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DE60303218T2 - Intergene regionen als insertionsstellen im genom von modifiziertem vaccinia virus ankara (mva) - Google Patents

Intergene regionen als insertionsstellen im genom von modifiziertem vaccinia virus ankara (mva) Download PDF

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DE60303218T2
DE60303218T2 DE2003603218 DE60303218T DE60303218T2 DE 60303218 T2 DE60303218 T2 DE 60303218T2 DE 2003603218 DE2003603218 DE 2003603218 DE 60303218 T DE60303218 T DE 60303218T DE 60303218 T2 DE60303218 T2 DE 60303218T2
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DE
Germany
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mva
segid
igr
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dna sequence
Prior art date
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DE2003603218
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Paul Glen Waverly HOWLEY
Sonja Leyrer
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Bavarian Nordic AS
Original Assignee
Bavarian Nordic AS
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Publication date
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Insertionsstellen, die für die Integration exogener DNA-Sequenzen in das MVA-Genom nützlich sind.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ist Mitglied der Orthopoxvirenfamilie und wurde durch etwa 570 serielle Passagen auf embryonalen Hühnerfibroblasten des Ankarastamms des Vacciniavirus (CVA) generiert (für einen Überblick vergleiche Mayr, A., et al. [1975], Infection 3, 6–14). Als Folge dieser Passagen enthält das resultierende MVA-Virus 31 Kilobasen weniger an Genominformation im Vergleich zu CVA und ist bezüglich der Wirtzzellen stark restringiert (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031–1038 [1991]). MVA ist durch seine extreme Attenuierung gekennzeichnet, nämlich durch eine verringerte Virulenz oder Infektiosität, jedoch bei einer weiterhin ausgezeichneten Immunogenität. Bei Tests in zahlreichen Tiermodellen hat MVA bewiesen, dass es sogar in immunosupprimierten Individuen avirulent ist. Noch wichtiger ist, dass die ausgezeichneten Eigenschaften des MVA-Stamms in ausführlichen klinischen Versuchen nachgewiesen wurden (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987]). Im Laufe dieser Studien an über 120.000 Menschen, einschließlich Hochrisikopatienten wurden keine Nebenwirkungen festgestellt (Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]).
  • Es wurde ferner herausgefunden, dass das MVA im späten Stadium des Virusreplikationszyklus in Säugetierzellen blockiert ist (Sutter, G. and Moss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847–10851). Dementsprechend repliziert das MVA seine DNA vollständig, synthetisiert frühe, intermediäre und späte Genprodukte, ist jedoch nicht in der Lage, reife infektiöse Virionen zu assemblieren, die aus einer infizierten Zelle freigesetzt werden könnten. Aus diesem Grund, nämlich. aufgrund seiner restringierten Replikation, wurde MVA vorgeschlagen, um als Genexpressionsvektor zu dienen.
  • In jüngerer Zeit wurde MVA verwendet, um rekombinante Impfstoffe zu generieren, die antigene Sequenzen, die entweder an der Stelle des Tymidinkinasegens (tk)(U.S. Pat. No. 5,185,146) oder an der Stelle einer natürlich auftretenden Deletion innerhalb des MVA-Genoms inseriert sind (PCT/EP96/02926), exprimieren.
  • Obwohl der tk-Insertionslocus für die Generierung rekombinanter Poxviren, insbesondere für die Generierung rekombinanter Vacciniaviren (Mackett, et al. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415–7419) häufig verwendet wird, war diese Technologie für das MVA nicht geeignet. Scheiflinger et al. haben gezeigt, dass das MVA sehr viel empfindlicher auf Genommodifikationen reagiert als andere Poxviren, die für die Generierung rekombinanter Poxviren verwendet werden können. Scheiflinger et al. haben insbesondere gezeigt, dass eine der am meisten für die Integration heterologer DNA in Poxvirengenome verwendeten Stellen, nämlich der Thymdinkinasegenlocus (tk), nicht zum Generieren rekombinanter MVAs verwendet werden kann. Jedes der resultierenden tk(–) rekombinanten MVAs hat bewiesen, dass es höchst instabil ist und bei der Reinigung sofort die inserierte DNA zusammen mit Teilen der Genom-DNA des MVA deletiert (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: pp 663–669).
  • Instabilität und damit die hohe Wahrscheinlichkeit einer Genomrekombination ist ein bekanntes Problem in der Pox-Virologie. Tatsächlich wurde das MVA im Laufe langfristiger Passagen etabliert, wobei die Tatsache ausgenutzt wurde, das das Virusgenom des CVA instabil ist, wenn es in vitro in Zellen vermehrt wird, die auf Gewebe kultiviert wurden. Mehrere tausend Nukleotide (31 kb) wurden aus dem MVA-Genom deletiert, das daher im Vergleich mit dem ursprünglichen CVA-Genom durch 6 große und viele kleine Deletionen gekennzeichnet ist.
  • Die Genomorganisation des MVA-genom wurde unlängst beschrieben (Antoine et al. [1998), Virology 244, 365–396). Das 178 kb-Genom des MVA ist dicht gepackt und umfasst 193 individuelle offene Leseraster (ORFs [open reading frames]), die für Proteine mit einer Länge von mindestes 63 Aminosäuren codieren. Im Vergleich mit dem hochinfektiösen Variolavirus und auch dem Prototyp des Vacciniavirus, nämlich dem Copenhagenstamm, ist die Mehrheit der ORFs des MVA fragmentiert oder trunkiert (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365–396). Mit nur sehr wenigen Ausnahmen werden jedoch alle ORFs, einschließlich der fragmentierten oder trunkierten ORFs in Proteine transkribiert oder translatiert. Im Folgenden wird die Nomenklatur von Antoine et al. verwendet, und – wenn sie geeignet ist – wird auch die Nomenklatur, die auf der HindIII-Restriktionsenzymverdauung basiert, angegeben.
  • Bisher führte nur die Insertion exogener DNA in die natürlich auftretenden Deletionsstellen des MVA-Genoms zu stabilen rekombinanten MVAs (PCT/EP96/02926). Bedauerlicherweise gibt es nur eine beschränkte Anzahl natürlich auftretender Deletionsstellen im MVA-Genom. Zusätzlich wurde gezeigt, dass andere Insertionsstellen, wie z. B. der tk-Genlocus kaum für die Generierung rekombinanter MVAs geeignet sind (Scheiflinger et al. [1996], Arch Virol 141: pp 663–669).
  • Aufgabe der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Insertionsstellen des MVA-Genoms zu identifizieren und Insertionsvektoren bereitzustellen, die die Insertion exogener DNA-Sequenzen in die neu identifizierten Insertionsstellen des MVA-Genoms steuern.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein rekombinantes MVA bereitzustellen, das exogene DNA-Sequenzen umfasst, die stabil in neue Insertionsstellen des MVA-Genoms integriert sind.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben neue Stellen für die Insertion exogener DNA-Sequenzen in das Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) identifiziert. Die neuen Insertionsstellen liegen in den intergenen Bereichen (IGRs [intergenic regions]) des Virusgenoms, wobei die IGRs wiederum zwischen zwei benachbarten offenen Leserastern (ORFs) des MVA-Genoms liegen oder von diesen flankiert werden.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegenden Erfindung ein rekombinantes MVA, das eine heterologe DNA-Sequenz umfasst, die in eine IGR des Virusgenoms inseriert ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere exogene DNA-Sequenzen in eine oder mehrere IGRs inseriert werden.
  • Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass exogene DNA-Sequenzen in den IGRs des MVA-Genoms wirklich stabil inseriert bleiben: Wie oben bereits angegeben wird das Genom des MVA als ziemlich instabil erachtet. Es scheint, dass die Gene oder DNA-Sequenzen, die für die Vermehrung des Virus nicht essentiell sind, deletiert oder fragmentiert sind. Obwohl – ebenfalls überraschenderweise – herausgefunden wurde, dass stabile rekombinante MVAs erhalten werden, wenn heterologe DNA-Sequenzen in die natürlich auftretenden Deletionsstellen des MVA-Genoms inseriert werden (PCT/EP96/02926), wurde – andererseits – herausgefunden, dass Wirtsspektrumsgene, wie z. B. der tk-Locus, der häufig für die Generierung anderer rekombinanter Poxviren verwendet wird, keine passenden Insertionsstellen im MVA sind. Die Tatsache, dass Vero-MVA eine extra Genomdeletion aufweist (PCT/EP01/02703), lässt ebenfalls vermuten, dass das Genom dynamisch ist, in dem Sinne, dass es leicht Gene deletiert, die für die Vermehrung nicht erforderlich sind. Daher kann gefolgert werden, dass bei der Insertion heterologer DNA-Sequenzen, die nicht essentiell für die Virusvermehrung sind, in die Räume zwischen den ORFs, damit gerechnet werden müsste, dass sie ebenfalls von dem Virus deletiert werden würden.
  • Während die Nukleotidsequenz eines ORFs eine Aminosäuresequenz codiert, die ein Peptid, Polypeptid oder Protein bildet, haben die IGRs zwischen zwei ORFs keine Codierungsfähigkeit, können aber regulatorische Elemente, Bindungsstellen, Promoter- und/oder Verstärkersequenzen umfassen, die für die Transkriptionskontrolle der viralen Genexpression essentiell oder an ihr beteiligt sind. Somit kann die IGR an der Regulationskontrolle des viralen Lebenszyklus beteiligt sein. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch ebenfalls gezeigt, dass die neuen Insertionsstellen den unerwarteten Vorteil haben, dass exogene DNA-Sequenzen stabil in das MVA-Genom inseriert werden können, ohne die typischen Eigenschaften und die Genexpression des MVAs zu beeinflussen oder abzuändern. Die neuen Insertionsstellen sind besonders nützlich, da kein ORF oder codierende Sequenz des MVA verändert wird.
