DE69434582T2

DE69434582T2 - Die regulation der antigenpräsentation

Info

Publication number: DE69434582T2
Application number: DE69434582T
Authority: DE
Inventors: Robert E. Humphreys
Original assignee: Antigen Express Inc
Current assignee: Antigen Express Inc
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2014-05-19
Also published as: CA2163196A1; JP3534761B2; DE69434582D1; JP2004161777A; US5559028A; WO1994026773A1; JPH09509561A; JP4019040B2; EP0702692A1; EP0702692A4; EP0702692B1; CA2163196C

Description

Hintergrund der Erfindung
Innerhalb gewisser Zellen werden Peptide aus fremden oder eigenen Antigenen intrazellulär an MHC-Moleküle gebunden und dann an die Zelloberfläche gebracht, wo das Peptid und die präsentierenden MHC-Moleküle zusammen als ein Komplex von Rezeptoren auf T-Lymphozyten erkannt werden. Allgemein präsentieren MHC-Typ I-Moleküle endogen synthetisiertes Antigen und MHC-Typ II-Moleküle präsentieren exogenes Antigen. Peptidfragmente von intrazellulär infektiösen Organismen werden in das endoplasmatische Reticulum überführt, um MHC-Klasse I-Moleküle kurz nach ihrer Synthese zu binden. Peptidfragmente von endozytosiertem extrazellulärem Antigen werden durch Proteolyse in einem post-Golgi verarbeitenden Kompartiment erzeugt, wo die Fragmente dann mit den MHC-Klasse II-Molekülen in Verbindung gebracht werden. Die meisten Zellen sind dazu fähig, Peptidfragmente durch MHC-Klasse I-Moleküle zu prozessieren und zu präsentieren und spezialisierte Klassen von Antigen präsentierenden Zellen präsentieren auch das exogene Antigen über den MHC-Klasse II-Pfad. Zum Beispiel nehmen Makrophagen Antigen auf und präsentieren es T-Zellen, welche sich zu Helfer- oder Killerzellen umwandeln, und virgin B-Cells binden Antigene auf ihre Oberflächen-Immunoglobuline und endozytosieren, verdauen und präsentieren Fragmente von diesem Antigen über ihre MHC-Klasse II-Moleküle den Helfer-T-Zellen. Diese Helfer-T-Zellen entlassen Lymphokine und geben direkte interzelluläre molekulare Signale, welche die B-Zellen dazu stimulieren, sich zu proliferieren und sich zu Immunglobulin produzierenden Plasmazell-„Fabriken" zu reifen. Die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse II-Moleküle ist entscheidend für die Initiierung von vielen Schutzimmunantworten und für den Ursprung der Autoimmunantworten.
Ein wichtiger Regulator der Antigenbeladung des MHC- Klasse II-α, β-Kettenkomplexes ist das I_i-Protein. Dieses Protein schließt sich den MHC-Klasse II-α, β-Ketten bei der Synthese an und geht in einem post-Golgi-Kompartiment verloren, wo es mit den gleichen Proteasen, die Peptidfragmente von anderen Antigenen erzeugen, verdaut werden kann. Blockieren der Peptidbindungsstelle auf den MHC-Klasse II-α, β-Ketten bis zum Verdau von I_i in dem Antigenprozessierenden Kompartiment schränkt die Autoantigen-Präsentation voraussichtlich ein. D.h., da MHC-Klasse II-Moleküle endogen hergestellte virale, Determinanten präsentieren können, können die Bindungsumstände entweder (1) den Transport von solchen Determinanten in das post-Golgi-Antigen-Bindungskompartiment aus dem Cytoplasma heraus durch die Membran des Kompartiments hindurch reflektieren, oder (2) den Transport von solchen Peptiden in das endoplasmatische Reticulum und „vorzeitiges" Binden an MHC-Klasse II-Moleküle bei „früherem" Freisetzen von I_i, oder Fluss von solchen Peptiden, möglicherweise in geschützten Komplexen, in das post-Golgi-Antigenbindungskompartiment.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein In-Vitro-Verfahren für die erhöhte Präsentation von einem auf MHC-Klasse II eingeschränkten Antigen-Peptid an eine T-Zelle aus:

(a) Bilden einer Reaktionsmischung aus: i) einer MHC-Klasse II-exprimierenden, Antigen präsentierenden Zelle; ii) dem Peptid YRMKLPKPPKPVSKMR (Seq.-ID Nr. 1); iii) dem auf MHC-Klasse II eingeschränkten Antigen-Peptid, das, wenn zu einer Inkubationsmischung zugegeben, nicht mit einer Antigen präsentierenden Zelle in Verbindung steht, und iv) einer T-Zelle als Antwort auf das auf MHC-Klasse II eingeschränkte Antigen-Peptid aus Teil iii), sowie
(b) Inkubieren der Reaktionsmischung aus Schritt a) unter Bedingungen, die für die Wechselwirkung zwischen der antigen-präsentierenden Zelle und der T-Zelle geeignet sind.

In einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur verbesserten Präsentation eines auf MHC-Klasse II eingeschränkten Antigen-Peptids an eine T-Zelle durch:

(a) Bilden einer Reaktionsmischung aus: i) einer MHC-Klasse II-exprimierenden Antigen-präsentierenden Zelle; ii) dem Peptid ENLRHLKNTMETLDWKV (Seq.-ID Nr. 2); iii) dem auf MHC-Klasse II eingeschränkten Antigen-Peptid, das, wenn es zu der Inkubationsmischung zugegeben wird, nicht mit einer Antigen präsentierenden Zelle in Verbindung ist, sowie iv) eine T-Zelle, welche die Antwort ist auf das auf MHC-Klasse II eingeschränkte Antigen-Peptid aus Teil iii), und
(b) Inkubieren der Reaktionsmischung aus Schritt a) unter Bedingungen, die für die Wechselwirkung zwischen der antigen-präsentierenden Zelle und T-Zelle geeignet sind.

Ein Verfahren zur Identifizierung von Stellen, die während der Ablösung von I_i von den MHC-Klasse II-α- und β-Ketten gespalten werden, ist ebenfalls offenbart. Dies kann bewirkt werden durch z. B. zur Verfügung stellen eines rekombinanten DNA-Konstrukts aus einer DNA-Sequenz, welche für I_i kodiert. Das Gen wird dann modifiziert durch Ausführen von stellenspezifischer Mutagenese, um die Identität eines Aminosäurenrestes zu verändern, der an oder nahe an einer mutmaßlichen Abspaltungserkennungsstelle für eine vorbestimmte Endoprotease in I_i ist, in einer Art und Weise, die dazu vorbestimmt ist, die lokale Sekundärstruktur in dem mutierten I_i zu verändern. Ein Trimerkomplex aus dem mutierten I_i, der MHC-Klasse II-α-Kette und der MHC-Klasse II-β-Kette wird dann durch Coexpression von korrespondierenden DNA-Sequenzen in einer Zelle gebildet.
Der Trimerkomplex wird dann mit einer Endoprotease in vitro verdaut. Die Größen der Peptidfragmente, die durch Verdau mit der Endoprotease erzeugt werden, wird durch herkömmliche Techniken bestimmt und mit den Fragmentgrößen verglichen, die in e) bestimmt wurden, mit Fragmentengrößen, die durch Verdau des Wildtyp-I_i mit der Endoprotease erzeugt wurden, um zu bestimmen, ob die Abspaltung an einer zuvor existierenden Abspaltungsstelle verändert wurde. Eine auf diese Art bestimmte Abspaltungsstelle stellt eine Stelle dar, die während des Freisetzens von Wildtyp-I_i aus den MHC-Klasse II-α- und β-Ketten gespalten wird.
Solche Verfahren und Mutanten, die durch solche Verfahren identifiziert werden, sind geeignet für die Identifizierung von Klassen von Verbindungen, wie z. B. kleinen organischen Verbindungen, die weiter auf immunomodulatorische Aktivität untersucht werden. Ein Anfangsschritt in einem solchen Verfahren ist, kleine organische Verbindungen zu identifizieren, die selektiv an ein Intermediat im I_i-Abspaltungspfad binden. Eine auf diese Art identifizierte Verbindung wird dann mit einer Antigen präsentierenden Zelle in Kontakt gebracht und die Änderung der Antigenpräsentation bestimmt.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Es wurde gezeigt, dass das immunoregulatorische Protein I_i, welches sich den MHC-Klasse II-α- und β-Ketten bei der Synthese anschließt, durch Proteasen von den α- und β-Ketten abgespalten und freigesetzt werden kann (Thomas, L.J. et al., 1988, J. Immunol., 140: 2670-2674), einschließlich der intrazellulären Proteasen Kathepsin B und D (Reyes, V.E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877-3880), voraussichtlich in den gleichen intrazellulären Kompartimenten, in welchen Proteinantigene zu Peptiden verdaut werden, die an die MHC-Klasse II-Moleküle binden. Es wird gefunden, dass fremde Peptide wirksamer an die MHC-Klasse II-Moleküle binden, wenn sie während der Abspaltung und der Freisetzung von I_i durch Kathepsin B vorliegen. Bindung von solchen Peptiden wird nicht erhöht, wenn sie während des Verdaus mit Kathepsin D alleine vorhanden sind, jedoch erhöhen Spurenmengen von Kathepsin D die Menge der Bindung des Peptids, katalysiert durch Kathepsin B, weiter. Diese Beobachtungen führen zu der Hypothese einer stufenweise Abspaltung und Freisetzung von I_i mit konkurrierendem Einschub von fremden Peptiden in das MHC-Klasse II-α- und β-I_i-Fragmentintermediat. Der Wahrheitsgehalt dieser Hypothese wird hierin durch Auslegung, Bildung und Test von Mutanten an den mutmaßlichen Spaltungsstellen gezeigt. Die Erfindung betrifft die Identifizierung von Spaltungsstellen in I_i auf der Basis von zwei Restmotiven (hydrophob-kationisch) für die Kathepsin B-Abspaltung und zwei Restmotiven (hydrophob-hydrophob) für die Kathepsin D-Abspaltung. Teilmengen von solchen Abspaltungsstellen sind in Bereichen der primären Aminosäurensequenz von I_i zusammengefasst, die anscheinend eine lokale Sekundärstruktur haben und daher Struktur und Funktion des Komplexes beherrschen. Die allgemeine Struktur der MHC-Klasse II-α, β-Ketten besteht aus zwei Proteinen, die an ihren C-Termini in die Zellmembran insertieren. Jeder der beiden externen, N-terminalen Abschnitte der α,β-Ketten knäult sich in der Nähe der Zelloberfläche in einem globularen Bereich, der ein β-gefaltetes Blatt trägt, auf welchem eine α-Helix sitzt. Die beiden Ketten sind annähernd Spiegelbilder und treffen sich an einem Ende des β-gefalteten Blatts derart, dass das Blatt die beiden α-Helices in einer antiparallelen Art trägt (Brown, J. H. et al., 1988, Nature 332:845-850). Ein Antigen-Peptid bindet zwischen die antiparallelen Helices (an der Antigen-Bindungsstelle) und der vollständige Komplex (insbesondere gewisse Reste auf dem fremden Peptid und auf den benachbarten α-Helices) wird durch einen Rezeptor auf den T-Lymphozyten erkannt. I_i kann die Peptidbeladung auf die MHC-Klasse II-α, β-Ketten durch Bindung zwischen den antiparallelen α-Helices bis zur Abspaltung und Freisetzung blockieren. Alternativ kann I_i mit den MHC-Klasse II-α, β-Ketten in anderer Art und Weise wechselwirken, wodurch die Kapazität der Antigen-Bindungsstelle an die empfangenden Peptide indirekt (allosterisch) reguliert wird.
