JPH08502244A

JPH08502244A - 免疫調節ペプチド

Info

Publication number: JPH08502244A
Application number: JP6506181A
Authority: JP
Inventors: ロバートグレンアーバン; ローマンエムチクズ; ダリオエーエービグナリ; マリーリンヘドレイ; ローランスジェイステルン; ジャックエルストロミンガー
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1992-08-11
Filing date: 1992-08-11
Publication date: 1996-03-12
Also published as: WO1994004557A1

Abstract

(57)【要約】天然由来のヒトのタンバク質の切片のアミノ酸配列と同一な配列からなるペプチドの精製調製品であって、上記切片が10から30残基までの長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】免疫調節ペプチド本発明の分野は、主要組織適合性複合体（MHC）抗原である。発明の背景主要組織適合性複合体（MHC）クラスII抗原は、脊椎動物におけるすべての特異的免疫応答を統合する細胞表面受容体である。ヒトは３種の別個のMHCクラスI I抗原のイソタイプを持つ、即ち、約70の異なったアロタイプが知られているDR 、33の異なったアロタイプが知られているDQ、及び47の異なったアロタイプが知られているDPとである。各個人は２乃至４のDR対立遺伝子、２個のDQ対立遺伝子、及び２個のDP対立遺伝子を持つ。 MHC受容体（クラスＩ及びクラスIIの両方共）は、病原体、或いは他の非宿主起源山来の小タンパク質断片（ペプチド）を結合して、これらペプチドを免疫系の調節細胞（Ｔ細胞）に提示することによって免疫認識に必須である第一段階に関与する。MHCによる提示が無い場合には、Ｔ細胞は病原性物質を認識することが出来ない。MHC クラスII受容体を発現する細胞は抗原提示細胞（APC）と呼ばれる。APC は病原性生物及び他の異物質をエンドソーム小胞に封入することによって摂取し、次いでそれらを酵素的、及び化学的分解に委ねる。APC によって摂取された異種タンパク質は、部分的に分解されるか、或いは“プロセシングを受けて（processed）”ペプチドの混合物を生じ、そのうちのあるものは、表面への移行途上にあるMHC クラスII分子に結合する。一旦、細胞表面に達すると、MH C 分子に結合したペプチドはＴ細胞による認識をうける。 MHC クラスII抗原は、α鎖、β鎖、及びプロセシングを受けたペプチドからなる３分子複合体としてAPC の表面上に発現される。細胞表面に発現される大抵のポリペプチドの様に、α鎖、β鎖は共にそのNH₂ 末端に短いシグナル配列を含み、両鎖を小胞体（ER）に標的指向する。小胞体内で、クラスIIのα／β鎖複合体はインバリアント鎖（Ii）と呼ばれるもう１つのタンパク質と会合する。Iiとの会合は（MHC ヘテロダイマーのペプチド結合切込み部位を封鎖することによって）時期尚早のペプチド捕捉を阻害し、安定なα／β相互作用を促進して上記複合体のエンドソーム小胞への以後の細胞内流通を指令するものと考えられている。エンドソーム内で、Iiはタンパク質分解を含むプロセスによって除去され、これによってペプチド結合切込みを暴露し、エンドソーム内に存在するペプチドが上記 MHC 分子に結合出来る様にする。クラスII／ペプチド複合体はエンドソームから細胞表面に運ばれ、そこで T細胞による認識とそれに続く免疫応答の活性化に利用されるようになる。クラスIIのMHC 分子は外因性（摂取された）タンパク質由来のペプチドのみならず、内因性（自己の）タンパク質の分解により生成されたペプチドにも結合する。クラスIIに結合する夫々のペプチド種の量は、その局所濃度と、所定のクラスII分子の結合切込みに対するその親和性によって決定され、種々のアロタイプは異なったペプチド結合特異性を示す。胎児発育期間の初期には、哺乳動物の免疫系は“寛容状態”にあり、自己のペプチドには応答しないように教えられている。この系の安定性と維持は、動物が自己に対して免疫応答を生じないことを保証するために重要である。この系の崩壊は糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症のような自己免疫症状を引起こす。免疫系を操作して適切な非応答性の再確立を意図する現行の技術には、遮断性ペプチドとして、合成の高親和性結合ペプチドの静脈内投与を含むプロトコルが取入れられている。予防接種は抗体仲介、及び／或いはT 細胞仲介の応答を刺激することによって病原性生物に対する保護免疫を発生する。大抵の現行の予防接種戦略は、なお、弱毒化、或いは不活性化したウイルスの様な比較的粗製の製品を用いている。この様なワクチンは、しばしば、抗体仲介、及び細胞仲介による免疫の両方を生じ、発生する免疫応答のタイプを修飾することは出来ない。更に、多くの疾病において、間違ったタイプの応答の発生は結果として疾病の悪化状態を招くことがある。発明の開示本出願に開示された研究において、凡そ70種の既知のヒトのMHC クラスIIDRアロタイプの内の６種（HLA-DRI、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR8 ）に結合した天然でプロセシングを受けたペプチドの特性が決定された。これらのペプチドは、外因性のタンパク質よりも主として自己タンパク質に由来することが見出だされた。自己ペプチドファミリーの幾つかは、予期せぬ変質した結合性を持つことが確認された。即ち、ある自己ペプチドが多数のHLA-DRアロタイプに結合することがある。この観察は、MHC クラスIIの機能に関する広く許容されている観念、即ち、各アロタイプは異なったセットのペプチドとの結合を指令するというMHC クラスIIの機能に関する広く受入れられている観念に逆行するものである。更に、本出願に開示された自己ペプチドのすべてでないにしてもその多くがクラスII分子に比較的高い親和性を持って結合する。これら３つの特性、（1）外因性よりも自己の、（2）変質した（degeneracy）、及び（3）高親和性結合は、Ｉ型糖尿病、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症の様な自己反応性を特徴とする病状の治療的介入に対する新規の手段を示唆する。更に、この様な治療法は移植拒絶を軽減するのに用いることが出来る。本発明の治療法においては、本発明の高親和性の免疫調節性の自己ペプチドをモデルにした短鎖ペプチド（好適には非対立遺伝子的に制限された）が患者のAP C に導入される。本発明のペプチドは多様なクラスIIイソタイプと結合するので、患者によって発現される特定のクラスII対立遺伝子を決定ずる組織タイプの分類は不必要であろう。個々のペプチドが完全には変性せず、即ち、ぺプチドがすべてではなく少数のアロタイブに結合する場合、ペプチドの“カクテル”を用いると有用かも知れない。当該カクテルは重複した結合特異性を与える。一旦、AP C内に入ると、ペプチドはクラスII分子に高親和性を持って結合し、それによって、当該病状の特徴である免疫反応の原因となる免疫原性ペプチドとの結合を阻害する。本発明の遮断性ペプチドは個体発生の間に寛容された正確なカルボキシ及びアミノ末端を保持する自己ペプチドであるので、これらは免疫的には不活性であり、非自己の遮断性ペプチドを用いる治療を面倒にする可能性のある免疫応答を誘発することがない。本発明のペプチドは、例えば、一種或いはそれ以上のペプチドを含む溶液の静脈内注射によって、APC に直接導入されてもよい。代わりに、大量の遮断ペプチドを細胞内で合成する手段をAPC に提供してもよい。遮断ペプチド配列に融合したER（小胞体）及び／或いはエンドソームへの標的指向性シグナルをコードする組換え遺伝子を適当な発現制御配列に連結して APCに導入する。一旦、細胞内に入ると、これらの遺伝子はハイブリッドペプチドの発現を指令する。ERに標的指向されたペプチドは、翻訳されてヘテロダイマーに組立てられるにつれてクラス IIのα及びβ鎖に結合するであろう。ER内に高親和性結合ペプチドが存在すると α／β複合体のインバリアント鎖との会合を防止して細胞内流通を妨害する。続いて、クラスII分子／遮断ペプチド複合体は細胞表面に発現される可能性があるが、T 細胞は発育の初期にこの複合体に寛容化されているので、免疫応答を引起こさない。ER保持シグナルを付与されたペプチドの使用もまたペプチドと複合したクラスII分子がERから脱離するのを防止する可能性がある。代わりに、組換えペプチドに、合成後それをエンドソーム分画に指向するエンドソーム標的指向性シグナルを付与し、それによって、又、エンドソーム内で内部的にプロセシングを受けたペプチドの遮断ペプチドに対する比率をずらし、ER内ではそれと結合しなかった遮断ペプチドのクラスII分子への結合を好適にしてもよい。いかなる患者個人に対しても、一種、或いはそれ以上のER指向化されたペプチドを、エンドソームに指向化されたペプチドと組合わせて用い、ER内で本発明のペプチドで飽和ざれていないα−β複合体が次いでエンドサイトーシス経路で遮断されることは有利なことかも知れない。最終結果は、又、非免疫原性のクラスII／ペプチド複合体の細胞表面発現である。細胞内輸送系に共役したクラスIIの非制限性の高親和性結合ペプチドの使用は、現行の薬理学的な戦略に伴う多方面の副作用を引起こすことなく、クラスIIに限定された免疫応答の特異的ダウンレグレーションを可能にする。これらの技術の巧みな適用は自家免疫疾患の治療及び移植拒絶反応の防止に対する重要な進歩である。本発明の細胞内輸送系（dclivery system）は、又、動物、例えば、ヒト患者、或いは口蹄疫の様な疾病に罹り易いウシの様な商業的に重要な哺乳動物の予防接種の新規の方法に利用することが出来る。この様な系は、以下の諸調整により所定の状況において要求されるタイプの免疫応答を生じる様に作成することが出来る。（a）クラスＩ或いはクラスII MHCに対するペプチドの特異性、（b）ペプチド／タンパク質の長さ及び／或いは配列、及び（c）細胞内小器官を標的指向するための特異的標識の使用。本発明の系は、これらのペプチドが細胞内においてのみ生成され、B細胞との接触による抗体生産を刺激し得る細胞外には存在しないことを保証する。これは、この様なワクチンによって引起こされる免疫応答を T細胞仲介の免疫に限定し、それによって、不適切な、或いは、潜在的に有害な応答、例えば、ヒトの免疫不全症、マラリア、ハンセン病、及びリーシュマニア症の原因となる生物を標的指向する一般的ワクチンで観察される様な免疫応答を制限するものである。