DE69332485T2

DE69332485T2 - Immunmodulierende peptide

Info

Publication number: DE69332485T2
Application number: DE69332485T
Authority: DE
Inventors: Roman M. Chicz; Mary Lynne Hedley; Lawrence J. Stern; Jack L. Strominger; Robert Glen Urban; Dario A. Vignali
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1992-08-11
Filing date: 1993-08-11
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2013-08-12
Also published as: CA2142007C; CA2142007A1; US5827516A; EP0671926A1; EP0671926A4; EP0671926B1; US6509033B1; US5880103A; DE69332485D1

Description

Das Gebiet der Erfindung sind Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Antigene.
Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Antigene der Klasse II sind Zelloberflächenrezeptoren, die alle spezifischen Immunantworten bei Wirbeltieren steuern. Der Mensch besitzt drei verschiedene MHC-Isotypen der Klasse II: DR, für welches etwa 70 unterschiedliche Allotypen bekannt sind; DQ, für welches 33 unterschiedliche Allotypen bekannt sind; und DP, für welches 47 unterschiedliche Allotypen bekannt sind. Jedes Individuum trägt zwei bis vier DR-Allele, zwei DQ-Allele und zwei DP-Allele.
MHC-Rezeptoren (sowohl Klasse I als auch Klasse III) sind an dem obligaten ersten Schritt der Immunerkennung beteiligt, indem sie kleine Proteinfragmente (Peptide), die von pathogenen oder anderen wirtsfremden Quellen stammen, binden und diese Peptide den Regulatorzellen des Immunsystems (T-Zellen) präsentieren. Erfolgt keine MHC-Präsentation, sind die T-Zellen nicht in der Lage, pathogenes Material zu erkennen. Zellen, die MHC-Rezeptoren der Klasse II exprimieren, werden als Antigen-präsentierende Zellen (APC) bezeichnet. APCs nehmen pathogene Organismen und andere Fremdstoffe in sich auf, indem sie diese in endosomen Vesikeln umhüllen, worauf sie diese dann einem enzymatischen und chemischen Abbau unterziehen. Fremdproteine, die von APCs aufgenommen werden, werden teilweise abgebaut oder "verarbeitet", um eine Mischung aus Peptiden zu erzielen, von welchen einige durch MHC-Moleküle der Klasse II gebunden werden, die sich auf dem Weg zur Oberfläche befinden. Sobald sie sich an der Zelloberfläche befinden, stehen MHC-gebundene Peptide für die T-Zell- Erkennung zur Verfügung.
MHC-Antigene der Klasse II sind auf der Oberfläche von APCs als ein dreimolekularer Komplex exprimiert, der aus einer α-Kette, einer β-Kette und einem verarbeiteten Peptid zusammengesetzt ist. Wie die meisten Polypeptide, die auf der Zelloberfläche exprimiert sind, enthalten sowohl die α-Kette als auch die β-Kette kurze Signalsequenzen an ihren NH&sub2;-Termini, welche diese zu dem endoplasmatischen Retikulum (ER) führen. In dem ER assoziiert sich der Komplex der α/β- Kette der Klasse II mit einem zusätzlichen Protein, das als invariante Kette (Ii) bezeichnet wird. Es wird vorgeschlagen, dass die Assoziation mit Ii die vorzeitige Akquisition von Peptiden blockiert (durch Blockieren des Peptidbindungsspaltes des MHC-Heterodimers), eine stabile α/β-Interaktion begünstigt und den nachfolgenden intrazellulären Transport des Komplexes zu endosomen Vesikeln lenkt. In den Endosomen wird die Ii durch einen Prozess, der mit Proteolyse einhergeht, entfernt; dadurch wird der Peptidbindungsspalt frei, wodurch sich Peptide, die in dem Endosom vorhanden sind, an das MHC-Molekül binden können. Der Peptidkomplex der Klasse II wird von den Endosomen zu der Zelloberfläche transportiert, wo er für die T-Zell-Erkennung und eine nachfolgende Aktivierung von Immunantworten zugänglich wird. MHC-Moleküle der Klasse II binden nicht nur an Peptide, die von exogenen (aufgenommenen) Proteinen stammen, sondern auch an solche, die durch den Abbau von endogenen (eigenen) Proteinen erzeugt werden. Die Menge jeder Spezies von Peptiden, welche die Klasse II binden, wird durch deren lokale Konzentration und deren relative Bindungsaffinität für die gegebene Bindungsgrube der Klasse II bestimmt, wobei die verschiedenen Allotypen unterschiedliche Peptidbindungsspezifizitäten zeigen.
In einer frühen Phase der fetalen Entwicklung wird das Immunsystem von Säugetieren für eigene Peptide "tolerisiert" oder gelehrt, nicht auf diese zu reagieren. Die Stabilität und die Aufrechterhaltung dieses Systems sind wichtig, um sicherzustellen, dass ein Tier keine Immunantwort gegen sich selbst erzeugt. Ein Zusammenbruch dieses Systems führt zu solchen Autoimmunzuständen wie Diabetes, rheumatoide Arthritis und multiple Sklerose. Derzeitige Technologien, die beabsichtigen, das Immunsystem dahingehend zu manipulieren, dass es wieder das richtige Nichtansprechen herstellt, beinhalten Protokolle, welche die intravenöse Gabe von synthetischen, mit hoher Affinität bindenden Peptiden als blockierende Peptide beinhalten.
Eine Impfung kann eine schützende Immunität gegen einen pathogenen Organismus erzeugen, indem eine Antikörpervermittelte und/oder eine T-Zell-vermittelte Antwort stimuliert wird. Die meisten der derzeitigen Impfstrategien nutzen noch immer relativ primitive Präparate wie beispielsweise abgeschwächte oder inaktivierte Viren. Diese Impfstoffe erzeugen oft eine Antikörper- und Zellen- vermittelte Immunität und ermöglichen nicht, die Art der erzeugten Immunantwort zu modulieren. Darüber hinaus kann bei vielen Krankheiten die Erzeugung der falschen Art von Immunantwort zu einem verschlimmerten Krankheitszustand führen.
In der vorliegend offenbarten Arbeit wurden natürlich verarbeitete oder prozessierte Peptide, die an sechs der etwa 70 bekannten menschlichen MHC-DR-Allotypen der Klasse II gebunden sind, (HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7 und HLA-DR8) charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass diese Peptide überwiegend von eigenen Proteinen anstatt von fremden Proteinen stammen. Es wurden mehrere Eigenpeptidfamilien mit der unerwarteten Eigenschaft der degenerierten Bindung identifiziert: Das bedeutet, dass ein gegebenes Eigenpeptid an eine Reihe von HLA-DR-Allotypen binden wird. Diese Beobachtung läuft der weitgehend akzeptierten Ansicht über die Funktion von MHC der Klasse II entgegen, welche besagt, dass jeder Allotyp einen unterschiedlichen Satz von Peptiden bindet. Darüber hinaus binden viele, wenn nicht alle, der vorliegend offenbarten Eigenpeptide an Moleküle der Klasse II mit einer relativ hohen Affinität. Diese drei Eigenschaften - (1) eigene statt fremde, (2) Degeneration, und (3) hohe Bindungsaffinität - legen ein neues Mittel zur therapeutischen Intervention bei Krankheitszuständen nahe, die durch Autoreaktivität gekennzeichnet sind, wie etwa Diabetes des Typs I, rheumatoide Arthritis und multiple Sklerose. Außerdem könnte eine solche Therapie genutzt werden, um die Abstoßung von Transplantaten zu reduzieren.
Bei der therapeutischen Nutzung der Erfindung werden kurze Peptide, die auf den erfindungsgemäßen immunmodulierenden Eigenpeptiden mit hoher Affinität modelliert werden (welche vorzugsweise nicht-allel restriktiert sind), in die APCs eines Patienten eingebracht. Eine Gewebetypisierung zur Bestimmung der speziellen Allele der Klasse II, die durch den Patienten exprimiert werden, ist möglicherweise unnötig, da unsere Peptide von mehreren Isotypen der Klasse II gebunden werden können. Es kann nützlich sein, einen "Cocktail" von Peptiden anzuwenden, wenn für einzelne Peptide eine vollständige Degenerierung fehlt, d. h. wenn sich Peptide an weniger als alle Allotypen binden; der Cocktail bietet eine überlappende Bindungsspezifizität. Sobald es sich in der APC befindet, bindet ein Peptid mit hoher Affinität an die Moleküle der Klasse II, wodurch es die Bindung von immunogenen Peptiden blockiert, welche für die für den Krankheitszustand charakteristische Immunantwort verantwortlich sind. Da unsere beschriebenen blockierenden Peptide Eigenpeptide mit den richtigen, während der Ontogenese tolerisierten Carboxyl- und Amino-Termini sind, sind sie immunologisch inert und werden keine Immunantwort induzieren, die bei der Verwendung nicht eigener blockierender Peptide die Behandlung komplizieren könnte.
Die Peptide können direkt in die APCs eingebracht werden, z. B. durch intravenöse Injektion einer Lösung, die eines oder mehrere der Peptide enthält. Alternativ können die APCs mit einem Mittel zur intrazellulären Synthese großer Mengen der blockierenden Peptide versehen werden. Rekombinante Gene, die ER- und/oder endosomale Zielsignale kodieren, die mit blockierenden Peptidsequenzen fusioniert sind, werden mit geeigneten Expressionssteuerungssequenzen verknüpft und in APCs eingebracht. Sobald sie sich in der Zelle befinden, steuern diese Gene die Expression der hybriden Peptide. Auf das ER zielgerichtete Peptide werden α- und β-Ketten der Klasse II binden, wenn sie translatiert und zu Heterodimeren zusammengesetzt werden. Das Vorhandensein von mit hoher Affinität bindenden Peptiden in dem ER wird die Assoziation des α/β-Komplexes mit der invarianten Kette verhindern und somit den intrazellulären Transport stören. Das Molekül/der blockierende Peptidkomplex der Klasse II kann nachfolgend auf der Zelloberfläche exprimiert werden, würde aber keine Immunantwort entlocken, da die T-Zellen in der frühen Entwicklung für diesen Komplex tolerisiert wurden. Die Verwendung von mit ER-Retentionssignalen markierten Peptiden kann möglicherweise auch verhindern, dass die Moleküle der Klasse II mit dem Peptidkomplex das ER verlassen. Alternativ kann das rekombinante Peptid mit einem endosomalen Zielsignal markiert werden, welches es nach der Synthese in das endosome Kompartiment führt, wobei auch das Verhältnis von endogen prozessierten Peptiden zu blockierenden Peptiden in dem Endosom verzerrt wird und die Bindung des blockierenden Peptids mit hoher Affinität an etwaige Moleküle der Klasse II, die dieses nicht in der ER gebunden haben, begünstigt wird. Für einen einzelnen Patienten kann es vorteilhaft sein, ein oder mehreren zum ER gerichtete Peptide in Kombination mit einem oder mehrere zum Endosom gerichteten Peptiden zu verwenden, sodass α/β-Komplexe, die nicht in dem ER mit erfindungsgemäßen Peptiden gefüllt werden, dann auf dem endozytischen Weg blockiert werden. Das Endergebnis ist wiederum die Expression eines nicht-immunogenen Peptidkomplexes der Klasse II auf der Zelloberfläche.
Die Verwendung eines nicht restriktierten bindenden Peptids mit hoher Affinität der Klasse II, das an ein intrazelluläres Ausliefersystem gekoppelt ist, ermöglicht die spezifische Verminderung von Klasse-II-restriktierten Immunantworten, ohne dass dies mit den pleiotropen nachteiligen Reaktionen einhergeht, die mit den derzeitigen pharmakologischen Strategien verknüpft sind. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technologien wird einen wesentlichen Fortschritt in Richtung der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und der Vorbeugung einer Transplantatabstoßung darstellen.