  • Überdies wurde überraschenderweise herausgefunden, dass die Expressionsstärke eines Fremdgens, das in eine IGR inseriert wurde, höher ist, als die Expressionsstärke eines Fremdgens, das in eine Deletionsstelle des MVA-Genoms inseriert wurde (vgl. auch Beispiel 1).
  • Die Nukleotidsequenz eines ORF beginnt in der Regel mit einem Startcodon und endet mit einem Stoppcodon. Abhängig von der Orientierung der zwei benachbarten ORFs der IGR, ist der Bereich zwischen diesen ORFs entweder von den beiden Stoppcodonen der zwei benachbarten ORFs flankiert, oder durch die zwei Startcodone der zwei benachbarten ORFs, oder vom Stoppcodon des ersten ORF und dem Startcodon des zweiten ORF, oder vom Startcodon des ersten ORF und dem Stoppcodon des zweiten ORF.
  • Dementsprechend kann die Insertionsstelle für die exogene DNA-Sequenz in die IGR stromabwärts oder 3' vom Stoppcodon eines ersten ORF liegen. Falls das benachbarte ORF, auch zweites ORF genannt, die gleiche Orientierung wie das erste ORF hat, liegt diese Insertionsstelle stromabwärts des Stoppcodons des ersten ORF stromaufwärts oder 5' vom Startcodon des zweiten ORF.
  • Falls das zweite ORF eine entgegen gesetzte Orientierung im Verhältnis zum ersten ORF hat, was bedeutet, dass die Orientierung der zwei benachbarten ORFs aufeinander zeigt, dann liegt die Insertionsstelle stromabwärts des Stoppcodons beider ORFs.
  • Als dritte Alternative, falls die zwei benachbarten ORFs in entgegen gesetzter Richtung lesen, aber die Orientierung der zwei benachbarten ORFs von einander wegzeigt, was synonym ist mit einer Positionierung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Startcodone der beiden ORFs einander benachbart sind, dann wird die exogene DNA stromaufwärts im Verhältnis zu beiden Startcodonen inseriert.
  • Die ORFs im MVA-Genom treten in zwei Codierungsrichtungen auf. Folglich tritt die Polymeraseaktivität von links nach rechts, d. h., in Vorwärtsrichtung und, entsprechend von rechts nach links (Rückwärtsrichtung) auf. Es ist in der Poxvirologie allgemeine Praxis und es wurde zur Standardklassifikation für Vacciniaviren, die ORFs über ihre Orientierung und ihre Position auf den verschiedenen HindIII-Restriktionsverdauungsfragmenten des Genoms zu identifizieren. Für die Nomenklatur werden die verschiedenen HindIII-Fragmente über absteigende Großbuchstaben benannt, die ihrer absteigenden Größe entsprechen. Das ORF ist von links nach rechts auf jedem HindIII-Fragment nummeriert und die Orientierung der ORFs wird durch ein großes L angegeben (das für Transkription von rechts nach links steht) oder R (das für Transkription von links nach rechts steht). Zusätzlich gibt es eine jüngere Publikation der MVA-Genomstruktur, die eine andere Nomenklatur verwendet, bei der die ORF einfach vom linken zum rechten Ende des Genoms nummeriert, und ihre Orientierung mit einem großen L oder R angegeben wird (Antoine et al. [1998], Virology 244, 365–396). Um ein Beispiel zu nennen: das I4L ORF nach der alten Nomenklatur entspricht dem 064L ORF nach Antoine et al. Wenn nichts anderes angegeben ist, verwendet die vorliegende Erfindung die Nomenklatur nach Antoine et al.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können heterologe DNA-Sequenzen in eine oder mehrere IGRs inseriert werden, die zwischen zwei benachbarten ORFs liegen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend:
    001L–002L, 002L–003L, 005R–006R, 006L–007R, 007R–008L, 008L–009L, 017L–018L, 018L–019L, 019L–020L, 020L–021L, 023L–d24L, 024L–025L, 025L–026L, 028R–029L, 030L–031L, 031L–032L, 032L–033L, 035L–036L, 036L–037L, 037L–038L, 039L–040L, 043L–044L, 044L–045L, 046L–047R, 049L–050L, 050L–051L, 051L–052R, 052R–053R, 053R–054R, 054R–055R, 055R–056L, 061L–062L, 064L–065L, 065L–066L, 066L–067L, 077L–078R, 078R–079R, 080R–081R, 081R–082L, 082L–083R, 085R–086R, 086R–087R, 088R–089L, 089L–090R, 092R–093L, 094L–095R, 096R–097R, 097R–098R, 101R–102R, 103R–104R, 105L–106R, 107R–108L, 108L–109L, 109L–110L, 110L–111L, 113L–114L, 114L–115L, 115L–116R, 117L–118L, 118L–119R, 122R–123L, 123L–124L, 124L–125L, 125L–126L, 133R–134R, 134R–135R, 136L–137L, 137L–138L, 141L–142R, 143L–144R, 144R–145R, 145R–146R, 146R–147R, 147R–148R, 148R–149L, 152R–153L, 153L–154R, 154R–155R, 156R–157L, 157L–158R, 159R–160L, 160L–161R, 162R–163R, 163R–164R, 164R–165R, 165R–166R, 166R–167R, 167R–168R, 170R–171R, 173R–174R, 175R–176R, 176R–177R, 178R–179R, 179R–180R, 180R–181R, 183R–184R, 184R–185L, 185L–186R, 186R–187R, 187R–188R, 188R–189R, 189R–190R, 192R–193R.
  • Nach der alten Nomenklatur entspricht ORF 006L C10L, 019L ist C6L, 020L ist N1L, 021L ist N2L, 023L ist K2L, 028R ist K7R, 029L ist F1L, 037L ist F8L, 045L ist F15L, 050L ist E3L, 052R ist E5R, 054R ist E7R, 055R ist E8R, 056L ist E9L, 062L ist I1L, 064L ist I4L, 065L ist I5L, 081R ist L2R, 082L ist L3L, 086R ist J2R, 088R ist J4R, 089L ist J5L, 092R ist H2R, 095R ist H5R, 107R ist D10R, 108L ist D11L, 122R ist A11R, 123L ist A12L, 125L ist A14L, 126L ist A15L, 135R ist A24R, 136L ist A25L, 137L ist A26L, 141L ist A30L, 148R ist A37R, 149L ist A38L, 152R ist A40R, 153L ist A41L, 154R ist A42R, 157L ist A44L, 159R ist A46R, 160L ist A47L, 165R ist A56R, 166R ist A57R, 167R ist B1R, 170R ist B3R, 176R ist B8R, 180R ist B12R, 184R ist B16R, 185L ist B17L, und 187R ist B19R.
  • Vorzugsweise wird die heterologe Sequenz in eine IGR inseriert, die von zwei benachbarten ORFs flankiert ist, ausgewählt aus der Gruppe, die 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L oder 148R–149L umfasst.
  • Heterologe oder exogene DNA-Sequenzen sind Sequenzen, die in der Natur normalerweise nicht in Verbindung mit dem Poxvirus gefunden werden, wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die exogene DNA-Sequenz mindestens eine codierende Sequenz. Die codierende Sequenz ist operativ an ein Transkriptionskontrollelement gekoppelt, vorzugsweise an ein poxvirales Transkriptionskontrollelement. Zusätzlich können auch Kombinationen zwischen einem poxviralen Transkriptionskontrollelement und, z. B., internen Ribosomen-Eintrittsstellen verwendet werden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die exogene DNA-Sequenz auch zwei oder mehrere codierende Sequenzen umfassen, die mit einem oder mehreren Transkriptionskontrollelementen gekoppelt sind. Vorzugsweise codiert die codierende Sequenz ein oder mehrere Proteine, Polypeptide, Peptide, Fremdantigene oder antigene Epitope, besonders jene von therapeutisch interessanten Genen.
  • Therapeutisch interessante Gene gemäß der vorliegenden Erfindung können Gene sein, die abgeleitet sind von oder homolog zu Genen pathogener oder infektiöser Mikroorganismen, die krankheitserregend sind. Dementsprechend werden im Kontext der vorliegenden Erfindung solche therapeutisch interessanten Gene dem Immunsystem eines Organismus präsentiert, um eine spezifische Immunantwort zu bewirken, vorzugsweise zu induzieren, und dadurch den Organismus gegen eine Infektion mit dem Mikroorganismus zu impfen oder prophylaktisch zu schützen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die therapeutisch interessanten Gene ausgewählt aus Genen infektiöser Viren, z. B., – aber nicht beschränkt auf – Denguevirus, Japan-Enzephalitis-Virus, Hepatitis-Virus B oder C oder Immunschwächeviren, wie etwa HIV.