更に、この T細胞仲介の免疫に限定された応答は、免疫原性ペプチドの長さ及び特性次第で、クラスＩ、またはクラスIIを基盤とするもの、或いはその両方であり得る。即ち、MHC のクラスＩ分子は、長さ８から10残基のペプチドに好適に結合するが、一方、クラスII分子は、12から25残基の長さの範囲のペプチドに高親和性で結合することが知られている。本発明に基く免疫感作及び治療には、本発明のペプチド、即ち、天然由来のヒトのタンパク質（即ち、“自己タンパク質”）の切片と同一のアミノ酸配列を含むペプチドの精製標品を用いることが出来る。この様な切片は、10から30残基の長さであり、当該ペプチドはヒトのMHC クラスIIアロタイプに結合し、好適には、少なくとも２つの別個のMHC クラスIIアロタイプにに結合する（例えば、約70 種の既知のDRアロタイプ、約47種の既知のDPアロタイプ、或いは、約33種の既知のDQアロタイプのいずれか）。自己ペプチド切片に対応する上記ペプチドの部分を、ここでは、“自己ペプチド”と呼ぶ。“精製標品”とは、ポリペプチド成分の少なくとも50%（重量で）が本発明のペプチドからなる標品を意味する。好適な適用例では、本発明のペプチドが精製標品の少なくとも60%（更に好適には80% ）を占める。天然由来のヒトのタンパク質は、好適には、HLA-A2（以下に広く定義される様に）、HLA-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Igκ鎖 C領域、Ig H鎖、Na⁺／K⁺ ATPアーゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、カルシトニン受容体、カルボキシペプチダーゼ E、 MET キナーゼ関連形質転換タンパク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプシン C、カテプシン S、金属プロテイナーゼ阻害因子１前駆体、或いは熱ショック・コグネイト71KDタンパク質であり、それは MHC（支配）のクラスＩまたはIIの抗原タンパク質、或いは、APC の細胞表面に生じるいかなる他のヒトのタンパク質であってもよい。自己ペプチドは、好適には、以下の構造形式（モティーフ）に従うものである、即ち、上記切片のアミノ末端残基、或いはその12残基内の最初の照合位置（I）に、正荷電残基（即ち、Lys、Arg、またはHis）、或いは大きな疎水性残基（即ち、Phe ）Trp、Leu、Ile、Met、Tyr、またはPro）、並びに、I+5 の位置に、水素結合提供残基（即ち、Tyr、Asn、Gln、Cys、Asp、Glu、Arg、Ser、TrP、またはThr）を持つ。更に、上記ペプチドは、また、I+9、I+1、及び／或いはI-1の位置に、疎水性残基（即ち、Phe、Trp、Leu、Ile、Met、Pro、Ala、Val、または、Tyr）（+ 記号は、右、或いはカルボキシ末端方向への位置を、及び - 記号は、左、或
いはアミノ末端方向への位置を表す）を持つ。本発明のペプチドの典型的な例は、 HLA-A2の残基 31-40（即ち、TQFVRFDSDA）、または残基 106-115（即ち、DWRFLR GYHQ）、或いはIiの残基 107-116（即ち、RMATPLLMQA）、或いは、以下の表 1-1 0 に示されている配列のどれか１つに本質的に同一な配列である。本発明の治療及び免疫感作の方法は、また、本発明のペプチドをコードするが自己タンパク質の全配列のすべてではなくそれ以下の配列をコードする核酸分子（RNA 或いは DNA）を利用することも出来る。上記核酸は、自己タンパク質（或いは他のタンパク質）から誘導されたシグナルペプチド、或いは他の流通関連の配列を任意に含むこともあるが、好適には MHCクラスII分子に結合する特定の自己ペプチド以外の自己タンパク質の非重要部分をコードするものである。流通関連の配列は、ポリペプチドに結合してその細胞内流通（小器官から小器官、或いは細胞表面への右向移動）を制御する様に機能するアミノ酸配列である。この様な流通関連の配列は、上記該ペプチドをER、リソソーム、或いはエンドソームに流通し、シグナルペプチド（翻訳の間、タンパク質をER内へ指向するアミノ酸配列）、KDELの様なER保持ペプチド、及びKFERQ 、QREFK の様なリソソーム標的指向ペプチド、並びにK、R、D、E、F、I、V、及び Lから選ばれた４残基がQの一側に隣接しているペンタペプチドを含む。本発明に有用なシグナルペプチドの一例は、クラスIIのα或いはβの様な MHCサブユニットのペプチドと本質的に同一なシグナルペプチドであり、例えば、 MHCクラスIIαのシグナルペプチドは、配列 MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWAに含まれる。本発明の核酸によってコードされるシグナルペプチドは、もし、その部分がポリペプチドのERへの流通を引き起こすのに十分であれば、上記の特定の25残基配列の一部（例えば、少なくとも 10アミノ酸残基）のみを含めばよい。好適な実施例においては、本発明の核酸は、第二の自己ペプチド及び第二の流通配列（第一の自己ペプチド及び第一の流通配列と同一か、或いは異なってもよい）をコードして、追加の自己ペプチド及び流通配列をコードすることもある。本発明のこの局面の更に別の変形では、自己ペプチド配列（或いは、縦に並べられた複数の自己ペプチド配列）が、本質的に無傷のIiポリペプチドにペプチド結合により連結され、次いで、これが、クラス II分子をERからエンドソームヘ流通する際に自己ペプチド配列を一緒に運ぶ。本発明の核酸は、又、発現制御配列（転写及び翻訳始動シグナル、プロモーター、及びエンハンサーと定義され、これらが会合するコーディング配列の発現を可能にし、及び／或いは最適にする配列）、及び／或いはファージ、或いはワクシニアウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、またはレトロウイルスの弱毒化、或いは非増殖、無毒化型のゲノム核酸を含むこともある。本発明のペプチド及び核酸は、それらを直接、薬剤的に許容される担体に懸濁、或いは、リポソーム、免疫刺激複合体（ISCOMS）またはそれらの類似体に封入することにより治療用に調製することが出来る。この様な調製品は、患者の複数のAPCを治療用調製品と接触させてペプチド或いは核酸を上記 APCに導入することによってヒト患者における免疫応答を阻害するのに有用である。本発明には、又、本発明の核酸分子を含む細胞（例、組織培養細胞、或いは、人体内の B細胞または APCの様な細胞）も包含される。本発明の核酸を含む培養細胞は、当該細胞を上記核酸分子からの当該ペプチドの発現を可能にする条件下での培養を含む方法において、本発明のペプチドの製造に用いることも出来る。ここに非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを同定する方法を開示する。当該方法は以下の事項を含む。（a）最初の MHCクラスIIアロタイプから溶離されたペプチドの混合物を分画し、（b）この混合物から自己ペプチドを同定し、及び（c）当該自己ペプチドが第二の MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうかを検査する。この様な結合は、当該自己ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドであることの表示である。別の具体例では、本発明は、潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法を含み、この方法は以下の事項を包含する。（a）MHCクラスII分子を表面に発現する細胞を提供し、（b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、及び（c）当該候袖ペプチドに結合するクラスII分子の比率が、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下の結合比率に比べて増加しているかどうかを測定する。この様な増加は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表示である。本発明には、又、潜在的な免疫調節ペプチドを確認する方法が含まれ、この方法は以下の事項を包含する。（a）MHCクラスII分子を発現する細胞を提供し、（b）当該細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入して、（c）当該細胞表面上の MHCクラスII分子のレベルが、上記核酸の存在下に、上記核酸の非存在下の MHCクラスII分子のレベルと比較して減少しているかどうかを測定する。この様な減少は、当該候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表示である。本発明には、又、非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを確認する方法を含み、この方法は以下の事項を包含する。（a）第一の MHCクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供し、この様な細胞を病原体（例、ヒトの免疫不全ウイルス（HIV）、 B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、狂人病ウイルス、Corynebacterium diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordetella pertussis（百日咳菌）、P1asmodium属、Schistosoma 属、Leishmania属、Trypanasoma 属、或いは Mycobacterium lepre（癩菌）の様なヒト或いは動物の病気の原因となる感染性病原体）に感染させ、（b）当該細胞の第一の MHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を溶離し、（c）当該混合物から候補ペプチドを確認し、この様な候補ペプチドは上記病原体由来のタンパク質の断片であり、及び、（d）当該候補ペプチドが第二の MHCアロタイプに結合するかを検査する。この様な結合は、上記の候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫刺激ペプチドであることの表示である。病原体タンパク質のこの様な免疫原性断片をコードする核酸は、ヒト患者に免疫応答を誘導する方法に用いることが出来、この方法は、患者の APC内への核酸の導入を含む。