DE3881364T2

DE3881364T2 - Verfahren zur Herstellung und Zusammensetzungen von Kollagen-Derivaten.

Info

Publication number: DE3881364T2
Application number: DE88312264T
Authority: DE
Inventors: Shlomo Magdassi; Dov Michaeli; Shmuel Shoshan
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1993-11-25
Anticipated expiration: 2008-12-23
Also published as: EP0322249B1; EP0322249A3; IL84911A0; EP0322249A2; ATE89740T1; DE3881364D1; US5073378A; IL84911A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von lagerbeständigen lyophilisierten Kollagenprodukten und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Das Phänomen der Wundheilung beschäftigt die Menschheit schon seit Beginn ihrer Existenz. Ärzte, Biologen, Biochemiker und Fachleute auf anderen Gebieten bemühten sich darum, dieses Phänomen zu verstehen, um bessere Verfahren und Vorrichtungen zur Beschleunigung des Heilungsprozesses zu entwickeln. Abgesehen von der chemischen und mechanischen Seite des Heilungsprozesses versuchten Forscher, den Prozeß der Wundheilung auch zu verstehen, um gewährleisten zu können, daß bei abgeheilten Wunden nur mehr minimale Spuren der Verletzung zurückbleiben. So. z.B. war man bemüht, die Narbenbildung insbesondere bei Verbrennungen und Schnittwunden zu vermindern bzw. ganz zu beseitigen.
Über das Verständnis des Wundheilungsprozesses gelangte man zu verschiedenen Gemischen und Verfahren, welche eine raschere Heilung bei verminderter Narbenbildung ermöglichten. Immer wieder wurde dabei erkannt, daß dem Kollagen bei der Wundheilung eine wichtige Rolle zukommt. Dieses ist nämlich Hauptbestandteil der Haut und daher zwangsläufig eine unumgängliche Komponente bei der Wiederherstellung des Gewebes im Verlaufe der Wundheilung. Die Rolle des Kollagens wird in der Arbeit "Wound Healing" von Shmuel Shoshan in International Review of Connective Tissue Research, Bd. 9 (1981), SS. 1-26, eingehend beschrieben.
Kollagen bildet das Bindegewebe und ist der wichtigste Typ faserbildender Proteine bei höheren Wirbeltieren. Kollagen liegt im natürlichen Zustand in Form einer Tripelkettenhelix bei konstanter Periodizität zwischen den ausgerichteten Tripelketten vor. Die in Tripelhelixkonfiguration vorliegenden Kollagenmoleküle richten sich zu Fibrillen mit einer Axialperiodizität von ca. 640 Å aus.
Es sind mehrere Kollagentypen bekannt, Haupttyp ist jedoch "Typ I", das Hauptkollagen von Haut, Knochen und Sehnen. Die Kettenzusammensetzung von Typ I ist [α1(I)&sub2;α2]. Die Ketten α1(I) und α2 sind homolog.
Bei jüngeren Tieren ist die intermolekulare Vernetzung noch relativ gering, was einen gewissen Grad an Löslichkeit des Kollagens bewirkt. Mit zunehmender Alterung kommt es jedoch zu einem relativen Anstieg an beständigen intermolekularen Vernetzungen, wodurch der Hauptanteil des Kollagens unlöslich wird.
Es wurde festgestellt, daß Kollagen in gereinigter Form für die Wundheilung verwendet werden kann. So z.B. wurde Kollagen in praktisch reiner Form und in seiner Faserform für viele Zwecke, einschließlich für Mittel zur Behandlung von Brandwunden (siehe US-PS 3 939 831 und 3 514 518) sowie für ähnliche medizinische Zwecke (siehe US-PS 3 157 524 und 3 628 974) vorgeschlagen. Dabei wird Kollagen in Plättchen- oder Faserform außen auf die Wunde bzw. Brandwunde zur Beschleunigung des Heilungsprozesses aufgebracht. Der Hauptvorteil des Kollagens in dieser Form liegt dabei in seiner blutstillenden, das Blut koagulierenden Wirkung sowie darin, daß es ein Substrat für das Zellwachstum abgibt.
Gemäß einer weiteren Art der Verwendung von Kollagen für die Behandlung von Wunden unf Verbrennungen wurde festgestellt, daß mit verschiedenen biologisch wirksamen Stoffen wie Antibiotika, Nährstoffen und dergleichen angereicherte Kollagenlösungen in vielen Bereichen, wie z.B. bei Zahnimplantaten, Verbrennungen, Schnittwunden und bei der Wiederherstellung von Sehnen, die Wundheilung beschleunigen. Diese Entwicklungen werden in folgenden Druckschriften beschrieben: "Improvement of Gliding Function of Flexor Tendons by Topically Aplied Enriched Collagen Solution" von Porat et al. in the Journal of Bone and Joint Surgery, Bd. 68-B, Nr. 2 (Mai 1980), SS. 208-213; "Enhanced Healing of Tooth-Pulp Wounds in the Dog by Enriched Collagen Solution as a Capping Agent" von Bimstein et al. in Archs Oral Biol., Bd. 26 (1981), SS. 97-101; "The Effect of Enriched Collagen Solutions on Scar Formation in Third-Degree Burns