  • Gene, die vom Denguevirus abgeleitet sind, sind bevorzugt NS1- und PrM-Gene, wobei die Gene von einem, zwei, drei oder vier oder von allen 4 Denguevirus-Serotypen abgeleitet werden können. Das NS1-Gen wird vorzugsweise vom Denguevirus-Serotyp 2 abgeleitet und wird vorzugsweise in die IGR zwischen den ORFs 064L–065L (I4L–I5L) inseriert. Die PrM-Gene, die vorzugsweise von allen 4 Denguevirus-Serotypen abgeleitet werden, werden vorzugsweise in die IGRs zwischen den ORFs inseriert, ausgewählt aus 007R–008L, 044L–045L, 136L–137L oder 148R–149L. Mehr bevorzugt wird das PrM-Gen, das das vom Denguevirus-Serotyp 1 (prM1) abgeleitet ist, in die IGR von 148R–149L inseriert, PrM2 in die IGR 007R–008L, PrM3 in die IGR der ORFs 044L–045L und PrM4 in die IGR 136L–137L.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die heterologe DNA-Sequenz vom HIV abgeleitet und codiert HIV env, wobei das HIV-env-Gen vorzugsweise in die IGR zwischen 007R–008L inseriert wird.
  • Außerdem umfassen therapeutisch interessante Gene der vorliegenden Erfindung auch krankheitsbezogene Gene, die eine therapeutische Wirkung auf proliferative Störung, Krebs oder Stoffwechselerkrankungen haben. Ein therapeutisch interessantes Gen im Hinblick auf Krebs könnte zum Beispiel ein Krebsantigen sein, das die Fähigkeit hat, eine spezifische Anti-Krebs-Immunreaktion zu induzieren.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die exogene DNA-Sequenz mindestens eine codierende Sequenz.
  • Selektionsgene transduzieren eine besondere Resistenz auf eine Zelle, wobei ein gewisses Selektionsverfahren möglich wird. Dem Fachmann sind zahlreiche Selektionsgene bekannt, die in einem poxviralen System verwendet werden können. Dazu gehören zum Beispiel das Neomycinresistenzgen (NPT) oder das Phosphoribosyl-Transferasegen (gpt).
  • Markergene induzieren eine Farbreaktion in transduzierten Zellen, die verwendet werden kann, um transduzierte Zellen zu identifizieren. Dem Fachmann sind zahlreiche Markergene bekannt, die in einem poxviralen System verwendet werden können. Dazu gehören die Gene, die z. B. β-Galactosidase (β-gal), β-Glucosidase (β-glu), das grün fluoreszierende Protein (EGFP) oder das blau fluoreszierende Protein codieren.
  • Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die exogene DNA-Sequenz eine Abstandssequenz, die das poxvirale Transkriptionskontrollelement und/oder die codierende Sequenz in der exogenen DNA-Sequenz vom Stoppcodon und/oder Startcodon der benachbarten ORFs separiert. Diese Abstandssequenz zwischen dem Stopp- bzw. Startcodon des benachbarten ORF und der inserierten codierenden Sequenz in der exogenen DNA hat den Vorteil, die inserierte exogene DNA zu stabilisieren, und somit jeden resultierenden rekombinanten Virus. Die Größe der Abstandssequenz ist variabel, solange die Sequenz keine eigene codierende oder regulatorische Funktion hat.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Abstandssequenz, die das poxvirale Transkriptionskontrollelement und/oder die codierende Sequenz in der exogenen DNA-Sequenz vom Stoppcodon des benachbarten ORF separiert, mindestens ein Nukleotid lang.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Abstandssequenz, die das poxvirale Transkriptionskontrollelement und/oder die codierende Sequenz in der exogenen DNA-Sequenz vom Stoppcodon der benachbarten ORF separiert, mindestens ein Nukleotid lang. Insbesondere in Fällen, in denen ein typisches Vacciniaviruspromoterelement stromaufwärts eines Startcodons identifiziert wird, kann die Insertion exogener DNA das Promoterelement vom Startcodon des benachbarten ORF nicht separieren. Ein typisches Vacciniapromoterelement kann identifiziert werden, indem z. B. die Sequenz „TAAAT" auf späte Promoter gescannt wird (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771–784) und eine A/T-reiche Domäne auf frühe Promoter. Eine Abstandssequenz von etwa 30 Nukleotiden ist die bevorzugte Distanz, um sicherzustellen, dass ein poxviraler Promoter, der stromaufwärts des Startcodons des ORF liegt, nicht beeinflusst wird. Zusätzlich beträgt, gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, die Distanz zwischen der inserierten exogenen DNA und dem Startcodon des benachbarten ORF etwa 50 Nukleotide und mehr bevorzugt etwa 100 Nukleotide.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Abstandssequenz ein zusätzliches poxvirales Transkriptionskontrollelement, das in der Lage ist, die Transkription des benachbarten ORF zu kontrollieren.
  • Ein typischer MVA-Stamm, der gemäß der vorliegenden Erfindung zur Generierung eines rekombinanten MVA verwendet werden kann, ist MVA-575, der bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Hinterlegungsnummer ECACC V00120707 hinterlegt wurde.
  • Ein anderer bevorzugter MVA-Stamm ist MVA-Vero oder ein Derivat davon. MVA-Vero-Stämme wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter den Hinterlegungsnummern ECACC V99101431 und 01021411 hinterlegt. Die Sicherheit des MVA-Vero wird durch biologische, chemische und physikalische Eigenschaften reflektiert, wie in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/02703 beschrieben sind. Im Vergleich mit anderen MVA-Stämmen beinhaltet der Vero-MVA eine zusätzliche Genomdeletion.
  • Ein weiterer, noch mehr bevorzugter MVA-Stamm ist MVA-BN. MVA-BN wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008 hinterlegt. Der MVA-BN-Virus ist ein extrem attenuierter Virus, der auch vom modifizierten Vacciniavirus Ankara abgeleitet ist (vergleiche auch PCT/EP01/13628).
  • Der Begriff „Derivate" eines Virus gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Virusnachkommen, die die gleichen charakteristischen Merkmale aufweisen wie der Elternvirus, jedoch Unterschiede in einem oder mehreren Teilen ihres Genoms zeigen. Der Begriff „Derivat von MVA" beschreibt einen Virus, der die im Vergleich mit dem MVA gleichen funktionellen Eigenschaften hat. Zum Beispiel hat ein Derivat von MVA-BN die gleichen charakteristischen Merkmale wie MVA-BN. Eine dieser Eigenschaften von MVA-BN oder Derivaten davon ist seine Attenuierung und die fehlende Replikation in menschlichen HaCat-Zellen.
  • Das rekombinante MVA gemäß der vorliegenden Erfindung ist als Medikament oder Impfung nützlich. Es wird gemäß einer weiteren Ausführungsform für die Einführung der exogenen codierenden Sequenz in eine Targetzelle verwendet, wobei diese Sequenz entweder homolog oder heterolog zum Genom der Targetzelle ist.
  • Die Einführung einer exogenen codierenden Sequenz in eine Targetzelle kann in vitro erfolgen, um Proteine, Polypeptide, Peptide, Antigene oder antigene Epitope zu produzieren. Dieses Verfahren umfasst die Infektion einer Wirtszelle mit dem rekombinanten MVA gemäß der Erfindung, die Kultivierung der infizierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen und die Isolierung und/oder Anreicherung des von der Wirtszelle produzierten Polypeptids, Proteins, Peptids, Antigens, Epitops und/oder Virus.
  • Außerdem kann das Verfahren zur Einführung einer oder mehrerer homologer oder einer oder mehrerer heterologer Sequenzen in Zellen für die In-vitro- und die In-vivo-Therapie angewendet werden. Für die In-vitro-Therapie werden isolierte Zellen, die zuvor (ex vivo) mit dem rekombinanten MVA gemäß der Erfindung infiziert wurden, einem lebenden Tierkörper verabreicht, um eine Immunantwort zu bewirken, vorzugsweise zu induzieren. Für die In-vivo-Therapie wird der rekombinante Poxvirus gemäß der Erfindung dem lebenden Tierkörper direkt verabreicht, um eine Immunantwort zu bewirken, vorzugsweise zu induzieren. In diesem Fall werden die Zellen, die die Inokulationsstelle umgeben, aber auch die Zellen, in die das Virus z. B. über den Blutstrom, transportiert wird, direkt in vivo mit dem rekombinanten MVA gemäß der Erfindung infiziert. Nach der Infektion synthetisieren diese Zellen die Proteine, Peptide oder antigenen Epitope der therapeutischen Gene, die von der exogenen codierenden Sequenz codiert werden, und präsentieren sie, oder Teile davon, anschließend auf der zellulären Oberfläche. Spezialisierte Zellen des Immunsystems erkennen die Präsentation solcher heterologer Proteine, Peptide oder Epitope und starten eine spezifische Immunantwort.
  • Da das MVA stark wachstumsrestringiert und somit stark attenuiert ist, ist es für die Behandlung eines großen Spektrums von Säugetieren, einschließlich des Menschen, einschließlich immungeschwächter Tiere oder Menschen, nützlich. Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe zur Induzierung einer Immunantwort in einem lebenden Tierkörper, einschließlich des Menschen, bereit.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann grundsätzlich einen oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche und/oder anerkannte Trägermittel, Zusatzmittel, Antibiotika, Konservierungsstoffe, Adjuvans, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren enthalten.
  • Solche Hilfssubstanzen können Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen oder ähnliche sein. Geeignete Trägermittel sind typischerweise große, langsam metabolisiserende Moleküle, wie etwa Proteine, Polysaccharide, polylaktische Säuren, Polyglycolsäuren, polymerische Aminosäuren, Aminosäurecopolymere, Lipidaggregate oder ähnliche.
