammastrahlen (25 kGy) sterilisiert.

i) Herstellung des Suspensionsmediums

Das Atelokollagen wird durch Behandlung mit Soda unter nachstehend angegebenen Bedingungen entnetzt.
Nach der Enthaarung, Spaltung und Zerkleinerung der Haut, wie in a) beschrieben, wird das zerkleinerte Material 2 Waschungen mit Phosphatpuffer bei pH 7,8 (21,7 g/l Na&sub2;HPO&sub4; und 0,78 g KH&sub2;PO&sub4;), dann zwei Waschungen mit entionisiertem und sterilem Was ser unterworfen.
Das zerkleinerte Material wird 8 Tage lang mit einer Soda- Lösung bei 1 kg zerkleinertes Material pro 4 1 Lösung mit einer Konzentration in Berührung gebracht, so daß die End-Menge an Soda 8 % (M/V) beträgt. Am Ende dieser Behandlung wird das Atelokollagen durch den Zusatz von konzentrierter Salzsäure ausgefällt, bis ein pH zwischen 2 und 2,5 erhalten wird. Die erhaltene Suspension wird in Dialysematerial (Trenngrenze zwischen 6 000 und 8 000 Dalton) eingebracht und gegen steriles und entionisiertes Wasser dialysiert.
Anschließend wird das erhaltene Atelokollagen lyophi]isiert, durch Gammastrahlen sterilisiert und unter sterilen Bedingungen in Lösung gebracht. Der pH und die Osmolarität der Lösung werden unter Verwendung von Phosphatpuffer (Mischung von Mono- und Di-Natrium- und/oder -Kaliumphosphaten) oder einer Mischung von Phosphatpuffer und Natriumchlorid eingestellt, um einen pH zwischen 6,8 und 7,5 und einen osmotischen Druck zwischen 260 und 320 mOsm/l H&sub2;O zu erhalten.
Beispiel der Zusammensetzung des Suspensionsmediums:
- Atelokollagen 1 %
- Na&sub2;HPO&sub4; 0,02 M
- NaCl 0,13 M
- pH 7,3

j) Suspendieren

Die Mikrokapseln werden in einem Suspensionsmedium von in Schritt i) erhaltenem Atelokollagen unter sterilen Bedingungen bei 100 g trockenen Sphären pro ml Suspensionsmedium suspendiert. Die Suspension wird gerührt, um eine völlig homogene Mischung zu erhalten. Der pH der Mischung wird überprüft.

k) Zubereitung von Spritzen

Die Mischung wird unter sterilen Bedingungen in 1 ml Spritzen vom Luer-Typ und Nadeln mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,5 mm eingebracht.

1) Prüfung des erhaltenen Produkts

* Wärmestabilität durch programmierte Differentialkalorimetrieanalyse:
Die an den Mikrokapseln nach Lyophilisierung festgestellten Parameter sind wie folgt:
- Ausgangs-Denaturierungstemperatur: 65 ºC
- Spitzen-Denaturierungs temperatur: 72,6 ºC
- End-Denaturierungstemperatur: 80 ºC
Die Werte sind besonders hoch und liegen in der gleichen Größenordnung wie mit Produkten, die beispielsweise durch Vernetzung mit Glutaraldehyd erhalten wurden.

* Untersuchung in vivo:

Die Versuche wurden an weiblichen Wistar-Ratten mit 180 bis 200 g durchgeführt.
Das Material wird auf dem Rücken der Ratten in subkutaner position implantiert. Jede Implantattonsstelle (2 pro Ratte) erhält ungefähr 0,1 ml Suspension.
Die 1 und 7 Tage nach Implantation durchgeführten Biopsien und histologischen Kontrollen zeigen:
- ein bedeutendes Füllvermögen
- eine perfekte Biokompatibilität
- ein völliges Fehlen eines Abbaus des Implantats.
Diese Ergebnisse stellen eine besonders hohe, langfristige Stabilität des Implantats sicher.

Beispiel 2: Suspension von ungefähr 200 µm Mikrokapseln aus Atelokollagen und Chondroitin-4-sulfat. die Hydroxyapatit- Granula in einem Gel aus Atelokollagen und Chondroitin-4-sulfat enthalten

In diesem Beispiel werden Hydroxyapatit-Granula (Mineral mit einer chemischen Zusammensetzung nahe jener von Knochenmineral, das für Knochenrekonstruktionen verwendet wird) in Mikrokapsen eingeschlossen. Dieses System ermöglicht das Vorsehen von Hydroxyapatit-Granula als Träger und macht sie durch einen Trokar injizierbar. So können sie auf perkutanem Weg in Knochenstellen implantiert werden.

a) Herstellung von Atelokollagen durch Soda-Behandlung

Dieser Schritt wird unter denselben Bedingungen wie den in Beispiel 1, Absatz i) beschriebenen durchgeführt.