in Animals After Early Surgical Excision of the Slough" von Shoshan et al. in Burns, Bd. 3, Nr. 3, SS. 153-158 und "Biological Anchoring of Arylic Tooth Implants in the Dog Using Enriched Collagen Solutions" von Jaffe et al. in Archs Oral Biol., Bd. 23 (1978), SS. 415-419. In der zuletzt zitierten Druckschrift wird beschrieben, daß angereicherte Kollagenlösungen wirksam sind bei der Beschleunigung der Wundheilung und bei der Verminderung der Narbenbildung. Die angereicherte Kollagenlösung wird dabei in die Wunde eingeführt, wobei sich Kollagenfasern bei in vivo-Temperaturen bilden, welche das Zellwachstum beschleunigen, als Koagulans dienen und die erforderlichen chemotaktischen Eigenschaften aufweisen, um Zellen anzuziehen und die Wundheilung zu beschleunigen. Die entscheidenden Eigenschaften derartiger angereicherter Kollagenlösungen bestehen vor allem darin, daß sie bei Umgebungstemperatur vorliegen, d.h. zwischen 15 und ca. 30ºC, bei in vivo-Temperaturen, d.h. über 35ºC jedoch Fasern gebildet werden. Bei der Wundbehandlung mit der angereicherten Kollagenlösung wird diese also unter 35ºC auf die Wunde in flüssiger Form aufgebracht, so daß sie in die Wunde eindringen und eine enge Verbindung mit dem Gewebe eingehen kann und dann, nach Erwärmung auf die in vivo-Temperatur, Kollagenfasern bildet, die als Wundheilungsmittel fungieren. Für die Praxis wichtig ist, daß derartige angereicherte Kollagenlösungen bei Temperaturen zwischen 0 und 34ºC in Lösung bleiben, während sich bei Temperaturen über ca. 34 und 35ºC die gelösten Kollagenmoleküle zusammenballen und Fasern bilden, wodurch sich aus der Lösung ein halbfestes Gel bildet.
Die EP-A-02 43 179 beschreibt ein Wundheilungsgemisch aus fibrillärem Kollagen, von aus Blutplättchen hergestellten Wachstumsfaktoren und Heparin.
Die WO-A-86 03 122 beschreibt die Verwendung von mit Blutplättchen angereicherten Plasma zur Herstellung eines Wundheilungsmittels. Das mit Blutplättchen angereicherte Plasma wird vorzugsweise durch Zugabe von Thrombin als Freisetzungsmittel aktiviert. Die nach dem Zentrifugieren erhaltene thrombozytenfreie Lösung wird dann mit einem Träger, vor zugsweise Kollagen, gemischt.
Die FR-A-23 01 568 beschreibt die Lyophilisierung von Kollagenprodukten zur Verwendung bei der Wundheilung.
Obwohl die beschriebenen angereicherten Kollagenlösungen bei der Wundheilung wirksam sind, ist ihr praktischer Nutzen doch begrenzt, da ihre Lagerfähigkeit und die für ihre Herstellung erforderliche Zeit problematisch sind. Gewöhnlich sind 4 bis 5 Tage erforderlich, um die angereicherten Kollagenlösungen herzustellen, d.h. derartige Lösungen müssen lange vor der Wundbehandlung bereitet werden. Außerdem wurde festgestellt, daß derartige Lösungen bei 4ºC und im tiefgefrorenen Zustand bei -20ºC hergestellt und gelagert werden könnten und dabei ihre Beständigkeit bis zu 12 Wochen beibehalten. An die Lagerfähigkeit der Lösungen war die Forderung gestellt, daß diese bei Erwärmung auf in vivo- Temperaturen die Kollagenfasern bilden. Nach 12 Wochen Lagerung zeigte sich jedoch eine spürbare Verminderung der Faserbildung bei in vivo-Temperaturen, d.h. die Eignung der angereicherten Kollagenlösung für die Wundheilung war erheblich herabgesetzt.
Nach weiteren Untersuchungen und einer weiteren Entwicklung wurde festgestellt, daß der Wundheilungsprozeß in fünf Phasen unterteilt werden kann:
1. Blutstillung
2. Entzündung
3. Kollagensynthese und Angiogenese
4. Epithelisierung und
5. Narbenbildung.
Unmittelbar nach der Verletzung wurden die Thrombozyten, die mit der Wundstelle in Berührung kamen, aktiviert und ballten sich zu einem vorübergehenden Pfropfen zusammen, der Blutverlust verhindert. Aktiviert wurde außerdem das Gerinnungssystem, was zur Bildung eines Fibrinnetzwerks führte, was wiederum zur Bildung eines mechanischen festen, dauerhaften Pfropfens im verletzten Gefäß führte.
Im Verlaufe einiger Stunden nach der Verletzung wandern phagozytierende polymorphkernige Zellen (PMN) in den Wundbereich ein, um Zellbruchstücke, nekrotisches Gewebe und Fremdkörper zu entfernen. An die Stelle dieser Zellen treten dann Makrophagen, die ebenfalls phagozytieren und dieselbe Funktion wie die ihnen vorangehenden PMN haben.