Das intrazelluläre Ausliefersystem kann auch beispielsweise bei der Impfung eines Tieres, eines menschlichen Patienten oder eines kommerziell bedeutsamen Säugetieres wie etwa einer Kuh, das für solche Krankheiten wie die Maul- und Klauenseuche anfällig ist, genützt werden. Ein solches System kann derart zugeschnitten werden, dass die in einer gegebenen Situation erforderliche Art von Immunantwort erzeugt wird, und zwar durch Anpassung in Folgendem: (a) Peptidspezifizität für MHC der Klasse I oder der Klasse II; (b) Peptid/Proteinlänge und/oder -sequenz; und (c) Verwendung spezifischer Marker für organelle Zielrichtung. Das erfindungsgemäße System stellt sicher, dass Peptide nur in Zellen erzeugt werden und nicht außerhalb der Zellen vorhanden sind, wo sie durch Kontakt mit B-Zellen eine Antikörperproduktion stimulieren könnten. Dies beschränkt die durch einen solchen Impfstoff erzeugte Immunantwort auf eine T-Zellenvermittelte Immunität, wodurch eine entweder ungeeignete oder potentiell schädliche Reaktion verhindert wird, wie sie bei Standardimpfstoffen beobachtet werden kann, welche auf die Organismen abzielen, die beispielsweise HIV, Malaria, Lepra und Leishmaniose verursachen. Darüber hinaus kann diese ausschließlich von T-Zellen vermittelte Immunantwort auf der Klasse I oder der Klasse II oder beiden basieren, und zwar in Abhängigkeit von der Länge und dem Charakter der immunogenen Peptide: Von MHC-Molekülen der Klasse I ist bekannt, dass sie sich vorzugsweise an Peptide mit einer Länge von 8 bis 10 Resten binden, während sich Moleküle der Klasse II mit einer hohen Affinität an Peptide binden, deren Länge im Bereich von 12 bis 25 Resten liegt.
Für die Immunisierung und Therapie im Zusammenhang mit der Erfindung kann ein gereinigtes Präparat eines unserer Peptide verwendet werden, d. h. ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die mit der eines Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins (d. h. eines "Eigenproteins") identisch ist, wobei ein solches Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten aufweist, wobei sich das Peptid an einen menschlichen MHC-Allotyp der Klasse II bindet und sich bevorzugt an zumindest zwei verschiedene MHC-Allotypen der Klasse II bindet (z. B. einen der etwa 70 bekannten DR-Allotypen, der etwa 47 bekannten DP-Allotypen oder der etwa 33 bekannten DQ-Allotypen). Der Teil des Peptids, der dem Eigenproteinsegment entspricht, wird vorliegend als "Eigenpeptid" bezeichnet. Mit "gereinigtem Präparat" ist ein Präparat gemeint, bei dem zumindest 50 (Gewichts-)% der Polypeptidbestandteile aus dem erfindungsgemäßen Peptid bestehen. In bevorzugten Ausführungsformen stellen die Peptide mindestens 60% (bevorzugter mindestens 80%) des gereinigten Präparats dar. Das natürlich vorkommende menschliche Protein ist HLA-A2 (wie später ausführlich definiert), HLA-A29, HLA-A30, HLA-B44, HLA-B51, HLA-Bw62, HLA-C, HLA-DQ α-Kette, HLA-DQ β-Kette, HLA-DQ3.2 β-Kette, HLA-DR α-Kette, HLA-DR β-Kette, HLA-DR4 β-Kette, invariante Kette (Ii), Ig Kappa-Kette, Ig Kappa-Kette C-Region, Ig- Schwerkette, Na&spplus;/K&spplus;-ATPase, Kaliumkanalprotein, Natriumkanalprotein, Kalziumfreigabekanalprotein, Komplement C9, Glucose-Transportprotein, CD35, CD45, CD75, Calgranulin B, Kinase C -Kette, Hämoglobin, Tubulin α-1-Kette, Myosin β- Schwerkette, Transferrin, Transferrin-Rezeptor, Fibronectin- Rezeptor α-Kette, Acetylcholin-Rezeptor, Interleukin-8- Rezeptor, Interferon α-Rezeptor, γ-Interferon-Rezeptor, Calcitonin-Rezeptor, LAM (Lymphozytenaktivierungsmarker) Blast-1, LAR(Leukozyten-Antigen-verwandtes)-Protein, LIF(Leukämie-Inhibitorfaktor)-Rezeptor, 4F2-Zelloberflächen- Antigen(ein Zelloberflächen-Antigen, das an normalem und neoplastischem Wachstum beteiligt ist)-Schwerkette, Cystatin SN, VLA-4 (ein Zelloberflächen-Heterodimer in der Integrin- Überfamilie von Adhäsionsrezeptoren), PAI-1 (Plasminogen- Aktivator-Inhibitor-1), IP-30 (γ-Interferon-induziertes Protein), ICAM-2, Carboxypeptidase E, Thromboxan-A-Synthase, NADH-Cytochrom-b5-Reduktase, c-myc-Transformationsprotein, K-ras-Transformationsprotein, MET-kinaseverwandtes Transformationsprotein, Interferon-induziertes Guanylat- Bindungsprotein, Mannose-Bindungsprotein, Apolipoprotein B-100, Cathepsin C, Cathepsin E, Faktor VIII, Von-Willebrand- Faktor, Metalloproteinase-Inhibitor-1-Präkursor, Metalloproteinase-Inhibitor 2 oder hitzegeschocktes, artverwandtes 71-kD-Protein. Das Eigenpeptid entspricht vorzugsweise dem folgenden Muster: An einer ersten Referenzposition (I) bei oder innerhalb von 12 Resten des Aminoterminalen Restes des Segments ein positiv geladener Rest (d. h. Lys, Arg oder His) oder ein stark hydrophober Rest (d. h. Phe, Trp, Leu, Ile, Met, Tyr oder Pro); und an Position I+5 ein Wasserstoffbindungsdonator-Rest (d. h. Tyr, Asn, Gln, Cys, Asp, Glu, Arg, Ser, Trp oder Thr). Zusätzlich kann das Peptid auch dahingehend charakterisiert sein, dass es an den Positionen I+9, I+1 und/oder I-1 einen hydrophoben Rest (d. h. Phe, Trp, Leu, Ile, Met, Pro, Ala, Val oder Tyr) aufweist (wobei %-" die Positionen nach rechts oder zum Carboxyl-Terminus hin und "-" die Positionen nach links oder zum Amino-Terminus hin bezeichnet.) Ein typisches Peptid wird eine Sequenz enthalten, die den Resten 106-115 von HLA = A2 entspricht (d. h. DWRFLRGYHQ; SEQ-ID-Nr. 150) oder den Resten 107-116 von Ii (d. h. RMATPLLMQA; SEQ-ID-Nr. 151), oder eine Sequenz, die im Wesentlichen mit einer der in den SEQ- ID-Nr. 1-22, 61, 63-67, 69-133, 135, 140-146, 150, 151, 158-246, 248-258 oder 269-273 dargelegten Sequenzen identisch ist.
Bei der Nutzung der Erfindung zur Therapie und Immunisierung kann auch ein Nukleinsäuremolekül (RNA oder DNA) verwendet werden, das eines unserer Peptide kodiert, das aber nicht die gesamte Sequenz des Eigenproteins kodiert. Die Nukleinsäure kodiert vorzugsweise keinen anderen wesentlichen Teil des Eigenproteins als das spezifizierte Eigenpeptid, welches sich an ein MHC-Molekül der Klasse II bindet, obwohl es optional ein Signalpeptid oder eine andere Transportsequenz enthalten kann, welche von dem Eigenprotein (oder von einem anderen Protein) abgeleitet wurde. Eine Transportsequenz ist eine Aminosäuresequenz mit der Funktion, den intrazellulären Transport (gerichtete Bewegung von Organelle zu Organelle oder zur Zelloberfläche) eines Polypeptids, an welchem sie angelagert ist, zu steuern. Solche Transportsequenzen können das Polypeptid zum ER, zu einem Lysosom oder einem Endosom transportieren und können Signalpeptide enthalten (die Aminoterminalen Sequenzen, welche die Proteine während der Translation in das ER lenken), ER-Retentionspeptide wie etwa KDEL (SEQ-ID-Nr. 152) und Lysosom-Zielpeptide wie etwa KFERQ (SEQ-ID-Nr. 153), QREFK (SEQ-ID-Nr. 154) und andere Pentapeptide, bei denen Q auf einer Seite von vier Resten flankiert ist, die aus K, R, D, E, F, I, V und L ausgewählt sind. Ein Beispiel eines Signalpeptides, das bei der Verwirklichung der Erfindung nützlich ist, ist ein Signalpeptid, das im Wesentlichen mit dem einer MHC-Untereinheit wie etwa α oder β der Klasse II identisch ist, z. B. ist das Signalpeptid von MHC Klasse II a in der Sequenz MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA (SEQ-ID-Nr. 155) enthalten. Das durch die Nukleinsäure entsprechend der Erfindung kodierte Signalpeptid kann nur einen Teil (z. B. mindestens zehn Aminosäurereste) der spezifizierten Sequenz mit 25 Resten enthalten, vorausgesetzt der Teil reicht aus, um den Transport des Polypeptides zu dem ER zu bewirken. In bevorzugten Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäure ein zweites Eigenpeptid und eine zweite Transportsequenz (die mit dem ersten Eigenpeptid und der ersten Transportsequenz identisch sein können oder sich von diesen unterscheiden können), und sie kann auch zusätzliche Eigenpeptide und Transportsequenzen kodieren. Bei einer weiteren Variante dieses Aspekts der Erfindung ist die Eigenpeptidsequenz (oder eine im Tandem angeordnete Mehrzahl von Eigenpeptidsequenzen) durch eine Peptidbindung mit einem im Wesentlichen intakten Ii-Polypeptid verknüpft, welches dann die Eigenpeptidsequenz mitnimmt, wenn es das Molekül der Kasse II von dem ER zu dem Endosom transportiert.
Die Nukleinsäure kann auch Expressionssteuerungssequenzen enthalten (die als Transkriptions- und Translations- Startsignale, Promotoren und Verstärker definiert sind, welche die Expression der Kodierungssequenz, welcher sie zugeordnet sind, ermöglichen und/oder optimieren) und/oder eine genomische Nukleinsäure eines Phagen oder eines Virus, beispielsweise eine abgeschwächte oder nichtreplikative, nichtvirulente Form des Vaccinia-Virus, Adenovirus, Epstein- Barr-Virus oder eines Retrovirus.
Die Peptide und Nukleinsäuren können für die therapeutische Verwendung präpariert werden, indem sie direkt in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufgelöst werden oder indem sie in Liposomen oder immunstimulierenden Komplexen (ISCOMs) eingekapselt werden. Solche Präparate sind brauchbar, um eine Immunantwort in einem menschlichen Patienten zu hemmen, indem eine Mehrzahl von APCs des Patienten in Kontakt mit dem therapeutischen Präparat gebracht wird und dadurch das Peptid oder die Nukleinsäure in die APCs eingebracht wird.
Außerdem ist im Schutzumfang der Erfindung eine Zelle enthalten (z. B. eine Gewebekulturzelle oder eine Zelle wie etwa eine B-Zelle oder eine APC in einem Menschen), die ein Nukleinsäuremolekül entsprechend der Erfindung enthält. Eine kultivierte Zelle, die eine solche Nukleinsäure enthält, kann zur Herstellung eines Peptids entsprechend der Erfindung verwendet werden, und zwar in einem Verfahren, das die Kultivierung der Zelle unter Bedingungen beinhaltet, welche die Expression des Peptids von dem Nukleinsäuremolekül gestatten.
Unsere therapeutischen Verwendungen lösen bestimmte Probleme, die mit den Methoden des Standes der Technik verknüpft sind, welche die intravenöse Injektion synthetischer Peptide beinhalten: (1) Wegen der Allel-Spezifizität ist bisher kein Peptid identifiziert worden, das in der Lage ist, sich mit einer hohen Affinität an alle oder auch die meisten der unterschiedlichen Allotypen der Klasse II zu binden, die in der allgemeinen Population exprimiert sind; (2) die Halbwertzeiten von Peptiden, die intravenös verabreicht werden, sind generell sehr niedrig, was eine wiederholte Verabreichung mit den damit verbundenen hochgradigen Unannehmlichkeiten und hohen Kosten notwendig macht; (3) diese Art des Ansatzes der Auslieferung macht es erforderlich, dass das blockierende Peptid das natürlich vorkommende Peptid, welches den Bindungsspalt eines Moleküls der Klasse II belegt, verschiebt, während sich das letztere auf der Zelloberfläche befindet, was nun als sehr ineffizienter Prozess betrachtet wird; und (4) wenn das verwendete blockierende Peptid selbst immunogen ist, kann es möglicherweise bei einigen Patienten schädliche Immunantworten begünstigen.
Andere Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden.
Zunächst werden kurz die Zeichnungen beschrieben. In den Zeichnungen zeigen die
Fig. 1A-1F chromatographische Analysen der Peptidpools, die aus Papain-digeriertem HLA-DR1, DR2, DR3, DR4, DR7 bzw. DR8 extrahiert wurden, welche das Peptidrepertoire der jeweiligen HLA-DR veranschaulichen, wie es durch die UV-Extinktion erfasst worden ist. Die UV-Extinktion sowohl für 210 nm als auch für 277 nm ist auf einer vollen Extinktionskala von 500 mAU mit einem Erfassungsfenster zwischen 16 Minuten und 90 Minuten gezeigt (jede Markierung stellt 2 Minuten dar).
Fig. 2 ist eine repräsentative massenspektrometrische Analyse der Größenverteilung isolierter HLA-DR1- gebundener Peptide. Die bestimmten Peptidmassen in Gruppen von 100 Masseeinheiten wurden gegen die Anzahl isolierter Peptide, die durch die Massenspektrometrie identifiziert wurden, aufgetragen. Die Peptidlänge wurde berechnet, indem die experimentelle Masse durch eine mittlere Aminosäuremasse von 118 Dalton dividiert wurde.
Fig. 3A ist eine Darstellung eines Minigens (SEQ-ID-Nr. 147), bei welchem das Leit- oder Leader-Peptid der HLA-DR α-Kette mit dem Amino-Terminus eines aus 15 Resten bestehenden blockierenden Peptidfragments der menschlichen invarianten Kette Ii verknüpft ist.
Fig. 3B ist eine Darstellung eines zweiten Minigens (SEQ-ID- Nr. 148), bei welchem das Leader-Peptid der HLA-DR α-Kette mit dem Amino-Terminus eines aus 24 Resten bestehenden blockierenden Peptidfragments der menschlichen invarianten Kette Ii verknüpft ist.