b) Herstellung von Chondroitin-4-sulfat

Nasenscheidewände von Schafen, von denen Muskel- und adipöses Gewebe entfernt wurde, werden durch Extrusion durch ein Gitter mit 4 mm Löchern zerhackt und zerkleinert; das zerkleinerte Material wird 24 h lang bei einer Temperatur von 6ºC in einen Kaliumchlorid-Puffer (11,8 g/l KCl; 78,8 mg/l Cystein, 180 mg/l EDTA), enthaltend 1 % Papain "MERCK", gegeben. Das Verhältnis ist 130 g zerkleinertes Material pro 1 l Puffer.
Der Überstand wird vom Rückstand mit Hilfe einer Dekantiervorrichtung bei 4 000 UpM kontinuierlich abzentrifugiert. Dem Überstand werden dann 40 g/l Trichloressigsäure zugesetzt. Der Niederschlag wird gemäß der vorhergehenden Technik kontinuierlich abzentrifugiert. Der Überstand wird mit Hilfe von Soda- Pastillen neutralisiert. Dann wird die Mischung gegen entionisiertes und steriles Wasser mit Hilfe eines Schlauches dialysiert, dessen Trenngrenze zwischen 6 und 8 000 Dalton liegt. Die dialysierte Lösung wird lyophilisiert. Das Chondroitin-4-sultat wird im trockenen Zustand erhalten.

c) Herstellung der Lösung von Atelokollagen und Chondroitin-4sulfat in einem Puffermedium bei pH 8,9

Das Atelokollagen in Form von Fasern, die von Dialyseschläuchen stammen, wird durch eine Lösung, enthaltend Chondroitin-4-sulfat und Natriumcarbonat, mit einem Volumen und einer Konzentration verdünnt, so daß die End-Konzentrationen wie folgt sind:
- Atelokollagen: 1,6 %
- Chondroitin-4-sulfat: 0,6 %
- wasserfreies Natriumcarbonat: 4,8 %
Der pH des Ganzen wird mit konzentrierter Salzsäure auf 8,9 eingestellt.
1 kg dieser Lösung wird hergestellt.

d) Einschluß von Hydroxyapatit

Hydroxyapatit in Form sphärischer Granula mit einem Durchmesser von ungefähr 50 µm wird in die vorstehend beschriebene Zubereitung bei 5 % (M/V) eingeschlossen.

e) Herstellung des Vernetzungsmittels

180 g Terephthaloylchlorid werden zu 4 l Isopropylmyristat zugesetzt. Das Ganze wird durch mechanisches Rühren bewegt.

f) Emulgierung

150 ml Span 85 (ICI Company) werden mit 3 l Isopropylmyristat gemischt In die mechanisch gerührte Lösung wird eine Kollagen-Lösung, enthaltend Hydroxyapatit, gegossen. Das Ganze wird einige Minuten lang gerührt, um eine Emulsion zu erhalten.

g) Vernetzung

Die Lösung des Vernetzungsmittels wird zur erhaltenen Emulsion zugesetzt. Das Rühren wird 30 min lang fortgesetzt.
Auf diese Weise werden Hydroxyapatit-Granula enthaltende Mikrokapseln erhalten.

h) Waschungen

Die Mikrokapseln werden unter den gleichen Bedingungen wie den in Beispiel 1 beschriebenen gewaschen.

i) Herstellung des Suspensionsmediums

Atelokollagen, das von Dialyseschläuchen stammt, wird mit einer Lösung von Chondroitin-4-sulfat mit einem Volumen und einer Konzentration verdünnt, so daß die End-Konzentrationen wie folgt sind:
- Atelokollagen 0,8 %
- Chondroitin-4-sulfat 0,2 %.
Die Mischung wird auf pH 8 gebracht.

j) Suspendieren der Mikrokapseln

Die Mikrokapseln werden im oben beschriebenen Medium in derartigen Verhältnissen suspendiert, daß in der End-Mischung 90 % der Gesamtheit von Atelokollagen - Chondroitin-4-sulfat von Mikrokapseln stammen und 10 % vom Suspensionsmedium stammen.
Auf diese Weise wird eine erfindungsgemäße Zusammensetzung erhalten, die als solche verwendet oder wie nachstehend beschrieben behandelt werden kann

k) Lyophilisierung

Die in Schritt j) erhaltene Zusammensetzung wird auf klassische Weise lyophilisiert.

l) Sterilisierung

Gleiche Bedingungen wie in Beispiel 1.

m) Rehydratisierung in gepuffertem Medium

Das Lyophilisat wird unter sterilen Bedingungen bei 500 mg Lyophilisat pro ml 0,1 M Phosphatpuffer suspendiert. Der pH des Phosphatpuffers wird derart eingestellt, daß der pH der Mischung zwischen 7 und 7,3 liegt.

n) Herstellung von Spritzen

Die Mischung wird unter sterilen Bedingungen in 5 ml Spritzen eingebracht, die mit Nadeln mit einem Durchmesser von 1,5 mm versehen sind.