Sobald das Wundbett von Zellbruchstücken befreit ist, wandern in den Randbereich und das Wundbett Fibroblasten ein und es wird neues Bindegewebe gebildet, vorwiegend durch Kollagen, Proteoglykane und Glykoproteine wie Fibronectin. Diese von Fibroblasten sezernierten Makromoleküle bilden dann die extrazelluläre Matrix des Gewebes, die den durch die Wunde geschaffenen Raum ausfüllt. Um das weitgehend zelluläre und synthetisierend wirkende Gewebe zu unterstützen, wandern Endothelzellen ein und bilden ein reiches Kapillarnetz, das das Gewebe mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt und Kohlendioxid sowie Stoffwechselprodukte aus dem neu entstehenden Gewebe ("Granulationsgewebe") entfernt.
Ist der Prozeß der Auffüllung des Wundraums mit der extrazellulären Matrix abgeschlossen, schließen sich zwei nachfolgende Prozesse an. Einerseits ist dies die Einwanderung von Epithelzellen aus den Wundrändern zur Bildung der endgültigen Zelldeckschicht sowie gleichzeitig die Abnahme der Fribroblastzahl und die Gefäßbildung, wodurch das Gewebe schließlich Narbenhistologie annimmt.
Aus der obigen Beschreibung geht hervor, daß Zellen in den Wundbereich einwandern und diesen wieder verlassen, wobei dies in einer ganz bestimmten festgelegten Reihenfolge erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines lagerbeständigen lyophilisierten Kollagenproduktes, das ein säurelösliches gereinigtes natives Kollagen in Kombination mit aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktoren enthält und folgende Stufen umfaßt:
a) Mischung der säurelöslichen Kollagens mit dem thrombozytenreichen Plasma;
b) Halten des Gemisches bei einer Temperatur von ca. 34 bis 37,5ºC während ca. 30 bis 60 Minuten bis zur Bildung eines festen Gels;
c) Abkühlung des Gels bei einer Temperatur von ca. 0 bis 4ºC während ca. 60 bis 120 Minuten, wobei das Gel in Lösung geht;
d) Zentrifugieren der erhaltenen Lösung bei 15.000 bis 35.000 U/min während 15 bis 25 Minuten zur Entfernung des unlöslichen Kollagens, der Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke, wodurch man einen lösliches Kollagen und freigesetzte Thrombozytenprodukte enthaltenden Überstand erhält, und
e) Lyophilisierung der Lösung unter Bildung eines beständigen lyophilisierten Produktes.
"Natives Kollagen" bedeutet hier Kollagen, das seine Tripelhelixstruktur beibehalten hat, in Wasser in sauren Medien löslich ist und bei geeignetem pH, entsprechender Ionenstärke und Temperatur eine Faserstruktur zu bilden vermag. Natives Kollagen, das für die Durchführung der Erfindung geeignet ist, ist gereinigtes säurelösliches natives Kollagen, das aus Säugern stammt, insbesondere natives Rinderkollagen. Verfahren zur Herstellung von säuresolubilisiertem nativem Kollagen sind bekannt. Es sind bereits mehrere Verfahren zu seiner Herstellung vorgeschlagen und verwendet worden. Gewöhnlich wird natives Kollagen mit einer Base wie Natriumhydroxid mit Natriumsulfat zur Unterdrückung der Faserquellung behandelt. Natriumhydroxid und Natriumsulfat dienen zur Beseitigung der Vernetzungen und gewährleisten damit die Säuresolubilisierung. Typische säurelösliche Kollagene werden in der US-PS Nr. 4 097 234, US-PS Nr. 3 637 642 und GB-PS Nr. 1 571 561 beschrieben.
Gewöhnlich weist die Ausgangslösung des nativen Kollagens einen sauren pH auf und eine Feststoffkonzentration in Wasser von ca. 0,15 bis 0,6 Gew.-%. Die Konzentration der Kollagenlösung sollte nicht unter 0,15 Gew.-% liegen, da sonst in vivo nicht ausreichend genug Fasern gebildet werden, um ideale Bedingungen für die Wundheilung zu schaffen. Andererseits zeigt eine Kollagenlösung mit einer Konzentration von über 0,6 Gew.-% die Tendenz zur Übersättigung, was für ihre Handhabung problematisch ist.
Nach Bildung der praktisch reinen Kollagenlösung bei saurem pH wird die Lösung auf einen pH von ca. 7,4 bis ca. 7.6 dialysiert, was dem physiologischen pH in vivo entspricht. Die Dialyse erfolgt gewöhnlich gegen einen Natrium- oder Kaliumphosphat-Puffer und eine mit Tris gepufferte Natriumchloridlösung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Lösung der Stufe d) zuerst mit einer Perfluorkohlenstoffverbindung und einem nichttoxischen pharmakologisch verträglichen Emulgator gemischt, wonach die erhaltene Emulsionslösung zur Bildung eines beständigen lyophilisierten Produktes lyophilisiert wird.