EXPERIMENTELLE DATEN

Verfahren

1. Reinigung von HLA-DR-Antigenen

HLA-DR-Moleküle wurden aus homozygen, durch den Epstein-Barr- Virus transformierten, menschlichen B-Lymphoblastoidlinien gereinigt: DR1 aus LG-2-Zellen, DR2 aus MST-Zellen, DR3 aus WT20-Zellen, DR4 aus Priess-Zellen, DR7 aus Mann-Zellen und DR8 aus 23.1-Zellen. Alle diese Zelllinien sind öffentlich verfügbar. Das Zellwachstum, die Gewinnungsbedingungen und die Proteinreinigung erfolgten wie bereits früher beschrieben (Gorga, J. et al., 1991). Kurz gesagt wurden 200 Gramm jedes Zelltyps in 10 mM Tris-HCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH-Wert 8,0 resuspendiert und in einem Thomas-Homogenisierer lysiert. Die Zellkerne wurden durch eine 5-minütige Zentrifugation bei 400 · g entfernt und die Pellets wurden gewaschen und erneut pelletiert, bis der Überstand klar war. Der gesamte Überstand wurde gesammelt und die Membranfraktion wurde durch eine 40-minütige Zentrifugation bei 175.000 · g gewonnen. Die Pellets wurden dann in 10 mM Tris-HCl, 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 4-% NP-40 resuspendiert. Das ungelöste Membranmaterial wurde durch 2-stündige Zentrifugation bei 175.000 · g entfernt und die in NP-40 lösliche Überstand-Fraktion wurde in der Immunoaffinitätsreinigung verwendet.
Das Detergens-lösliche HLA-DR wurde an eine LB3.1-Protein-A- Sepharosesäule gebunden (Gorga et al., id.) und mit 100 mM Glycin, pH-Wert 11,5 gelöst. Nach der Auflösung wurde die Probe sofort durch Zugabe von Tris-HCl neutralisiert und dann gegen 10 mM Tris-HCl, 0,1% Deoxycholsäure (DOC) dialysiert. Der monoklonale Antikörper von LB3.1 erkennt eine an der nicht polymorphen HLA-DR α-Kette vorhandene Konformationsdeterminante und erkennt somit alle Allotypen von HLA-DR.
Die Transmembrandomäne der DR-Moleküle wurde durch Papain- Digestion entfernt, und das sich ergebende wasserlösliche Molekül wurde weiter durch Gelfiltrationschromatographie auf einer S-200-Säule, equilibriert in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 gereinigt. Die gereinigten DR-Proben wurden durch Ultrafiltration konzentriert, der Ertrag wurde durch BCA-Untersuchung bestimmt und durch SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese analysiert.

II. Extraktion und Fraktionierung gebundener Peptide

Die wasserlöslichen, immunoaffinitätsgereinigten Moleküle der Klasse II wurden weiter durch eine Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt, und zwar in 25 mM N-Morpholinoethan-Sulfosäure (MES), pH-Wert 6,5 und bei einer Flussrate von 1 ml/min, um etwaig verbliebene Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht zu entfernen. Als nächstes wurden Centricon-Mikrokonzentratoren (Molekulargewicht-Grenze 10.000 Dalton) (Amicon Corp.) nacheinander unter Verwendung einer SEC-Pufferlösung und 10%iger Essigsäure gewaschen, bevor die Zentrifugationskonzentrierung der Proteinprobe (Endvolumen zwischen 100 und 200 ul) erfolgte. Aus den ausgewählten Allelen der Klasse II wurden durch Zugabe von 1 ml 10%iger Essigsäure während 15 Minuten bei 70ºC Peptidpools extrahiert. Diese Bedingungen sind ausreichend, um gebundene Peptide von Molekülen der Klasse II freizusetzen, sind jedoch sanft genug, um einen Peptidabbau zu vermeiden. Der Peptidpool wurde nach der Zentrifugierung von dem Molekül der Klasse II abgetrennt, und zwar durch den Centricon-Konzentrator, wobei der Durchfluss die zuvor gebundenen Peptide enthielt.
Der gesammelte säureextrahierte Peptidpool wurde vor der HPLC-Abtrennung in einem Speed-Vac Savant auf ein Volumen von 50 ul konzentriert. Die Peptide wurden auf einer Umkehrphasenchromatographie(RPC)-Säule mit Mikrokern C-18 (Vydac) unter Verwendung des folgenden nichtlinearen Gradientenprotokolls bei einer konstanten Flussrate von 0,15 ml/min separiert: 0-63 min 5-33%ige Pufferlösung B; 63-96 min 33-60%ige Pufferlösung B; 95-105 min 60-80%ige Pufferlösung B, wobei die Pufferlösung A 0,06%ige Trifluor- Essigsäure in Wasser darstellte und die Pufferlösung B 0,055%ige Trifluor-Essigsäure in Acetonitril darstellte. Chromatographische Analysen wurden bei mehreren UV-Wellenlängen (210, 254, 277 und 292 nm) gleichzeitig überwacht, was vor der Massen- und Sequenzanalyse eine spektrophotometrische Bewertung gestattete. In Fig. 1 sind Chromatogramme für jeden der sechs analysierten DR-Peptidpools gezeigt. Die gesammelten Fraktionen wurden danach mittels Massenspektrometrie und Edman-Sequenzierung analysiert.

III. Analyse von Peptiden

Die spektrophotometrische Bewertung der Peptide während der RPC liefert wertvolle Informationen hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung (Beitrag aromatischer Aminosäuren) und wird als Screeningmethode für die nachfolgende Charakterisierung verwendet. Als nächstes wurden geeignete, während der RPC-Separation gesammelte Fraktionen unter Verwendung eines matrixunterstützten Laserdesorptions-Massenspektrometers (MALD-MS) Finnegan MAT-LaserMAT analysiert, um die einzelnen Massenwerte für die prädominanten Peptide zu bestimmen. Zwischen 1% und 4% der gesammelten Fraktion wurde mit der Matrix (1 ul α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure) gemischt, um eine Massenbestimmung extrahierter Peptide zu erzielen. Das Ergebnis dieser Analyse für HLA-DR1 ist in Fig. 2 gezeigt. Als nächstes wurden ausgewählte Peptidproben mittels automatisierter Edman-Degradationsmikrosequenzierung unter Verwendung eines Protein-Sequenzierers ABI-477A (Applied Biosystems) sequenziert, wobei die Verifikation des Carboxyl-Terminus durch massenspektrometrische Analyse unter Verwendung des Triple-Quadrupol-Massenspektrometers Finnigan MAT-TSQ-700, das mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet ist, geliefert wurde. Diese parallele Analyse stellte die vollständige Identität der Peptidzusammensetzung und -sequenz sicher. Der Peptidabgleich mit in der Datenbank SWISS-PROT gespeicherten Proteinsequenzen erfolgte unter Verwendung des Computerdatenbank-Suchprogramms FASTA. In den Tabellen 1-10 sind die Ergebnisse dieser Sequenzanalyse für jedes der untersuchten DR-Moleküle dargelegt.