  • Für die Herstellung von Impfstoffen wird der rekombinante Poxvirus gemäß der Erfindung in eine physiologisch unbedenkliche Form umgewandelt. Das kann auf der Basis der Erfahrung bei der Herstellung von Poxvirusimpfstoffen erfolgen, die für die Impfung gegen Pocken verwendet wurden (wie von Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 beschrieben). Das gereinigte Virus wird zum Beispiel bei –80°C mit einem Titer von 5 × 10E8 TCID50/ml gelagert, das in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH-Wert 7,4, formuliert ist. Für die Herstellung von Impfschüssen werden z. B. 10E2–10E8-Teilchen des Virus in 100 ml von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, vorzugsweise in einer Glasampulle, lyophilisiert. Alternativ können die Impfschüsse produziert werden, indem das Virus schrittweise in einer Formulierung gefriergetrocknet wird. Diese Formulierung kann zusätzliche Zusatzmittel, wie etwa Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon oder andere Hilfsstoffe, wie etwa Antioxidanzien oder Inertgas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z. B. menschliches Serumalbumin) enthalten, die für die Verabreichung in vivo geeignet sind. Die Glasampulle wird dann versiegelt und kann zwischen 4°C und Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. Solange jedoch kein Bedarf besteht, sollte die Ampulle vorzugsweise bei Temperaturen von unter –20°C gelagert werden.
  • Für die Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat in 0,1 bis 0,5 ml einer wässrigen Lösung gelöst werden, vorzugsweise physiologischer Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, und entweder systemisch oder lokal verabreicht werden, d. h. parenteral, subkutan, intramuskulär, durch Hautritzung oder jeden anderen Verabreichungsweg, der dem Fachmann bekannt ist. Die Art der Verabreichung, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen kann auf bekannte Weise von Fachleuten optimiert werden. Im Allgemeinen wird ein Patient jedoch mit einem zweiten Schuss etwa einen Monat oder sechs Wochen nach dem ersten Impfschuss geimpft.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Plasmidvektoren, die verwendet werden können, um ein rekombinantes MVA gemäß der vorliegenden Erfindung zu generieren und betrifft auch bestimmte DNA-Sequenzen:
    In der Regel umfasst die IGR, die zwischen zwei benachbarten ORFs liegt, oder von diesen flankiert wird, Nukleotidsequenzen, in die die interessierende exogene DNA-Sequenz inseriert werden kann. Dementsprechend umfasst der Plasmidvektor gemäß der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz, die homolog zum Genom des MVA oder von ihm abgeleitet ist, wobei die DNA-Sequenz ein vollständiges oder teilweises Fragment einer IGR-Sequenz umfasst, das zwischen zwei benachbarten ORFs des Virusgenoms liegt oder von diesen flankiert wird. Vorzugsweise umfasst der Plasmidvektor, der in die IGR-abgeleitete Sequenz inseriert ist, mindestens eine Klonierungsstelle für die Insertion einer interessierenden exogenen DNA-Sequenz und vorzugsweise für die Insertion eines poxviralen Transkriptionskontrollelements, das operativ mit der heterologen DNA-Sequenz gekoppelt ist. Optional umfasst der Plasmidvektor eine Reporter- und/oder Selektionsgenkassette. Der Plasmidvektor umfasst vorzugsweise auch Sequenzen von zwei benachbarten ORFs, die das vollständige oder teilweise Fragment der IGR- Sequenz flankieren.
  • Es wurden einige IGRs identifiziert, die keine Nukleotidsequenzen beinhalten. In diesen Fällen umfasst der Plasmidvektor DNA-Sequenzen von flankierenden IGR-Sequenzen, d. h. DNA-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs. Vorzugsweise wir die Klonierungsstelle für die Insertion der heterologen DNA-Sequenz in die IGR inseriert. Die DNA der flankierenden IGR-Sequenzen wird verwendet, um die Insertion der exogenen DNA-Sequenzen in die entsprechende IGR im MVA-Genom zu steuern. Ein solcher Plasmidvektor kann zusätzlich ein vollständiges oder teilweises Fragment einer IGR-Sequenz beinhalten, das die Klonierungsstelle für die Insertion der heterologen DNA-Sequenz umfasst und, optional, die Reporter- und/oder Selektionsgenkassette.
  • Die IGR-DNA-Sequenzen sowie die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs werden vorzugsweise ausgewählt aus IGRs bzw. ORFs, die ausgewählt werden aus der Gruppe, umfassend
    001L–002L, 002L–003L, 005R–006R, 006L–007R, 007R–008L, 008L–009L, 017L–018L, 018L–019L, 019L–020L, 024L–021L, 023L–024L, 024L–025L, 025L–026L, 028R–029L, 030L–431L, 031L–032L, 032L–033L, 035L–036L, 036L–037L, 037L–038L, 039L–040L, 043L–044L, 044L–045L, 046L–047R, 049L–050L, 050L–051L, 051L–052R, 052R–053R, 053R–054R, 054R–055R, 055R–056L, 061L–062L, 064L–065L, 065L–066L, 066L–067L, 077L–078R, 078R–079R, 080R–081R, 081R–082L, 082L–083R, 085R–086R, 086R–087R, 088R–089L, 089L–090R, 092R–093L, 094L–095R, 096R–097R, 097R–098R, 101R–102R, 103R–104R, 105L–106R, 107R–108L, 108L–109L, 109L–110L, 110L–111L, 113L–114L, 114L–115L, 115L–116R, 117L–118L, 118L–119R, 122R–123L, 123L–124L, 124L–125L, 125L–126L, 133R–134R, 134R–135R, 136L–137L, 137L–138L, 141L–142R, 143L–144R, 144R–145R, 145R–146R, 146R–147R, 147R–148R, 148R–149L, 152R–153L, 153L–154R, 154R–155R, 156R–157L, 157L–158R, 159R–160L, 160L–161R, 162R–163R, 163R–164R, 164R–165R, 165R–166R, 166R–167R, 167R–168R, 170R–171R, 173R–174R, 175R–176R, 176R–177R, 178R–179R, 179R–180R, 180R–181R, 183R–184R, 184R–185L, 185L–186R, 186R–187R, 187R–188R, 188R–189R, 189R–190R, 192R–193R.
  • Die Sequenzen werden mehr bevorzugt ausgewählt aus IGRs bzw. ORFs, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L oder 148L–149L umfasst. IGR-abgeleitete Sequenzen werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die die folgenden Nukleotidsequenzen umfassen:
    Nr. 527-608 der SegID Nr. 32;
    Nr. 299-883 der SegID Nr. 33;
    Nr. 339-852 der SegID Nr. 34;
    Nr. 376-647 der SegID-Nr. 35;
    Nr. 597-855 der SegID-Nr. 36;
    Nr. 400-607 der SegID-Nr. 37.
  • Flankierende IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFS werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die die folgenden Nukleotidsequenzen umfasst:
    Nr. 1-525 und 609-1190 der SegID-Nr. 32;
    Nr. 101-298 und 884-1198 der SegID-Nr. 33;
    Nr. 1-338 und 853-1200 der SegID-Nr. 34;
    Nr. 1-375 und 648-1200 der SegID-Nr. 35;
    Nr. 1-596 und 856-1200 der SegID-Nr. 36;
    Nr. 1-399 und 608-1081 der SegID-Nr. 37.
  • Die DNA-Sequenzen werden vorzugsweise vom Genom des MVA abgeleitet, oder sind homolog zu ihm, das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegt ist.
  • Um einen Plasmidvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zu generieren, werden die Sequenzen isoliert und in einen Standardklonierungsvektor, wie etwa pBluescript (Stratagene), kloniert, wobei sie die exogene DNA, die in das MVA-Genom inseriert werden soll, flankieren. Optional umfasst ein solcher Plasmidvektor eine Selektions- oder Reportergenkassette, die aus dem endgültigen rekombinanten Virus deletiert werden kann, aufgrund einer repetitiven Sequenz, die in dieser Kassette enthalten ist.
  • Verfahren zur Einführung exogener DNA-Sequenzen durch einen Plasmidvektor in ein MVA-Genom und Verfahren, um ein rekombinantes MVA zu erhalten, sind dem Fachmann bekannt und können zusätzlich aus den folgenden Quellen hergeleitet werden:
    Molecular Cloning, A laboratory Manual. Second Edition. By J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: beschreiben Techniken und Know-how für molekularbiologische Standardtechniken, wie etwa Klonieren von DNA, RNA-Isolierung, Western-Blot-Analyse, RT-PCR- und PCR-Amplifikationstechniken;
    Virology Methods Manual. Edited by Brian W. J. Mahy and Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: beschreibt Techniken für die Handhabung und Manipulation von Viren;
    Molecular Virology: A Practical Approach. Edited by A. J. Davison and R. M. Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors;
    Current Protocols in Molecular Biology. Publisher: John Wiley and Son Inc. 1998. Chapter 16, section IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector: beschreibt Techniken und Knowhow für die Handhabung, Manipulation und gentechnische Herstellung von MVA.
  • Das MVA gemäß der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise das MVA, das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegt wurde, kann produziert werden, indem eine Zelle mit einem Plasmidvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert wird, wobei die transfizierte Zelle mit einem MVA infiziert wird und indem anschließend die MVA gemäß der Erfindung identifiziert, isoliert und optional gereinigt wird.