Die Perfluorkohlenstoffverbindungen sind dichte, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeiten von geringer Oberflächenspannung. Ihre biomedizinische Bedeutung beruht auf ihrer Fähigkeit, ca. 40 % Sauerstoff bei 37ºC und unter Atmosphärendruck zu lösen (Wasser löst lediglich 2,3 Vol.-% Sauerstoff). Diese Verbindungen kommen als Sauerstoffträger und als Mittel zur Freisetzung von Sauerstoff in Frage und finden daher als vorübergehende Blutersatzmittel in kritischen Fällen von Hämorrhagie oder Ischämie Anwendung. Eine Übersicht über die Verwendung von Perfluorchemikalien in Chemie, Biologie und für andere Verwendungszwecke wird in "International Anesthesiological Clinics", Seite 23, Frühjahr 1985, gegeben.
Vorzugsweise wird die Perfluorkohlenstoffverbindung ausgewählt unter Perfluortripropylamin, cis- und trans-Perfluordecalin, Perfluorisopentyltetrahydropyran, Perfluor-N,N- dimethylcyclohexylamin, Perfluor-1-methyldecalin und Perfluortributylamin, insbesondere cis-Perfluordecalin, trans- Perfluordecalin, Perfluor-1-methyldecalin, Perfluortripropylamin und Perfluor-tributylamin.
Vorzugsweise wird der Emulgator ausgewählt unter Lecithin, Tween 80 und Pluronic F-68 .
Die Erfindung stellt ferner ein pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch verwendbares Gemisch zur Beschleunigung der Wundheilung bereit, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde und eine wässerige Lösung von wasserlöslichem säurelöslichem gereinigtem nativem molekularem Kollagen und aus Thrombozyten hergestellten löslichen zellfreien und granulatfreien Wachstumsfaktoren darstellt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger Gemische für pharmazeutische oder veterinärmedizinische Zwecke, das folgende Stufen umfaßt:
a) Mischung des säurelöslichen Kollagens mit dem thrombozytenreichen Plasma;
b) Halten des Gemisches bei einer Temperatur von ca. 34 bis 37,5ºC während ca. 30 bis 60 Minuten bis zur Bildung eines festen Gels;
c) Abkühlung des Gels bei einer Temperatur von ca. 0 bis 4ºC während ca. 60 bis 120 Minuten, wobei das Gel in Lösung geht;
d) Zentrifugieren der erhaltenen Lösung bei 15.000 bis 35.000 U/min während 15 bis 25 Minuten zur Entfernung des unlöslichen Kollagens, der Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke, wodurch man einen lösliches Kollagen und freigesetzte Thrombozytenprodukte enthaltenden Überstand erhält,
e) Mischung dieser Lösung mit einer Perfluorkohlenstoffverbindung und einem pharmakologisch verträglichen Emulgator und
f) Einleitung von molekularem Sauerstoff in die Lösung zwecks Mischung mit der Perfluorkohlenstoffverbindung, wobei diese als Sauerstoffträger und Mittel zur Freisetzung von Sauerstoff im Gemisch dient.
Wie bereits Elaine W. Raines et al. in "Methods of Enzymology", Bd. 109 (1985), SS. 749-773, zeigen konnten, ist der Platelet-derived growth factor (PDGF) ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 30.000, das während der Gerinnung aus den Thrombozyten freigesetzt wird, eines der wichtigsten Makromoleküle im Vollblutserum, das die DNA-Synthese und das Zellwachstum in Bindegewebszellen in vitro zu stimulieren vermag. Obwohl von allen 4 Laboratorien, die am Thrombozytenmitogen arbeiten, dasselbe Molekül gereinigt und als PDGF gekennzeichnet worden war, wurde PDGF, das für ca. 50 % der mitogenen Aktivität verantwortlich gemacht wird, in Thrombozyten gefunden. Die übrigen 50 % entfallen möglicherweise auf mehr als einen der bereits bekannten Wachstumsfaktoren, wie z.B. TGF-b oder auf noch zu entdeckende Wachstumsfaktoren. Als sehr wirksames Mitogen für Fibroblasten und glatte Muskelzellen, das lokal an Wundstellen freigesetzt wird, spielt PDGF eine physiologische Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparation sowie eine pathologische Rolle bei der Bildung von Läsionen infolge Atherosklerose.
Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsformen in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, so daß die einzelnen Aspekte besser verstanden werden können, ist damit keine Einschränkung der Erfindung auf diese konkreten Ausführungsformen gemeint. Andererseits ist es die Absicht, sämtliche alternativen Modifikationen und Äquivalente, die zum Erfindungsumfang, wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, gehören, abzudecken. Somit dienen die nachfolgenden Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen umfassen, zur Illustration der Durchführung der Erfindung, wobei es sich von selbst versteht, daß die angeführten Einzelheiten lediglich beispielhaften Charakter haben und zur Illustration der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung dienen. Sie sollen die nützlichsten Formulierungsverfahren sowie das Konzept der Erfindung illustrieren.