本発明の治療法は、合成ペプチドの静脈内注射を含む従来の方法に伴う諸問題を解決する。（1）対立遺伝子の特異性のために、全体の母集団内で発現される種々のクラスIIアロタイプのすべて、或いは大抵のものに高親和性で結合出来るペプチドは以前には確定されていなかった。（2）静脈内に投与されたペプチドの半減期は一般に極めて低く、高度の不便と出費を伴う反復投与が必要であり、（3）このタイプの運搬手段は、阻害ペプチドがクラスII分子、これは細胞表面にあるが、の結合間隙を占拠する天然由来のペプチドを除去することが必要で、この手段は、今では非常に非効率的なプロセスであると信じられており、又、（ 4）もし、利用される阻害ペプチドが、それ自身、免疫原性であれば、患者によっては右害な免疫応答が促進されることがある。本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記載と特許請求の範囲から明瞭となるであろう。詳細な説明先ず、図面を簡単に説明する。図面図 1A-1Fは、夫々、パパインで消化されたHLA-DR1、DR2、DR3、DR4、DR7及びD R8 から抽出されたペプチドプールのクロマトグラフ分析であり、紫外線吸収によって検出された通りの各HLA-DRのペプチドの種目を図示する。 210 nm及び 27 7 nmの両方に対する紫外線吸収が、16分と90分の間の保持ウインドウ（retentio n window）で500 mAUのフルスケールで示されている（各マークは２分を表す）。図２は、分離されたHLA-DR1に結合したペプチドのサイズ分布の代表的な質量分析である。100 質量ユニットで測定されたペプチド質量が、質量分析によって確定された分離ペプチドの数に対してプロットされている。ペプチドの長さは、質量実験値を平均アミノ酸質量である118 ダルトンで割って計算された。図３は、本発明の２つのミニ遺伝子を表し、この中でHLA-DRα鎖のリーダーペプチドが、ヒトのインバリアント鎖Iiの15残基（A）或いは、24残基（B）の遮断ペプチド断片のアミノ酸末端に連結している。実験データ方法Ｉ．HLA-DR抗原の精製 HLA-DR分子は、ホモ接合の、エプスタイン・バールウイルスで形質転換されたヒトの幼弱化 Bリンパ芽球系から、DR1 はLG-2細胞から、DR2 はMST 細胞から、 DR3 はWT20細胞から、DR4 はPriess細胞から、DR7 はMann細胞から、及びDR8 は 23.1細胞から精製された。これらの細胞系のすべては公然と入手出来る。細胞増殖、細胞収集条件、及びタンパク質の精製は以前に記述ざれた通りであった（Go rga，J. et al.，1991）。簡単に述べると、各細胞タイプの200 gを10 mMのトリス-HCI、１ mMのジチオトレイトール（DDT）、0.1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、pH 8.0に再懸濁して、Thomasホモゲナイザーで溶解した。核は4000 x gで５分間の遠心で除去し、ペレットを洗浄して上清が清澄になる迄、ペレット操作を繰り返した。すべての上清を集め、膜画分が175,000 x gで40 分の遠心によって収集された。ペレットは、次いで、10 mMのトリス-HC1、１ mM のDTT、１mMのPMSF、４%のNP-40 に再懸濁された。溶解されない膜物質は、175, 000ｘｇで２時間の遠心で除去し、NP-40 に可溶の上清画分が免疫親和精製に使用された。界面活性剤に可溶のHLA-DRをLB3.1-プロティンA のカラム（Gorga et al.，同上）に結合して、100 mMのグリシン、pH 11.5 で溶離した。溶離後、サンプルにトリス-HC1を加えて直ちに中和し、次いで10 mMトリス-HC1、0.1%デオキシコール酸（DOC）に対して透析した。LB3.1 単クローン性抗体は、非多形性のHLA-DR α鎖上に存在する立体配座決定基を認識し、この様にしてHLA-DRのすべてのアロタイプを認識する。 DR分子の貫膜領域はパパイン消化によって除去され、その結果得られた水溶性分子は更に10 mM トリス-HC1、pH 8.0で平衡化されたS-200 カラムのゲル濾過によって精製された。精製されたDRサンプルは、限外濾過によって濃縮され、得量をBCA アッセイで測定され、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。 II．結合したペプチドの抽出と分画水溶性で、免疫アフィニイティーによって精製されたクラスII分子は、更に、 25 mM N-モルホリノエタンスルホン酸（MES）PH 6.5中、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により、流速１ ml／分で精製して、いかなる残りの小分子量の夾雑物をも除去した。次いで、Centricon ミクロ濃縮器（分子量分離10,0 00ダルトン）（Amicon社）を、タンパク質サンプル（最終容量 100-200 μlの間）のスピン濃縮前に、順次、SEC 緩衝液及び10% の酢酸で洗浄した。ペプチドのプールは、選択したクラスII対立遺伝子産物から１ mlの10%酢酸を加え、15分間、70℃で抽出された。これらの条件は、結合したペプチドをクラスII分子から遊離するために十分であり、しかも、適度に緩和でペプチドの分解を回避出来る。ペプチドのプールは、centricon 濃縮器を介する遠心後、クラスII分子から分離され、素通し画分に以前に結合していたペプチドが含まれていた。収集された酸抽出のペプチドプールは、HPLCによる分離に先立ち、Savant Spe ed-Vac中で容量 50μl に濃縮された。ペプチドは、ミクロボアC-18逆相クロマトグラフィー（RPC）カラム（Vydac）上、以下の非直線密度勾配プロトコルを川い、0.15 ml／分の一定流速で分離された： 0-63分、5%-33%の緩衝液 B；63-95 分、33%-60% の緩衝液 B； 95-105分、60%-80% の緩衝液 B、ここで、緩衝液 A は0.06% のトリフルオロ酢酸／水で、緩衝液 Bは、0.055%トリフルオロ酢酸／アセトニトリルであった。クロマトグラフィー分析は、多重の紫外線波長（210、2 54、277、および 292 nm）で同時に検出して、質量分析及び配列解析の前に、分光光度的な測定を可能にした。図１に、解析された６種のDRペプチドプールの各々に対するクロマトグラムが示されている。収集された画分は、次いで、質量分析及びエドマン配列決定法によって分析された。 III．ペプヂドの分析 RPCの間の、ペプチドの分光光度計による測定は、アミノ酸組成（芳香族アミノ酸の寄与）に関する貴重な情報を提供し、以後の特性決定のためのスクリーニング法として用いられる。RPC 分離の間に収集された適切な画分は、次いで、Fi nnegan-MAT LaserMatマトリックス−利用のレーザー脱着質量分析計（MALD）を用いて分析し、量的に優勢なペプチドに対する個々の質量を決定した。収集された画分の1%-4% をマトリックス（１μｌのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸）と混合して、抽出されたペプチドの質量決定を達成した。HLA-DR1 に対するこの分析の結果を図２に示す。次に、選択したペプチドサンプルは、自動エドマン分解ミクロ配列決定法により、ABI 477A タンパク質シークエンザー（Applied Bios ystems）を用い、電子スプレーイオンソースを装着したFinnigan-MAT TSQ 700三重四重極質量分析計を用いた質量分析により提供されたカルボキシ末端確認と合わせて配列決定された。この平行して行われた分析は、ペプチドの組成及び配列の完全な確認を保証する。SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク質配列とのペプチドの照合は、FASTA コンピュータデータベース検索プログラムを用い、て行われた。表1-10は、検討されたDR分子の各々に対する本配列分析の結果である。結果１．HLA-DR1．本研究に用いられたHLA-DR1 は、当該物質が結晶学的解析、及び結合ペプチド分析に使用出来る様にパパインで可溶化された。DR1 に結合したペプチドは、酸で抽出され、RPC を用いて分画された（図１）。２回目の抽出／RPC 分離の後、いかなる検出可能なペプチド様物質も存在せず、ペプチドの定量的抽出が証明された。抽出されたペプチドプールのアミノ酸分析（ABI 420A/130Aデリバタイザー／HPLC）は、質量分析によって決定されたサイズ分布（図２参照）に対応する結合ペプチドのモル当量によって精製DR1 が完全に占拠されると仮定して、70-8 0%の得量であることが判明した。いくつかの別々の標品のDR1 抽出から得られた RPC プロフィル（溶離図）は再現性があった。更に、界面活性剤可溶性、或いはパパイン可溶化DR1 の溶離図は同等であった。ペプチドが、界面活性剤可溶性、及びパパイン可溶化DR1 中で、事実、同一であることを確認するために、質量分析及びエドマン配列決定分析が行われ、２つの標品からの相当する画分に対する質量及び配列は一致することが判明した。マトリックス利用のレーザー脱着質量分析（MALD-MS）を用いて、平均サイズ1 8で15残基の様式を持つDR1 の溶離されたペプチドプール内に含まれる独自の質量を持つ111 種を同定した（図２）。13-25 残基の分子量範目内に、更に、500 以上の質量種の存在が検出された。しかしながら、シグナルは十分ではなく、個々の質量を自信をもって割当てるには至らなかった。単一の RPCピークに対応する画分に種々の質量を持つ多重種が検出されたことは、ペプチドの共溶離を示唆する。これらのペプチドの特徴を更に検討するために、サンプルを、電子スプレーイオンソースを装備した三重四重極（triplo quadruple）質量分析計（ESI-MS ）と自動エドマン分解微量配列決定法により平行して分析した（Lane et al.，J ．Prot．Chem．10:151-160（1991））。これら２つの技法を組み合わせることにより、単一の画分に含まれる（複数の）ペプチドのN-及びC-末端両方のアミノ酸の重要な確認が可能となる。DR1 から分離された20種のペプチドに対して得られた配列及び質量のデータが表１に列挙されている。すべての確認されたペプチドは、SWISS-PROTデータベースに保存されているタンパク質の領域に割り当てられて完全に確認されている。驚くべきことに、20種の配列決定されたDR1 に結合したペプチドの内16種が、自己タンパク質HLA-A2及びクラスIIと会合したインバリアント鎖（Ii）の領域に 100%同一であり、全部の抽出されたペプチド質量の少なくとも26% に相当した。