Die unveränderliche Kette I_i, die bei der Synthese zu MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden wird, kann den intrazellulären Transport der MHC-Klasse II-α, β-Ketten-Komplexe von ihrem Ort der Synthese in das endoplasmatische Reticulum zu einem post-Golgi-Kompartiment dirigieren, wo die Komplexe endocytosiertes und verdautes fremdes Antigen treffen (Guagliardi, L. E. et al., 1990, Nature, 343: 133-139). Die Gegenwart der I_i-Kette auf den MHC-Klasse II-α, β-Komplexen kann das Binden von Antigen-Peptiden an die Antigen-Bindungsstelle der MHC-Klasse II-α, β-Ketten verhindern (Teyton, L. et al., 1990, Nature, 348: 39–44); Roche, P. et al., 1990, Nature, 345: 615–619). In diesen Berichten wird vollständige Entfernung von I_i von den Klasse II-α, β-Ketten vorgeschlagen, was vor der Bindung des fremden Peptids auftreten soll. Es ist hierin offenbart, dass die Bindung des fremden Peptids als ein konzertiertes Ereignis mit der Entfernung eines Fragments des proteolysierten I_i auftritt und sogar davon katalysiert wird.
Kathepsin B und D können beide Antigen-Proteine zu immunogenen Fragmenten verdauen und I_i aus den MHC-Klasse II-α, β-Ketten freisetzen. Kathepsin B und Kathepsin D erzeugen Antigen-Peptidfragmente (Takahashi, H. et al., 1989, J. Immunol., 142: 2221–2226; Roche, P. et al., 1990, Nature 345: 615–619; Rodriguez, G. M. et al., 1992, J. Immunol., 149: 2894–2898). Kathepsine werden in den intrazellulären Kompartimenten gefunden, wo man glaubt, dass Peptidbeladung auf MHC-Klasse II-Moleküle auftritt (Guagliardi, L. E. et al., 1990, Nature, 343: 133–139). Die Thiolprotease Kathepsin B und die Aspartylprotease Kathepsin D erzeugen p21 und andere kleinere Fragmente von I_i (Roche, P. A. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3150–3154; Reyes, V. E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877–3880). Der Kathepsin B-Inhibitor Leupeptin beschränkt die finale Proteolyse von I_i auf p21- und p14-Fragmente (Blum, J. S. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 3975–3979; Nguyen, Q. V. et al., 1989, Human Immunol., 24: 153–163) und blockiert die Antigenbeladung in vitro (Puri, J. et al., 1988, J. Immunol., 141: 3313–3319). Da Kathepsin B, nicht aber Kathepsin D durch Leupeptin inhibiert wird (Bond, J. S., 1989, Kommerziell erhältliche Proteasen, in: Proteolytic Enzymes: Eine praktische Annäherung, herausgegeben von R. J. Beynon, et al., Seiten 232, IRL Press, New York), kann die intrazelluläre Abspaltung von I_i, die aufeinanderfolgende Wirkung von Kathepsin D und dann Kathepsin B erfordern. Kathepsin B-Verdau von gereinigtem α-, β-, I_i-Trimeren erzeugt eine Peptidbindungsstelle (Roche, P. A. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3150–3154).
Eindeutige Muster von I_i-Fragmenten, nach wie vor in Verbindung mit MHC-Klasse II-α, β-Ketten, oder aber von diesen abgelöst, können nach proteolytischer Freisetzung mit den Kathepsinen B oder D gesehen werden (Reyes, V. R. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877–3880). Kathepsin B erzeugt p21- und p6-Fragmente von I_i. Da sowohl [³⁵S]-Cystein als auch das einzige Cystein in I_i an C²⁸ ist, sind sie N-terminal und das p21 ist höchstwahrscheinlich M¹-K¹³⁸. Das p6-Fragment kann M¹-R⁶¹ sein. Das transiente p24-Fragment kann M¹-K¹⁵⁴ sein. Die p21- und p10-I_i-Fragmente, die stark in den Leupeptin behandelten Zellen nach metabolischem Radiomarkieren ansteigen, können aufgrund von teilweiser Inhibierung des endogenen Kathepsin B durch Leupeptin, das diese Fragmente weiter abbaut, hervorgehoben sein (Rudensky, A. Y. et al., 1991, Nature, 353: 622–627; Chicz, R. M. et al., 1992, Nature, 358: 764–768). Kathepsin D spaltet I_i in zwei diskrete Muster, anscheinend ohne eine Mischung von Spaltungsstellen innerhalb der jeweiligen Moleküle. Zusätzlich wird die N-terminale Natur eines relativ basischen, variabel sialinsäure-derivaritisierten N-terminalen p25 identifiziert, da es C²⁸ enthält, das einzige Cyctein in I_i. Diese p25b-Form, enthaltend [³⁵S]-Cystein, kann aus M¹-W¹⁶⁸ und M¹-L¹⁷³ erhalten werden.
Die Entdeckung, dass der Prozess der Antigen-Beladung während der I_i-Freisetzung in dem post-Golgi-MHC-Klasse II Antigen-I_i-Austauschskompartiment die sequenzielle oder schrittweise Abspaltung von I_i aus einem trimären Komplex aus I_i und der MHC-Klasse II-α, β-Kette involviert, ist ebenfalls hierin offenbart. Diese Ergebnisse zeigen, dass Peptidbindung an die MHC-Klasse II-α, β-Ketten ein konzertierter Prozess ist mit der Abspaltung und Freisetzung von I_i durch Endoproteasen, die in den antigen-verarbeitenden Zellen vorhanden sind. Peptide werden in die Antigen-Bindungsstelle in einigen Schritten bei der Freisetzung der I_i-Fragmente insertiert. Ein Verfahren zur Bestimmung von Stufen bei der Abspaltung und Freisetzung von I_i durch Verwendung von I_i-Mutationen an mutmaßlichen Abspaltungsstellen ist ebenfalls beschrieben. Ausgewählte I_i-Mutationen nach proteolytischer Behandlung, die somit einem Intermediat im I_i-Abspaltungs/Freisetzungs-Peptidbeladungsmechanismus ähneln, können für das Screening von kleinen organischen Molekülen verwendet werden, welche das Beladen und die Präsentation von Antigen durch die MHC-Klasse II-α, β-Ketten beeinflussen. Weiterhin können Homologe der Fragmente von I_i den Peptidbeladungsprozess regulieren oder möglicherweise andere Schritte in der Immunantwort.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Stellen, die während der Freisetzung von I_i aus MHC-Klasse II-α, β-Ketten gespalten werden, ist ebenfalls beschrieben.
Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines rekombinanten DNA-Konstrukts, das eine DNA-Sequenz enthält, die für I_i kodiert (siehe zum Beispiel Strubin et al., EMBO J. 3: 869–872 (1984)). Stellenspezifische Mutagenese wird auf dem rekombinaten DNA-Konstrukt ausgeführt unter Verwendung von konventionellen Techniken, um die Identität eines Aminosäurenrestes zu verändern, der sich an oder in der Nähe der mutmaßlichen Spaltungserkennungsstelle für eine vorbestimmte Endoprotease befindet, in einer Art, für die vorhergesagt wird, dass sie die Abspaltungsstellenspezifität in dem mutierten I_i verändert. Die stark wiederholten Muster von hydrophoben und positiv geladenen, angrenzenden Aminosäureresten, die sich um zwei lokale Segmente anhäufen, die einer Tetraprolyl, kationischen Pseudohelix oder Knick bzw. einer amphiphatischen amphiphilen α-Helix ähneln, legt nahe, dass diese Stellen durch Kathepsin B gespalten werden. Die Reihenfolgen von drei angrenzenden hydrophoben Resten an Leu⁹⁷ Leu Met und Leu¹⁷³ Leu Phe stimmen mit den bekannten Abspaltungsstellen überein, die für Kathepsin D spezifisch sind. Aminosäuresubstitutionen, die für eine Änderung der Abspaltungsstellenspezifität vorhergesagt werden, werden allgemein ausgewählt auf der Basis einer R-Gruppen-Funktionalität, die sich von der des Restes, der im Wildtypmolekül vorhanden ist, unterscheidet. Die häufigste ausgewählte Aminosäurensubstitution, für die eine Änderung solcher spezifischer Abspaltungsstellen vorhergesagt wird, ist, eine in dem Wildtypmolekül vorhandene Aminosäure durch Alanin zu ersetzen.
Der nächste Schritt im Verfahren zur Identifizierung von Stellen, die während der Freisetzung von I_i aus MHC-Klasse II-α, β-Ketten gespalten werden, ist, einen Trimerkomplex-Komplex zu bilden, der mutiertes I_i und MHC-Klasse II-α, β-Ketten enthält. Dies wird am einfachsten ausgeführt durch die Coexpression des oben beschriebenen mutierten I_i-Gens und der MHC-Klasse II-α, β-Ketten. Die Coexpression wird gewährleistet durch Verwendung herkömmlicher Verfahren, vorzugsweise in kultivierten Säugetierzellen, wie z. B. COS-Zellen. DNA kodierende MHC-Klasse II-α, β-Ketten können aus der Kultursammlung von der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, erhalten werden. Die drei Gene, welche für die Komponenten des Trimerkomplexes kodieren, sind innerhalb von DNA-Expressionskonstrukten angeordnet, welche die regulatorischen Sequenzen enthalten, die dafür bekannt sind, dass sie für die Expression erforderlich sind (vorzugsweise sowohl in vivo als auch in vitro), sowie einen selektierbaren Marker. Die Verwendung von kultivierten Zellen wird im Zusammenhang mit dieser Offenbarung als in vitro-Verwendung angesehen. Die Konstrukte werden dann dazu verwendet, um Säugetierzellen in Kultur zu transfizieren. Die Zellen werden für eine geeignete Zeitdauer folgend auf die Transfektion wachsen lassen und metabolisch radiomarkiert (z.B. unter Verwendung von [³⁵S]-Methionin). Mikrosomale Membranen werden dann aus den radiomarkierten Zellen durch herkömmliche Verfahren hergestellt und dann in einem nicht-ionischen Detergenz solubilisiert. Auf dieser Stufe kann das Vorhandensein von zusammengebautem Trimerkomplex durch immunobiochemische Verfahren (z. B. durch Immunfällung) bestätigt werden. Antikörper, die gegenüber Komponenten des trimeren Komplexes reaktiv sind, die für diese Bestätigung geeignet sind, sind erhältlich von ATCC und aus kommerziellen Quellen.