Kollagenquelle und Reinigung

Verwendet werden kann Kollagen Typ I von jedem Säuger. In den nachfolgenden Beispielen werden zwei Kollagenquellen verwendet:
1. Mit Pepsin verdautes Rinderhautkollagen. Dies ist ein Handelsprodukt (Zyderm der Fa. Collagen Corp.) und ist aus säurelöslichem Rinderhautkollagen zusammengesetzt.
2. Säureextrahiertes und durch NaCl-Ausfällung gereinigtes Rinderhautkollagen, beschrieben in "Methods in Enzymology", Bd. 82, SS. 3-217, Academic Press, 1982.

Thrombozyten

Verwendet wurden drei Thrombozytenquellen: Menschliches Blut sowie Kaninchen- und Rinderblut. Thrombozytenreiches Plasma wurde erhalten durch Zentrifugieren des Blutes bei 800 g während 10 Minuten.

Freisetzung aus Thrombozyten

Die Freisetzung aus den Thrombozyten erfolgt nach einer Reihe von Techniken:
1. 1 bis 5 E Thrombin waren ausreichend, um die Freisetzungsreaktion in ca. 50 ml PRP zu bewirken. Nach Halten während 30 bis 60 Minuten mit Thrombin wurde das PRP bei 20.000 g zentrifugiert, um die Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke zu entfernen.
2. Das Kollagen wurde bei einer Konzentration von 1 bis 3 mg/ml mit PRP gemischt, wobei sich die Thrombozytenkonzentrationen zwischen der Konzentration im normalen Serum und einer ca. 66fachen Konzentration bewegt. Das Gemisch wurde während 30 Minuten bei 37ºC gehalten. Dies führte zur Bildung eines festen Gels. Nach dem Halten wurde das Gel während 30 bis 90 Minuten auf 4ºC abgekühlt. Dies führte zu seiner Lösung. Die Kollagenlösung wurde dann bei 20.000 g zentrifugiert, um das unlösliche Kollagen, die Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand enthielt lösliches Kollagen und die Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten.
Der Überstand kann entweder unmittelbar verwendet oder z.B. in der Kälte über der Gefriertemperatur, z.B. zwischen 0 und +5ºC bis zu einer Woche gelagert oder - für einen späteren Gebrauch - gefriergetrocknet bis zu 12 Monaten in einer Tiefkühlanlage bei -20ºC gelagert werden. Aliquote Anteile von jeweils 5 ml des Überstandes werden dann auf bei -70ºC tiefgefrorene 10 ml-Ampullen verteilt und dann unter Vakuum getrocknet (lyophilisiert). Sämtliche Vorgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Gegebenenfalls wird das in den Ampullen enthaltene getrocknete Material mit 5 ml keimfreiem kaltem destilliertem Wasser regeneriert und dann auf die Wunde aufgebracht.
3. Andere Substanzen, die auf spezifische Weise die Thrombozytenreaktion auslösen, sind Epinephrin, ADP und Arachidonsäure. Man kann sich auch einer nichtspezifischen Behandlung der Thrombozyten bedienen, um die Freisetzung ihres Inhalts zu bewirken, wie z.B. durch wiederholte Zyklen des Einfrierens und Auftauens, Verwendung von Detergentien, Zerreißen der Thrombozytenmembran mit Hilfe von Homogenisatoren usw.
Wie bereits oben beschrieben, wird der das lösliche Kollagen und die Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten einschließlich PDGF enthaltende Überstand vorzugsweise durch Zugabe von ca. 0,15 bis 0,30 ml einer Perfluorkohlenstoffemulsion weiter modifiziert, die 20 bis 60 % Perfluordecalin, Perfluortributylamin oder ein Gemisch aus beiden oder andere Perfluorkohlenstoffe in Lecithin oder anderen Emulgatoren enthält, wobei man diese Emulsion durch Einleiten von molekularem Sauerstoff während 1 bis 5 Minuten unter Verwendung einer Injektionsnadel sättigt.