これらの分離されたペプチドは長さが様々で、N-及びC-末端の両方で切断されており、以下のことを示唆する：１）DR1 に結合後、抗原のプロセシングが両末端で起こる。或いは２）クラスII分子が、無差別に生成されたペプチドのプールからの抗原に結合する。ペプチドの微量配列決定からの得量は、HLA-A2（図１）及びIiが、それぞれ、全DR1 に結合したペプチドの少なくとも13%に当たることを示唆している。更に驚くべき発見は、HLA-DRに結合し、HLA-A2ペプチドと100%相同であるにも拘らず、HLA-A2タンパク質を発現しない細胞に由来するペプチドに関するものである。明らかに、このペプチドは、HLA-A2タンパク質のある領域と相同の領域を含むタンパク質に由来している。従って、これを明確にする目的で、“HLA-A2タンパク質”という術語は、HLA-A2タンパク質自身、並びに、HLA-A2由来のHLA-DR 結合ペプチドと80%以上の相同性を持つ10個或いはそれ以上のアミノ酸の長さの領域を含むいかなる天然由来のタンパク質をも包含することを意味する。同様に、“HLA-A2ペプチド”は、本申請中に広く定義されている様に、いかなるHLA-A2 タンパク質にせよそれに由来するペプチドを指すことになる。 DR1 の研究において確認された他の４種のペプチドは、２つの自己タンパク質、トランスフェリン受容体、及びNa⁺ /K⁺ ATP アーゼ、並びに、１つの外因性タンパク質であるウシ血清のフェチュイン（細胞を浸す培地を強化するために用いられる血清中に存在するタンパク質）に由来した。これらのペプチドは、各々、全DR1 母集団の僅か0.3-0.6%を占めるに過ぎず、HLA-A2、或いはIiぺプチドよりも著しく少ない。クラスII分子は、細胞表面への移送途上で、外部から入ってくるエンドサイトーシス小胞の経路と交差する。リサイクルする膜タンパク質、及びエンドサイトーシスで取込まれた外因性タンパク質は、両方共、この共通の経路を移動する。従って、HLA-A2、トランスフェリン受容体、Na⁺/K⁺ ATPアーゼ、及びウシのフェチュインに由来するペプチドは、すべて、同じ様にDR1 に遭遇する。Iiは小胞体（ER）内で発生期のクラスIIと会合して（Jones et al.，Mol．I mminol．16:51-60（1978））、クラスII/Ii複合体がエンドサイトーシス画分に到着するまで、抗原の結合を阻止し（Roche and Cresswell，Nature 345:615-61 8（1990））、そこでIiはタンパク質分解を受け（Thomas et al.，J．Immunol． 140:2670-2675（1988）； Roche and Cresswell，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:3150-3154（1991））、この様にしてペプチド結合の進行を可能にする。恐らく、DR1 に結合するIiペプチドは、この段階で生成されたと思われる。表１に報告されているペプチドの中の５つに相当ずる合成ペプチドを調製して、それらのDR1 に対する相対的結合親和性を測定した。インフルエンザ A 赤血球凝集素ペプチド（HA）307-319は、以前に、高親和性のHLA-DR1 制限ペプチドと記載されているので（Roche and Cresswell，J．Immunol．144:1849-1856（19 90）；Rothbard et al.，Cell 52:515-523（1988））、対照ペプチドとして選ばれた。組換えDR1 のcDNAを発現する昆虫細胞から精製された“空の（EmPty）” のDR1 が、ヒトの細胞から分離されたDR1 よりも高い結合容量と10倍速い会合動力学を示すので結合実験に用いられた（Stern and Wiley，Cell 68:465-477（1992））。すべての合成ペプチドがHAペプチドに対してよく（Ki<100 nM）競合することが見出された（表２）。最初の概算で、Iiの106-119ペプチドが、測定されたすべての競合ペプチドの中で、最高の親和性を持ち、対照のHAペプチドについて側定された値と同等であった。Ki測定に加えて、これらのペプチドは、SDS-PAGEで解析した場合、SDS によって誘導される“空の”DR1 のα−β鎖解離に耐性を与え、安定なペプチド結合を示唆する（Sadegh-Nassori and Germain，Nature 353:167 -170（1991）； Dornmair et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．54 :409-415（1989）； SPringer et al.，J．Bio1．Chem．252:6201-62-7（1977））。２つの対照ペブチド、β₂ m 152-64、或いはIi 96-110 は、いずれもSDS-誘導によるDR1 の鎖解離に耐性を与えず、DR1 との結合に対してHA 307-319と競合出来なかった。これらのペプチドは両方共、本研究に報告されている推定結合モチーフを欠いている（以下参照）。幾つかの自然界でプロセシングを受けたペプチドのコア抗原決定基（最小限の長さ）の配列整理に基ずく推定DR1 結合モチーフが表３に示されている。この表に列挙されているペプチドには、HLA-DR1 に対して本申請において決定されたものに加えて、他の研究者によって確認され、DR1 を結合することが知られているペプチドも含まれている（本表の参考文献#6は、O'Sullivan et al.，J．Immuno １．145:1799-1808，1990；参考文献#17は、Roche & Cresswoll，J．Immunol．1 44:1849-1856；参考文献#25は、Guttinger et al.，Inten. Immunol．3:899-9 06，1991；参考文献#27は、Guttinger et al.，EMBO J．7:2555-2558，1988；及び、参考文献#28は、Harris et al.，J．Immunol．148:2169-2174，1992である。）。上記モチーフに提唱されている基本的に重要な残基は以下の通りである。正荷電グループが第一の位置に所在し、本申請では方向付けのための指標位（I ）ど呼ばれ、水素結合ドナーが I+5に、更に、疎水性の残基が I+9に位置する。更に、疎水性残基が、しばしば、I+1 及び／或いは I-1に見出される。DR1 から配列決定された、天然でプロセシングを受けたペプチドはいずれもこのモチーフに属する（残基 I+9を欠くHLA-A2ペプチド 103-116を例外として）。推定モチーフは、第一のアミノ酸に関して明確に定められた位置には所在しないため、又、結合ペプチドの長さが不規則であるために、クラスＩ分子に対してされた様に、ペプチドプールの配列からモチーフを推定することは不可能である（Falk et al .，Nature 351:290-299（1991））。li 96-110ぺプチド、即ち、結合実験で用いられた負の対照ぺプチドは、その配列の中にI及びI+5のモチーフ残基を持つが、 li 105-118に見出される８個の追加のアミノ酸が欠けている（表 3C）。 35種のこれまでに記載されているDRIに結合する合成ぺプチド（O'Sulllvan et al.，J．Immunol．145:1799-1808（1990）; Guttinger et al.，Intern．Immun ol．3:899-906（1991）; Hill et al.，J．Immunol．147:189-197（1991）; Gut tinger et al.，EMBO J．7:2555-2558（1988）; Harris et al.，J．Immunol.， 148:2169-2174（1992））の配列の比較も、又、このモチーフを支持している。上記35種の合成ぺプチドの中で、21種（60%）は上記の正確なモチーフを持ち、９種（30%）はＩ或いはI+9位に単一のシフト（sllift）を含み、又、残りの５種（10%）はＩ位に単一の置換を持つ（表 3B及び C）。興昧のあることに、後に挙げたペプチドにおいては、Ｉ位の市荷電は、常により大きな疎水性残基で置換されている（表 8C）。この正確な置換に便宜を与えることの出来るポケット構造がクラスＩ分子で記載されている（Latron et al.， Porc．Natl．Acad．Sci．U SA88:11325-11329（1991））。他の８つのアミノ酸の上記モチーフ内、或いはペプチドの長さの中における寄与は十分には評価されてはいないが、これらのペプチドが示す結合において、転位／喪失した残基の補償をしているのかも知れない。これらの研究において引川された残り 117種のDR1 に結合しないベプチド（これらのペプチドは表３に含まれていない）の検討は、これらペプチドの中で99種（85%）が、本申請で提唱されているDR1 モチーフを含まないことを示している。DR1 に結合しないが、当該モチーフを含む残り18種のペプチド（15%）の中で６種は（5%）は、他のDRアロタイプに結合することが知られている。残り12種のペブヂドは、結合を妨害する他の部位で不都合な相互作用をするのかも知れない。 I-A^bと呼ばれるマウスのクラスII抗原に結合する６種のぺプチド、及びマウスのI-E^bに結合する５種のペプチドに関する以前の研究において観察された正確な N-末端の分裂とは対照的に（Rudensky et al.，Nature 3565:622-627（1991））、DR1 に結合する当該ペプチドは、N-及びC-末端の両方において不均一である。クラスＩ分子に結合するべプチドは９量体が支配的であるが、これらとは対照的に（Van Bleek and Nathenson，NatUre 348:213-216（1990）; Rotzschke e tal.，Nature 348:252-254（1990）; Jardetzky et al.，Nature 353:326-329（ 1991）; Hunt et al.，Science 255:1261-1263（1992））、クラスIIペプチドはよりサイズが大きく、又、末端の切断の長さと部位の両方において高度の不均一性を示し、クラスＩ及びクラスIIのペプチドに対するプロセシングの機構が相当に異なることを意昧している。更に、今回の結果は、クラスIIのプロセシングは、確率論的な事象であり、DRアロタイプは、複雑で不揃いな混合物の中から種々の長さのベプチドに結合する可能性を示唆している。観察された上記の不均一性は、単に、結合したペプチドが更に分解するのを防ぐためかも知れない。