Ergebnisse

I. HLA-DR1

Das in der vorliegenden Untersuchung verwendete HLA-DR1 wurde mittels Papain aufgeschlossen, um die Verwendung des Materials sowohl für kristallographische Analysen als auch Analysen der gebundenen Peptide zu ermöglichen. Die an DR1 gebundenen Peptide wurden säureextrahiert und unter Verwendung von RPC fraktioniert (Fig. 1). Das Nichtvorhandensein irgendeines erfassbaren Peptidmaterials nach einer zweiten Extraktion/RPC-Separation bestätigte die quantitative Peptidextraktion. Die Aminosäureanalyse (ABI 420A/130A Derivatisierer/HPLC) der extrahierten Peptidpools zeigte eine Ausbeute von 70-80% bei Annahme einer vollständigen Belegung des gereinigten DR1 mit einem molaren Äquivalent gebundener Peptide entsprechend der durch die Massenspektrometrie bestimmten Größenverteilung (siehe Fig. 2). Die aus den DR1-Extraktionen mehrerer unabhängiger Präparate erhaltenen RPC-Profile waren reproduzierbar. Darüber hinaus waren die Profile von entweder Detergens-löslichem oder Papain-aufgeschlossenem DR1 äquivalent. Um zu bestätigen, dass die Peptide in Detergens-löslichem und Papain- aufgeschlossenem DR1 tatsächlich identisch waren, erfolgten massenspektrometrische und Edman-Sequenzierungsanalysen, und diese ergaben identische Massen und Sequenzen für analoge Fraktionen aus den zwei Präparaten.
Die matrixunterstützte Laserdesorptions-Massenspektrometrie (MALD-MS) wurde verwendet, um 111 Spezies mit eindeutiger Masse, die in dem gelösten Peptidpool von DR1 enthalten waren, zu identifizieren, und zwar mit einer mittleren Größe von 18 und einer größten statistischen Häufigkeit von 15 Resten (Fig. 2). Es wurden über 500 zusätzlichen Massenspezies, die in einem Molekulargewichtsbereich von 13-25 Resten vorhanden waren, erfasst; das Signal reichte jedoch nicht aus, um zuverlässig einzelne Massen zuzuordnen. Es wurden mehrere Spezies veränderlicher Masse in Fraktionen erfasst, die einzelnen RPC-Peaks entsprachen, was eine gleichzeitige Lösung von Peptiden anzeigte. Uni diese Peptide weiter zu charakterisieren, wurden Proben parallel auf einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer analysiert, das mit einer Elektrospray-Ionenquelle ausgestattet war (ESI-MS), sowie durch automatische Edman-Degradationsmikrosequenzierung (Lane et al., J. Prot. Chem. 10: 151-160 (1991)). Die Kombination dieser beiden Verfahren erlaubt einen kritischen Nachweis sowohl der N- als auch der C-terminalen Aminosäuren von Peptiden, die in einzelnen Fraktionen enthalten sind. Die Sequenz- und Massedaten, die für zwanzig aus DR1 isolierte Peptide gewonnenen wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle identifizierten Peptide stimmten mit vollständiger Identität mit Regionen von Proteinen überein, die in der Datenbank SWISS-PROT gespeichert sind.
Überraschenderweise waren sechzehn der zwanzig sequenzierten DR1-gebundenen Peptide zu 100% identisch mit Regionen der Eigenproteine HLA-A2 und der Klasse-II-assoziierten invarianten Kette (Ii), was mindestens 26% der gesamten extrahierten Peptidmasse darstellt. Diese isolierten Peptide variierten in der Länge und waren sowohl am N- als auch am C-Terminus abgeschnitten, was nahe legt, dass: (1) die Antigen-Verarbeitung nach der Bindung an DR1 von beiden Enden aus erfolgt, oder (2) Moleküle der Klasse II Antigene aus einem Pool zufällig erzeugter Peptide binden. Die Ergebnisse aus der Peptid-Mikrosequenzierung zeigten an, dass HLA-A2 (Fig. 1) und Ii jeweils mindestens 13% der gesamten DR1-gebundenen Peptide ausmachen.
Ein zusätzlicher überraschender Befund betraf ein Peptid, das, obwohl es an HLA-DR gebunden ist und zu 100% homolog mit dem HLA-A2-Peptid ist, aus einer Zelle abgeleitet wurde, die kein HLA-A2-Protein exprimiert. Offensichtlich ist dieses Peptid von einem Protein abgeleitet, das eine mit einer Region des HLA-A2-Proteins homologe Region enthält. Somit soll die Bezeichnung "HLA-A2-Protein" für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung das HLA-A2-Protein selbst als auch jedes natürlich vorkommende Protein umfassen, das eine zehn oder mehr Aminosäuren lange Region mit einer Homologie von > 80% mit einem HLA-DR-bindenden Peptid, das von HLA-A2 abgeleitet ist, enthält. Ein "HLA-A2-Peptid" bezeichnet analog Peptide von einem beliebigen HLA-A2-Protein entsprechend der vorliegenden breit gefassten Definition.
Die anderen vier in den DR1-Untersuchungen identifizierten Peptide waren von zwei Eigenproteinen abgeleitet, dem Transferrin-Rezeptor und der Na&spplus;/K&spplus;-ATPase, sowie von einem exogenen Protein, dem Rinderserum-Fetuin (einem Protein, das in dem Serum vorhanden ist, welches zur Stärkung des die Zellen umgebenden Mediums verwendet wird). Jedes dieser Peptide belegte nur 0,3 - 0,6% der gesamten DR1-Population, deutlich weniger als sowohl die HLA-A2- oder die Ii-Peptide. Es ist bekannt, dass Moleküle der Klasse II auf dem Weg zur Zelloberfläche den Weg hereinkommender endozytischer Vesikeln kreuzen. Sowohl rezyklierende Membranproteine als auch endozytosierte exogene Proteine wandern auf diesem gemeinsamen Weg. Somit werden die von dem HLA-A2-Transferrin- Rezeptor, der Na&spplus;/K&spplus;-ATPase und dem Rinderfetuin abgeleiteten Peptide alle in ähnlicher Weise auf DR1 treffen. Ii assoziiert sich mit frei werdenden Molekülen der Klasse II in dem endoplasmatischen Retikulum (ER) (Jones et al., Mol. Immunol. 16: 51-60 (1978)), was eine Antigenbindung verhindert, bis der Klasse-II/Ii-Komplex an einem endozytischen Kompartiment ankommt (Roche und Cresswell, Nature 345: 615-618 (1990)), wo Ii eine Proteolyse erfährt (Thomas et al., J. Immunol., 140: 2670-2675 (1988); Röche und Cresswell, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 315003154 (1991)), was das Fortsetzen der Peptidbindung ermöglicht. Vermutlich wurden die an DR1 gebundenen Ii-Peptide in dieser Phase erzeugt.
Es wurden synthetische Peptide entsprechend fünf der in der Tabelle 1 aufgelisteten Peptide hergestellt und deren relative Bindungsaffinitäten an DR1 wurden bestimmt. Das Influenza-A-Hämagglutininpeptid (HA) 307-319 (SEQ-ID-Nr. 24) ist bereits früher als ein HLA-DR1-restriktiertes Peptid mit hoher Affinität beschrieben worden (Roche und Cresswell, J. Immunol. 144: 1849-1856 (1990); Rothbard et al., Cell 52: 515-523 (1988)) und wurde somit als das Kontrollpeptid ausgewählt. Aus Insektenzellen aufgereinigtes "leeres" DR1, das rekombinante DR1 cDNA exprimiert, wurde auf Grund seiner höheren Bindungskapazität und der 10-fach schnelleren Assoziationskinetik als aus menschlichen Zellen isoliertes DR1 (Stern und Wiley, Cell 68: 465-477 (1992)) in den Bindungsexperimenten verwendet. Es wurde festgestellt, dass alle synthetischen Peptide gegenüber den HA-Peptiden (Tabelle 2) gut konkurrierten (Ki < 100 nM). In erster Nährung wies das Peptid Ii 106-119 (SEQ-ID-Nr. 156) die höchste Affinität von allen gemessenen, konkurrierenden Peptiden auf, die der für das Kontrollpeptid HA bestimmten äquivalent war. Zusätzlich zu den Ki-Bestimmungen wurde festgestellt, dass diese Peptide eine Widerstandsfähigkeit gegenüber SDS-induzierter α/β-Kettendissoziation von "leerem" DR1 verleihen, als sie mittels SDS-PAGE analysiert wurden, was eine stabile Peptidbindung anzeigt (Sadegh-Nasseri und Germain, Nature 353: 167-170 (1991); Dornmair et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54: 409-415 (1989), Springer et al" J. Biol. Chem. 252: 6201-6207 (1977)). Keines der beiden Kontrollpeptide, weder β&sub2;m 52-64 (SEQ-ID- Nr. 26) noch Ii 96-110 (SEQ-ID-Nr. 25) war in der Lage, entweder eine Widerstandsfähigkeit gegenüber der SDS-induzierten Kettendissoziation von DR1 zu verleihen oder mit HA 307-319 (SEQ-ID-Nr. 24) hinsichtlich der Bindung an DR1 zu konkurrieren; diesen beiden Peptiden fehlte das mutmaßliche Bindungsmuster, von dem in dieser Untersuchung berichtet wird (siehe weiter unten).
Das mutmaßliche DR1-Bindungsmuster, basierend auf den Sequenzabgleichen der Kernepitope (der minimalen Länge) bestimmter natürlich prozessierter Peptide ist in Tabelle 3 gezeigt. Die in dieser Tabelle aufgelisteten Peptide beinhalten jene, die vorliegend für HLA-DR1 bestimmt wurden, als auch eine Reihe von Peptiden, die von Anderen identifiziert wurden und von denen bekannt ist, dass sie DR1 binden (die Referenznummer 6 in dieser Tabelle ist O'Sullivan et al., J. Immunol. 145: 1799-1808, 1990; die Referenznummer 17: Roche und Cresswell, J. Immunol. 144: 1849-1856, 1990; Referenznummer 25: Guttinger et al., Intern. Immunol. 3: 899-906, 1991; Referenznummer 27: Guttinger et al., EMBO J. 7: 2555- 2558, 1988; und die Referenznummer 28: Harris et al., J. Immunol. 148: 2169-2174 1992). Die wichtigsten oder "Schlüssel"reste, die in dem Muster vorgeschlagen werden, sind folgende: eine positiv geladene Gruppe ist an der ersten Position angeordnet, welche hier zur Orientierung als Indexposition (I) bezeichnet wird; ein Wasserstoffbindungsdonator ist bei I+5 angeordnet; und ein hydrophober Rest ist bei I+9 angeordnet. Zusätzlich findet sich oft ein hydrophober Rest bei I+1 und/oder I-1. Jedes von DR1 sequenzierte, natürlich verarbeitete Peptid entspricht diesem Muster (mit der Ausnahme des HLA-A2-Peptids 103-116 (SEQ-ID-Nr. 3), bei dem der Rest I+9 fehlt). Da das mutmaßliche Muster nicht an einer definierten Position in Bezug auf die erste Aminosäure angeordnet ist und wegen der unregelmäßigen Länge gebundener Peptide ist es unmöglich, aus der Sequenzierung von Peptidpools ein Muster abzuleiten, wie es für Moleküle der Klasse I getan wurde (Falk et al., Nature 351: 290-296 (1991)). Das Peptid Ii 96-110 (SEQ-ID-Nr. 25), ein in Bindungsexperimenten verwendetes negatives Kontrollpeptid, weist in seiner Sequenz die Reste des Musters I und I+5 auf, ihm fehlen aber die acht zusätzlichen Aminosäuren, die sich bei Ii 105-118 (SEQ-ID-Nr. 16) finden (Tabelle 3C).
Ein Sequenzvergleich von 35 früher beschriebenen DR1-bindenden synthetischen Peptiden (O'Sullivan et al., J. Immunol. 145: 1799-1808 (1990); Guttinger et al., Intern. Immunol. 3: 899-906 (1991); Hill et al., J. Immunol. 147: 189-197 (1991), Guttinger et al., EMBO J. 7: 2555-2558 (1988), Harris et al., J. Immunol. 148: 2169-2174 (1992)) stützt ebenfalls dieses Muster. Von den 35 synthetischen Peptiden weisen 21 (60%) das präzise Muster auf, neun (30%) enthalten eine einzige Verschiebung, entweder bei I oder bei I+9, und die restlichen fünf (10%) weisen eine einzige Substitution bei I auf (Tabelle 3 B und C). Interessanterweise ist bei den letzteren Peptiden eine positive Ladung bei I immer durch einen großen hydrophoben Rest ersetzt (Tabelle 8C); in Molekülen der Klasse I ist eine Tasche beschrieben worden, die diese exakte Substitution aufnehmen kann (Latron et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11325-11329 (1991)). Beiträge durch die anderen acht Aminosäuren in dem Muster oder der Länge von Peptiden sind nicht vollständig bewertet worden und können möglicherweise verschobene/fehlende Reste in jenen Peptiden, die eine Bindung zeigen, kompensieren. Eine Bewertung der verbleibenden 117 nicht an DR1 bindenden Peptide, die in diesen Untersuchungen zitiert sind (wobei diese Peptide nicht in Tabelle 3 enthalten sind), zeigt, dass 99 (85%) dieser Peptide nicht das hier vorgeschlagene DR1-Muster enthalten. Von den verbleibenden 18 Peptiden (15%), die nicht an DR1 binden, welche aber das Muster enthalten, ist von sechs (5%) bekannt, dass sie sich an andere DR-Allotypen binden; die verbleibenden 12 Peptide können möglicherweise ungünstige Wechselwirkungen an anderen Positionen aufweisen, welche eine Bindung stören.
Im Gegensatz zu den präzisen N-terminalen Spaltungen, die in früheren Untersuchungen von sechs Peptiden beobachtet wurden, die an das Antigen der Klasse II der Maus gebunden sind, mit der Bezeichnung I-Ab, und fünf an die Maus gebundene I-Eb (Rudensky et al., Nature 3563: 622-627 (1991)), sind die an DR1 gebundenen Peptide sowohl am N- als auch am C-Terminus heterogen. Im Gegensatz zu Peptiden, die an Moleküle der Klasse I gebunden sind, welche überwiegend Nonamere sind (von Bleek und Nathenson, Nature 348; 213-216 (1990; Rotzschke et al. Nature 348: 252-254 (1990); Jardetzky et al., Nature 353: 326-329 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-1263 (1992)) sind die Peptide der Klasse II größer und zeigen eine hochgradige Heterogenität sowohl in der Länge als auch der Stelle der Terminal-Abspaltung, was impliziert, dass die Mechanismen der Verarbeitung für Peptide der Klasse I und der Klasse II wesentlich verschieden sind. Darüber hinaus legen die vorliegenden Ergebnisse nahe, dass die Prozessierung der Klasse II ein stochastisches Ereignis ist und dass ein DR- Allotyp Peptide unterschiedlicher Längen aus einer komplexen Zufallsmischung binden kann. Die beobachtete Heterogenität kann möglicherweise einfach auf dem Schutz gebundener Peptide vor weiterem Abbau beruhen. Somit würden Moleküle der Klasse II eine aktive Rolle bei der Antigen-Prozessierung spielen (wie bereits früher vorgeschlagen wurde (Donermeyer und Allen, J. Immunol. 142: 1063-1068, 1989)), indem sie die gebundenen Peptide vor einem vollständigen Abbau schützen. Alternativ könnte das Vorherrschen von an DR1 gebundenen 15-meren (wie sowohl durch MALD-MS als auch durch die Ergebnisse der sequenzierten Peptide erkannt wurde) das Ergebnis eines Beschneidens gebundener Peptide sein. In jedem Fall legt das Nichtvorhandensein erfassbarer Mengen von Peptiden, die kürzer als 13 und länger als 25 Reste sind, nahe, dass es Längenbeschränkungen gibt, die entweder dem Mechanismus der Peptidbindung oder der Antigenprozessierung eigen sind. Das Überwiegen von an DR1 gebundenen Peptiden, die von endogen synthetisierten Proteinen abgeleitet sind, und insbesondere von MHC-verwandten Proteinen, kann möglicherweise von der Evolution eines Mechanismus zur Präsentation von Eigenpeptiden in Verbindung mit der Erzeugung einer Eigentoleranz herrühren.