Beispiel 1

Ein Gemisch aus Kollagen und PDGF enthaltenden Freisetzungsprodukten aus Thrombozyten wurden auf seine wundheilende Aktivität hin getestet, indem man damit Schwämme aus Polyvinylalkohol (Ivalon ) imprägnierte, die dann Ratten subkutan implantiert wurden. Nach einer bestimmten Zeitdauer (sieben Tage) wurde der PVA-Schwamm aus dem Tier wieder entfernt, histologisch angefärbt und mikroskopisch auf Zellinvasion und Abscheidung der extrazellulären Matrix in den Hohlräumen des Schwammes geprüft. Das Ausmaß an Fibroblast- und Endothelzelleninfiltration war ein Maß für die Fähigkeit des Gemisches, die Wundheilung durch Anziehen von Reparationszellen in diesem Bereich zu beschleunigen.
Bei einer Versuchsgruppe unter Verwendung der oben im Zusammenhang mit PVA-Schwämmen beschrieben in vivo-Testtechnik wurden PVA-Schwämme, die ausschließlich mit Kollagen (2 mg/ml) in physiologischer Kochsalzlösung oder mit Kollagen (2 mg/ml) im Gemisch mit unterschiedlichen Konzentrationen an Freisetzungsprodukten aus Thrombozyten imprägniert worden waren, in die Testtiere implantiert. Sieben Tage später wurden die Implantate entfernt und mikroskopisch geprüft, um den Grad der Fibroplasie (Fibroblastinfiltration), Angiogenese (Endothelzelleninfiltration) und Entzündung zu ermitteln. Die Objektträger wurden nach der Methode des Blindversuchs gelesen und anhand einer Skala von 1 bis 4 bewertet, wobei 1 keine oder nur geringe Infiltration (jeweils durch Fibroblasten, Blutgefäße oder inflammatorische Zellen) und 4 einen entsprechenden hohen Grad bedeutet. Nachfolgend sind die Ergebnisse tabellarisch zusammengefaßt. Präparation Fibroplasie Angiogenese Entzündung Schwamm Schwamm + Kollagen Schwamm + Kollagen + Thrombozyten
Aus der Tabelle geht hervor, daß die zwischen 3,3 x 10&sup6;/mm³ und 33 x 10&sup6;/mm³ Thrombozyten enthaltenden Gemische in bezug auf Fibroplasie und Angiogenese bessere Ergebnisse erzielen ließen.

Beispiel 2

Die Fähigkeit der Thrombozytenprodukte, Fibroblasten anzuziehen, wurde unabhängig davon in der sogenannten Boyden- Kammer getestet (s. Boyden, J. Expl. Med. 115-453 ff., 1962). Dazu wurden Fibroblasten in Lösung in die eine Hälfte der Boyden-Kammer gegeben, während die Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten bei niedrigen Konzentrationen in der anderen Hälfte der Kammer gelöst wurden. Die beiden Hälften waren durch eine semipermeable Membran voneinander getrennt. Die Wanderung der Fibroblasten in Richtung auf die semipermeable Membran hin und durch diese hindurch, wurde anschließend mikroskopisch verfolgt. In der nachfolgenden Tabelle sind die aus einer Reihe von Boyden-Kammer-Tests bei verschiedenen Konzentrationen an Freisetzungsprodukten aus Thrombozyten gewonnenen Daten zusmamengefaßt. Getestetes Material x-facher Anstieg der Chemotaxis gegenüber der Kontrolle Kontrolle (physiologische Kochsalzlösung) aus Thrombozyten freigesetztes Produkt, ul