この様にして、クラスII分子は、結合したぺプチドが完全に分解されることから防御ずることによって、抗原のプロセシングにおいて積極的な役割を演じるのであろう（以前に提唱された様に（Donermeyer and Allen，J．Immunol．142:1063-1068 （1989）））。又は、DRI に結合するものは15量体が支配的であるが（MALD-MS 及び配列決定されたペプチドの得量の両方から検出される様に）、これは、結合したペプチドの剪定（trimming）の結果かも知れない。いずれにせよ、検出可能な量の、13残基より短く、25残基より長いペプチドが存在しないことは、ペプチドの結合機構、或いは抗原のプロセシングに特有の長さ制限があることを示唆している。DR１に結合するペプチドは、内因的に合成されたタンパク質、特にMHC に関連したタンパク質に由来するものが支配的であることは、自己寛容の発生に関連して、自己ペプチド提示機構の進化の結果かも知れない。 II．他のHLA-DRＲ分子 DR2、DR3、DR4、DR7及びDR8の各々から溶離された天然でプロセシングを受げたペプチドのアミノ酸配列が、夫々、表4-8に示されている。表9には、野生型の Arを持たないが、A2様のペプチドを結合した他の細胞系由来のDR1のアミノ酸配列が示されている。表10は、ヒトの牌臓由来の細胞に発現されるDR4及びDR11分子から溶離したペプチドのアミノ酸配列を示す。これらのデータは、外因性ペプチドと比較して、結合する自己ペプチドが大いに優勢であることを証明する。このデータ、又、A2及びliペプチドが、繰り返し生じることを示す。 III．ペプチドの運搬遺伝的構成本発明の免疫調節ペプチドをコードする遺伝子のin vivo投与のための遺伝的構成物を調製するために、以下の操作が行行われる。重複した合成のオリゴヌクレオチドを用いて、図３に示されているリーダーペプチド／遮断ペプチドのミニ遺伝子を、ヒトのHLA-DRα及びインバリアント鎖の cDNA鋳型から、PCR 増幅によって生成した。これらのミニ遺伝子は、Iiペプチド断片である KMRMATPLLMQALPM（即ち、li₁₅）、及び、LPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPM （即ち、Ii₂₄ ）をコードする。その結果得られた構成物は、プラスミドpGEM-2- α-li₁₅、及びpGEM-2-α-li₂₄を形成するために、pGEM-2（Promega社）中に、以下に述べるin vitro転写／翻訳系で用いるための上流T7プロモーターと共にクローンされた。 in vivo発現のために、各ミニ遺伝子は、その後、pGEM-2誘導体からトランスフェクション・ベクターであるpHβアクチン-1-ネオ（neo）（Gunning et al.，（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:4831）中にザブクローンされてプラスミドpHβアクチン-α-Ii₁₅及びpHβアクチン-α-Ii₂₄を形成した。上記の挿入されたミニ遺伝子は、この様にして、構成的で／強力なヒトのβアクチンブロモーターから生体内（in vivo）で発現される。これに加えて、上記ミニ遺伝子は、p GEM-2誘導体からワクシニアウイルスの組換えベクターであるpSC11（S.Chakraba rti et al.，（1985）Mol．Cell．Biol．5，3403-3409）中にサブクローンされてプラスミドpSCll-α-Ii₁₅及びpSCll-α-Ii₂₄を形成した。ウイルスのゲノム中に組換え後、上記のミニ遺伝子は強力なワクシニアp_7.5プロモーターから発現される。ペプチドに加えられる細胞内流通シグナル短いアミノ酸配列は、タンパク質を特定の細胞内分画（コンパートメント）に指向するためのシグナルとして作用することが出来る。例えば、疎水性シグナルペプチドは、ERに仕向けられているタンパク質のアミノ末端に見出されるが、アミノ酸配列KFERQ（及び、他の密接に関連した配列）は細胞内ポリペプチドをリソソームに指向することが知られており、一方、他の配列はポリペプチドをエンドソームに指向する。更に、ペプチド配列KDELはERに対する保持シグナルとして作用することが示されている。これらのシグナルペプチドの各々、或いは、これらを組合わせて、本発明の免疫調節ペプチドを、希望通りの流通に用いることが出来る。例えば、ER標的指向のシグナルペプチドに連結された所定の免疫調節ペプチドをコードする構成物は、当該ペプチドをERに指向し、そこで組立てられたままで、クラスII分子に結合して、流通に必須である無傷のIiの結合を防止する。又は、上記ペプチド上のER保持シグナルは、クラスII分子が、仮にも、ERから分離することを防止する助けとなるような構築物を作ることも出来る。もし、代わりに、本発明のペプチドがエンドソーム分画に指向されるならば、これは、インバリアント鎖がプロセシングを受けたペプチドで置換される場合、大量の当該ペプチドが存在し、それによってクラスII複合体に組込まれたペプチドが、天然由来で潜在的に免疫原性のペプチドよりもむしろ本発明の高親和性ペブチドである可能性を増大する。本発明のペプチドがクラスIIへの組込みに利用出来る見込みは、当該ペプチドを無傷のIiポリペプチド配列に連結することによって増大することが出来る。IiはクラスII分子をエンドソームヘ流通することが知られているので、ハイブリッドIiは、本発明のペプチドの１つ、或いはそれ以上のコピーをクラスII分子と共に運ぶことになる。一旦、エンドソーム内に入ると、上記ハイブリッドIiは正常のエンドソームのプロセスによって分解して、本発明のペプチド或いは、それに類似の分子の多重コピー、及びクラス１１の開放された結合間隙とを生成する。標的指向シグナルを含む免疫調節ペプチドをコードするDNA は、PCR或いは他の標準の遺伝子操作、または合成的技法によって生成され、これらペプチドがDR分子と会合する能力は、下記の様に、in vitro及びin vivoで分析される。インバリアント鎖は、クラスII分子がER内でペプチドを結合することを防市してヘテロダイマー形成に貢献する可能性があると提唱されている。この会合を防止する機構は、いかなるものでもクラスII遮断の効率を増大するであろう。従って、クラスIIヘテロダイマーに結合するIi上の部位、或いはIiに結合するヘテロダイマーのαまたはβサブユニット上の部位に対応するペプチドは、この会合を防止し、それによって、MHCクラスIIの機能を中断するために用いることが出来る。In vitro における組立て無細胞抽出液が真核生物のタンパク質を発現するため日常的に使用されている（Kreig，P．& Melton，D.（1984）Nucl．Acid Res．12，7057；Pelham，II．an d Jackson，R．（1976）Eur．J．Biochem．67，247）。特定のmRNAが、ウイルス RNA ポリメラーゼのプロモーターを含むDNAベクターから転写されて（Melton，D . et al．（1984）Nucl．Acid Res．12，7035）、ミクロコッカスヌクレアーゼで処理された細胞抽出液に加えられる。³⁵Ｓメチオニン及びアミノ酸の添加が、外因性のmRNAの翻訳を始動し、結果として標識タンバク質が生成される。タンパク質は、次いでSDS-PAGEにより分析され、オートラジオグラフィーによって検出される。シグナルペプチドの切断及びコアグリコシル化の様なプロセシング事象は、翻訳の間にミクロソーム小胞を添加することによって開始され（Walter，P ．and Blobel，G．（1983），Meth. Enzymol.，96，50）、これらの事象はSDS-P AGEゲルにおけるタンパク質の移動度の変化によって検査される。シグナルペプチド配列を含むペプチド正確にプロセシングを受けて、インバリアント鎖とER中でクラスII結合に対して競合する能力は、上述のin vitro系でアッセイされる。とりわけ、上述のDRIのα-とβ-鎖、及びインバリアント鎖ペプチドの構成物は、mRNAに転写され、これが哺乳動物のミクロソーム膜の存在下に翻訳されるであろう。DRヘテロダイマーのIiとの会合、DR及びIiに対する抗血清による免疫沈降試験によって測定される。本発明のペプチドをコードするmRNAを翻訳反応に加え、トリスートリシンゲル上のSDS-PAGEで測定する場合、共免疫沈降するIiのレベルが減少すると同時に共免疫沈降するペプチドが出現する結果となるはずである。これらの実験は、所定の遮断ペプチドのERにおけるIi鎖結合に対する競合剤としての潜在的有川性を決定するための迅速なアッセイ系を提供するであろう。この無細胞系においてIiと有効に競合する能力のあることが判明している本発明のこれらのペプチドは、次いで、以下に述べる様に、無傷の細胞において検査することが出来る。In vivo における組立てヒトのEBVで形質転換されたB細胞系であるLG-2とHOM-2（HLA-DR1に対して同型接合）及びマウスの B細胞ハイブリドーマであるLK35.2が、50μｇの鎖状化 pHβアクチン-α-Ii₁₅或いはpHβアクチン-α-Ii₂₄、又は（コントロールとして）_PHβアクチン-1-neoで、エレクトロポレーション（150 mV、960μF、キュベット幅0.2cm）によってトランスフェクトされる。エレクトロポレーション後、上記細胞は、G418を含まない培地中で完全回復まで（約4日）培養される。各母集団は、次いで、ネオマイシン耐性を表現する形質転換体母集団が得られる迄 G41 8 選別にかける（約 1-2ケ月）。耐性母集団は、制限稀釈によってサブクローンし、安定な形質転換体の遺伝的同一性は、遮断ペプチドのmRNA発現のPCR増幅によって決定される。遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載するLG-2、及びHO M-2の安定な形質転換体を、ペレット化細胞塊20ｇを得る迄、大規模培養条件で培養する。各形質転換体によって発現されたHLA-DRを精製し、結合ペプチドの量（細胞内及び細胞外両方からの）を上記の様にして分析する。総結合ペプチドの多様性の減少の成功が証明されれば、免疫調節ペプチドの細胞内への運搬の表示となる。もう一つの細胞によるアッセイは、遮断ペプチドのミニ遺伝子、或いは負の制御ベクターを担載するLK35.2細胞の安定な形質転換体を利用する。これらの細胞は、T細胞増殖アッセイにおいてAPCとして用いられる。各形質転換体を、種々の稀釈度の鶏卵リゾチーム（HEL）、及びHELに特異的な T細胞ハイブリドーマの存在下に24時間培養する。各アッセイに存在する T細胞の川対的活性化（リンホカイン生成により測定）は、市販のリンホカイン依存性細胞系であるCTLL2 を用いて、³H-チミジンの取込みアッセイ（Vignali et al．