  • Die DNA-Sequenzen gemäß der Erfindung können verwendet werden, um das MVA oder dessen Derivate gemäß der Erfindung und Zellen oder Individuen, die mit einem MVA gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind, zu identifizieren oder zu isolieren. Die DNA-Sequenzen werden z. B. verwendet, um PCR-Primere oder Hybridisierungssonden zu generieren oder werden in Array-Technologien verwendet.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Restriktionskarte der Vektorkonstrukte pBNX39 (1a), pBNX70 (1b) und pBN84 (1c), die etwa 600 bp der MVA-Sequenzen umfassen, die die Insertionsstelle nach dem I4L ORF flankieren. Die Plasmide umfassen zusätzlich exogene DNA (Ecogpt bzw. hBFP) unter der Transkriptionskontrolle des Poxviruspromoters P) zwischen den flankierenden Sequenzen: Flanke 1 (F1 I4L–I5L) und Flanke 2 (F2 I4L–I5L). F1rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 1, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. pBN84 (1c) codiert zusätzlich für das Denguevirusprotein NS1 (NS1 DEN). Weitere Abkürzungen: AmpR = Ampicilinresistenzgen; bps = Basenpaare.
  • 2: Restriktionskarte der Vektorkonstrukte pBNX51 (2a), pBNX67 (2b) und pBN27 (2c), die etwa 600 bp der MVA-Sequenzen umfassen, die die Insertionsstelle nach ORF 137L flankieren (Flanke 1: F1136–137 entspricht Position 129340 bis 129930 des MVA-Genoms; Flanke 2: F2136–137 entspricht Position 129931 bis 130540 des MVA-Genoms). Zusätzlich umfasst der Vektor pBNX67 (2b) exogene DNA (NPTII-Gen = Neomycinresistenz). unter der Transkriptionskontrolle eines Poxviruspromoters P) zwischen den flankierenden Sequenzen. F2rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 2, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. pBN27 (2c) codiert zusätzlich für den Denguevirus PrM4 unter der Kontrolle eines Poxviruspromoters. Weitere Abkürzungen: AmpR = Ampicilinresistenzgen; bps = Basenpaare; IRES = Interne Ribosomen-Eintrittsstelle; EGFP = Gen für das verstärkte grüne fluoreszierende Protein.
  • 3: Restriktionskarte der Vektorkonstrukte pBNX79 (3a), pBNX86 (3b), pBNX88, (3c), pBN34 (3d) und pBN56 (3e), die etwa 600 bps der MVA-Sequenzen umfassen, die die Insertionsstelle zwischen ORF 007R und 008L flankieren (Flanke 1: F1 IGR 07–08 beginnt bei Position 12200 des MVA-Genoms; Flanke 2: F2 IGR 07–08 stoppt bei Position 13400 des MVA-Genoms). F2rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 2, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. Zusätzlich umfassen die Vektoren pBNX88 (3c) und pBNX86 (3b) exogene DNA (BFP+gpt bzw. NPT II + EGFP) unter der Transkriptionskontrolle eines Poxviruspromoters P) zwischen den flankierenden Sequenzen. F2rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 2, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. PBN56 (3e) codiert zusätzlich für das HIV-1 env Protein und pBN34 (3d) enthält die den Denguevirus codierende Sequenz PrM2 unter der Kontrolle eines Poxviruspromoters. Weitere Abkürzungen: AmpR = Ampicilinresistenzgen; bps = Basenpaare.
  • 4: Restriktionskarte der Vektorkonstrukte pBNX80 (4a), pBNX87 (4b) und pBN47 (4c), die etwa 600/640 bps der MVA-Sequenzen umfassen, die die Insertionsstelle zwischen ORF 044L und 045L flankieren (Flanke 1: F1 IGR 44–45 beginnt bei Position 36730 des MVA-Genoms; Flanke 2: F2 IGR44–45 stoppt bei Position 37970 des MVA-Genoms). Zusätzlich umfasst der Vektor pBNX87 (4b) exogene DNA (NPT II gene + EGFP) unter der Transkriptionskontrolle eines Poxviruspromoters P) zwischen den flankierenden Sequenzen. F2rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 2, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. PBN47 (4c) codiert zusätzlich für den Denguevirus PrM3 unter der Kontrolle eines Poxviruspromoters. Weitere Abkürzungen: AmpR = Ampicilinresistenzgen; bps = Basenpaare.
  • 5: Restriktionskarte der Vektorkonstrukte pBNX90 (5a), pBNX92 (5b) und pBN54 (5c), die etwa 596/604 bps der MVA-Sequenzen umfassen, die die Insertionsstelle zwischen ORF 148R und 149L flankieren (Flanke 1: F1 IGR 148–149 beginnt bei Position 136900 des MVA-Genoms; Flanke 2: F2 IGR 148–149 stoppt bei Position 138100 des MVA-Genoms). Zusätzlich umfasst der Vektor pBNX92 (5b) exogene DNA (gpt + BFP) unter der Transkriptionskontrolle eines Poxviruspromoters P) zwischen den flankierenden Sequenzen. PBN54 (5c) codiert zusätzlich für den Denguevirus PrM1. F2rpt steht für eine repetitive Sequenz von Flanke 2, um die Deletion der Reporterkassette aus einem resultierenden rekombinanten Virus zu ermöglichen. Weitere Abkürzungen: AmpR = Ampicilinresistenzgen; bps = Basenpaare.
  • 6: Schematische Präsentation der intergenen Insertionsstellen des MVA (Genbank Ac. U94848).
  • 7: PCR-Analyse der IGR I4L–I5L im rekombinanten MVA, bei dem das Denguevirus NS1 in die IGR I4L–I5L inseriert ist. Spur „BN" zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des NS1-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (1, 2, 3, 4; verschiedene DNA-Konzentrationen). M = Molekulargewichtmarker, H2O Wasser negative Kontrolle.
  • 8: 8a: Die PCR-Analyse der IGR 136–137 in der rekombinanten MVA, bei dem das Denguevirus PrM4 in die IGR 136–137 inseriert ist. Spur „BN" zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des PrM4-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (mBN23, 1/10, 1/100: verschiedene DNA-Konzentrationen). M = Molekulargewichtmarker, H2O = Wasser negative Kontrolle, pBN27 = Plasmid positive Kontrolle.
  • 8b: Mehrstufige Wachstumskurve für den leeren MVA-BN-Vektor und das rekombinante MVA, bei dem PrM4 in die IGR 136–137 inseriert ist (MVA-mBN23).
  • 9: 9a: Die PCR-Analyse der IGR 07–08 in dem rekombinanten MVA, bei dem das Denguevirus PrM2 in die IGR 07–08 inseriert ist. Spur 3 zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des PrM2-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (Spur 2). M = Molekulargewichtmarker, Spur 1 = Wasser negative Kontrolle.
  • 9b: Mehrstufige Wachstumskurve für den leeren MVA-BN-Vektor und das rekombinante MVA, bei dem PrM2 in die IGR 07–08 inseriert ist (MVA-mBN25).
  • 10: Die PCR-Analyse der IGR 07–08 in der rekombinanten MVA, bei dem das HIV env in die IGR 07–08 inseriert ist. Spur BN zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des PrM2-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (Spur 1, 2, 3). M = Molekulargewichtmarker, – = Wasser negative Kontrolle, + = Plasmid positive Kontrolle.
  • 11: 11a: Die PCR-Analyse der IGR 44–45 des rekombinanten MVA, bei dem das Denguevirus PrM3 in die IGR 44–45 inseriert ist. Spur BN zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des PrM3-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (Spur 1 bis 4, verschiedene DNA-Konzentrationen). M = Molekulargewichtmarker, – = Wasser negative Kontrolle.
  • 11b: Mehrstufige Wachstumskurve für den leeren MVA-BN-Vektor und das rekombinante MVA, bei dem PrM3 in die IGR 44–45 inseriert ist (MVA-mBN28).
  • 12: 12a: Die PCR-Analyse der IGR 148–149 des rekombinanten MVA, bei dem das Denguevirus PrM1 in die IGR 148–149 inseriert ist. Spur BN zeigt das PCR-Produkt unter Verwendung des leeren MVA-BN-Vektors. Unter Verwendung des PrM1-rekombinanten MVA ist ein größeres Fragment nachweisbar (Spur 1). M = Molekulargewichtmarker, – = Wasser negative Kontrolle, + = Plasmid positive Kontrolle.
  • 12b: Mehrstufige Wachstumskurve für den leeren MVA-BN-Vektor und das rekombinante MVA, bei dem PrM1 in die IGR 44–45 inseriert ist (MVA-mBN33).
  • Die folgenden Beispiele werden die vorliegende Erfindung weiter illustrieren. Jeder Fachmann wird verstehen, dass die bereitgestellten Beispiele keinesfalls so zu interpretieren sind, dass sie die vorliegende Erfindung auf diese Beispiele beschränken. Der Umfang der Erfindung wird nur durch den vollen Umfang der beiliegenden Ansprüche beschränkt.
  • Beispiel 1
  • Insertionsvektoren pBNX39, pBNX70 und pBN84
  • Für die Insertion exogener Sequenzen in den intergenen Bereich, der der 065L ORF des MVA benachbart ist (Die Insertionsstelle ist bei Genomposition 56760.), wurde ein Vektor konstruiert, der etwa 1200 bp der flankierenden Sequenzen umfasst, die der Insertionsstelle benachbart sind. Diese flankierenden Sequenzen werden in zwei Flanken separiert, wobei eine Flanke etwa 610 bp des 065L ORF (alternative Nomenklatur: I4L ORF) umfasst, und auf dem anderen Teil etwa 580 bp des intergenen Bereichs hinter dem 065L ORF, sowie Teile des proximalen ORF. Zwischen diesen flankierenden Sequenzen liegen ein Ecogpt-Gen (gpt steht für Phosphoribosyl-Transferasegen, das aus E. coli isoliert ist) bzw. ein BFP (blaues fluoreszierende Protein), unter der Transkriptionskontrolle eines Poxviruspromoters. Zusätzlich gib es mindestens eine Klonierungsstelle für die Insertion zusätzlicher Gene oder Sequenzen, die in den intergenen Bereich hinter dem I4L ORF inseriert werden sollen. Beispielhafte Vektorkonstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung werden in 1a) und b)(pBNX39, pBNX70) offenbart. In Vektor pBN84 (1c) wird der codierende Bereich für Denguevirus NS1 in die Klonierungsstelle von pBNX70 (1b) inseriert.