Beispiel 3

In einem anderen Test wurde die Fähigkeit der Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten geprüft, Angiogenese zu induzieren (Hornhautimplantattest bei Kaninchen, beschrieben von Gimbrone Jr. MA, Cotran RS, Leapman SB, Folkman J. J Natl. Cancer Inst. 52: 413-427, 1974). Zu diesem Zweck wurde die Prüflösung mit einer gleichen Menge Hydron (Fa. Hydron Laboratories, New Brunswick, N.J.) gemischt, dann in 20 ul- Anteilen auf eine Polyethylenbahn aufgetropft und dann unter Vakuum getrocknet. Die auf diese Weise erhaltenen, die Freisetzungsprodukte aus Thrombozyten enthaltenden Pellets aus polymerisiertem Hydron wurden dann in die Hornhaut 2 mm proximal zum oberen Limbus implantiert. Die Augen wurden dann täglich im Verlaufe von 14 Tagen nach der Implantation bewertet. Das Kapillarwachstum vom Limbus aus in Richtung zum Implantat oder in dieses hinein wurde als positives Zeichen für Angiogenese gewertet. Die angiogene Reaktion wurde im Blindversuch anhand einer relativen Skala von 0 bis 4 bewertet, wobei ein normales bzw. negatives Auge mit 0 eingestuft wurde, eine maximale Reaktion dagegen mit 4. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt. Testmaterial Angiogene Reaktion Physiologische Kochsalzlösung aus Thrombozyten freigesetztes Produkt, ul
Aus der Tabelle geht hervor, daß die Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten eine starke angiogene Reaktion auslösen.
Das Kollagen hat in diesem Präparat zwei Hauptfunktionen. Es bildet Fasern, an denen entlang sich vorzugsweise Zellen bilden und erleichtert bzw. beschleunigt damit die Zellbildungsreaktion auf die Freisetzungsprodukte aus den Thrombozyten. Außerdem bildet es eine Matrix, welche die Diffusion der Freisetzungsprodukte von der Wunde weg verzögert und damit ihre Aktivität verlängert.

Beispiel 4

Zur Überprüfung der Wirkung eines Kollagen-Thrombozyten- Präparats auf das Schließen einer Hautwunde in vivo wurden durchgehende Hautdefekte auf dem Rücken von Meerschweinchen mit folgenden Präparaten behandelt:
a) ausschließlich Kollagen (dasselbe wie in den PVA- Versuchen)
b) ausschließlich Thrombozyten (5 x 10&sup6;/ml)
c) Kollagen + Thrombozyten (dasselbe wie in den PVA- Versuchen)
d) unbehandelt.
Die Wirkung der einzelnen Behandlungen auf den Heilungsprozeß wurde täglich geprüft, indem der Wundbereich gemessen wurde sowie histologisch 10 Tage danach durch Messung des Fortschreitens der Epithelisierung unter Verwendung eines Mikrorasters im Okular des Mikroskops.
Schließlich wurde zur Überprüfung der Wirkung des vollständigen Kollagengemisches auf den Heilungsprozeß eine weitere Serie von Meerschweinchen verwundet und mit dem Kollagen- Thrombozyten-Gemisch behandelt, dem nach Emulgierung mit Lecithin in einer Öl-Wasser-Emulsion, bei der die Konzentration der dispergierten Phase 20 bis 60 % betrug, 0,25 l/ml einer mit FC-45 (der Firma Sigma) bezeichneten Perfluorkohlenstoffverbindung zugesetzt worden war.
Bei den Versuchen mit dem Perfluorkohlenstoff wurde das vollständige Kollagengemisch dadurch hergestellt, daß man 0,25 ml der Emulsion jeweils einem ml des Kollagen-Thrombozyten-Gemisches zusetzte, gewöhnlich unter Zugabe von 1 ml Polyfluorkohlenstoff zu 4 ml Kollagen-Thrombozytengemisch in einer sterilen, luftdicht abgeschlossenen 10 ml-Ampulle, in der die Luft durch Sauerstoff ersetzt worden war, den man über eine Injektionsnadel hatte einströmen lassen. Die Ampullen wurden vor dem Abziehen des Inhalts zur Anwendung auf die offenen Wunden gut geschüttelt. Einige Wunden wurden lediglich mit Polyfluorkohlenstoff behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Art der Behandlung Prozentanteil der nach ... Tagen geschlossenen Wundfläche Relativer Fortschritt in der Epithelisierung am 10. Tag Unbehandelt Ausschließlich Kollagen Ausschließlich Thrombozyten Ausschließlich PFC Kollagen + Thrombozyten Kollagen + Thrombozyten + PFC (vollständig*) * Ein deutliches Merkmal des Epithels war bei dieser Versuchsgruppe die fast normale Dicke und die Anwesenheit gut ausgebildeter Epithelausbuchtungen (rete pegs)
Für einen Fachmann ist klar, daß die Erfindung nicht auf die Einzelheiten der angeführten illustrierenden Beispiele beschränkt ist und sie auch auf andere Weise ausgeführt werden kann, ohne von ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen. Sämtliche Ausführungsformen und Beispiele haben daher nur illustrierenden und nicht einschränkenden Charakter, wobei mehr auf die beigefügten Ansprüche Bezug genommen wird als auf die vorangegangene Beschreibung. Alle Änderungen innerhalb des Bereichs der Ansprüche werden daher von diesen mitumfaßt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines lagerbeständigen lyophilisierten Kollagenproduktes, das ein säurelösliches gereinigtes natives Kollagen in Kombination mit aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktoren enthält, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