（1992）J.E.M. 175：925- 932）で測定する。遮断ペプチドを発現する形質転換体が、HEL を特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに提示する能力を減少することを成功裡に証明出来れば、免疫調節ペプチドの細胞内への運搬の確証となるであろう。ヒトのTK^-細胞系143（ATCC ）の細胞をワクジニアウイルス（WR株、TK⁺）（ATCC）に感染させ、感染後２時間して、pSCll-α-Ii₁₅、或いはpSCll-α-Ii₂₄を感染細胞内にリン酸カルシウム沈殿法によって導入する。TK~組換え体は、25μｇ/mlの濃度のブロモデオキシウリジンを用いて選択する。組換えプラークは、ミニ遺伝子DNA の存在を求めて、 PCR によりスクリーンする。組換えウイルスは、純粋クローンのウイルス株を生成するために、3ラウンドの限界稀釈によりクローンする。前述のトランスフェクション実験に類似の実験において、ミニ遺伝子、或いはベクターのみをコードする組換えワクシニアウイルスを用いて、EBVで形質転換されたヒトのB細胞系である、LG-2、及びHOM-2 の大規模培養物を感染する。感染後、HLA-DRを精製して、結合ペプチドの量を上記の様にして分析する。結合ペプチド母集団の複雑性の低下、及び結合したIiペプチドの相対的量の著明な増大は、ワクシニアが遮断ペプチドをヒトのAPC に運搬出来ることの確証である。ミニ遺伝子、或いはベクターをコードする同じ組換えワクシニアウイルスが、実験的に導入された自己免疫を体験しているマウスを感染するのに用いられるであろう。この様なモデルは多数知られており、Kronenberg、Cell 65:537-542（1 991）に引用されている。合成ペプチド、或いはミニ遺伝子構成物のリポソームによる運搬リポソームは、薬物の担体として、又、最近では、ヒトにおけるマラリアのワクチン注射のための安全で有力な補助戦略として成功裡に使川されている（Frie s et al．（1992），Proc. Natl．Acad．Sci．USA 89:358）。包膜されたリポソームは、可溶性タンパク質を取込み、これらの抗原を細胞に運搬して、in vitro 及びin vivoの両方における CD 8⁺仲介の細胞溶解性（CTL）の応答をもたらす（ REddy et al., J. Immunol. 148:1585-1589，1992；及びCollins et al., J.Imm unol. 148:3336-3341，1992）。この様にして、リポソームは、合成ペプチドを APC内に運搬するための伝達体（vehicle）として用いてもよい。 Harding ら（Cell（1991）64，393-401）は、リポソームにより運搬される抗原の、２つの細胞内のクラスII充填分画（loading compartments）のいずれか、即ち、初期のエンドソーム及び／或いはリソソームへの標的指向は、リポソームの膜組成を変えることによって達成出来ることを証明している。即ち、酸感受性リポソームは、その内容物を初期エンドソーム、に指向するが、一方、酸耐性のリポソームは、その内容物をリソソームに運搬することが見出だされている。この様にして、本発明のペプチドは、エンドソームへの運搬が望まれている場合、酸感受性のリポソームに、又、リソソームへの運搬が望まれている場合は、酸耐性リポソームに取込まれることになろう。リポソームは、標準の界面活性剤透析、或いは脱水−再水和法によって調製される。酸感受性リポソームに対しては、ジオレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）及びパルミトイル・ホモシステイン（PHC）が用いられ、一方、ジオレオイル・ホスファチジルコリン（DOPC）及びジオレオイル・ホスファチジルセリン（DOPS）が、酸耐性リポソームの調製に使用される。10^-5モルの総脂質（DOPC/DOPS或いはDOPE/PHC、4:1 のモル比で）を乾燥し、0.2 mlのHEPES 緩衝食塩水（HBS）（150 mM Nacl、1 mM EGTA、10 mM HEPES ｐH 7.4）中で水和して超音波処理する。脂質の懸濁液を0.1 mlのHBSに溶かした1 M のオクチルグルコシドを加えて可溶化する。封入されるべきぺプチドを20% HBS 中 6 mM のペプチド0.2 mlに加える。混合物は、次いで、凍結し、一晩凍結乾燥してから再水和する。これらのリポソームは、キモトリプシンで処理して、表面に結合したペプチドをすべて消化する。リポソームのEBV で形質転換した細胞系（上述の様に）への運搬は、37℃で12-16 時間のインキュベーションにより達成されるであろう。HLA-DRは、リポソームで処理した細胞から精製されて、結合ペプチドは前記の様にして分析される。代わりに、リポソームは本発明のDNA ミニ遺伝子構成物で処方調製されて、in vitro或いはin vivoで上記構成物をAPCに運搬するために利用される。ヒトの免疫感作は、臨床検査のためのジョンズ・ホプキンス大学・合同委員会（The Johns Hopkins University Joint Committee for Clinical Investigatio n）、及び米国陸軍・軍医総監室・ヒト患者の研究検閲評議会（Human Subject R esearch Review Board of the Office of the Surgeon General of the U.S. Ar my）の両方によって承認された手順（Fries et al. （1992），Proc．Natl．Aca d．Sci．U.S.A．89:358-362）に従い、そこに記載の用量、或いは、治療薬のリポソームを基盤とする運搬に対する文献に記載されているの他の用量を用いて行われるであろう。免疫刺激複合体（ISCOMS）を介する運搬 ISCOMSはコレステロールとQuil A（サポニン）を混合すると自発的に生成されるサイズ30-40 nmの負荷電の籠形構造物である。保護免疫は、トキソプラズマ病及びエプスタイン・バールウイルスで誘発される腫瘍を含む種々の感染の実験モデルにおいて、ISCOMSを抗原の運搬伝達体として用いて発生されている（Mowat and Donachie, Immunology Today 12:383-385，1991）。ISCOMSに封入された１ μｇ程度の低い抗原用量でもクラスＩ仲介のCTL 応答を起こすことが見出だされており、ここでは、精製した無傷のIIIV-1-IIIB gp 160 包膜糖タンパク質、或いはインフルエンザ赤血球凝集素が抗原である（Takahashi et al.，Nature 344 :873ー875, 1990）。ペプチドは、ISCOCOMSを用い、上述のリポソームに対するのと同じ様式と用量で組織培養細胞内に運搬される。運搬されたペプチドのクラス IIペプチド結合は、次いで、上述の様に、抽出と特徴決定によって決定される。 ISCOMSによって運搬され培養細胞によって効果的に利用される本発明のペプチドは、次いで、動物或いはヒトで検査される。治療用の合成ペブチドの運搬に加えて、ISCOMSは、ミニ遺伝子をAPC に運搬するために構成され、この様にして上に概説されたワクシニア戦略に対する代替法として役立つ。免疫原性ペブチドの運搬（ワクチン）免疫系をダウンレギュレーションするという特異的な目的で、非免疫原性の自己ペプチドを運搬するために前述の細胞内運搬システムを利用することに加えて（この様にして自己免疫状態を軽減する）、本発明の運搬システムは、代わりに、動物の免疫系の一部を刺激するために、予防接種の新規の方法として用いることも出来る。後の場合、上記の運搬システムは、特定の病原体に対する免疫応答の刺激を意図して、免疫原性で病原体由来のペプチドを発現するDNA 構成物を、適当な細胞内に運搬するために利用される。上記免疫原性ペプチドは標的細胞自身の中で生成されるので、本発明のワクチン法は、抗体生成を刺激し、それによって潜在的に有害な、或いは不適切な免疫反応誘導に利用される様な血中を循環する遊離の抗原は存在しないことを保証する。本発明のワクチンによって刺激される免疫応答は、ワクチンはAPC にのみ指向されているので、もっと全般的な免疫応答という結果になる標準のワクチンプロトコルとは対照的に、T 細胞仲介の応答に限定されている。ペプチドを提示するAPC のあるものは、初期に宿主のホストT 細胞によって溶解されることもあるが、とりわけ、ウイルス基盤のワクチンは、非複製的で、即ち、各担体ウイルスは単に 1個の細胞のみを感染するので、この様な溶解は限定されている。本発明の系を完璧にして検査するために用いられるモデル抗原は、鶏卵のリゾチーム（HEL）である。議論はあるものの、これは、抗原提示研究のために最もよく特徴が検討されているタンパク質であり、それに対しては、多数の単クローン性抗体、及びクラスIとクラスIIに限定されたマウスの T細胞クローン及びハイブリドーマが存在する。研究される一次抗原決定基は、単クローン性抗体及び CD4+ T細胞ハイブリドーマの両方が入手出来るので、ペプチドHEL34-45であり、及び、クラス IとクラスII限定 T細胞クローン及びハイブリドーマが作られ、市販されているので、ペプチドHEL46-61とである。この様にして、これら 2つのアミノ酸配列は、免疫原性の抗原決定基であることが立証されている。最初、異なったポリペプチドをコードする 4種の構成物が分析される。（a）分泌されるHEL の全体、（B）HEL 34-45、（c）HEL 46-61、及び（d）HEL 34-61。最後の 3種は、これらの細胞内で切断されることが知られているシグナル配列、例えば、1A^ｋ（MPRSRALILGVLALTTMLSLCGG）を含み、結果としてERを指向する。すべての構成物は、次いで、pHβApr-1 neo 中にサブクローンされる。これらの構成物を作成する方法論は、上に概説されたものと同じである。上記構成物は、通常の真核細胞のトランスフェクション、或いは、上述の運搬伝達体（例えば、ワクシニア、リポソーム、或いは、ISCOMS）の１つによって、適切なAPC、例えば、LK35.2細胞内に導入される。マウスのMHC クラスII制限分子であるIA^k及びIE^kを持ち、上記構成物の各々でトランスフェクトされたLK35.2細胞が、適当なクラスI 及びクラスII制限 T細胞ハイブリドーマ並びにクローンを刺激する能力を標準技法で検査される。クラス I刺激が観察されるかどうかは、クラス I分子との結合に適切な 8-10 量体を生成するためにペプチドの剪定がER内で起こり得るかどうかに係ると思われる。もし、これらの構成物がクラス I刺激に効果的でないならば、クラス I結合に対して更に効果的なペプチドを生成するために、これらの構成物を修飾することが出来る。