Der zusammengebaute Trimerkomplex, der als Bestandteil der detergenziensolubilisierten, mikrosomalen Membranpreparation vorhanden ist, wird dann mit einer Endoprotease verdaut, von der angenommen wird, dass sie eine intrazelluläre Protease ist, die in antigen-prozessierenden Zellen vorhanden ist. Bevorzugte Endoproteasen beinhalten Kathepsine B und D. Solche Enzyme sind kommerziell erhältlich und werden mit Protokollen zur Verfügung gestellt, welche die geeigneten Inkubationsbedingungen beschreiben. Verdauperioden und Enzymkonzentrationen können variiert werden, um das Spektrum der endoproteolytischen Verdauprodukte zu zeigen, das von Intermediatfragmenten bis zu den kleinsten detektierten Peptiden reicht. Die Größe der Verdauprodukte wird bestimmt, z.B. durch SDS-Gel Elektrophorese (z.B. in einem polyacrylamidelektrophoretischen Medium). Durch Korrelieren von Bandenmustern mit der Verdauzeit ist es möglich, die Sequenzmuster der Abspaltung von dem I_i-Molekül durch die jeweiligen Proteasen zu detektieren.
Die Größen der auf diese An bestimmten Peptidfragmente werden dann verglichen mit Fragmentgrößen, die durch Verdau von Wildtyp-I_i mit den Endoproteasen erzeugt werden, um zu bestimmen, ob die Abspaltung an einer zuvor existierenden Spaltungsstelle verändert wurde. Eine Spaltungsstelle, die durch diesen Vergleich gefunden wurde, stellt eine Stelle dar, die während der Freisetzung des Wildtyps-I_i aus den MHC-Klasse II-α, β-Ketten gespalten wurde.
Wie in den folgenden Beispielen beschrieben, wurden verschiedene mutierte I_i-Moleküle in der oben beschriebenen Art und Weise identifiziert. Die hierbei verwendete Nomenklatur verwendet den Einbuchstaben-Aminosäurecode. Jede auf diese Art und Weise identifizierte Mutante wird durch den Buchstaben „M" (für Mutant) bezeichnet, gefolgt durch die Information in Klammern, welche die speziellen Mutationen spezifiziert, die in der Mutante vorliegen. Zum Beispiel bedeutet M [R¹⁹ → A; R²⁰ → A] ein mutiertes I_i, bei welchem Arginin an Position 19 durch Alanin ersetzt wurde und Arginin an Position 20 durch Alanin ersetzt wurde. Andere Mutanten, die besonders identifiziert wurden, die ein Endoproteasen-Verdaumuster zeigen, das sich von dem des Wildtyps unterscheidet, sind:
M[R⁷⁸ → A; K⁸⁰ → A; K⁸³ → A; K⁸⁶ → T], M[K¹³⁷ → A; K¹⁴³ → A]; M[R¹⁵¹ → A; K¹⁵⁴ → A]; sowie M[L¹⁷⁴ → V; F¹⁷⁵ → A].
Verfahren zur Identifizierung von kleinen organischen Verbindungen, die selektiv an Intermediat im I_i-Spaltungspfad binden, sind ebenfalls beschrieben. Solche Intermediate können z. B. einen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt bei dem Abspaltungs/Freisetzungs-Peptidbeladungsprozess imitieren. Kleine organische Verbindungen, so wie hier verwendet, sind organische Verbindungen mit vorzugsweise weniger als 3 000 Molekulargewicht und bevorzugt weniger als 1 000 Molekulargewicht, die erhalten werden durch chemische Synthese oder erhalten werden als Extrakte aus biologischen Quellen. Bibliotheken für solche kleinen organischen Verbindungen, organisiert nach strukturellen Merkmalen, werden geführt und routinemäßig für solche Screeningzwecke verwendet.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung solcher kleiner organischer Verbindungen ist, einen Inhibierungs-Bindungs-Test zu entwickeln, der z. B. ein T-Zellen präsentiertes Peptid oder ein Homologes davon verwendet. Ein T-Zellen präsentiertes Peptid ist ein Peptid, von dem gezeigt wurde, dass es ein einzigartiges Epitop enthält, das von einem T-Zellen-Hybrid im Zusammenhang mit einem MHC-Klasse II-Molekül erkannt wird. Diese können erzeugt werden z.B. durch Proteasenverdau und Isolierung, oder durch chemische Synthese. So wie hier verwendet ist ein Homologes eines T-Zellen präsentierten Peptids definiert als ein Peptid mit Aminosäuresubstitutionen, Fragmenten von solchen Peptiden, oder eine kleine organische Verbindung, von der angenommen wird, dass sie strukturelle Homologität zu einem Segment des T-Zellen präsentierten Peptids enthält. Ein solcher Inhibierungs-Test wird ausgeführt durch Kombination der folgenden Komponenten in vitro 1) einem endoproteaseverdauten ersten Trimerkomplex aus einem mutierten I_i mit einem Endoproteasen-Verdaumuster, das sich von dem des Wildtyps unterscheidet und MHC-Klasse II-α, β-Ketten, 2) einem kleinen organischen Molekül, das auf Inhibierung von T-Zellen präsentierter Peptidbindung getestet wird und 3) einem T-Zellen präsentierten Peptid. In einem solchen Test kann, wenn das Binden des T-Zellen präsentierten Peptids an den endoproteaseverdauten Trimerkomplex in Gegenwart der kleinen organischen Verbindung blockiert wird, geschlossen werden, dass die kleine organische Verbindung an ein Intermediat im stufenweisen Abspaltungsprozess bindet. Indikator-Tests, wie z.B. ein ELISA-Test, können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche das Binden der Indikatorverbindung blockieren. Ein solcher Test wird ausgeführt durch Verknüpfen eines gereinigten Moleküls, das auf seine Bindungsaffinität an das T-Zellen präsentierte Peptid (oder dessen Homologes) geprüft werden soll, an einen festen Träger. Das in einer Lösung vorhandene T-Zellen präsentierte Peptid (oder sein Homologes) wird dann mit dem auf den festen Träger gebundenen Molekül unter für die Bindung geeigneten Bedingungen inkubiert. Eine solche Bindung wird bestimmt durch die Erkennung eines Indikators, der an das T-Zellen präsentierte Peptid oder sein Homologes angeheftet ist.
Die Selektivität der oben bezeichneten Bindung wird definiert relativ zur Bindung der kleinen organischen Verbindung an einen zweiten Trimerkomplex aus Wildtyp-I_i, MHC-Klasse II-α- und β-Ketten und einem Dimer aus MHC-Klasse II-α- und β-Ketten. Verbindungen, welche eine Bindungsaffinität für den endoproteaseverdauten ersten Trimerkomplex zeigen, die zumindestens etwa dreifach höher ist als die Bindungsaffinität für einen zweiten Trimerkomplex aus Wildtyp-I_i, MHC-Klasse II-α- und β-Ketten und einem Dimer aus MHC-Klasse II-α- und β-Ketten, erfüllen das Selektivitätserfordernis des vorliegenden Verfahrens. Bindungsaffinitätsbestimmungen können unter Verwendung einer Vielzahl von wohlbekannten Techniken (z. B. ELISA) gemacht werden.
Die Bestimmung der Bindungsaffinität wird separat für jeden der folgenden Komplexe ausgeführt: 1) proteaseverdauter erster Trimerkomplex, zweiter Trimerkomplex (enthaltend Wildtyp-I_i) und MHC-Klasse II-α- und β-Ketten. mutiertes I_i enthaltende Komplexe, welche die erforderliche Selektivität zeigen, werden identifiziert. Solche Mutanten werden dann in einem ähnlichen Inhibierungsbindungstest verwendet. Insbesondere wird im Fall eines ELISA-Inhibierungsbindungstest der mutierte Komplex an einen festen Träger fixiert, gefolgt von Inkubation mit einem ausgewählten kleinen organischen Molekül. Die Konzentration des kleinen organischen Moleküls kann empirisch bestimmt werden. Das Ziel dieses Screeningschrittes ist, ein kleines organisches Molekül zu identifizieren, das an den mutierten I_i enthaltenden Komplex bindet und dabei die Bindung des T-Zellen präsentierten Peptids (oder seines Homologen) an den mutierten I_i enthaltenden Komplex inhibiert.
Kleine organische Verbindungen, die bei dem oben beschriebenen Bindungsinhibierungstest identifiziert werden, können auf immunmodulatorische Aktivität gettestet werden. Eine Vielzahl von Tests (sowohl in vivo als auch in vitro), die für diesen Zweck verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt. Ein Beispiel für einen solchen Test beinhaltet die Analyse der Modulation der Präsentation eines immunogenen Peptids durch eine Antigen präsentierende Zelle auf einen Antwort-T-Lymphozyten. Insbesondere wird eine kleine organische Verbindung, die auf immunmodulatorische Aktivität getestet werden soll, mit einer Zellkultur in Kontakt gebracht, die ein bekanntes T-Zellen immunogenes Peptid enthält, seine einschränkendes Antigen präsentierende Zelle, sowie T-Zellen, die spezifisch auf das immunogene Peptid im Zusammenhang mit der Antigen präsentierenden Zelle antworten. In Abwesenheit einer inhibierenden Verbindung wird die Kombination der angegebenen Komponenten in einer T-Zellenstimulation resultieren. T-Zellenstimulation kann z.B. bestimmt werden durch Messung der Interleukin-Freisetzung aus einer T-Zelle. Falls jedoch die kleine organische Verbindung einen immunmodulatorischen Effekt hat, wird der Basalwert der T-Zellenstimulation ohne den Inhibitor messbar verändert. Messbar verändert, so wie hier verwendet, bedeutet eine Änderung von mehr als einer Standardabweichung im gemessenen Wert der T-Zellenaktivierung in der Mischung, die die kleine organische Verbindung enthält, relativ zu dem Wert der T-Zellenaktivierung in der Kontrollprobe, die das kleine organische Molekül nicht enthält.