II. Andere HLA-DR-Moleküle

Die Sequenzen von natürlich prozessierten Peptiden, die jeweils aus DR2, DR3, DR4, DR7 bzw. DR8 gelöst wurden, sind in den Tabellen 4 bis 8 gezeigt. Zusätzlich zu den in Tabelle 4 gezeigten Peptiden ist festgestellt worden, dass sich DR2 an lange Fragmente der HLA-DR2a β-Kette und HLA-DR2b β-Kette bindet, welche den Resten 1-126 oder 127 des jeweiligen dieser Proteine entspricht. Vermutlich wird nur ein kurzes Segment dieser langen Fragmente tatsächlich in der Bindungsgrube von DR2 gebunden, wobei der Rest jedes Fragments aus einem oder beiden Enden der Grube vorragt.
Tabelle 9 gibt Sequenzen von DR1 aus einer anderen Zelllinie an, welche keine Ar vom Wildtyp aufweist, sondern welche gebundene A2-artige Peptide aufweist. Tabelle 10 gibt Sequenzen von Peptiden an, die von DR4- und DR11-Molekülen gelöst wurden, welche in Zellen aus einer menschlichen Milz exprimiert sind. Diese Daten zeigen das große Überwiegen gebundener Eigenpeptide im Vergleich zu exogenen Peptiden. Die Daten zeigen auch, dass die A2- und Ii-Peptide wiederholt auftreten. Zusätzlich enthalten bestimmte Tabellen Peptide, die von Virenproteinen abgeleitet zu sein scheinen, wie etwa das Hauptcapsidprotein des Epstein-Barr-Virus, die wahrscheinlich in den untersuchten Zellen vorhanden sind.

III. Peptidauslieferung

Genetische Konstruktionen

Um genetische Konstrukte für die in vivo Verabreichung von Genen, die immunmodulierende Peptide der Erfindung kodieren, zu präparieren, wurde die folgende Prozedur ausgeführt: Überlappende synthetische Oligonukleotide wurden verwendet, um die in Fig. 3 dargestellten Minigene des Leader- Peptids/blockierenden Peptids zu erzeugen, und zwar durch PCR-Amplifikation von cDNA-Matrizen der α- und invarianten Kette des menschlichen HLA-DR. Diese Minigene kodieren die Ii-Peptidfragmente KMRMATPLLMQALPM (oder Ii&sub1;&sub5;; SEQ-ID-Nr. 15) und LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM (oder Ii&sub2;&sub4;, SEQ-ID-Nr. 7). Die resultierenden Konstrukte wurden in pGEM-2 (Progema Corp.) geklont, um die Plasmide pGEM-2-α-Ii&sub1;&sub5; und pGEM-2-α-Ii&sub2;&sub4; zu bilden, und zwar mit einem Stromauf-T7-Promotor zur Verwendung in dem später beschriebenen in vitro Transkriptions-/Translationssystem.
Für die in vivo Expression wurde jedes Minigen danach aus den pGEM-2-Derivaten in einen Transfektionsvektor, pHβ-Actin-1- neo subgeklont (Gunning et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84: 4831), um die Plasmide pHβ-Actin-α-Ii&sub1;&sub5; und pHβ- Actin-α-Ii&sub2;&sub4; auszubilden. Die eingefügten Minigene werden somit in vivo von dem konstitutiven/starken menschlichen β-Actin-Promotor exprimiert. Außerdem wurden die Minigene von den pGEM-2-Derivaten in den Rekombinationsvektor pSCl1 des Vaccinia-Virus subgeklont (S. Chakrabarti et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409), um die Plasmide pSC11-α-Ii&sub1;&sub5; und pSC11-α-Ii&sub2;&sub4; zu bilden. Nach der Rekombination in das Virengenom werden die eingefügten Minigene von dem starken Vaccinia-p7,5-Promotor exprimiert.

An Peptide angefügte intrazelluläre Transportsignale

Kurze Aminosäuresequenzen können als Signale wirken, um Proteine zielgerichtet zu spezifischen interzellulären Kompartimenten zu lenken. Beispielsweise finden sich hydrophobe Signalpeptide am Amino-Terminus von Proteinen, die zu dem ER unterwegs sind, während von der Sequenz KFERQ (SEQ-ID- Nr. 153) (und anderen nahe verwandten Sequenzen) bekannt ist, dass sie interzelluläre Polypeptide zielgerichtet zu Lysosomen führen, während andere Sequenzen Polypeptide zielgerichtet zu Endosomen führen. Zusätzlich ist gezeigt worden, dass die Peptidsequenz KDEL (SEQ-ID-Nr. 152) als ein Retentionssignal für das ER wirkt. Jedes dieser Signalpeptide oder eine Kombination derselben kann verwendet werden, um unsere immunmodulierenden Peptide wie gewünscht zu transportieren. Beispielsweise würde ein Konstrukt, das ein gegebenes immunmodulierendes Peptid kodiert, das mit einem ER-Zielsignalpeptid verknüpft ist, das Peptid zu dem ER lenken, wo es sich an das Molekül der Klasse II binden würde, wenn es eingebaut wird, was die Bindung der intakten Ii verhindern würde, die für den Transport wesentlich ist. Alternativ kann ein Konstrukt erzeugt werden, bei welchem ein ER- Retentionssignal an dem Peptid zu verhindern helfen würde, dass das Molekül der Klasse II jemals das ER verlässt. Wenn stattdessen eines unserer Peptide zu dem endosomen Kompartiment gelenkt wird, würde dies sicherstellen, dass große Mengen des Peptids vorhanden sind, wenn die invariante Kette durch die prozessierten Peptide ersetzt wird, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass das in den Komplex der Klasse II eingebaute Peptid ein erfindungsgemäßes Peptid mit hoher Affinität anstatt ein natürlich vorkommendes, potentiell immunogenes Peptid ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass unsere Peptide verfügbar sind, bedeutet, dass der Einbau in die Klasse II durch die Verknüpfung der Peptide mit einer intakten Ii-Polypeptidsequenz erhöht werden kann. Da von Ii bekannt ist, dass sie Moleküle der Klasse II zu den Endosomen transportiert, würde die hybride Ii eine oder mehrere Kopien des erfindungsgemäßen Peptids zusammen mit dem Molekül der Klasse II tragen; sobald sie sich in dem Endosom befindet, würde die hybride Ii durch normale endosomale Prozesse abgebaut werden, sodass sowohl mehrfache Kopien des erfindungsgemäßen Peptids oder diesem ähnliche Moleküle als auch ein offener Bindungsspalt der Klasse II erzielt werden. DNAs, die immunmodulierende Peptide kodieren, welche Zielsignale enthalten, werden durch PCR oder andere standardmäßige Gentechnologien oder synthetische Verfahren erzeugt, und die Fähigkeit dieser Peptide, sich mit DR- Molekülen zu assoziieren, wird in vitro als auch in vivo analysiert, wie nachstehend beschrieben ist.
Es wird vorgeschlagen, dass die invariante Kette verhindert, dass Moleküle der Klasse II Peptide in dem ER binden und dass sie möglicherweise zur Heterodimerbildung beiträgt. Jeder Mechanismus, der diese Assoziation verhindert, würde die Effizienz der Klasse-II-Blockade erhöhen. Daher könnte ein Peptid, das der Stelle auf Ii entspricht, die an das Heterodimer der Klasse II bindet, oder das der Stelle auf entweder der α- oder der β-Untereinheit des Heterodimers entspricht, welche an Ii bindet, verwendet werden, um diese Assoziation zu verhindern und dadurch die Funktion von MHC der Klasse II zu unterbrechen.