これらの構成物は、クラスII限定応答に対してより効果的でないことが立証される場合には、V 節に述べられた様に、これらにエンドソーム及び／或いはリソソーム指向の配列を付与することが出来る。免疫原性ペプチドを特定の細胞内小器官に指向するために用いられる標的指向シグナルの効果性は、種々の形質転換体の免疫金染色切片の電子顕微鏡分析を用いて検出されるであろう。この適用のため、ウサギの抗ペプチド抗血清を生成し、アフィニティを利用して精製する。更にHEL 34-45を認識する抗体HF10が川いられるであろう。一旦、ある構成物が、形質転換体によってin vitroで効果的に提示出来ることが明確になれば、そのin vivo における効果性が決定される。これは、上記形質転換体をC3H/Balb/c F1 マウスに腹腔内及び／或いは皮下注射することにより、または、適当な運搬伝達体（例えば、リポソーム、ISCOMS、レトロウイルス、ワクシニア）に取込まれた構成物を注射することによって検査することが出来る。この様な免疫感作注射に対する至適プロトコル及び用量は、本出願に提供されている開示があれば、当事者によって決定することが出来る。免疫感作の効率は、以下の様な標準の方法によって検査出来る。（a）HEL を適用された（HEL pulse d）APCに応答するクラスIIに限定された T細胞の増殖、（b）⁵¹Crで標識された標的に対する CTL応答、及び（c）ELISA で測定される血清の抗体価。一旦、本発明のワクチン運搬システムの細部が至適化されれば、有用な免疫感作の潜在能力を持つペプチドをコードする構成物を上記の系に組込むことが出来る。この様なペプチドは、病原体由来のタンパク質上の免疫原性抗原決定基の同定に現今用いられている標準手段によって確認することが出来る。例えば、免疫感作のための候補ペプチドは、抗体及び特定の病原体で感染された動物の T細胞の分析から決定してもよい。保護的で効果的な既往（記憶）応答を獲得するために、予防接種に川いられるペプチドは、理想的には、感染すると最高の頻度と効率で提示されるペプチドでなければならない。これは、感染細胞から MHCクラス II分子に結合したペプチドを抽出して特徴決定するために、前記実験の部に概説されている操作を用いて最もよく決定することが出来る。免疫原性ペプチドに対立遺伝子制限があるならば（本発明の自己ペブチドで観察された変質した結合と対比して）、全母集団に対して有用なワクヂ〕／を提供するためには数種の免疫原性ペブチドをコードするミニ遺伝子が要求されるであろう。ワクチンの投与と用量は、天然痘の予防接種に現在適用されているものと同様である。特許請求の範囲は次の通りである。配列リスト（１）一般情報：（ｉ）出願人：ロバートジーアーバンローマンエムチクビダリオエーエービグナリマリーエルヘドレイローランスジェイステルンジャックエルストロミンガー（ii）発明の名称：免疫調節ペプチド（iii）配列数： 157 （iv）対応アドレス：（A）名宛人：フィッシュアンドリチャードソン（B）通り： 225フランクリンストリート（C）市：ボストン（D）州：マサチューセッツ（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号：０２１１０−２８０４（ｖ）コンピュータ読み出し形態：（A）媒体形式： 3.5”ディスク，1.44Mb （B）コンピュータ： IBM PS/2モデル50Zまたは55SX （C）作動システム： MS-DOS（バージョン5.0）（D）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5.1）（vi）現出願データ：（A）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９２／０６６９２（B）出願日：１９９３年８月１１日（C）分類：（vii）優先出願データ：（A）出願番号：０７／９２５，４６０（B）出願日：１９９２年８月１１日（viii）代理人情報：（A）氏名：クラークポールティー（B）登録番号：３０，１６２（C）整理番号：００２４６／１６２００１（ix）遠隔通信情報：（A）電話番号：（６１７）５４２−５０７０（B）ファックス番号：（６１７）５４２−８９０６（C）テレックス番号：２００１５４（２）配列番号１の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 18 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号１の記載：（２）配列番号２の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 15 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号２の記載：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 14 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号３の記載：（２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（A）配列の長さ： 14 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号４の記載：（２）配列番号５の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 13 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号５の記載：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 25 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号６の記載：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 24 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（B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D））トポロジー：直鎖状（xi）配列番号151の記載：（２）配列番号152の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：4 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号152の記載：（２）配列番号153の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：5 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号153の記載：（２）配列番号154の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：5 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号154の記載：（２）配列番号155の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 25 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号155の記載：（２）配列番号156の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 14 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号156の記載：（２）配列番号157の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 23 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号157の記載：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/55 39/00 Ａ 9284−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 7/08 14/47 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 9455−4Ｃ 37/64 9281−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 7729−4Ｂ 5/00 Ｂ (72)発明者ビグナリダリオエーエーイギリス国ケント州ローワーレインハムロード 761 (72)発明者ヘドレイマリーリンアメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジ＃１ワルデンストリート 214 (72)発明者ステルンローランスジェイアメリカ合衆国マサチューセッツ州アーリントンニューポートストリート 181 (72)発明者ストロミンガージャックエルアメリカ合衆国マサチューセッツ州レキシントンマサチューセッツアベニュー 2030

Claims