Die Identifizierung von immunomodulatorischen Peptiden ist ebenfalls hierin beschrieben. Hypothetisch angenommen, dass I_i-Freisetzung aus MHC-Klasse II-Molekülen als stufenweiser Prozess auftritt, mit der Insertion eines immunogenen Peptids in die Antigenbindungsstelle eines MHC-Klasse II-Komplexes, ist es sinnvoll vorzuschlagen, dass Peptide von I_i an ausgewählte Orte in den Intermediatkomplexen binden und dabei den Prozess der Antigenpräsentation modulieren. Um diese Hypothese zu testen, werden I_i-Peptide und ihre Homologen mit einem Antigen präsentierenden Test des oben genannten Typs in Kontakt gebracht, um die immunomodulatorische Aktivität zu bestimmen.
Unter Verwendung eines Tests von diesem Typ wurden Peptide von I_i, die immunomodulatorische Aktivität haben, identifiziert. Sowohl Verstärker als auch Inhibitoren für Antigenpräsentation wurden identifiziert. Zum Beispiel beinhalten Peptide, welche die Antigenpräsentation erhöhen [Tyr-I_i (78-92), (YRMKLPKPPKPVSKMR) (Seq.-Id. Nr. 1)] und [I_i (148-164), (ENLRHLKNTMETLDWKV) (Seq.-Id. Nr. 2)] und Peptide, welche Antigenpräsentation inhibieren, beinhalten [LYELQYKLQTLKJ. Es wird bemerkt, dass Sette et al., ((1992) Science 258: 1801–1804) über ein Peptid I; berichtet haben, das einen inhibitorischen Effekt auf die Bindung eines T-Zellen präsentierten Peptids hat. Jedoch wurde die Offenbarung eines I_i-Peptids, das die Antigenpräsentation erhöht, bisher in der Literatur nicht veröffentlicht. Es ist wahrscheinlich, dass ein Fachmann ein Homologes von [Tyr-I_i (78-92), (YRMKLPKPPKPVSKMR)] (Seq.-Id. Nr. 1) erhalten kann, das die Antigenpräsentation durch systematische Ersetzung von Aminosäureresten verhindert, welche das Binden von MHC-Klasse II-α- und β-Ketten beibehalten, aber nicht die Funktion erlauben, die mit der Erhöhung der Antigenpräsentation verknüpft ist.
Die Offenbarung hier hat Auswirkungen in Bezug auf die Behandlung von Autoimmunerkrankung. Die Entwicklung von therapeutischen Arzneien, um MHC-Klasse II-α, β-vermittelte Antigenpräsentation auf T-Zellen zu blockieren, kann stark verbessert werden durch die Verwendung von solchen Übergangskomplexhomologen, die durch diese mutierten I_i-Moleküle zur Verfügung gestellt werden, bei denen das Fortschreiten zu einem nachfolgenden Schritt blockiert ist, z. B. wenn eine strukturelle Änderung in den Klasse II-α, β-Ketten die antigenen Peptide an den Antigen-Bindungsstellen befestigt.
Die MHC-Klasse II-vermittelte Präsentation von endogenen autoantigenen Determinanten durch gewisse Zellen mit MHC-Klasse II-α, β-Ketten werden durch einen relativen oder absoluten Mangel an I_i induziert. Während die meisten Modelle für die MHC-Klasse II-vermittelte Präsentation von Antigen das Internalisieren und Verdauen des exogenen Antigens beinhalten, das an die MHC-Klasse II-α-, β-Ketten in einem post-Golgi/endosomalen Kompartiment gebunden wird, werden Antigene, die endogen durch antigen-präsentierende Zellen synthetisiert werden, ebenfalls präsentiert. Fragmente von solchen Antigenen, die in das endoplasmatische Reticulum transportiert werden, um an die MHC-Klasse I-Moleküle zu binden, sind normalerweise nicht an die MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden, da das I_i-Molekül die Insertion in die Antigen-Bindungsstelle während des Transports und des Verarbeitens der Klasse II-Moleküle verhindert. In gewissen Zellen, z. B. pankreatischen β-Zellen, kann unter gewissen pathologischen Bedingungen MHC-Klasse II-α, β-Kette mit einem absoluten oder relativen Verlust von I_i induziert werden. Die endogenen Peptide, die andernfalls für die Bindung an Klasse I-MHC-Moleküle gedacht sind, können dann ebenfalls and die MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden werden und anschließend den T-Zellen präsentiert werden, wobei eine Autoimmunantwort induziert wird.
Die Präsentation von endogenem Antigen unter solchen unnormalen pathologischen Bedingungen kann durch Ersetzen der Funktion von I_i mit Proteinen verhindert werden, die aus mutierten I_i-Genen erzeugt werden, oder durch Peptidfragmente oder Verbindungen, die mit Screens identifiziert wurden, unter Verwendung von solchen Strukturen, oder aus solchen Strukturen entwickelt.
Zum Beispiel kann diese Bedingung in solchen Zellen durch die Expression von I_i-Mutanten korrigiert werden, die nicht vollständig gespalten sind, sondern an die Klasse II-MHC-α, β-Ketten gebunden bleiben, z. B. M[R⁷⁸ → A; K⁸⁰ → A; K⁸³ → A; K⁸⁶ → T] und die das Beladen von Peptid oder die Präsentation des beladenen Peptids an der Zelloberfläche für die T-Zellen nicht erlauben (oder inhibieren). Ohne auf die Theorie festgelegt zu sein werden gebundene Wildtyp-I_i oder I_i-Mutanten, die wegen der Charakteristik des Zurückhaltens der MHC-Klasse II-α, β-Ketten ausgewählt wurden, in einer Zelle exprimiert, die dazu vorgesehen ist, Autoantigene zu präsentieren, um die Bindung von Peptiden an die MHC-Klasse II-α, β-Ketten während ihres Transports und Prozessierens an anderer Stelle als in dem post-Golgi/endosomalen Kompartiment zu blockieren, an welcher erwartet wird, dass das Binden des Antigens unter normalen physiologischen Bedingungen auftritt. Im Fall von pankreatischen β-Zellen wird das Gen für den Wildtyp-I_i oder eine ausgewählte I_i-Mutante unter der Kontrolle des Promotors für Insulin unter Verwendung von bewährten molekularbiologischen Techniken exprimiert, um jenes Konstrukt zu erzeugen. Das Insulinpromotor-I_i-Gen-Konstrukt wird durch transgene oder ähnliche Verfahren insertiert. Optimale Bedingungen für die Verbesserung dieses Verfahrens, um die MHC-Klasse II-Präsentation von Autoantigenen zu blockieren, werden im nicht fettleibigen diabetischen Mäuse-Modell eingesetzt und dann auf menschliche Subjekte für die Behandlung von Diabetes Mellitus oder andere Autoimmunerkrankungen angewendet.
BEISPIELE
Beispiel 1: Peptidbindung während I_i-Freisetzung durch Kathepsin B
Die Wirksamkeit der Peptidbindung wird während der Kathepsin B-vermittelten Freisetzung von I_i aus solubilisierten MHC-Klasse II-α, β-, I_i- Komplexen untersucht. Verdau mit unterschiedlichen Konzentrationen von Kathepsin B bei pH 5,0 [A: kein Enzym (nur Peptid), B: Kathepsin B (0,1 U/ml), C: Kathepsin B (0,5 U/ml), D: Kathepsin B (2,5 U/ml)] für 5, 15, 30 oder 60 Minuten bei Raumtemperatur oder 37°C werden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimidazidobenzoyl (HSAB)-gekennzeichnetem, ¹²⁵J-radiogekennzeichnetem Influenzavirus MA (18-29)-Peptid, das anschließend vernetzt wird, wo es gebunden wurde, ausgeführt. Dieses auf HLA-DR1-beschränkte, T-Zellen präsentierte Peptid wird mit der DR-1-positiven Jesthom Zelllinie getestet. Das radiojodierte Peptid (100 nM) wird zu den solubilisierten mikrosomalen Membranproteinen der Jesthom-Zellen zusammen mit Kathepsin B, das I_i abspaltet, für verschiedene Zeitdauern zugegeben. Nach jeder Inkubation wird das Enzym durch 1:1-Verdünnung mit 10 mM Tris, pH 9,0, enthaltend 2 mM PMSF, 10 mM N-Ethylmaleimidsäure und 1 mM Jodacetamid inaktiviert. Die Peptide werden dann zu den α, β-Ketten nach Ultraviolettlicht-Aktivierung der Azidogruppe vernetzt. Die vernetzten Peptide werden nach 5 Minuten Verdau mit progressiver Erhöhung der Werte für an die MHC-Klasse II-α, β-Ketten vernetztes Peptid bestimmt. Zu vergleichbaren Zeitpunkten und Temperaturen bindet etwa 10 Mal so viel Peptid mit 0,05 U/ml Kathepsin B als mit Peptid allein ohne Enzym. Die Peptidbindung erhöht sich proportional mit der Menge an Enzym, der Dauer der Inkubation und der Temperatur der Inkubation.
Beispiel 2: Zugabe von Peptid nach Inaktivierung von Kathepsin B
Peptidbindung wird ohne Kathepsin B-Behandlung nicht festgestellt und es werden sehr viel größere Mengen an Peptid gebunden, wenn während der I_i-Proteolyse Peptid anwesend ist. Die Bindung von Peptid an MHC-Klasse II-α, β-I_i-Trimere wird verglichen mit der Bindung von MHC-Klasse II-α, β-Dimeren, aus welchen I_i mit Kathepsin B freigesetzt wurde. Detergentiensolubilisierte mikrosomale Membranen, enthaltend MHC-Klasse II-α, β-I_i-Trimer, werden mit Kathepsin B inkubiert (0, 0,1, 0,5, 2,5 U/ml) und zwar für 30 Minuten, pH 5,0 bei Raumtemperatur, in Gegenwart von ¹²⁵J-markiertem HSAB-MA (18-29)-Peptid (100 nM). Nach dieser Inkubierung wird das Peptid durch Photoaktivierung dort vernetzt, wo es gebunden ist, und Proben werden mit Anti-Klasse-II-mAb, das einem SDS-PAGE unterzogen wird, immunpräzipitiert und die getrockneten Gele werden autoradiographiert. Wechselweise wird nach 30 Minuten Inkubation mit solubilisierten mikrosomalen Membranen das Enzym inaktiviert durch 1:1-Verdünnung mit 10 mM Tris, pH 9,5, enthaltend 2 mM Phenylmethylsulfon, 10 mM N-Ethylmaleimid und 1 mM Jodacetamid. ¹²⁵J-markiertes HSAB-MA (18-29) wird für weitere 30 Minuten zugegeben und zur Peptidvernetzung photoaktiviert. Immunpräzipitationen dieser Proben mit Anti-MHC-Klasse II-Antikörper werden wie oben durchgeführt. Das Peptid wird etwa 3 Mal wirksamer an MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden, wenn es während dem Kathepsin B-Verdau anwesend ist, als wenn es danach zugegeben wird, beurteilt durch Densitometrie der Autoradiographen aus den Verdäuen mit 0,5 U/ml oder 2,5 U/ml Kathepsin B. Das Peptid bindet nicht an MHC-Klasse II-α, β-I_i-Komplexe, die nicht mit Kathepsin B behandelt sind.