In vitro Einbau

Zellfreie Extrakte werden routinemäßig verwendet, um eukaryotische Proteine zu exprimieren (Krieg, P. & Melton, D. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 7057; Pelham, H. und Jackson, R. (1976) Eur. J. Biochem. 67: 247). Spezifische mRNAs werden von den DNA-Vektoren transkribiert, die virale RNA-Polymerase- Promotoren enthalten (Melton, D. et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035)und werden zu Nuklease-behandelten Zellextrakten von Mikrokoggen hinzugefügt. Die Zugabe von 35S- Methionin und Aminosäuren löst die Translation der exogenen mRNA aus, was zu einem markierten Protein führt. Die Proteine können nachfolgend durch SDS-PAGE analysiert werden und durch Autoradiographie erfasst werden. Solche Prozessierungsereignisse wie die Signalpeptidspaltung und die Kernglycosilierung werden ausgelöst durch die Zugabe von mikrosomen Vesikeln während der Translation (Walter, P. und Blobel, C. (1983), Meth. Enzymol.; 96, 50), und diese Ereignisse werden durch die veränderte Mobilität der Proteine in SDS-PAGE-Gels aufgezeigt.
Die Fähigkeit von Peptiden, die eine Signalpeptidsequenz enthalten, exakt verarbeitet zu werden und mit der invarianten Kette um die Bindung der Klasse II in dem ER zu konkurrieren, wird in dem vorstehend beschriebenen in vitro System untersucht. Insbesondere werden die vorstehend beschriebenen Peptidkonstrukte mit DR1-α- und β-Kette und der invarianten Kette in mRNAs transkribiert, die unter Vorhandensein von mikrosomalen Membranen von Säugetieren translatiert werden. Die Assoziation des DR-Heterodimers mit Ii wird durch Immunpräzipitation mit Antisera zu DR und Ii bestimmt. Die Zugabe von mRNA, die das erfindungsgemäße Peptid kodiert, zu der Translationsreaktion, sollte zu einem verminderten Grad an gleichzeitig immunpräzipitierter Ii und dem damit einhergehenden Auftauchen von gleichzeitig immunpräzipitiertem Peptid führen, wie durch SDS-PAGE an TRIS-Tricin-Gelen bestimmt wurde. Diese Experimente werden ein schnelles Testsystem zur Bestimmung der potentiellen Nützlichkeit eines gegebenen blockierenden Peptids als ein Konkurrent für die Ii-Ketten-Bindung in dem ER liefern. Diejenigen unserer Peptide, welche sich als fähig erweisen, in diesem zellfreien Versuch erfolgreich mit Ii zu konkurrieren, können dann in intakten Zellen getestet werden, wie nachstehend beschrieben ist.

In vivo Einbau

Die menschlichen, EBV-transformierten B-Zelllinien LG-2 und HOM-2 (homozygot für HLA-DR1) und das B-Zell-Hybridom LK35.2 der Maus werden entweder mit 50 ug linearisierter pHβ-Actin- α-Ii&sub1;&sub5; oder pHβ-Actin-α-Ii&sub2;&sub4; oder (als Kontroliprobe) pHβ-Actin-1-neo durch Elektroporation (150 mv, 960 uF, 0,2 cm Cuvettenspalt) transfektiert. Nach der Elektroporation werden die Zellen in einem G418-freien Medium bis zur vollständigen Erholung (etwa vier Tage) kultiviert. Jede Population wird dann unter. G418-Selektion platziert, bis Neomycin exprimierender resistente Populationen von Transfektanter erzielt sind (etwa 1 bis 2 Monate). Die resistenten Populationen werden subgeklont, indem die Verdünnung und die Klonalität stabiler Transfektanten begrenzt wird, die durch PCR-Amplifikation der mRNA-Expression der blockierenden Peptide bestimmt wird.
Stabile Transfektanten von LG-2 und HOM-2, die Minigene blockierender Peptide oder negative Kontrollvektoren tragen, werden unter Massenkultivierungsbedingungen gezüchtet, bis 20 Gramm pelletierter Zellmasse erhalten wird. Die von dem jeweiligen Transfektanten exprimierte HLA-DR wird gereinigt, und das Repertoire gebundener Peptide (sowohl von innerhalb der Zelle als auch von der Zelloberfläche) wird wie zuvor beschrieben analysiert. Die erfolgreiche Demonstration einer Reduktion der Gesamtdiversität gebundener Peptide wird ein abschließender Nachweis für die intrazelluläre Auslieferung immunmodulierender Peptide sein.
Ein zweiter, zellbasierter Test verwendet stabile Transfektanten von LK35.2-Zellen, die Minigene von blockierenden Peptiden oder negative Kontrollvektoren tragen; diese Zellen werden in T-Zell-Proliferationstests als APCs verwendet. Jeder Transfektant wird 24 Stunden lang unter Anwesenheit unterschiedlicher Verdünnungen von Hühnerei-Lysozym (HEL) und HEL-spezifischen T-Zell-Hybridomen kultiviert. Die relative Aktivierung der in jedem Test vorhandenen T-Zellen (wie sie durch die Lymphokin-Produktion gemessen wird) wird unter Verwendung der öffentlich verfügbaren Lymphokin-abhängigen Zelllinie CTLL2 in einem 3H-Thymidin-Inkorporationstest (Vignali et al. (1992) J. E. M. 175: 925-932) bestimmt. Das erfolgreiche Aufzeigen einer Reduzierung der Fähigkeit von Transfektanten, die blockierende Peptide exprimieren, HEL gegenüber spezifischen T-Zell-Hybridomen zu präsentieren, wird ein abschließender Nachweis für die intrazelluläre Auslieferung immunmodulierender Peptide sein. Zellen der menschlichen TK-Zelllinie 143 (ATCC) werden mit dem Vaccinia-Virus (des Stammes WR, TK+) (ATCC) infiziert, und zwei Stunden nach der Infektion wird durch Calciumphosphatpräzipitation pSC11-α-Ti&sub1;&sub5; oder pSC12-α-Ii&sub2;&sub4; oder pSC11 in die infizierten Zellen eingebracht. Mit Bromdeoxyuridin bei 25 ug/ml wird nach TK-Rekombinanten selektiert. Die rekombinanten Plaques werden mittels PCR auf das Vorhandensein von Minigen-DNA hin abgesucht. Der rekombinante Virus wird durch drei Durchgänge begrenzender Verdünnung geklont, um reine klonale Virenvorräte zu erzeugen.
In zu den vorstehend beschriebenen Transfektionsexperimenten analogen Experimenten werden rekombinante Vaccinia-Viren, die Minigene oder den Vektor allein kodieren, verwendet, um Massenkulturen der menschlichen, EBV-transformierten B-Zelllinien LG-2 und HOM-2 zu infizieren. Nach der Infektion wird die HLA-DR gereinigt und das Repertoire gebundener Peptide wie vorstehend beschrieben analysiert. Eine Reduzierung der Komplexität der Population gebundener Peptide und eine deutliche Zunahme der relativen Menge gebundener Ii-Peptide stellt den abschließenden Nachweis dafür dar, dass Vaccinia blockierende Peptide an menschliche APCs ausliefern kann.
Die gleichen rekombinanten Vaccinia-Viren, die Minigene oder den Vektor kodieren, werden verwendet, um Mäuse zu infizieren, bei denen eine experimentell induzierte Autoimmunität auftritt. Eine Reihe solcher Modelle sind bekannt und sind bei Kronenberg, Cell 65: 537-542 (1991) angeführt.

Auslieferung synthetischer Peptide oder Minigen-Konstrukte durch Liposomen

Liposomen sind erfolgreich als Arzneimittelträger und in jüngerer Zeit bei sicheren und potenten Hilfsstrategien für die Malaria-Impfung bei Menschen (Fried et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 358) verwendet worden. Es ist gezeigt worden, dass eingekapselte Liposomen lösliche Proteine inkorporieren und diese Antigene an Zellen ausliefern, und zwar sowohl für eine in vitro als auch für eine in vivo CD8&spplus;-vermittelte CTL-Antwort (Reddy et al., J. Immunol. 148: 1585-1589, 1992; und Collins et al., J. Immunol. 148: 3336 -3341, 1992). Somit können Liposomen als Transportmittel zur Auslieferung synthetischer Peptide in APCs verwendet werden.
Harding et al. (Cell (1991) 64, 393-401) haben gezeigt, dass das zielgerichtete Einbringen von durch Liposomen mitgeführten Antigenen in eines von zwei interzellulären Beladungskompartimenten der Klasse II, den frühen Endosomen und/oder Lysosomen, erreicht werden kann, indem die Membranzusammensetzung des Liposoms verändert wird: Es wurde festgestellt, dass säureempfindliche Liposomen ihren Inhalt zu frühen Endosomen lenken, während säureresistente Liposomen ihren Inhalt an Lysosomen ausliefern. Somit können unsere Peptide in säureempfindliche Liposomen eingebaut werden, wenn die Auslieferung an Endosomen gewünscht ist, und in säureresistente Liposomen für die Auslieferung an Lysosomen.
Liposomen werden durch standardmäßige Detergensdialyse- oder Dehydrations-/Rehydrations-Verfahren präpariert. Für säureempfindliche Liposomen werden Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Palmitoylhomocystein (PHC) verwendet, während Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) für die Präparation von säureresistenten Liposomen verwendet werden. 10&supmin;&sup5; mol des Gesamtlipids (DOPC/DOPS oder DOPE/PHC bei Molverhältnissen von 4 : 1) werden getrocknet, in 0,2 ml HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) (150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES pH-Wert 7,4) hydriert und Ultraschall ausgesetzt. Die Lipidsuspensionen werden durch Zugabe von 0,1 ml von 1 M Octylglucosid in HBS aufgeschlossen. Die einzufangenden Peptide werden zu 0,2 ml von 0,6 mM Peptid in 20%iger HBS zugegeben. Die Mischung wird dann eingefroren, über Nacht gefriergetrocknet und rehydriert. Diese Liposomen werden mit Chymotrypsin behandelt, um etwaige oberflächengebundene Peptide zu verdauen. Die Liposomenauslieferung an EBV-transformierte Zelllinien (wie vorstehend beschrieben) erfolgt durch 12- 16-stündige Inkubation bei 37ºC. HLA-DR wird aus den Liposomen-behandelten Zellen aufgereinigt und die gebundenen Peptide werden wie vorstehend beschrieben analysiert.
Alternativ werden die Liposomen mit den DNA-Minigenkonstrukten der Erfindung formuliert und verwendet, um die Konstrukte entweder in vitro oder in vivo in APCs auszuliefern.
Die menschliche Immunisierung wird gemäß des Protokolls ausgeführt, das sowohl vom Joint Committee for Clinical Investigation der John-Hopkins-Universität als auch dem Human Subject Research Review Board des Büros des Generalstabsarztes der US-Armee zugelassen ist (Fries et al. (1992), Proc. Natl., Acad. Sci, USA 89: 358-362), wobei die dort beschriebenen Dosierungen verwendet werden, oder Dosierungen die in der Literatur für die Auslieferung therapeutischer Stoffe auf Basis von Liposomen beschrieben sind.

Auslieferung über immunstimulierende Komplexe (ISCOMs)

ISCOMs sind negativ geladene, käfigartige Strukturen von 30- 40 nm Größe, die sich bei der Mischung von Cholesterol und Quil A (Saponin) spontan bilden. Eine schützende Immunität ist in mehreren experimentellen Infektionsmodellen erzeugt worden, darunter bei durch Toxoplasmose und das Epstein-Barr- Virus induzierten Tumoren, unter Verwendung von ISCOMs als das Ausliefertransportmittel für Antigene (Mowat und Donachie, Immunology Today 12: 383-385, 1991). Es ist festgestellt worden, dass derart geringe Dosen des Antigens wie 1 ug, eingekapselt in ISCOMs, Klasse-I-vermittelte CTL- Antworten erzeugen, wobei entweder gereinigtes, intaktes HIV- 1-IIIB-gp-160-Hüll-Glycoprotein oder Influenza-Hämagglutinin das Antigen darstellt (Takahashi et al., Nature 344: 873- 875, 1990). Die Peptide werden unter Verwendung von ISCOMs in einer analogen Weise und Dosierung wie der zuvor für Liposomen beschriebenen in Gewebekulturzellen ausgeliefert; die Peptidbindungen der Klasse II von ausgelieferten Peptiden werden dann durch Extraktion und Charakterisierung wie vorstehend beschrieben bestimmt. Mittels ISCOMs ausgelieferte Peptide der Erfindung, die von kultivierten Zellen effektiv verwendet werden, werden dann bei Tieren oder Menschen getestet.
Zusätzlich zur Auslieferung der therapeutischen, synthetischen Peptide könnten ISCOMs derart konstituiert werden, dass sie die Minigenkonstrukte an APCs ausliefern und somit als eine Alternative für die vorstehend ausgeführte Vaccinia- Strategie dienen.