【特許請求の範囲】１．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプチドの精製標品であって、当該切片は長さ10から30残基までであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。２．請求項１に記載の調製品であって、上記ペプチドが少なくとも２つの別個の MHCクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。３．請求項１に記載の調製品であって、上記のヒトタンパク質が、HLA-A2、HL A-A29、HLA-Bw62、HLA-C、HLA-DRα、HLA-DRβ、インバリアント鎖（Ii）、Igκ 鎖 C領域、Ig H鎖、Na⁺/K⁺ ATP アーゼ、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、カルシトニン受容体、カルボキシペプチダーゼ E、MET キナーゼ関連形質転換タンパク質、グアニル酸結合タンパク質、マンノース結合タンパク質、アポリポタンパク質 B-100、カテプシンＣ、カテプシンＳ、金属プロテイナーゼ阻害因子１前駆体、或いは、熱ショック・コグネイト 71 kD タンパク質である。４．請求項１に記載の調製品であって、上記ヒトタンパク質がMHC のクラス I 或いはクラスII分子であることを特徴とする。５．請求項１に記載の調製品であって、上記切片が以下のモチーフに属することを特徴とする。当該切片のアミノ末端、或いはその12残基内の最初の照合点(I)に、正荷電残基、又は大きな疎水性残基を、及び I+5 位に、水素結合供与残基を含む。６．請求項５に記載の調製品であって、上記モチーフが I+9 位に疎水性残基を含むことを特徴とする。７．請求項６に記載の調製品であって、上記モチーフが、更に、I+1 或いはI -1 位に疎水性残基を含むことを特徴とする。８．請求項１に記載の調製品であって、上記切片がHLA-A2の残基 29-40、或いは残基 106-115を含むことを特徴とする。９．請求項１に記載の調製品であって、上記切片がIiの残基 107-116を含むことを特徴とする。１０．治療用組成品が、（a）天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプチドであって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合し、及び、（b）薬剤学的に許容される担体からなることを特徴とする。１１．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含むリポソームであって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記ペブチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）のクラスIIアロタイプに結合することを特徴とする。１２．天然由来のヒトのタンパク質の切片のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含む免疫刺激複合体（ISCOM）であって、上記切片は10から3 0残基の長さであり、上記ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）クラス IIアロタイプに結合することを特徴とする。１３．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の抗原提示細胞（APC）を請求項１０に記載の治療用組成物と接触させることからなることを特徴とする。１４．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の APCを請求項１１に記載のリポソームと接触させることからなることを特徴とする。１５．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、患者の APCを請求項１２に記載のISCOMと接触させることからなることを特徴とする。１６．ポリペプチドをコードする核酸であって、上記ポリペブチドがペプチド結合で連結された第一と第二のアミノ酸配列からなり、上記第一の配列は天然由来のヒトのタンパク質の切片の配列と同一であり、当該切片がヒトのMHCのクラスI Iアロタイプに結合して、10から30残基の長さであり、又、第二の配列は、それが付着するポリペプチドの細胞内流通を制御する配列（流通配列）であることを特徴とする。１７．請求項１６に記載の核酸であって、上記の流通配列が上記ポリペプチドを小胞体（ER）、リソソーム、或いはエンドソームに流通することを特徴とする。１８．請求項１６に記載の核酸であって、上記の第二の配列が MHCサブユニットのシグナルペプチドと本質的に同一であることを特徴とする。１９．請求項１８に記載の核酸であって、上記サブユニットがMHCクラスIIα或いはβサブユニットであることを特徴とする。２０．請求項１６に記載の核酸であって、上記の流通配列が KDEL、 KFERQ、 QR EFK 、 MAISGVPVLGFFIIAVLMSAQESWA 、Qの一側にK 、R 、D 、E 、F 、I 、V 及びＬから選ばれた４残基が隣接しているペンタペプチド、或いはシグナルペプチドであることを特徴とする。２１．請求項１６に記載の核酸を含むリポソーム、或いはISCOMを特徴とする。２２．ペプチド結合で連結された第一と第二のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸であって、上記第一の配列が天然由来のヒトのタンパク質の切片の配列と同一であり、上記切片がヒトのMHCクラスIIアロタイプに結合して、10から30残基の長さであり、又、第二の配列がヒトのIiと本質的に同一であることを特徴とする。２３．請求項２２に記載の核酸であって、上記ポリペプチドが、上記の第二配列に縦に連結した上記第一配列の複数のコピーからなることを特徴とする。２４．天然由来のヒトのタンパク質の切片と同一のアミノ酸からなる自己ペプチドをコードする核酸分子であって、上記切片は10から30残基の長さであり、上記自己ペプチドがヒトの主要組織適合性複合体（MHC）クラスIIアロタイプに結合し、上記核酸分子が上記タンパク質の全配列よりも少ない配列をコードすることを特徴とする。２５．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、それが付着するポリペブチドの細胞内流通を制御するペプチド配列をコードすることを特徴とする（流通配列）。２６．請求項２５に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、第二の自己ペプチド及び第二の流通配列をコードすることを特徴とする。２７．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子が、更に、発現制御因子を含むことを特徴とする。２８．請求項２４に記載の核酸分子であって、上記分子がプラスミド、或いはウイルスのゲノム、配列を含むことを特徴とする。２９．請求項２８に記載の核酸分子であって、上記分子が非増殖性で非毒性のワクシニアウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、或いはレトロウイルスのゲノムであることを特徴とする。３０．請求項２４に記載の核酸分子を含むリポソーム、或いはISCOMを特徴とする。３１．請求項２７に記載の核酸分子を含む細胞を特徴とする。３２．請求項３１に記載の細胞であって、上記細胞がヒトの B細胞、或いはAPC であることを特徴とする。３３．請求項３１に記載の細胞であって、上記核酸がウイルスのゲノム核酸からなることを特徴とする。３４．ペプチド調製の方法であって、当該方法が、上記核酸分子からの上記ペプチドの発現を可能にする条件下に請求項３１に記載の細胞を培養することからなることを特徴とする。３５．ヒト患者における免疫応答を阻害する方法であって、上記方法が、請求項２４に記載の核酸を、上記患者の複数の APCに導入することからなることを特徴とする。３６．薬剤学的に許容される担体中の請求項２４に記載の核酸からなる治療用組成物を特徴とする。３７．ヒト患者に免疫応答を誘発する方法であって、上記方法が、上記患者の A PC内に、ヒト起源以外のタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸分子を導入し、上記断片が MHCのクラスＩ或いはII分子に結合することを特徴とする。３８．請求項３７に記載の方法であって、上記タンパク質が、ヒト、或いは動物の病気の原因となる感染性作用物質に関するものであることを特徴とする。３９．請求項３８に記載の方法であって、上記感染性作用物質が、ヒトの免疫不全症ウイルス（HIV）、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、 Corynebactcm diphtheriae（ジフテリア菌）、Bordetella pertussis（百日咳菌）、Plasmodium属、Schistosoma属、Lei shmania属、Trypanasoma属、或いは Mycobacterium lepre（癩菌）であることを特徴とする。４０．請求項１に記載の調製品であって、上記切片が、本質的に表1-10のいずれかに提示されている配列の１つからなることを特徴とする。４１．非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチドの同定方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特徴とする。（a）第一のMHC クラスIIアロタイプから溶離されるペプチドの混合物を分画し、（b）上記混合物から自己ペプチドを同定して、（C）上記自己ペプチドが第二の MHCクラスIIアロタイプに結合するかどうかを検査し、当該結合は、自己ペプチドが非対立遺伝子的制限の免疫調節ペプチドであることの表示である。４２．潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特徴とする。（a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提供し、（b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、（c）上記の候補ペプチドに結合する上記クラスII分子の比率が、上記核酸の非存在下に結合する比率と比較して、上記核酸の存在下に増大するかどうかを測定し、上記増大は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表示である。４３．潜在的な免疫調節ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特徴とする。（a）MHC のクラスII分子を表面上に発現する細胞を提供し、（b）上記細胞内に候補ペプチドをコードする核酸を導入し、（c）上記細胞の表面上の MHCのクラスII分子のレベルが、上記核酸の非存在下の上記分子のレベルと比較して、上記核酸の存在下に減少するかどうかを測定し、上記減少は、上記候補ペプチドが潜在的な免疫調節ペプチドであることの表示である。４４．非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドを同定する方法であって、上記方法が以下の事項からなることを特徴とする。（a）第一のMHCのクラスＩ、或いはクラスIIアロタイプを保持する細胞を提供し、上記細胞が病原体で感染され、（b）上記細胞の第一のMHCアロタイプに結合するペプチドの混合物を溶離し、（c）上記混合物から候補ペプチドを同定し、上記候補ペプチドが上記病原体からのタンパク質の断片であり、（d）上記候補ペプチドが第二のMHCアロタイプに結合するかどうかを検査し、上記結合は、上記候補ペプチドが非対立遺伝子的に制限された免疫調節ペプチドであることの表示である。