Beispiel 3: Peptidbindung während I_i-Freisetzung durch Kathepsin D
Die Peptidbindung wird durch Kathepsin D während der I_i-Abspaltung nicht erhöht. Detergentiensolubilisierte mikrosomale Membranen, enthaltend MHC-Klasse II-α, β-I_i-Trimer, werden mit verschiedenen Mengen Kathepsin D 30 Minuten in Gegenwart von ¹²⁵J-markiertem HSAB-MA (18-29)-Peptid (100 nM) inkubiert, vernetzt und wie oben verarbeitet. Unter einem weiten Konzentrationsbereich von Kathepsin D, das I_i abspaltet, aber nicht sofort zur vollständigen Dissoziation seiner Fragmente aus den MHC-Klasse II-α, β-Ketten führt (Reyes, V. E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877–3880), wird keine erhöhte Bindung des radiojodierten MA (18-29)-Peptids beobachtet.
Die Entdeckung, dass Peptidbindung an MHC-Klasse II-α, β-Ketten durch die Gegenwart von Peptid während Kathepsin B- (aber nicht Kathepsin D-) Behandlung erhöht wird, führt zu dem Schluss, dass Abspaltung und Freisetzung dieser Fragmente einen konzertierten Prozess darstellt mit Beladen der MHC-Klasse II-Moleküle mit antigenen Peptiden.
Beispiel 4: Konkurrenz um die Peptidbindung
Die Spezifität von (¹²⁵J)MA(18-29)-Bindung an MHC-Klasse II-Moleküle von HLA-DR1⁺Jesthom, menschliche B-Lymphoplastoidzellen, wird untersucht im Wettbewerb mit: MA(18-29)-Peptid, auf HLA-DR1 beschränktem Influenza HA(306-318), auf HLA-DP beschränktem Dengue-Virus NS3 (251-265), und auf HLA-B37 beschränktem Influenzavirus NP (336-356). Diese Peptide und ¹²⁵J-markiertes HSAB-MA (18-29)-Peptid (100 nM) werden 30 Minuten mit detergentiensolubilisierten mikrosomalen Membranen, enthaltend MHC-Klasse II-α, β-, I_i-Trimer, in Gegenwart von 0,5 U/ml Kathepsin B inkubiert, zur Vernetzung photoaktiviert und mit anti-MHC-Klasse II-Antikörper immunpräzipitiert und wie oben verarbeitet. Wettbewerb für die Bindung wird lediglich festgestellt mit den HLA-DR1-beschränkten Peptiden, d.h. Peptiden, für die von anderen gezeigt wurde, dass sie durch T-Lymphozyten nach Bindung mit menschlichen MHC-Klasse II-HLA-DR1-Molekülen erkannt werden. D.h., die Bindung von [¹²⁵J]-HSAB-MA (18-29) (10^-7 M) an MHC-Klasse II-Moleküle steht in Wettbewerb mit kaltem HSAB-konjugiertem MA(18–29) und mit Influenzavirus HA(306-318), aber nicht mit Influenzavirus NP(336-356) und Dengue-Virus NS3 (251-265).
Beispiel 5: Weitere Erhöhung des Kathepsin B-vermittelten Peptid-Bindungseffekts durch Zugabe von Kathepsin D.
Die geringste Menge an Kathepsin D, für die eine Abspaltung von I_i beobachtet werden konnte, ist 0,1 U/ml. Solubilisierte mikrosomale Membranproteine aus [³⁵S] methioninmarkierten Jesthom-Zellen werden mit dem Kathepsin D (Konzentrationen 0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 10,0 U/ml) bei pH 5,0 30 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Am Ende der Inkubation wird das Enzym inaktiviert und immunpräzipitiert mit Anti-Klasse II-mAb, IVA12 oder mit Anti-I_i-mAb wird VIC-Y1 gebildet. Die immunpräzipitierten Proben werden durch SDS-PAGE analysiert und autoradiographiert. In einem zweiten Experiment, wenn der niedrigste Gehalt an Kathepsin D (0,1 U/ml), von dem beobachtet wurde, dass er I_i spaltet, zu dem Test für Peptidbindung in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen Kathepsin B (0,02 – 0,5 U/ml) zugegeben wird, wird die Nettomenge der Peptidbindung etwa 3 × erhöht gegenüber dem, was ohne Kathepsin D beobachtet werden konnte, beurteilt durch Densitometrie der Autoradiographen. Für dieses Experiment werden jodiertes HSAB-MA (18-29)-Peptid und nicht-radiomarkierte mikrosomale Membranen mit oder ohne 0,1 U/ml Kathepsin D 10 Minuten oder 30 Minuten lang in Gegenwart von verschiedenen Mengen Kathepsin B (0,02, 0,1 oder 0,5 U/ml) inkubiert. Nach anschließender Fotoaktivierung und Immunpräzipitation mit Anti-Klasse II-mAb werden die Proben SDS-PAGE und Autoradiographie unterzogen.
Beispiel 6: Identifizierung von I_i-Spaltungsstellen durch Analyse der Primärsequenz von I_i in zu berechnende anscheinende sekundäre Strukturelemente und Abspaltungsmotive für Kathepsine B und D.
Vermutliche Spaltungsstellen in der Sequenz von I_i werden für die stufenweise Spaltung und Freisetzung von I_i durch Kathepsin D und Kathepsin B vorgeschlagen, um die Hypothese zu untersuchen, dass fremde Peptidbeladung der MHC-Klasse II-α, β-Ketten-Antigen-Bindungsstelle ein konkurrierender Prozess mit der Spaltung und Freisetzung von I_i ist. Da Kathepsin B und Kathepsin D I_i aus MHC-Klasse II-α, β-Ketten mit einer Serie von I_i-Fragmenten spalten, die für jedes Enzym einzigartig ist (Reyes, V.E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877–3880), hat I_i Spaltungsstellen, die für jedes Enzym spezifisch sind. Kathepsin B-Spaltung an hydrophob-kationischen Stellen und Kathepsin D-Spaltung an hydrophob-hydrophoben Stellen kann vorgeschlagen werden (Tabelle I). Tabelle I Potentielle Kathepsin B und Kathepsin D-Abspaltungsstellen in I_i
In Tabelle I sind Kathepsin B-Stellen durch\oberhalb der Sequenz und Kathepsin D-Stellen durch/unterhalb der Sequenz markiert. In jedem Fall wird angenommen, dass die Spaltung auf der Carbonylseite des angegebenen Restes auftritt. Der transmembrane Bereich Gly³¹-Gln⁵⁷, der hexa-kationische Tetraprolyl-Knick Leu⁷⁷-Met⁹³ und die α-Helix Phe¹⁴⁶-Val¹⁶⁴ sind unterstrichen.
Spaltung kann auch auf lokale I_i-Strukturen beschränkt sein (Tabelle I), einschließlich: die transmembrane Helix A³²-L⁵⁵, ein Tetraprolyl-Palindrom (L⁸¹-M⁹³) mit den potentiellen Kathepsin B-Spaltungsstellen LR⁷⁸, MK⁸⁰, PK⁸³, PK⁸⁶, VSK⁹⁰, MR⁹², eine zweite Tetraprolyl-Region P⁹⁶-P¹¹¹, eine amphipathische Helix F¹⁴⁶-V¹⁶⁴ mit potentiellen Kathepsin B-Spaltungsstellen LK¹³⁷, LK¹⁴³ LR¹⁵¹, LK¹⁵⁴, WK¹⁶³, VK¹⁶⁵, sowie ein C-terminales Ende mit der potentiellen Kathepsin D-Spaltungsstelle LLF¹⁷ ⁵. Um die Funktionen dieser vermutlichen Spaltungsstellen zuzuordnen, wurden die folgenden I_i-Genmutationen erzeugt: [R⁷⁸→ A, K⁸⁰ → A, K⁸⁶ → T], [K¹³⁷ → A, K¹⁴³ → A], [R¹⁵¹ → A, K¹⁵⁴ → A] und [L¹⁷⁴ → V, F¹⁷⁵ → A]. Die Kathepsin B- und Kathepsin D-Spaltungsmuster der Proteinprodukte in den COS1-Zellen, die mit mutierten I_i- und Wildtyp-HLA-DR-α-und β-Genen transfiziert werden, zeigen abgestufte Spaltung von I_i durch Kathepsin D und Kathepsin B. Man kann annehmen, dass wenn Kathepsin D zuerst bei LLF¹⁷ ⁵ spaltet, Kathepsin B-Spaltung bei LK¹³⁷ und LK¹⁴³ dann die vermutliche Helix Phe¹⁴⁶-Leu¹⁶⁴ freisetzen kann, gefolgt von Peptidinsertion in die Antigen-Bindungsstelle. Diese Helix wird schnell durch Kathepsin B-Verdau an den sechs LR- oder LK-Positionen in und um die Helix herum zerstört. Endgültige Spaltung in das kurze Tetraprolyl-Palindrom L⁸¹-M⁹³ an einer oder mehr der sechs LK- oder LR-Stellen kann zu der Erzeugung von kleinen I_i-Fragmenten führen, die mit den α, β-Ketten assoziiert bleiben. MA (18–29) kann auf der Stufe der Kathepsin B-Spaltung bei LK¹³⁷ und LK¹⁴³ oder der Kathepsin B-Spaltung bei dem Tetraprolyl-Palindrom LK¹³⁷-M⁹³ die MHC-Klasse II-α, β-Ketten binden. Weitere funktionelle Studien mit diesen verwandten I_i-Mutanten werden den Mechanismus der Peptidinsertion in die MHC-Klasse II-Antigen-Bindungsstelle auflösen und zu Tests für die Auswahl von allel-nicht-spezifischen, immununterdrückenden Mitteln führen.