Claims

1. Zusammensetzung auf der Basis von Kollagen, welche leicht injizierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mikrökapseln aus Atelokollagen oder einer Mischung von Atelokollagen und einem Polysaccharid, insbesondere einem Glykosaminoglykan, in Suspension in einer viskosen biokompatiblen Träger-Lösung umfaßt, wobei die Gesamtheit der Mikrokapseln und der viskosen Träger-Lösung eine Viskosität aufweist, die die Injektion der Zusammensetzung mit einer Nadel ermöglicht.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger-Lösung zumindest eine Protein-Substanz, beispielsweise Atelokollagen, und/oder eine Polysaccharid-Substanz umfaßt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger-Lösung eine Protein-Substanz, ausgewählt aus Atelokollagen, das vorzugsweise durch eine chemische Behandlung, insbesondere mit Soda, erhalten wird, umfaßt.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Atelokollagen der Mikrokapseln mit einem für die gewünschte Anwendung geeigneten Entnetzungsgrad entnetzt ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharid-Substanz der Träger-Lösung ausgewählt ist aus einem Glykosaminoglykan, einem Alginat, einem Dextran, einer Cellulose oder einem Cellulose-Derivat, einem Xanthan-Gummi, einem Akaziengummi und ihrer (ihren) Mischung (Mischungen).

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln aus Atelokollagen oder einer Mischung von Atelokollagen und Polysaccharid, die vernetzt sind, hergestellt sind, wobei das Polysaccharid vorzugsweise ausgewählt ist aus einem Glykosaminoglykan mit einer Struktur, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat sowie Heparin und seinen Derivaten, insbesondere Heparinen mit niedriger Molmasse mit einer Molmasse zwischen ungefähr 2 000 und ungefähr 10 000, und einem Stärkehydrolysat, insbesondere Dextran.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das relative Verhältnis Masse/Volumen der Mikrokapseln, bezogen auf die Träger-Lösung, zwischen 0,5 und 15 Masse-% der Mikrokapseln, bezogen auf das Volumen der Träger- Lösung, liegt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Masseverhältnis in den Stärkehydrolysat- Mikrokapseln, bezogen auf das Atelokollagen, zwischen 10 und 70 % liegt.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln zumindest eine aktive Substanz, entweder eingekapselt im Inneren der Mikrokapseln oder in der Masse der Wände oder gepfropft auf die innere und/oder äußere Oberfläche, enthält, welche aktive Substanz vorzugsweise eine biologisch, kosmetisch oder pharmazeutisch aktive Substanz ist.

10. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Mikrokapseln weniger als ungefähr 500 µm beträgt.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln aus Atelokollagen oder einer Mischung von Atelokollagen und einem Glykosaminoglykan, insbesondere Chondritin-4-sulfat, hergestellt sind, und Hydroxyapatit-Granula enthalten; und die Träger-Lösung aus einem Atelokollagen-Gel, gegebenenfalls gemischt mit einem Glykosaminoglykan, insbesondere Chondroitin-4-sulfat, hergestellt ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Kollagen-Gehalt der Zusammensetzung zumindest 7 Masse/Vol-% und vorzugsweise ungefähr 10 Masse/Vol.% beträgt.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Abbau der Mikrokapseln durch die Regulierung des Grenzflächenvernetzungsgrads oder durch einen variablen Entnetzungsgrad von Atelokollagen auf chemischem oder enzymatischem Weg moduliert wird.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die viskose biokompatible Träger-Lösung für physiologische pH und osmotische Druck-Bedingungen geeignet ist, indem sie vorzugsweise einen pH zwischen 6,8 und 7,5 und einen osmotischen Druck zwischen 260 und 320 mOsm/l H&sub2;O aufweist, wobei sie insbesondere mit einem Phosphatpuffer oder einer Mischung von Phosphatpuffer und Natriumchlorid eingestellt wird.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtheit der Mikrokapseln und der viskosen Träger-Lösung eine Viskosität aufweist, die die Injektion der Zusammensetzung in Form einer kontinuierlichen Faser aus der Öffnung einer feinen Nadel mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 0,3 bis 0,5 mm ermöglicht.

16. Verwendung einer Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, als Vektormittel einer aktiven Substanz, insbesondere einer biologisch, kosmetisch oder pharmazeutisch aktiven Substanz.

17. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Füllmaterial, insbesondere von Weichgeweben oder Knochengeweben, insbesondere mit einer Stabilität in vivo zumindest gleich jener von mit Glutaraldehyd behandelten Kollagen-Materialien.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Zusammensetzung auf der Basis von Kollagen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, umfaßt.

19. Füllmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Zusammensetzung auf der Basis von Kollagen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 15 definiert, hergestellt ist.