  • Die Generierung des rekombinanten MVA mittels homologer Rekombination
  • Fremdgene können in das MVA-Genom mittels homologer Rekombination inseriert werden. Zu diesem Zweck wird das interessierende Fremdgen in einen Plasmidvektor kloniert, wie oben beschrieben. Dieser Vektor wird in MVA-infizierte Zellen transfiziert. Die Rekombination findet im Zytoplasma der infizierten und transfizierten Stellen statt. Mit Hilfe der Selektions- und/oder Reporterkassette, die auch in dem Insertionsvektor enthalten ist, werden Zellen, die rekombinante Viren umfassen, identifiziert und isoliert.
  • Für die homologe Rekombination werden BHK-Zellen (Babyhamsternieren) oder CEF-Zellen (primäre embryonale Hühnerfibroblasten) in Platten mit 6 Vertiefungen gesät unter Verwendung von DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco BRL) + 10% fötales Kälberserum (FCS) oder VP-SFM (Gibco BRL) + 4 Mmol/l L-Glutamin für einen serumfreien Produktionsprozess.
  • Die Zellen müssen noch in der Wachstumsphase sein und daher sollten sie am Tag der Transfektion eine Konfluenz von 60 bis 80% erreichen. Die Zellen werden vor dem Säen gezählt, da die Anzahl der Zellen für die Bestimmung der Infektionsmultiplizität (MOI) für die Infektion bekannt sein muss.
  • Für die Infektion wird der MVA-Stock in DMEM/FCS oder VP-SFM/L-Glutamin verdünnt, damit 500 μl Verdünnung eine geeignete Menge an Virus enthalten, was eine MOI von 0,1 bis 1,0 ergibt. Es wird davon ausgegangen, dass die Zellen sich nach der Saat einmal geteilt haben. Die Zellen werden aus dem Medium entfernt und die Zellen werden mit 500 μl des verdünnten Virus infiziert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Inokulum wird entfernt und die Zellen werden mit DMEM/VP-SFM gewaschen. Die infizierten Zellen werden in 1,6 ml DMEM/FCS bzw. VP-SFM/L-Glutamin stehen gelassen, während die Transfektionsreaktion (Qiagen Effectene Kit) eingerichtet wird.
  • Für die Transfektion wird der „Effectene"-Transfektionskit (Qiagen) verwendet. Eine Transfektionsmischung wird aus 1 bis 2 μg linearisiertem Insertionsvektor (Gesamtmenge für Mehrfachtransfektion) hergestellt, mit dem Puffer EC, um ein Endvolumen von 100 μl zu ergeben. Dann werden 3,2 μl Verstärker zugegeben, vortexiert und bei Raumtemperatur 5 Min. lang inkubiert. Dann werden 10 μl Effectene zugefügt nachdem das Röhrchen mit dem Stock vortexiert wurde und die Lösung wird mittels Vortexierung gründlich gemischt und bei Raumtemperatur 10 Min. lang inkubiert. 600 μl DMEM/FCS bzw. VP-SFM/L-Glutamin werden zugefügt, gemischt und anschließend wird die gesamte Transfektionsmischung den Zellen zugefügt, die bereits mit Medium bedeckt sind. Der Teller wird sanft geschüttelt, um die Transfektionsreaktion zu mischen. Die Inkubation findet bei 37°C mit 5% CO2 über Nacht statt. Am nächsten Tag wird das Medium entfernt und durch frisches DMEM/FCS oder VP-SFM/L-Glutamin ersetzt. Die Inkubation wird bis zum 3. Tag fortgesetzt.
  • Zur Ernte werden die Zellen in Medium geschabt, dann wird die Zellsuspension in ein geeignetes Röhrchen übertragen und bei –20°C für die kurzfristige Lagerung und bei –80°C für die langfristige Lagerung eingefroren.
  • Die Insertion von Ecogpt in die Insertionsstelle I4L des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBNX39 (1a), der das Ecogpt-Gen enthält (Ecogpt, oder abgekürzt gpt, steht für Phosphoribosyl-Transferasegen) als Reportergen transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren werden mittels 3 Runden Plaquereinigung unter Phosphribosyl-Transferase-Metabolismus-Selektion durch die Zugabe von Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin gereinigt. Mycophenolsäure (MPA) inhibiert Inosinmonophosphat-Dehydrogenase und resultiert bei den meisten Zelllinien in der Blockierung der Purinsynthese und der Inhibition der viralen Replikation. Diese Blockierung kann überwunden werden, indem Ecogpt von einem konstitutiven Promoter exprimiert wird, und die Substrate Xanthin und Hypoxanthin bereitgestellt werden.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle I4L zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID-Nr.: 1) und BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID-Nr.: 2) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 328 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA amplifiziert wird, das eine exogene DNA an der Insertionsstelle I4L eingebaut hat, ist das Fragment entsprechend größer.
  • Die Insertion von NS1 in die IGR 064L bis 065L (I4L bis I5L) Insertionsstelle des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN84 (1c), der das Ecogpt-Gen als Selektionsgen und BFP (blaues fluoreszierendes Protein) als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren werden mittels 7 Runden Plaquereinigung unter Phosphribosyl-Transferase-Metabolismus-Selektion durch die Zugabe von Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin gereinigt. Mycophenolsäure (MPA) inhibiert Inosinmonophosphat-Dehydrogenase und resultiert bei den meisten Zelllinien in der Blockierung der Purinsynthese und der Inhibition der viralen Replikation. Diese Blockierung kann überwunden werden, indem Ecogpt von einem konstitutiven Promoter exprimiert wird und die Substrate Xanthin und Hypoxanthin bereitgestellt werden.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle I4L zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID-Nr.: 1) und BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID-Nr.: 2) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 328 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für NS1 amplifiziert wird, das einen den Denguevirus NS1 codierenden Bereich an der Insertionsstelle I4L eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 1683 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 7 zeigen eindeutig die stabile Insertion von NS1 in die Insertionsstelle I4L nach 17 Runden Virusamplifikation.
  • In-vitro-Test des recMVA, das NS1 beinhaltet (MVA-BN22)
  • Ein T25-Kolben mit etwa 80% konfluenten Monolayern von BHK-Zellen wurde mit 100 μl des Virusstocks inokuliert, auf 1 × 107 in MEMα mit 1% FCS verdünnt, und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang geschüttelt. 5 ml MEMα mit 3% FCS wurde in jeden Kolben zugefügt und bei 30°C in einem CO2-Inkubator inkubiert. Der Kolben wurde nach 48 Stunden geerntet. Der Überstand wurde aus dem Kolben entfernt und bei 260 g 10 Minuten lang bei 4°C geschleudert. Die Überstände wurde in Aliquots bei –80°C gelagert. Das Pellet wurde mit 5 ml von 1 × PBS zweimal gewaschen und dann in 1 ml hypotonischem Douncing-Puffer mit 1% TX100 resuspendiert. Die Zelllysate wurden geerntet und 5 Minuten lang bei 16.000 g geschleudert und die Überstände wurden in einer Mikrozentrifugenröhre bei –80°C gelagert.
  • Die Kolben wurden mit MVA einschließlich GFP, MVA einschließlich des NS1-Gens in einer Deletionsstelle (MVA-BN07) inokuiert, und Mock-infizierte Kolben wurden auch auf die gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt.
  • Das Zell- bzw. Viruslysat und der Überstand wurden in nicht reduzierendem bzw. reduzierendem Probenpuffer unter nicht erwärmten bzw. erwärmten Bedingungen behandelt. Die Proteine wurden auf 10% SDS PAGE separiert und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Blots wurden über Nacht mit Rekonvaleszentenseren aus einem Pool (PPCS) bei einer 1:500 Verdünnung untersucht. Nach 3 Mal Waschen mit 1 × PBS wurden die Blots mit anti-humanem IgG-HRP (DAKO) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Blots wie zuvor beschrieben gewaschen worden waren, wurde die Farbe unter Verwendung von 4-Chloro-1-naphtol entwickelt.
  • Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass NS1 in MVA-BN22 in großen Mengen exprimiert ist. NS1 wurde in der richtigen Konfirmation exprimiert, als Dimer unter nicht erwärmten Bedingungen und als Monomer unter erwärmten Bedingungen.
  • Die NS1-Expression wurde sowohl im MVA-BN22 als auch im MVA-BN07 verglichen. Die BHK-Zellen wurden mit der gleichen PFU inokuliert und nach 48 Stunden geerntet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von NS1 in BN22 sehr viel höher war als in BN07. Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten auch, dass beim BN22-Konstrukt im Vergleich zu BN07 mehr NS1 in den Überstand sekretierte.
  • Die Ergebnisse zeigten auch, dass NS1, das in Zellen exprimiert ist, die mit BN22 infiziert wurden, antigen ist, und von Rekonvaleszentenseren aus einem Pool erkannt wurde.
  • Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NS1 in großen Mengen und in der richtigen Konfirmation in den BHK-Zellen, die mit BN22 infiziert sind, exprimiert wird. Sowohl das Dimer als auch das Monomer sind antigen und werden von Rekonvaleszentenseren aus einem Pool erkannt.
  • Beispiel 2
  • Insertionsvektor pBNX67 und pBN27
  • Die MVA-Sequenzen, die zur neuen Insertionsstelle (an Genomposition 129940) zwischen ORF 136L und 137L benachbart liegen, wurden mittels Standard-PCR-Amplifikation der interessierenden Sequenz isoliert, unter Verwendung der folgenden Primere:
    oBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEQ ID-Nr.: 3) und oBN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAG GT; SEQ ID Nr.: 4) für die isolierende Flanke 1;
    oBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID Nr.: 5) und oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID Nr.: 6) für die isolierende Flanke 2.
  • Das PCR-Fragment, das die Flanke 1 umfasst, wurde mit dem Restriktionsenzymen SacII und XbaI behandelt und an einem SacII/XbaI-verdauten und dephosphorylierten Basisvektor, wie etwa pBluescript (Stratagene) ligiert.
  • Das resultierende Plasmid wurde XhoI/ApaI-verdaut, dephosphoryliert und an das XhoI/ApaI-verdaute PCR-Fragment ligiert, das Flanke 2 umfasst.
  • Optional wurde eine repetitive Sequenz von Flanke 2, die mittels PCR isoliert worden war, unter Verwendung der Primere oBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID Nr.: 7) und oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID Nr.: 8) und die HindIII/PstI-verdaut wurde, in die HindIII/PstI-Stelle des resultierenden Vektors inseriert. 2a) zeigt den Vektor (pBNX51).
  • Eine Reporterkassette, die einen synthetischen Promoter umfasst, wurde NPTII-Gen (Neomycinresistenz), poly-A-Bereich, IRES, EGFP-Gene (Ps-NPTII-polyA-IRES-EGFP) Ec1136II/XhoI-verdaut und in die HindIII/XhoI-Stelle des Insertionsvektors inseriert, wobei die HindIII-Stelle ein glattes Ende hatte mit T4 DNA Polymerase (Roche). Eine Restriktionskarte eines beispielhaften Vektorkonstrukts gemäß diesem Beispiel ist in 2b) offenbart (pBNX67).
  • Für die Konstruktion von pBN27 (2c) wurde der Denguevirus PrM vom Serotyp 4 in die einfache PacI-Stelle von pBNX67 inseriert.
  • Die Generierung des rekombinanten MVA mittels homologer Rekombination
  • Der Vektor pBNX67 (2b) kann verwendet werden, um ein rekombinantes MVA zu generieren, unter Verwendung des oben genannten Protokolls – z. B. unter Verwendung von pBN27 (2c) für homologe Rekombinationsergebnisse in einem rekombinanten MVA, der das Denguevirus PrM4 im intergenen Bereich zwischen zwei benachbarten ORFs trägt.
  • Die Insertion von PrM4 in die Insertionsstelle IGR 136–137 des MVA
  • In einer ersten Runde wurden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN27 (2c), der das NPT-Gen als Selektionsgen und das EGFP (verstärktes grünes fluoreszierendes Protein) als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels 4 Runden Plaquereinigung unter G418-Selektion gereinigt.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle IGR 136–137 zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN900 (cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID Nr.: 9) und BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID Nr.: 10) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 88 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für PrM4 amplifiziert wird, das einen den Denguevirus PrM4 codierende Bereich an der Insertionsstelle IGR 136–137 eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 880 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 8a) zeigen eindeutig die stabile Insertion von PrM4 in die Insertionsstelle IGR 136–137 nach 22 Runden Virusamplifikation. Die rekombinante MVA zeigt noch immer die gleichen Wachstumseigenschaften wie MVA-BN. Es repliziert in embryonalen Hühnerfibroblasten (CEF-Zellen) und wächst attenuiert in Säugetierzellen (8b).
  • Beispiel 3
  • Die Insertionsvektoren pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 und pBN56
  • Die MVA-Sequenzen, die zur neuen Insertionsstelle (an Genomposition 12800) zwischen ORF 007R und 008L benachbart liegen, wurden mittels Standard-PCR-Amplifikation der interessierenden Sequenz isoliert, unter Verwendung der folgenden Primere:
    IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID Nr.: 11) und IGR 07/08 F1end (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID Nr.: 12) für die isolierende Flanke 1;
    IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATA TGGCATAGAAC; SEQ ID Nr.: 13) und IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID Nr.: 14) für die isolierende Flanke 2.
  • Das PCR-Fragment, das die Flanke 1 umfasst, wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und SacI behandelt und an einem SacII/SacI-verdauten und dephosphorylierten Basisvektor, wie etwa pBluescript (Stratagene) ligiert.
  • Das resultierende Plasmid wurde XhoI/ApaI-verdaut, dephosphoryliert und an das XhoI/ApaI-verdaute PCR-Fragment ligiert, das Flanke 2 umfasst.
  • Optional wurde eine repetitive Sequenz von Flanke 2, die mittels PCR isoliert worden war, unter Verwendung der Primere IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID Nr.: 13) und IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCA ATACTA; SEQ ID Nr.: 15) und die BamHI/PstI-verdaut wurde, in die BamHI/PstI-Stelle des resultierenden Vektors inseriert.
  • Jedes Reportergen oder therapeutische Gen, das eine Kassette umfasst, mit z. B. einem poxviralen Promoter, einem Markergen, einem Poly-A-Bereich und optional einem IRES-Element, einem weiteren Gen, das z. B. eine therapeutisch aktive Substanz oder ein Genprodukt exprimiert, kann ein stumpfes Ende mit T4 DNA Polymerase (Roche) nach einer Restriktionsverdauung haben und in eine geeignete Klonierungsstelle des Plasmidvektors inseriert werden. Eine Restriktionskarte eines beispielhaften Vektorkonstrukts gemäß diesem Beispiel ist in 3a) offenbart (pBNX79). Die Insertion der NPT/EGFP-Selektionskassette resultiert in Vektor pBNX86 (3b) bzw. Insertion der gpt/BFP-Selektionskassette in Vektor pBNX88 (3c). Wird eine Expressionseinheit für ein therapeutisches Gen betrachtet, das ein therapeutisches Gen und einen operabel gekoppelten Promoter umfasst, wird diese Expressionseinheit in die PacI-Stelle inseriert. Zur Konstruktion von pBN34 (3d) wurde der Denguevirus PrM2 in pBNX88 cloniert (3c) und für die Synthese von pBN56 (3e) wurde der HIV-env-codierende Bereich PacI-cloniert in pBNX86 (3b).
  • Die Generierung des rekombinanten MVA mittels homologer Rekombination
  • Die Vektoren pBNX86 (3b) bzw. pBNX88 (3c), können verwendet werden, um ein rekombinantes MVA unter Verwendung des oben genannten Protokolls zu generieren. Die Verwendung von pBN34 (3d) für homologe Rekombination resultiert in einem rekombinanten MVA, das das Denguevirus PrM2 in den intergenen Bereich zwischen zwei benachbarten ORFs trägt. Die Rekombination von pBN56 (3e) mit dem MVA-BN-Genom resultiert in einem rekombinanten MVA, das das HIV-env-Gen in den entsprechenden IGR enthält.
  • Die Insertion von PrM2 in die Insertionsstelle IGR 07–08 des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN34 (1c), der das gpt-Gen als Selektionsgen und BFP als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren wurden gereinigt mittels 3 Runden Plaquereinigung unter Selektion durch Mycophenolsäure wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle IGR 07–08 zu amplifizieren, wurde das Primerpaar BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID Nr.: 16) und BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID Nr.: 17) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 190 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für PrM2 amplifiziert wird, das einen den Denguevirus PrM2 codierender Bereich an der Insertionsstelle IGR 07–08 eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 950 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 9a) zeigen eindeutig die stabile Insertion von PrM2 in die Insertionsstelle IGR 07–08 nach 20 Runden Virusamplifikation. Die rekombinante MVA zeigt noch immer die gleichen Wachstumseigenschaften wie MVA-BN. Es repliziert in embryonalen Hühnerfibroblasten (CEF-Zellen) und wächst attenuiert in Säugetierzellen (9b).
  • Die Insertion von HIV env in die Insertionsstelle IGR 07–08 des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN56 (3e), der das NPT-Gen als Selektionsgen und EGFP als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels 6 Runden Plaquereinigung unter G418-Selektion gereinigt.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle IGR 07–08 zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN902 ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID Nr.: 16) und BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID Nr.: 17) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 190 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für env amplifiziert wird, das einen den HIV env codierender Bereich an der Insertionsstelle IGR 07–08 eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 2,6 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 10 zeigen eindeutig die stabile Insertion von env in die Insertionsstelle IGR 07–08 nach 20 Runden Virusamplifikation.
  • Beispiel 4
  • Die Insertionsvektoren pBNX80, pBNX87 und pBN47
  • Die MVA-Sequenzen, die zur neuen Insertionsstelle (an Genomposition 37330) zwischen ORF 044L und 045L benachbart liegen, wurden mittels Standard-PCR-Amplifikation der interessierenden Sequenz isoliert, unter Verwendung der folgenden Primere:
    IGR 44/45 F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID Nr.: 18) und IGR 44/45 F1end (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ ID NO.: 19) für die isolierende Flanke 1;
    IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATT ATT; SEQ ID Nr.: 20) und IGR 44/45 F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEQ ID Nr.: 21) für die isolierende Flanke 2.