Mutationen werden in dem I_i-Gen erzeugt, die zu einer vermutlichen Kathepsin D-Stelle korrespondieren und es werden drei Cluster aus vermutlichen Kathepsin B-Stellen erzeugt. Eine Mutation wird auch an der cytoplasmatischen dibasischen Stelle R¹⁹R²⁰ gemacht. Vier strategische Prinzipien werden verwendet, um die Mutanten zu entwickeln. (1) Vermutliche Spaltungsstellen sollen zu den Fragmenten führen, die experimentell nach dem Kathepsin B- oder Kathepsin D-Verdau gefunden werden. Zum Beispiel können Spaltungen bei K¹³⁷ oder K¹⁴³ das Fragment erzeugen, da Kathepsin B ein N-terminates 21 kDa-Fragment von I_i erzeugt (Reyes, V.E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877–3880). (2) Proteasespezifische Spaltungsmotive werden identifiziert. Von Kathepsin B wird vermutet, dass es die unübliche Abfolge von geclusterten LK- und LR-Resten angreift und von Kathepsin D wird berichtet, dass es gepaarte hydrophobe Reste bevorzugt, außer wenn das C-terminale Ende eines ist aus Val, Gly oder Ala (Bond, J.S., 1989, Commercially available Proteases. In: Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, herausgegeben von R. J. Beynon, et al., Seite 232, IRL Press, New York). (3) Die Tatsache, dass sowohl p21 als auch natürlich auftretende I_i-Verdauprodukte, zum Beispiel L⁹⁷-G¹¹⁹, an MHC-Klasse II-α, β-Ketten binden (Chicz, R.M, et al., 1992, Nature, 358: 764–768), führt zu dem Vorschlag, dass Spaltungsstellen, die p21 und p25 erzeugen, C-terminal zu diesem Bereich sind. (4) Es wird angenommen, dass lokale I_i-Strukturen mit Clustern von vermutlichen Kathepsin B-Spaltungsstellen (Tabelle I) zu einem Modell für die stufenweise Spaltung und Freisetzung von I_i durch Kathepsin B und Kathepsin D führen.
Beispiel 7: Expression von Wildtyp- und mutierten I_i-Ketten mit oder ohne HLA-DR-α, β-Ketten in COS1-Zellen.
Die mutierten I_i-Gene, die mit den Oligonucleotiden aus Tabelle II hergestellt werden, werden mit HLA-DRI-α- und β- Genen in COS1-Zellen nach Einbringen in ein RSV.S (Neo)-Plasmid, in welche menschliche HLA-DR1-α, β-Gene (RSV-5 (Neo)-DRa120 und RSV.5 (gpt)-DRβ008) kloniert wurden, transfiziert und durch Rous-Sarcoma-Virus (RSV) lang-terminale Wiederholungs-Sequenzen (LTR) (Long et al., 1991) angetrieben. Das I_i-Gen (45 1-p33-143) (Sekaly et al., 1986) wird für das Erzeugen der I_i-Mutationen verwendet.
Die mutierten und WT-I_i-Gene werden in einen RSV.5 (Hygromycin)-Vektor kloniert. Alle diese Gene und der Klonierungs-Vektor sind ein Geschenk von Dr. Eric Long von NIH. Die HLA-DR1-α- und β-Gene werden zu einem Plasmid durch Verdau von RSV.5 (Neo)-DRIα 120 mit Nde 1 wieder aufgebaut, um das Plasmid zu linearisieren und von RSV.5 (gpt) DR1β 008 mit Nde 1 und Bgl II, um das DR1β-Gen frei zu setzen. Linearisiertes RSV.5 (neo) DR1α 120-Plasmid wird mit Kalbsdarmphosphatase behandelt und an das gereinigte DR1β-Genfragment gebunden. Das Produkt wird mit T4 DNA- Polymerase behandelt, um die nicht-passenden Enden aufzufüllen und zu religieren.
Ortsgerichtete Mutagenese wird durch das Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Verfahren gemäß Ho et al., (1989) ausgeführt unter Verwendung der Oligodeoxynucleotide aus Tabelle II. PCRs werden ausgeführt unter Verwendung von Taq-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT). Ein Oligodeoxynucleotid (Oligo A), korrespondierend zu der RSV.5-Vektorsequenz an der Sal 1-Stelle wird synthetisiert, um in 3'-Richtung während der PCR zu polymerisieren und ein zweites DNA-Oligodeoxynucleotid (Oligo B), korrespondierend zu der Sequenz des 3'-nicht-übersetzten Bereiches des I_i-Gens von Nucleotid 26 bis Nucleotid 43 3', um den Codon zu stoppen (Strubin et al., 1984), wird synthetisiert, um in einer 5'-Richtung während der PCR zu polymerisieren. Sal 1- bzw. BamH 1-Stellen werden in diesen beiden Oligodeoxynucleotiden für Klonungszwecke erzeugt. Andere Oligodeoxynucleotide werden entsprechend den Sequenzen synthetisiert, an denen die Mutationen gemacht werden sollen (Tabelle 1). PCR-Reaktionen werden in 50 μl Volumina ausgeführt, enthaltend: 50 mM KCl, 10 mM Tris-NaCl, pH 8,3, 4 nM MgCl₂, 100 μM von jedem dNTP, 200 ng von jedem Oligonucleotid, sowie 2,5 Einheiten Taq-Polymerase. Diese Proben werden mit 50 μl Mineralöl überschichtet. PCR-Reaktionen werden ausgeführt unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus), der wie folgt programmiert ist: ein Zyklus der Denaturierung (94°C, 2 Min.), tempern (Temperatur wird berechnet gemäß Ho et al., 2 Min.), Verlängerung (72°C, 2 Min.). Weitere 30 Zyklen der Amplifikation werden unter den Bedingungen des ersten Zykluses folgen lassen, mit der Ausnahme, dass 94°C auf 1 Minute gesetzt wird. Mutagenese wird in zwei Schritten ausgeführt: Amplifikation von DNA- Fragmenten aus dem Plasmid-Templat und Überlappungsvergrößerung von angrenzenden DNA-Fragmenten, die in einem niedrig schmelzenden Gel gereinigt werden. Eine zweite Runde PCR-Produkte wird mit Sal 1 und BamH 1 verdaut und an einen RSV.5-Vektor ligiert, der ein Hygromycin-Resistenzgen enthält (Long et al., 1991) und mit Sal 1 und BamH 1 verdaut. Alle molekularebiologischen Techniken werden gemäß Sambrook et al., (1989) ausgeführt und die Mutationen werden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Tabelle II. Oligonucleotide, die bei der Herstellung von I_i-Mutanten verwendet werden
COS1-Zellen wurden erhalten von Dr. P. Newberger von der Universität des Massachusetts Medical Center (Worcester, MA). Die Zellen werden in RPMI-1640-Medium kultiviert, ergänzt mit 2% fötalem Kalbsserum und 8% Rinderkalbsserum (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) in 10 cm Gewebekulturschalen (Falcon, Lincoln, Parker) bei 37°C in einer 5%-igen CO₂ Atmosphäre. COS1-Zellen exprimieren I_i nicht, wie durch Immunpräzipitationen entweder VIC-Y1- oder E1-Antikörpern untersucht wurde. VIC-Y1 erkennt alle I_i-Moleküle, während E1 lediglich hochmannose Formen von I_i erkennt. VIC-Y1 mAb gegen eine N-terminalen I_i-Determinante (Quaranta et al., 1984) ist das Geschenk von Dr. Walter Knapp in An Der Grub, G.m.b.H. (Kaumberg, Österreich). E1 anti-humanes I_i(183–193)-Serum wurde zuvor hergestellt (Thomas et al., 1988). IVA12 mAb gegen menschliche MHC-Klasse II-Moleküle wird hergestellt als Asciten aus dem Hybridoma HB 145 von der ATCC.
Gen-Transfektion wird durch Elektroporation gemäß Xu and Stavnezer (1992) ausgeführt. COS1-Zellen werden 24 Stunden wachsen lassen, mit Trypsin-EDTA (GIBCO, BRL) freigesetzt, zweimal mit erwärmtem RPMI-1640-Medium ohne Serum gewaschen und in RPMI-1640-Medium ohne Serum zu 6 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Transfektionen werden ausgeführt bei 250 V/1200 μF/ml Volumen mit einem PG200 Progenitor II Elektroporator (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Jedes Plasmid wird zu 24 μg je 6 × 10⁶ Zellen verwendet. Nach Transfektion werden Zellen in vollständigem RPMI-1640-Medium zu 3 × 10⁶ Zellen/8 ml/Schale rekultiviert. Elektroporation bringt DNA wirksam in die COS1-Zellen hinein. 40–65% der COS1-Zellen exprimieren 45 Stunden nach Transfektion HLA-DR1-Moleküle an der Zelloberfläche, bestimmt durch Immunfluorescenzfärbung.
45 Stunden nach Transfektion werden Zellen 3 Stunden lang mit [³⁵S]-Methionin (Sambrook et al., 1989) markiert. Nach Abgießen des Mediums werden die Schalen zweimal mit 10 ml erwärmtem, methionin-freiem, serum-freiem RPMI-1640-Medium gewaschen und 1,5 ml erwärmtes, methionin-freies RPMI-1640-Medium, enthaltend 2% FKS und 8% BKS (beides dialysiert) wird zugegeben. Die Schalen werden 20 Minuten bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Zu jeder Schale werden 0,15 mCi [³⁵S]-Methionin (NEN, MA) zugegeben, gefolgt von Inkubierung für 3 Stunden mit Schütteln der Schalen alle 20 Minuten. Nach 3 Stunden werden die Schalen zweimal mit gekühltem PBS gewaschen und dann 1 ml Lysispuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, sowie 0,5% Triton-X100) zugegeben. Die Schalen werden 20 Minuten lang auf Eis gehalten und die Zellen aus der Schale gekratzt und in ein Röhrchen überführt. Nach Vortexen für eine Minute werden die Lysate in einer Mikrozentrifuge bei 4°C 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden in einem zweiten Röhrchen gesammelt und mit formalinisiertem Staphylococcus Aureus Cowen-Stamm A (Chemicon, E1 Segundo, CA) und mit gebrauchten Immunfällungen geklärt. Immunadsorbantien werden hergestellt durch Inkubieren von 100 μl Protein A-Sepharose (Sigma) mit entweder 1 μl IVA12 mAb, 1 μl VIC-Y1 mAb, oder 25 μl E1-Antiserum. Die Immunadsorbantien werden 5 Mal mit Puffer gewaschen (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% Triton-X100 und 0,02% NaN₃) und mit SDS-Proben-Puffer eluiert. Die Proben werden durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert (Reyes et al., 1991).