Auslieferung immunogener Peptide (Vakzinen)

Zusätzlich zur Verwendung der vorstehend beschriebenen intrazellulären Ausliefersysteme, um nicht immunogene Eigenpeptide auszuliefern, und zwar mit dem speziellen Ziel, das Immunsystem bremsend zu modulieren (und somit Autoimmunzustände zu mildern), kann ein erfindungsgemäßes Ausliefersystem alternativ als neuartiges Mittel der Impfung verwendet werden, um einen Teil des Immunsystems eines Tieres zu stimulieren. Im letztgenannten Zusammenhang wird das Ausliefersystem verwendet, um an geeignete Zellen DNA- Konstrukte auszuliefern, die immunogene, von Pathogenen abgeleitete Peptide exprimieren, welche dafür gedacht sind, eine Immunantwort gegen ein spezifisches Pathogen zu stimulieren. Da das antigene Peptid innerhalb der Zielzelle selbst erzeugt wird, stellt ein Impfverfahren entsprechend der Erfindung sicher, dass kein frei zirkulierendes Antigen zur Verfügung steht, um eine Antikörperbildung zu stimulieren und dadurch potentiell schädliche oder ungeeignete immunologische Reaktionen zu induzieren. Die durch Vakzinen entsprechend der Erfindung stimulierte Immunantwort ist, da die Vakzinen lediglich zielgerichtet zu APCs gelenkt werden, auf die T-Zell-vermittelte Antwort beschränkt, in Gegensatz zu standardmäßigen Impfprotokollen, welche zu einer allgemeineren Immunantwort führen. Obwohl einige der Peptid- präsentierenden APCs anfänglich durch Wirts-T-Zellen lysiert werden, wird eine solche Lyse begrenzt sein, da unter anderem die Virus-basierte Vakzine nicht replikativ ist, d. h. jeder Trägervirus nur eine Zelle infizieren kann.
Das Modell-Antigen, das verwendet wird, um das System zu perfektionieren und zu testen, stellt Hühnerei-Lysozym (HEL) dar. Dieses dürfte das am besten charakterisierte Protein für Antigen-Präsentationsuntersuchungen sein, für welche es zahlreiche monoklonale Antikörper und Klasse-I- sowie Klasse- II-restriktierte T-Zell-Klone und Hybridomen der Maus gibt. Die hauptsächlichen Epitope, die untersucht werden, sind das Peptid HEL 34-45, da sowohl monoklonale Antikörper als auch CD4&spplus;-T-Zell-Hybridomen verfügbar sind, und das Peptid HEL 46-61, da sowohl Klasse-I- als auch Klasse-II-restriktierte T-Zell-Klone und -Hybridomen gezüchtet wurden und öffentlich verfügbar sind. Diese zwei Sequenzen stellen somit geprüfte immunogene Epitope dar. Zu Beginn werden vier Konstrukte, die unterschiedliche Polypeptide kodieren, analysiert: (a) ganzes, sekretiertes HEL, (b) HEL 34-45, (c) HEL 46-61 und (d) HEL 34-61. Die letzten drei enthalten eine Signalsequenz, von der bekannt ist, dass sie in diesen Zellen aufgespalten ist, z. B. IAk (MPRSRALILGVLALTTMLSLCGG; SEQ-ID- Nr. 274), welche zur zielgerichteten Lenkung zu dem ER führen würde. Alle Konstrukte werden dann in pHβ-Apr-1-neo subgeklont. Die Methode zur Herstellung dieser Konstrukte ist ähnlich der zuvor aufgeführten. Die Konstrukte werden in geeignete APCs, z. B. LK35.2-Zellen, eingebracht, und zwar mittels einer herkömmlichen eukaryotischen Transfektion oder durch eines der vorstehend diskutierten Auslieferungstransportmittel (z. B. Vaccinia, Liposomen oder ISCOMs). Die LK35.2-Zellen, welche die Restriktionsmoleküle IAk und IEk von MHC Klasse II der Maus besitzen, welche mit dem jeweiligen Konstrukt transfektiert sind, werden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die geeigneten Klasse-L- und Klasse-II-restriktierten T-Zell-Hybridomen und Klone zu stimulieren, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken. Ob eine Stimulation der Klasse I beobachtet wird, wird davon abhängen, ob in dem ER eine Peptidbeschneidung auftreten kann, um ein 8-10-mer zu erzeugen, das zur Bindung an Moleküle der Klasse I geeignet ist. Wenn diese Konstrukte für eine Stimulation der Klasse I nicht effektiv sind, können sie modifiziert werden, um ein effektiveres Peptid für eine Bindung der Klasse I zu erzeugen. Wenn sich diese Konstrukte als weniger effektiv für Klasse-II-restriktierte Antworten erweisen, können sie mit endosomalen und/oder lysosomalen Zielsequenzen markiert werden, wie in Abschnitt V erörtert worden ist.
Die Effizienz von Zielsignalen, die verwendet werden, um immunogene Peptide zu bestimmten intrazellulären Organellen zu lenken, würde man unter Verwendung einer elektronenmikroskopischen Analyse von Immunogold-markierten Abschnitten der verschiedenen Transfektanten aufzeigen. Für diese Anwendung würde man Antipeptid-Antisera vom Kaninchen erzeugen und affinitätsreinigen. Zusätzlich wird der monoklonale Antikörper HF10, der HEL 34-45 erkennt, verwendet.
Sobald ein Konstrukt definiert ist, das von Transfektanten in vitro effektiv präsentiert werden kann, wird dessen Effizienz in vivo bestimmt. Diese kann durch Injektion der Transfektanten i.p. und/oder s.c. in C3H/Balb/c-F1-Mäuse oder durch Injektion des in ein geeignetes Auslieferungstransportmittel (z. B. Liposom, ISCOMs, Retrovirus, Vaccinia) inkorporierten Konstrukts erfolgen. Optimale Protokolle und Dosen für solche immunisierenden Injektionen können angesichts des vorliegend bereitgestellten Offenbarungsgehalts von einem Fachmann bestimmt werden. Die Effizienz der Immunisierung kann durch Standardverfahren wie etwa (a) der Proliferation von Klasse- II-restriktierten T-Zellen in Reaktion auf HEL-gepulste APCs, (b) CTL-Antwort auf &sup5;¹Cr-markierte Ziele, und (c) Serum- Antikörper-Titer, wie durch ELISA bestimmt, getestet werden.
Sobald die Details des Vakzine-Ausliefersystems der Erfindung optimiert sind, können Konstrukte, welche Peptide mit nützlichem immunisierendem Potential kodieren, in das System eingebaut werden. Solche Peptide können durch standardmäßige Mittel, die nun zur Identifizierung immunogener Epitope an von Pathogenen abgeleiteten Proteinen verwendet werden, identifiziert werden. Beispielsweise können die Kandidatenpeptide für die Immunisierung aus Antikörper- und T-Zell-Analysen von mit einem bestimmten Pathogen infizierten Tieren bestimmt werden. Um eine schützende und effiziente anamnestische Antwort zu erzielen, sollten die zur Impfung verwendeten Peptide idealerweise diejenigen sein, welche bei der Infektion mit der größten Häufigkeit und Effizienz präsentiert werden. Dies könnte am besten unter Verwendung von Prozeduren festgestellt werden, die zuvor im experimentellen Abschnitt ausgeführt wurden, um die durch MHC-Moleküle der Klasse II gebundenen Peptide aus infizierten Zellen zu extrahieren und zu charakterisieren. Angesichts der allelen Restriktion immunogener Peptide (im Gegensatz zu der beobachteten degenerierten Bindung von Eigenpeptiden der Erfindung) wird möglicherweise ein Minigen, das mehrere immunogene Peptide kodiert, erforderlich sein, um eine für die gesamte Population nützliche Vakzine bereitzustellen. Die Verabreichung und Dosierung der Vakzine erfolgt derart, wie sie derzeit für die Pockenimpfung angewendet wird. TABELLE 1 LG-2/HLA-DR1-bindende Peptide TABELLE 2 an HLA-DR1 bindendes Peptid
a Die ersten sechs Einträge entsprechen Peptiden, die mit HLA-DR1 assoziiert gefunden wurden, und die Sequenzen sind in Tabelle 1 gezeigt. Außerdem wurden zwei Kontrollpeptide getestet: β&sub2;m 52-64, SDLSFSKDWSFYL, stammt vom menschlichen β&sub2;-Mikroglobulin und Ii 96-110, LPKPPKPVSKMRMAT, ist eine gestutzte Version des längsten, von der invarianten Kette abgeleiteten Peptids, das von HLA-DR1 isoliert wurde. Die Peptide wurden unter Verwendung der Festphasen-Fmoc-Chemie synthetisiert, unter Verwendung von Standardverfahren deprotektiert und gespalten und danach durch RPC gereinigt. Die gereinigten Peptide wurden durch Massenspektrometrie analysiert und die Konzentrationen wurden durch quantitative Ninhydrin-Analyse bestimmt.
b Die Hemmungskonstanten (Ki) wurden als die Konzentration des Testpeptids gemessen, welche 50% des mit X51 markierten HA 307-319, das sich an "leere", in Insektenzellen erzeugte HLA-DR1 bindet, hemmt. HA wurde unter Verwendung von Na¹²&sup5;I und Chloramin-T markiert und durch Gelfiltration isoliert. Die spezifische Aktivität bestimmt durch BCA-Test (Pierce) und Gammazählung, betrug 26.000 cpm/pmol. 10 nM markiertes Peptid und 10 nM gereinigtes HLA-DR1 wurden mit 10 verschiede Konzentrationen (10 nM bis 10 uM) von synthetischem, kaltem Konkurrenzpeptid in phosphatgepufferter Salzlösung, pH-Wert 7,2 gemischt, die 1mM EDTA, 1mM PMSI 0,1 mM Iodoacetamid und 3mM NaH&sub3; enthielt, und 85 Stunden lang bei 37º C inkubiert. Die freien und gebundenen Peptide wurden mittels natürlicher Gel-Elektrophorese (33) separiert, und die gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Bildplattenanalysators Fujix (BAS 2000) nach 4-stündigen Expositionen auf den phospho- abbildenden Platten quantifiziert. Die prozentuale Hemmung wurde als das Verhältnis von hintergrundkorrigierter Radioaktivität in der Probe zu hintergrundkorrigierter Radioaktivität in einer Parallelprobe, die kein Konkurrenzpeptid enthielt, bestimmt. Unter diesen Bedingungen konnten die Ki-Messungen < 10 nM nicht exakt bestimmt werden.
c Die Fähigkeit der synthetischen Peptide, eine Widerstandsfähigkeit gegenüber SDS-induzierter Kettendissoziation von in Insektenzellen produziertem HLA-DR1 zu verleihen, wurde wie beschrieben bestimmt (20). Kurz gesagt wurde 20 uM HLA-DR1 mit fünffachem Überschuss an synthetischem Peptid 85 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, und zwar in phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,2) mit der vorstehend beschriebenen Protease-Inhibitormischung. Nach der Inkubation wurden die Proben mittels SDS- PAGE mit und ohne Kochen vor dem Beladen analysiert. Peptide, welche die SDS-induzierte Kettendissoziation verhinderten, sind positiv (+) angegeben und diejenigen, die dies nicht taten, negativ (-). Tabelle 3 vermutliches HLA-DR1-Peptidbindungsmuster Tabelle 3, Fortsetzung Tabelle 4 HST/HLA-DR2-bindende Peptide Tabelle 4, Fortsetzung Tabelle 5 WT-20/HLA-DR3 natürlich prozessierte Peptide Tabelle 5, Fortsetzung Tabelle 6 PRIESS/HLA-DR4 natürlich prozessierte Peptide Tabelle 6, Fortsetzung Tabelle 7 MANN/HLA-DR7 natürlich prozessierte Peptide Tabelle 7, Fortsetzung Tabelle 8 23.I/HLA-DR5 natürlich prozessierte Peptide Tabelle 5, Fortsetzung Tabelle 9 HCM2/HLA-DR1 natürlich prozessierte Peptide Tabelle 10 Zusammenfassung der an HLA-DR gebundenen, natürlich prozessierten Peptide, die in der normalen menschlichen Milz exprimiert sind