a) Mischung des säurelöslichen Kollagens mit dem thrombozytenreichen Plasma;

b) Halten des Gemisches bei einer Temperatur von 34 bis 37,5ºC während 30 bis 60 Minuten bis zur Bildung eines festen Gels;

c) Abkühlung des Gels bei einer Temperatur von 0 bis 4ºC während 60 bis 120 Minuten, wobei das Gel in Lösung geht;

d) Zentrifugieren der erhaltenen Lösung bei 15.000 bis 35.000 U/min während 15 bis 25 Minuten zur Entfernung des unlöslichen Kollagens, der Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke, wodurch man einen lösliches Kollagen und freigesetzt Thrombozytenprodukte enthaltenden Überstand erhält, und

e) Lyophilisierung der Lösung unter Bildung eines beständig gen lyophilisierten Produktes.

2. Verfahren zur Herstellung eines lagerbeständigen lyophilisierten Kollagenproduktes nach Anspruch 1, das die zusätzliche Stufe der Mischung der Lösung von Stufe d) mit der Emulsion einer Perfluorkohlenstoffverbindung und eines nichttoxischen pharmakologisch verträglichen Emulgators unter nachfolgender Lyophilisierung der erhaltenen Emulsionslösung zur Bildung eines beständigen lyophilisierten Produktes umfaßt.

3. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen oder veterinärmedizinischen Gemisches zur Verbesserung der Wundheilung, das folgende Stufen umfaßt:

a) Mischung des säurelöslichen Kollagens mit dem thrombozytenreichen Plasma;

d) Zentrifugieren der erhaltenen Lösung bei 15.000 bis 35.000 U/min während 15 bis 25 Minuten zur Entfernung des unlöslichen Kollagens, der Thrombozytenmembranen und Zellbruchstücke, wodurch man einen lösliches Kollagen und freigesetzte Thrombozytenprodukte einschließlich aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktoren enthaltenden Überstand erhält;

e) Mischung dieser Lösung mit einer Perfluorkohlenstoffverbindung und einem pharmakologisch verträglichen Emulgator und

f) Einleitung von molekularem Sauerstoff in die Lösung zwecks Mischung mit der Perfluorkohlenstoffverbindung, wobei diese als Sauerstoffträger und Freisetzungsmittel im Gemisch dient.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin die Perfluorkohlenstoffverbindung Perfluortripropylamin, cis- und trans-Perfluordecalin, Perfluorisopentyltetrahydropyran Perfluor-N,N- dimethylcyclohexylamin, Perfluor-1-methyldecalin oder Perfluortributylamin, vorzugsweise cis-Perfluordecalin, trans- Perfluordecalin, Perfluor-1-methyldecalin Perfluortripropylamin oder Perfluor-tributylamin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin der Emulgator Lecithin, Tween 80 oder Pluronic F-68 ist.

6. Pharmazeutisches oder veterinärmedizinisches Gemisch zur Verbesserung der Wundheilung, das ein lagerfähiges lyophilisiertes Kollagen umfaßt, das säurelösliches gereinigtes natives Kollagen im Gemisch mit aus Thrombozyten gewonnenen Wachstumsfaktoren enthält, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5 hergestellt wurde.