Fünfundvierzig Stunden nach Transfektion mit Genen für mutierte und Wildtyp- I_i-Ketten ohne HLA-DR-α, β-Gene werden die COS1-Zellen 3 Stunden lang mit [³⁵S]-Methionin markiert, mit E1-Anti-I_i (183-193)-Serum Immunpräzipitationen gebildet und mit Endoglycosidase H verdaut. Die Proben werden durch SDS-PAGE und Autoradiographie untersucht. Die fünf I_i-mutierten Proteine werden ebenso stark exprimiert wie das Wildtyp-I_i. Da die I_i-Ketten empfindlich auf Endoglycosidase H-Behandlung sind, enthalten sie hochmannose Polysaccharidketten. Sie werden vermutlich im rauen endoplasmatischen Reticulum ohne weitere Verarbeitung von Kohlenhydratseitenketten abgesondert, nachdem Marks et al., (1990, J. Cell Biol., 111:839–855) zeigten, dass I_i im rauen endoplasmatischen Reticulum ohne Sialylierung und mit Endoglycosidase-H-Sensitivität abgesondert werden kann, wenn das I_i nicht an die Klasse II-α, β-Ketten gebunden ist. Da VIC-Y1 mAb die [R¹⁹R²⁰]-Mutante nicht erkennt, während es die andere Mutante und die Wildtyp-I_i-Ketten erkennt (Daten nicht gezeigt), verändert diese Mutation vermutlich die VIC-Y1-Determinante, was somit die scheinbare Erkennungsstelle von VIC-Y1 am N-Terminus von I_i weiter definiert (Quaranta, V. et al., 1984, J. Immunol., 132: 1900–1905).
Beispiel 8: Kathepsin B-Verdäue von mutiertem und Wildtyp-I_i
Kathepsin B-Verdäue werden gemäß Reyes et al., (1991, J. Immunol., 146: 3877–3880) ausgeführt. Das Zell-Lysat von etwa 5 × 10⁵ Zellen in 150 μl wird mit 0,1 M Natriumcitrat (pH 2,5) auf pH 5,0 gebracht. Die Lysate werden mit Kathepsin B in Gegenwart von 1 mM DTT und 1 mM EDTA bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt, oder für andere Zeiten wie angegeben. Nach enzymatischem oder Kontrollverdau werden die Proben mit 10 mM Tris (pH 9,5), enthaltend 2 mM PMSF, 10 mM NEM und 1 nM Jodacetamid, auf pH 7,4 gebracht und es werden Immunpräzipitate mit IV A12-Anti-MHC-Klasse II-α, β-Ketten hergestellt, um I_i-Fragmente zu analysieren, die bereits an die MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden sind. Um I_i-Fragmente zu analysieren, die sowohl an MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden haben, als auch von diesen freigesetzt wurden, werden Immunpräzipitate unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben in 30 μl Volumina verdaut und die Reaktionen werden mit 3X SDS- Probenpuffer (1X SDS-Probenpuffer enthält: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (Gew./Volumen) Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol und 2,3% SDS) gestoppt und auf 100°C erwärmt. Die Proben werden direkt auf die elektrophoretischen Gele aufgebracht. Immunpräzipitationen mit Anti-MHC-Klasse II-mAb IVA-12 von MHC-Klasse II-α, β- und I_i-dreifach-Transfektanten zeigen, dass Wildtyp- und alle mutierten I_i-Ketten mit den Klasse II-α, β-Ketten assoziieren und annäherungsweise gleiche Mengen trimerer Komplexe bilden. Verdäue dieser Komplexe mit Kathepsin B eröffnen jedoch unterschiedliche Muster der I_i-Spaltung (Tabelle III). Alle Mutanten mit Ausnahme von [R¹⁵¹K¹⁵⁴] haben reduzierte Mengen oder Abwesenheit von gewissen Fragmenten, die bei dem Kathepsin B-Verdau von Wildtyp-I_i auftreten. Die prinzipiellen Wildtypformen von I_i, die bei Verdau des Wildtyp-I_i gefunden werden, sind p21, p14, p10 und p6. Im Gegensatz zu dem Wildtyp-I_i-Verdaumuster hat Mutante [L¹⁷⁴F¹⁷⁵] eine Spurenmenge von p21 und Mutante [R⁷⁸K⁸⁰K⁸³K⁸⁶] erzeugt kein p14, p10 und p6. Auch haben die Mutanten [R¹⁹R²⁰] und [K¹³⁷K¹⁴³] schwache p21 Banden, die etwa ein Zehntel so stark sind wie die Wildtyp-p21-Bande (wenn man die Muster mit 5 Einheiten Kathepsin B mit Mutant [R¹⁹R²⁰] und [K¹³⁷K¹⁴³] gegen 0,5 Einheiten Kathepsin B mit Wildtyp-I_i vergleicht).
Tabelle III. Auftreten von Fragmenten vom Wildtyp und mutierter I_i-Kette nach Verdau mit Kathepsin B.
Die Buchstaben in Klammern zeigen, wo die Mutationen gemacht wurden. Zum Beispiel werden in M[R¹⁹ → A, R² → A] die Arginine in den Positionen 19 und 20 durch Alanine ersetzt. Zur Einfachheit in dieser Offenbarung wird der Ersetzungsrest weggelassen, d. h. [R¹⁹→ A, R²⁰→ A] wird abgekürzt zu [R¹⁹R²⁰]. +/- zeigt die Bandenform des mutierten I_i, die schwächer ist als die korrespondierende von WT-I_i. Es wird nicht vorausgesetzt, dass Fragmente von vergleichbarer Größe aus den Verdäuen mit CB oder CD an identischen Stellen gespalten werden.
Die Verdaumuster von Wildtyp-I_i und Mutante [R⁷⁸K⁸⁰K⁸³K⁸⁶] zeigen, dass p14, p10 und p6 Abbauprodukte von p21 sind. Um den Zusammenhang zwischen diesen kleineren I_i-Fragmenten von einem zum anderen zu klären, werden die Klassen II-MHC-α, β-Kettenkomplexe mit Wildtyp- oder mutierten I_i-Ketten mit einer Serie von Kathepsin B-Konzentrationen verdaut, einschließlich der relativ hohen Dosierung von 30 U/ml. Bei dieser Kathepsin B-Dosis werden I_i und alle I_i-Fragment-Zwischenprodukte gespalten, mit Ausnahme des resistenten p6, das nach wie vor assoziiert ist mit den MHC-Klasse II-α, β-Ketten in den Immunpräzipitaten der IVA-12 mAb gegen die α, β-Ketten. Dieses Ergebnis und der Befund, dass die integrierte Dichte der durch die hohe Kathepsin B-Dosis erzeugten p6-Bande etwa die Summe der p14-, p10- und p6-Banden ist, die bei niedrigeren Kathepsin B-Verdaudosen beobachtet werden, deutet darauf hin, dass p6 ein Abbauprodukt von p14 und p10 ist.
Zuvor wurde berichtet, dass Kathepsin B und Kathepsin D I_i von MHC-Klasse II-Molekülen spalten und freisetzen, ohne offensichtliche Schädigung der α, β-Ketten (Reyes, V.E. et al., 1991, J. Immunol., 146: 3877 – 3880). Im Licht des Befundes, dass einige I_i-Mutanten die Klassen II-β-Kette vor dem Verlust von 1–2 Kilodalton schützen, wird jedoch klar, dass Entfernung von Wildtyp-I_i mit einer Spaltung der β-Kette, vermutlich bei K¹², assoziiert ist.
Beispiel 9: Kathepsin D-Verdaumuster von Wildtyp- und mutiertem I_i
CD-Verdäue werden ausgeführt gemäß Reyes et al. (1991). Das Zell-Lysat von etwa 5 × 10⁵ Zellen in 150 μl wird mit 0,1 m Natriumcitrat (pH 2,5) auf pH 5,0 gebracht. Die Lysate werden mit Kathepsin D (Sigma) in Gegenwart von 1 mM EDTA bei Raumtemperatur 1 Stunde lang oder für andere Zeiten, wie angegeben, behandelt. Nach enzymatischen oder Kontrollverdäuen werden die Proben mit 10 mM Tris (pH 9,5), enthaltend 2 mM PMSF, 10 mM NEM und 1 mM Jodacetamid auf pH 7,4 gebracht und Immunpräzipitate hergestellt, um I_i-Fragmente zu analysieren, die noch an MHC-Klasse II-α, β-Ketten gebunden sind. Um I_i-Fragmente zu analysieren, die sowohl gebunden sind an als auch freigesetzt von MHC-Klasse II-α, β-Ketten, werden Immunpräzipitate unter den gleichen Bedingungen wie oben in 30 μl Volumen verdaut und die Reaktionen werden mit 3X SDS-Probenpuffer (1X SDS-Probenpuffer enthält: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (w/v) Glyzerin, 5% 2-Mercaptoethanol und 2,3% SDS) beendet und auf 100°C erwärmt. Die Proben werden direkt auf elektrophoretische Gele aufgebracht.
Bei der Kathepsin D-Verdau von transfizierten Trimeren wird aus allen Mutanten und Wildtyp-I_i p21 produziert, ausgenommen für Mutante [L¹⁷⁴F¹⁷⁵] (Tabelle III). L¹⁷³L¹⁷⁴F¹⁷⁵ scheint daher eine Kathepsin D-Spaltstelle zu sein. In Mutante [L¹⁷⁵F¹⁷⁵] werden sogar mehr p14, p10 und p6 erzeugt, was darauf hinweist, dass wenn die L¹⁷³L¹⁷⁴F¹⁷⁵-Stelle einmal verändert ist, andere Kathepsin D-Spaltungsstellen vorherrschen und dass diese kleineren Fragmente aus p21 erhalten werden könnten. Das I_i-Fragmentierungsmuster des Kathepsin D-Verdaus verläuft allgemein parallel zu dem des Kathepsin B-Verdaus, wahrscheinlich, weil die Kathepsin D-Stellen in der Umgebung der Kathepsin B-Stellen sind. Es werden jedoch einige Unterschiede gefunden. (1) Kathepsin D-Verdau führt nicht zur vorzeitigen Freisetzung von I_i-Fragmenten. Mutanten [R⁷⁸K⁸⁰K⁸³K⁸⁶] und [K¹³⁷K¹⁴³] sind einigermaßen resistent gegenüber Kathepsin D-Verdau und haben Restmengen an p21 und erhöhtes intaktes I_i im Vergleich zu den Beobachtungen mit Kathepsin B. (2) Mit diesen letzteren beiden Mutanten wird die p21 Bande eindeutig durch Kathepsin D-Verdau gebildet, jedoch ist im Fall des Kathepsin B-Verdaus die p21 Bande mehr verschmiert.
Beispiel 10: Erhöhte Freisetzung von Kathepsin B erzeugtem p21 I_i-Fragment aus einigen I_i-Mutanten
Um zu überprüfen, ob das aus Kathepsin B erhaltene p21 von den Mutanten [R¹⁹R²⁰], [K¹³⁷K¹⁴³] und [L¹⁷⁴F¹⁷⁵] erzeugt, abgebaut oder aus HLA-DR1-α, β-Ketten dissoziiert ist, werden Klasse II-α, β-Trimere durch Immunpräzipitation mit NA-12 mAb isoliert und dann diese mit Kathepsin B verdaut und alle Produkte durch SDS-PAGE analysiert. Die Immunpräzipitate werden unter den selben Bedingungen wie in Beispiel 8 in 30 μl Volumen verdaut und die Reaktionen werden mit 3X SDS-Probenpuffer (1X SDS-Probenpuffer enthält: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (w/v) Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol und 2,3% SDS) und erwärmen auf 100°C beendet. Die Proben werden direkt auf die elektrophoretischen Gele aufgebracht.