Sequenzauflistung

(1) Allgemeine Informationen

(i) Anmelder:
President and Fellows of Harvard College
17 Quincy Street
Cambridge
Massachusetts 02138
Vereinigte Staaten von Amerika
(ii) Bezeichnung der Erfindung: Immunmodulierende Peptide
(iii) Anzahl der Sequenzen: 274
(iv) Rechnerlesbare Form:
(A) Medienart: 3,5"-Diskette, 1,44 MB Speicher
(B) Rechner: IBM-kompatibler PC
(C) Betriebssystem: Compaq 386 MS-DOS
(D) Software: WordPerfect (Version 5.1)
(vi) aktuelle Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: 93 921 177.7
(B) Anmeldedatum: 11. August 1993
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.:
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 2
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 3
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 3
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 4
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 4
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 5
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 5
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 6
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 6
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 7
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 7
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 8
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 8
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 9
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 9
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 10
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 10
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 11
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 11
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 12
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 12
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 13
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 13
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 14
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 14
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 15
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 15
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 16
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 16
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 17
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 17
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 18
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 18
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 19
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 19
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 20
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 20
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 21
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 21
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 22
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 22
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 23
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 23
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 24
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 24
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 25
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 25
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 26
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 26
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 27
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 27
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 28
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 28
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 29
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 29
(2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 30
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 30
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 31
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 31
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 32
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 32
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 33
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 33
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 34
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 34
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 35
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 35
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 36
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 36
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 37
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 37
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 38
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 38
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 39
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 39
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 40
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 40
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 41
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 41
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 42
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 42
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 43
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 43
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 44
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 44
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 45
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 45
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 46
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 46
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 47
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 47
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 48
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 48
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 49
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 49
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 50
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 50
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 51
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 51
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 52
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 52
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 53
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 53
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 54
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 54
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 55
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 55
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 56
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 56
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 57
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 57
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 58
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 58
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 59
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 59
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 60
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 60
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 61
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 61
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 62
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 62
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 63
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 63
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 64
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 64
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 65
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 65
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 66
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 66
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 67
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 67
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 68
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 68
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 69
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 69
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 70
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 70
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 71
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 71
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 72
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 72
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 73
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 73
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 74
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 74
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 75
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 75
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 76
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 76
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 77
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 77
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 78
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 78
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 79
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 79
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 80
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 80
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 81
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 81
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 82
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 82
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 83
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 83
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 84
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 84
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 85
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 85
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 86
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 86
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 87
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 87
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 88
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 88
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 89
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 89
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 90
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 90
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 91
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 91
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 92
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 92
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 93
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 93
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 94
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 94
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 95
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 95
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 96
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 96
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 97
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 97
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 98
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 98
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 99
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 99
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 100
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 100
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 101
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 101
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 102
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 102
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 103
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 103
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 104
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 104
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 105
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 105
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 106
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 106
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 107
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 107
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 108
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 108
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 109
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 109
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 110
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 110
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 111
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 111
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 112
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 112
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 113
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 113
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 114
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 114
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 115
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 115
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 116
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 116
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 117
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 117
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 118
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 118
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 119
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 119
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 120
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 120
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 121
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 121
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 122
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 122
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 123
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 123
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 124
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 124
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 125
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 125
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 126
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 126
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 127
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 127
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 128
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 128
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 129
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 129
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 130
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 130
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 131
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 131
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 132
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 132
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 133
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 133
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 134
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 134
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 135
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 135
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 136
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 136
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 137
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 137
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 138
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 138
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 139
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 139
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 140
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 140
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 141
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 141
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 142
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 142
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 143
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 143
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 144
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 26
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 144
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 145
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 145
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 146
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 146
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 147
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 123
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangigkeit: einfach
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-TD-Nr.: 147
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 148
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 150
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Strangigkeit: einfach
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 148
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 149
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 10
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 149
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 150
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 10
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 150
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 151
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 10
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 151
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 152
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 4
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 152
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 153
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 5
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 153
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 154
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 5
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 154
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 155
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 155
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 156
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 156
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 157
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 157
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 158
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 158
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 159
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 159
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 160
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 160
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 161
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 161
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 162
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 162
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 163
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 163
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 164
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 164
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 165
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 165
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 166
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 166
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 167
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 167
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 168
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 168
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 169
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 169
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 170
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 170
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 171
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 171
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 172
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 172
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 173
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 173
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 174
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 174
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 175
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 175
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 176
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 176
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 177
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 177
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 178
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 178
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 179
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 179
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 180
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 180
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 181
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 181
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 182
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 182
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 183
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 183
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 184
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 184
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 185
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 185
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 186
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 186
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 187
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 187
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 188
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 188
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 189
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 189
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 190
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 190
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 191
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 191
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 192
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 192
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 193
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 193
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 194
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 194
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 195
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 195
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 196
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 196
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 197
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 197
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 198
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.; 198
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 199
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 199
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 200
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 200
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 201
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 201
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 202
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 202
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 203
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 203
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 204
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 204
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 205
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 205
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 206
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 206
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 207
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 207
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 208
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 208
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 209
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 209
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 210
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 210
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 211
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 211
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 212
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 212
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 213
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 213
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 214
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 26
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 214
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 215
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 215
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 216
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 30
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 216
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 217
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 217
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 218
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 218
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 219
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 219
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 220
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 220
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 221
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 221
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 222
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 25
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 222
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 223
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 223
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 224
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 224
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 225
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 225
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 226
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 226
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 227
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 227
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 228
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 228
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 229
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 229
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 230
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 230
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 231
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 231
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 232
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 232
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 233
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 233
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 234
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 234
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 235
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 235
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 236
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 236
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 237
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 237
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 238
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 238
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 239
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 239
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 240
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 240
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 241
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 241
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 242
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 242
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 243
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 243
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 244
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 244
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 245
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 245
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 246
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 246
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 247
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 247
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 248
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 248
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 249
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 24
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 249
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 250
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 250
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 251
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 251
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 252
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 252
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 253
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 253
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 254
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 10
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 254
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 255
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 22
(β) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 255
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 256
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 256
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 257
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 14
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 257
2) Informationen Zür SEQ-ID-Nr.: 258
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 258
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 259
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 259
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 260
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 260
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 261
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 261
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 262
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 262
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 263
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 263
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 264
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 264
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 265
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 265
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 266
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 266
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 267
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit.:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 267
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 268
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 266
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 269
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 17
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 269
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 270
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 270
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 271
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 15
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 271
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 272
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 21
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 272
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 273
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 273
2) Informationen zur SEQ-ID-Nr.: 274
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 23
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangigkeit:
(D) Topologie: linear (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ-ID-Nr.: 274

Claims

1. Gereinigtes Peptidpräparat, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135, 140-143, 150, 151 oder 187 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekül der Klasse II bindet.

2. Präparat nach Anspruch 1, wobei sich das Peptid an wenigstens zwei verschiedene MHC-Allotypen der Klasse II bindet.

3. Präparat nach Anspruch 1, wobei das menschliche Protein ein MHC-Molekül der Klasse I oder Klasse II ist.

4. Präparat nach Anspruch 1, wobei das Segment aus einer Sequenz besteht, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135 und 140-143 dargelegt ist.

5. Gereinigtes Präparat eines Peptids, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID- Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)- Molekül der Klasse II bindet.

6. Präparat nach Anspruch 5, wobei sich das Peptid an wenigstens zwei verschiedene MHC-Allotypen der Klasse II bindet.

7. Präparat nach Anspruch 5, wobei das menschliche Protein ein MHC-Molekül der Klasse I oder Klasse II ist.

8. Präparat nach Anspruch 5, wobei das Segment aus einer Sequenz besteht, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist.

9. Liposom, das ein Peptid enthält, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID- Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135, 140-143, 150, 151 oder 187 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekül der Klasse II bindet.

10. Liposom, das ein Peptid enthält, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID- Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)- Molekül der Klasse II bindet.

11. Immunstimulationskomplex (ISCOM), umfassend ein Peptid, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135, 140-143, 150, 151 oder 187 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekül der Klasse II bindet.

12. Immunstimulationskomplex (ISCOM), umfassend ein Peptid, im Wesentlichen bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist, und wobei sich das Peptid an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekül der Klasse II bindet.

13. Nucleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die erste Sequenz mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135, 140-143, 150, 151 oder 187 dargelegt ist, das Peptid sich an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC)-Molekül der Klasse II bindet und die zweite Sequenz eine Sequenz ist, die den intrazellulären Transport eines Polypeptids steuert, an das sie angelagert ist ("Transportsequenz").

14. Nucleinsäure nach Anspruch 13, wobei die Transportsequenz KDEL (SEQ-ID-Nr. 152), KFERQ (SEQ-ID-Nr. 153), KREFK (SEQ-ID-Nr. 154), MAISGVPVLGFFIIA VLMSAQESWA (SEQ-ID-Nr. 155) ist, ein Pentapeptid, umfassend Q, auf einer Seite von vier Resten flankiert, ausgewählt aus K, R, D, E, F, I, V und L, oder ein Signalpeptid.

15. Nucleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, wobei das Polypeptid eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die erste Sequenz mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von I0 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID-Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist, das Peptid sich an ein menschliches Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekül der Klasse II bindet und die zweite Sequenz eine Sequenz ist, die den intrazellulären Transport eines Polypeptids steuert, an das sie angelagert ist ("Transportsequenz").

16. Nucleinsäure nach Anspruch 15, wobei die Transportsequenz KDEL (SEQ-ID-Nr. 152), KFERQ (SEQ-ID-Nr. 153), KREFK (SEQ-ID-Nr. 154), MAISGVPVLGFFIIA VLMSAQESWA (SEQ-ID-Nr. 155) ist, ein Pentapeptid, umfassend Q, auf einer Seite von vier Resten flankiert, ausgewählt aus K, R, D, E, F, I, V und L, oder ein Signalpeptid.

17. Nucleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, umfassend eine erste und eine zweite Sequenz, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die erste Sequenz mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID- Nummern 1-22, 61, 63-67, 69, 72-133, 135, 140-143, 150, 151 oder 187 dargelegt ist, das Peptid sich an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Allotyp der Klasse II bindet und die zweite Sequenz im Wesentlichen identisch mit der invarianten Kette (Ii) ist.

18. Nucleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, umfassend eine erste und eine zweite Sequenz, die durch eine Peptidbindung verknüpft sind, wobei die erste Sequenz mit der eines natürlich verarbeiteten Segments eines natürlich vorkommenden menschlichen Proteins identisch ist, wobei das Segment eine Länge von 10 bis 30 Resten hat, wobei das Segment eine Sequenz umfasst, die in beliebigen der SEQ-ID- Nummern 70, 71, 144-146, 158-186, 188, 189-246, 248-258 oder 269-273 dargelegt ist, das Peptid sich an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Allotyp der Klasse II bindet und die zweite Sequenz im Wesentlichen identisch mit der invarianten Kette (Ii) ist:

19. Zelle, umfassend die Nucleinsäure aus Anspruch 13.

20. Zelle, umfassend die Nucleinsäure aus Anspruch 15.

21. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle aus Anspruch 19 unter Bedingungen umfasst, die eine Expression des Polypeptids von der Nucleinsäure zulassen.

22. Verfahren zur Herstellung eines Peptids, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle aus Anspruch 20 unter Bedingungen umfasst, die eine Expression des Polypeptids von der Nucleinsäure zulassen.