Kathepsin B erzeugt p21 aus Mutanten [R¹⁹R²⁰] und [K¹³⁷K¹⁴³] genauso stark wie aus dem Wildtyp-I_i, was andeutet, dass p21 aus diesen zwei Mutanten hergestellt wird, dass es aber prompt aus DR1-α, β-Ketten dissoziiert wird. In Mutante [K¹³⁷K¹⁴³] kann Kathepsin B-Spaltung bei R¹⁵¹ oder K¹⁵⁴ auftreten, oder immer noch bei K¹³⁷ oder K¹⁴³, um p21 zu erzeugen. Jedoch ist die natürliche Konformation an oder in der Nähe von K¹³⁷K¹⁴³ die am meisten bevorzugte Stelle für die Kathepsin B-Spaltung, um p21 zu erzeugen, das auf den α, β-Ketten verbleibt. Wenn Kathepsin B K¹³⁷K¹⁴³ nicht zuerst spaltet, dann dissoziiert I_i von den MHC-Klasse II-α, β-Ketten ab. Mutation an R¹⁹R²⁰ führt ebenfalls zur vorzeitigen Ablösung von p21 nach Kathepsin B-Verdau. Im Falle von Mutante [L¹⁷⁴F¹⁷⁵] werden p18 und p16 anstelle von p21 erzeugt, was nahe legt, dass Mutation an der L¹⁷⁴F¹⁷⁵-Stelle dort nicht nur Kathepsin D-Spaltung verhindert, sondern auch die Kathepsin B-Spaltung bei K¹³⁷K¹⁴³. p18 und p16 werden aus den MHC-Klasse II-α, β-Ketten freigesetzt, nach dem sie erzeugt wurden. Die Muster der niedrig-molekulargewichtigen Banden in diesem Experiment sind ähnlich zu denen nach Kathepsin B-Verdau mit hoher Dosis, die lediglich p6 zeigt, mit wenig oder keinem p14 und p10. In diesen Immunpräzipitaten gibt es wahrscheinlich geringere kompetitive Hemmung durch andere Lysatproteine, was zu Mustern führt, die zum Kathepsin B-Verdau mit hoher Dosis vergleichbar sind.
Beispiel 11: Inhibierung von Antigen-Präsentation durch PH-1,0-Peptid und Erhöhung der Antigen-Präsentation durch I_i (148-164) und I_i (78-92)-Peptide
Seit der Demonstration von DeLisi und Berzofsky, dass T-Zellen-präsentierte Epitope als amphipathische Helices geknäult werden können (DeLisi, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7048–7052) wurden Theorien für die Auswahl solcher Epitope basierend auf Mechanismen solcher Motive untersucht (Margalit, H., et al., 1987, J. Immunol., 138:2213–2229, Rothbard, J.B. et al., 1988, EMBO J., 7:93–100, Stille, C.J. et al., 1987, Mol. Immunol., 24:1021–1027, Reyes, V.E. et al., 1988, Mol. Immunol., 25:867–871). Das Auffinden einer solchen „perfekten" amphipathischen Helix in I_i (146–164) führte zu der Hypothese, dass diese Helix ein Ersatzantigen ist und dazu fähig, die Peptidbindungsstelle der MHC-Klasse II-Moleküle zu blockieren (Elliott, W.L. et al., 1987, J. Immunol., 138:2949–2952, Stille, C.J. et al., 1987, Mol. Immunol., 24:1021–1027). Das synthetische Peptid PH-1,0 ist so ausgelegt, dass es I_i (146-164) strukturell in Bezug auf eine enge längs-hydrophobe strip-of-Helix imitiert. Eine Serie von Analoga zu PH-1,0 wurde ebenfalls entworfen, um die Effekte von systematischen Substitutionen von Threonin durch Leucin innerhalb der längslaufenden strip-of-Helix auf das helicale Knäulen von Peptiden gegenüber Lipidmicellen zu untersuchen (Lu, S. et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:10054–10057).
Die Wirkung von PH-1,0 auf Antigen-Präsentation wird in einem funktionellen Test untersucht. PH-1,0 blockiert die Präsentation des Taubencytochrom C (81-104)-Peptids auf spezifische E^k-eingeschränkte TPc9.1-murine T-Zell- Hybridomazellen (Tabelle IV). Der kompetitive Hemmungstest wird wie folgt ausgeführt. 5 × 10⁴ paraformaldehyd-fixierte CH27 B-Lymphomzellen (antigenpräsentierende Zellen) werden in 96 Wellplatten mit 5 × 10⁴ TPc9.1 T-Hybridomazellen (bestrahlt mit 2200 rad) 24 Stunden in Gegenwart von 6 μM (81-104) Antigenpeptid und verschiedenen Konzentrationen des PH-1,0-Peptids inkubiert. Jede Bedingung wird dreifach überprüft. Nach Inkubation wird die Antwort der T-Zellen-Hybridoma durch Messung des während den 24 Stunden Kultur ausgeschiedenen IL-2/IL-4 bestimmt. Kulturüberstände werden gesammelt und auf IL-2/IL-4-Gehalt untersucht durch die Fähigkeit, das Wachstum der IL-2/IL-4-abhängigen Zelllinie HT-2 zu unterstützen, gemessen durch Einbau von [³H]-Thymidin. Die prozentuale Inhibierung wird berechnet zu: 100 – [(CPM von T + APC + Peptid + pH–1,0/CPM von T + APC + Peptid) × 100].
Tabelle IV PH-1,0 inhibiert die auf MHC-Klasse II beschränkte Präsentation von antigenem Peptid auf T-Zellen
I_i (148-164)-(Seq.-ID Nr. 2) und I_i (78-92)-Peptide erhöhen die Antwort auf Taubencytochrom C (81-104)-Peptid durch das spezifische, E^k-eingeschränkte Murin-T-Zellen-Hybridom, TPc9.1 (Tabelle V). Die Untersuchung wird wie folgt ausgeführt. 5 × 10⁴ paraformaldehyd-fixierte CH27 B-Lymphomzellen (antigenpräsentierende Zellen) werden in 96 Wellplatten mit 5 × 10⁴ TPc9,1 T-Hybridomazellen (bestrahlt mit 2200 rad) 24 Stunden in Gegenwart von: keinem Peptid, 50 μM I_i-Peptid alleine, 6 μM Taubencytochrom C (81-104)-Peptid allein und 50 μM I_i-Peptid plus 6 μM Taubencytochrom C (81-104)-Peptid inkubiert. Jede Bedingung wird sechsfach überprüft. Nach der Inkubation wird die Antwort des T-Zellen-Hybridomas bestimmt durch Messen des während der 24 ständigen Kultur ausgeschiedenen IL-2/IL-4. Das Überstände werden gesammelt und auf den IL-2/IL-4-Gehalt untersucht durch die Fähigkeit, das Wachstum der IL-2/IL-4 abhängigen Zelllinie HT-2 zu unterstützen, gemessen durch [³H]-Thymidineinbau. Die in Tabelle V präsentierten Werte sind die für CPM × 10^-3, eingebaut in den HT-2-Indikatortest.
Tabelle V. I_i-Peptide erhöhen die auf MHC-Klasse II beschränkte Präsentation von Taubencytochrom C-Peptid (81-104) gegenüber T-Zellen
Die Erhöhung der Antworten auf Taubencytochrom C-Peptid (81-104) durch I_i (148-164) und I_i (78-92) wird als eine Funktion der Konzentration des zugegebenen I_i-Peptids (Tabelle VI) überprüft. Die Werte in der Tabelle repräsentieren die prozentuale Erhöhung der Taubencytochrom C (81-104)-peptidspezifischen, E^k-eingeschränkten Antwort des TPc9.1 Murin-T-Zellen-Hybridomas (T) auf das Peptid, dargestellt durch paraformaldehyd-fixierte CH27 B-Lymphomzellen (APC). Die Überstände aus der Kultur werden gesammelt und auf den IL-2/IL-4-Gehalt untersucht durch die Fähigkeit, das Wachstum der IL-2/IL-4 abhängigen Zelllinie HT-2 zu unterstützen, gemessen durch den Einbau von [³H]-Thymidin. Die prozentuale Erhöhung wird berechnet nach [(CPM von T + APC + Peptid + I_i-Peptid/CPM von T + APC + Peptid) × 100) – 100. Tabelle VI. I_i-Peptide erhöhen die auf MHC-Klasse II beschränkte Präsentation von Antigenpeptid an T-Zellen
Sequenzlistung

Claims

In vitro-Verfahren zur Erhöhung der Präsentation eines auf MHC-Klasse II-beschränkten Antigen-Peptids für eine T-Zelle, umfassend: (a) die Bildung einer Reaktionsmischung, die (i) eine MHC-Klasse II exprimierende, Antigen-präsentierende Zelle; (ii) das Peptid YRMKLPKPPKPVSKMR (SEQ ID NO:1); (iii) das auf MHC-Klasse II beschränkte Antigen-Peptid, das, wenn es zur Inkubations-Mischung zugegeben wird, nicht in Assoziation mit einer Antigenpräsentierenden Zelle vorliegt; und (iv) eine T-Zelle, die auf das auf MHC-Klasse II beschränkte Antigen-Peptid von Teil iii) anspricht; umfasst; und (b) die Inkubation der Reaktionsmischung von Schritt a) unter Bedingungen, die für eine Interaktion zwischen der Antigen-präsentierenden Zelle und der T-Zelle geeignet sind.
In vitro-Verfahren zur Erhöhung der Präsentation eines auf MHC-Klasse II beschränkten Antigen-Peptids für eine T-Zelle, umfassend: (a) die Bildung einer Reaktionsmischung, die (i) eine MHC-Klasse II exprimierende, Antigen-präsentierende Zelle; (ii) das Peptid ENLRHLKNTMETLDWKV (SEQ ID NO:2); (iii) das auf MHC-Klasse II beschränkte Antigen-Peptid, das, wenn es zur Inkubations-Mischung zugegeben wird, nicht in Assoziation mit einer Antigenpräsentierenden Zelle assoziiert vorliegt; und (iv) eine T-Zelle, die auf das auf MHC-Klasse II beschränkte Antigen-Peptid von Teil iii) anspricht; umfasst; und (b) die Inkubation der Reaktionsnischung von Schritt a) unter Bedingungen, die für eine Interaktion zwischen der Antigen-präsentierenden Zelle und der T-Zelle geeignet sind.