  • Das PCR-Fragment, das die Flanke 1 umfasst, wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und SacI behandelt und an einem SacII/SacI-verdauten und dephosphorylierten Basisvektor, wie etwa pBluescript (Stratagene) ligiert.
  • Das resultierende Plasmid wurde XhoI/ApaI-verdaut, dephosphoryliert und an das XhoI/ApaI-verdaute PCR-Fragment ligiert, das Flanke 2 umfasst.
  • Optional wurde eine repetitive Sequenz von Flanke 2, die mittels PCR isoliert worden war, unter Verwendung der Primere IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID Nr.: 20) und IGR 44/45 F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTAT TAACG; SEQ ID Nr.: 22) und die BamHI/PstI-verdaut wurde, in die BamHI/PstI-Stelle des resultierenden Vektors inseriert.
  • Jedes Reportergen oder therapeutische Gen, das eine Kassette umfasst, mit z. B. einem poxviralen Promoter, einem Markergen, einem Poly-A-Bereich und optional einem IRES-Element, einem weiteren Gen, das z. B. eine therapeutisch aktive Substanz oder ein Genprodukt exprimiert, kann ein stumpfes Ende mit T4 DNA Polymerase (Roche) nach einer Restriktionsverdauung haben und in eine geeignete Klonierungsstelle des Plasmidvektors inseriert werden. Wird eine Reportergenkassette der PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, AvaI oder XhoI-Restriktionsenzymstelle zwischen Flanke 2 und der Flanke-2-Repetition wird als Klonierungsstelle bevorzugt. Für die Konstruktion von pBNX87 (4b) wurde die NPT/EGFP-Selektionskassette wurde in pBNX80 (4a) inseriert.
  • Wird eine Expressionseinheit für ein therapeutisches Gen betrachtet, das ein therapeutisches Gen und einen operabel gekoppelten Promoter umfasst, wird diese Expressionseinheit in die PacI-Stelle inseriert.
  • Eine Restriktionskarte von beispielhaften Vektorkonstrukten gemäß diesem Beispiel ist in 4a) und b) offenbart (pBNX80, pBNX87).
  • Der Vektor kann verwendet werden, um einen rekombinanten MVA zu generieren – gemäß dem oben erwähnten Protokoll – der eine exogene Sequenz im intergenen Bereich zwischen den zwei benachbarten ORFs trägt. Für die Konstruktion von pBN47 (4c) wurde das PrM des Denguevirus Serotyp 3 in pBNX87 kloniert (4b).
  • Die Insertion von PrM3 in die Insertionsstelle IGR 44–45 des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN47 (4c), der das NPT-Gen als Selektionsgen und EGFP als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels 3 Runden Plaquereinigung unter G418-Selektion gereinigt.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle IGR 44–45 zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID Nr.: 23) und BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID Nr.: 24) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 185 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für PrM3 amplifiziert wird, das einen den Denguevirus PrM3 codierenden Bereich an der Insertionsstelle IGR 44–45 eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 850 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 11a) zeigen eindeutig die stabile Insertion von PrM3 in die Insertionsstelle IGR 44–45 nach 19 Runden Virusamplifikation. Die rekombinante MVA zeigt noch immer die gleichen Wachstumseigenschaften wie MVA-BN. Es repliziert in embryonalen Hühnerfibroblasten (CEF-Zellen) und wächst attenuiert in Säugetierzellen (11b).
  • Beispiele 5
  • Die Insertionsvektoren pBNX90, pBNX92 und pBN54
  • Die MVA-Sequenzen, die zur neuen Insertionsstelle (an Genomposition 137496) zwischen ORF 148R und 149L benachbart liegen, wurden mittels Standard-PCR-Amplifikation der interessierenden Sequenz isoliert, unter Verwendung der folgenden Primere:
    IGR 148/149 F1up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEQ ID Nr.: 25) und IGR 148/149 F1end (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID Nr.: 26) für die isolierende Flanke 1; IGR 148/149 F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID Nr.: 27) und IGR 148/149 F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ ID Nr.: 28) für die isolierende Flanke 2.
  • Das PCR-Fragment, das die Flanke 1 umfasst, wurde mit den Restriktionsenzymen SacII und XbaI behandelt und an einem SacII/XbaI-verdauten und dephosphorylierten Basisvektor, wie etwa pBluescript (Stratagene) ligiert.
  • Das resultierende Plasmid wurde HindIII/ApaI-verdaut, dephosphoryliert und an das HindIII/ApaI-verdaute PCR-Fragment ligiert, das Flanke 2 umfasst.
  • Optional wurde eine repetitive Sequenz von Flanke 2, die mittels PCR isoliert worden war, unter Verwendung der Primere IGR 148/149 F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID-Nr.: 27) und IGR 148/149 F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID Nr.: 29) und die BamHI/PstI-verdaut wurde, in die BamHI/PstI-Stelle des resultierenden Vektors inseriert.
  • Jedes Reportergen oder therapeutische Gen, das eine Kassette umfasst, mit z. B. einem poxviralen Promoter, einem Markergen, einem Poly-A-Bereich und optional einem IRES-Element, einem weiteren Gen, das z. B. eine therapeutisch aktive Substanz oder ein Genprodukt exprimiert, kann ein stumpfes Ende mit T4 DNA Polymerase (Roche) nach einer Restriktionsverdauung haben und in eine geeignete Klonierungsstelle des Plasmidvektors inseriert werden. Für die Konstruktion von pBNX92 (5b) wurde die gpt/BFP-Expressionskassette in diese Klonierungsstelle inseriert. Eine Reportergenkassette der PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII Restriktionsenzymstelle zwischen Flanke 2 und der Flanke-2-Repetition wird als Klonierungsstelle bevorzugt. Wird eine Expressionseinheit für ein therapeutisches Gen betrachtet, das ein therapeutisches Gen und einen operabel gekoppelten Promoter umfasst, wird diese Expressionseinheit in die PacI-Stelle inseriert. Für die Konstruktion von pBN54 (5c) wurde der Denguevirus PrM1 in diese PacI-Stelle inseriert.
  • Eine Restriktionskarte eines beispielhaften Vektorkonstrukts gemäß diesem Beispiel ist in 5a) und b) offenbart (pBNX90, pBNX92).
  • Der Vektor kann verwendet werden, um einen rekombinanten MVA zu generieren – gemäß dem oben erwähnten Protokoll – der eine exogene Sequenz im intergenen Bereich zwischen den zwei benachbarten ORFs trägt. Für die Generation eines rekombinanten MVA, das das Denguevirus PrM1 pBN54 (5c) exprimiert, wurde für eine homologe Rekombination verwendet.
  • Die Insertion von PrM1 in die Insertionsstelle IGR 148–149 des MVA
  • In einer ersten Runde werden die Zellen mit MVA gemäß dem oben beschriebenen Protokoll infiziert, und dann zusätzlich mit dem Insertionsvektor pBN54 (5c), der das gpt-Gen für das Selektionsgen und BFP als Reportergen enthält, transfiziert. Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels 3 Runden Plaquereinigung unter Selektion mit Mycophenolsäure gereinigt.
  • Die resultierenden rekombinanten Viren wurden mittels Standard-PCR-Assays identifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, das die erwartete Insertionsstelle selektiv amplifiziert. Um die Insertionsstelle IGR 148–149 zu amplifizieren wurde das Primerpaar BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID Nr.: 30) und BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID Nr.: 31) verwendet. Falls die DNA des leeren Vektorvirus MVA amplifiziert wird, ist das erwartete PCR-Fragment 450 Nukleotide (nt) lang, falls ein rekombinantes MVA für PrM1 amplifiziert wird, das einen den Denguevirus PrM1 codierenden Bereich an der Insertionsstelle IGR 148–149 eingebaut hat, wird erwartet, dass das Fragment 1200 bp hat. Die PCR-Ergebnisse aus 12a) zeigen eindeutig die stabile Insertion von PrM1 in die Insertionsstelle IGR 148–149 nach 23 Runden Virusamplifikation. Die rekombinante MVA zeigt noch immer die gleichen Wachstumseigenschaften wie MVA-BN. Es repliziert in embryonalen Hühnerfibroblasten (CEF-Zellen) und wächst attenuiert in Säugetierzellen (12b).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
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  • Figure 00570001

Claims (46)

  1. Rekombinantes modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA), umfassend, eine in einen intergenen Bereich (IGR [intergenic region]) des Virusgenoms inserierte heterologe, exogene DNA-Sequenz.
  2. MVA nach Anspruch 1, wobei die heterologe, exogene DNA-Sequenz in einen IGR zwischen zwei benachbarten offenen Leseraster (ORFs [open reading frames]), ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L, inseriert ist.
  3. MVA nach Anspruch 1 oder 2, wobei die heterologe, exogene DNA-Sequenz mindestens eine codierende Sequenz, vorzugsweise unter der Transkriptionskontrolle eines Poxvirus-Transkriptionskontrollelements, umfaßt.
  4. MVA nach Anspruch 1 bis 3, wobei die heterologe, exogene DNA-Sequenz ein oder mehrere Proteine, Polypeptide, Peptide, Fremdantigene oder antigene Epitope codiert.
  5. MVA nach Anspruch 1 bis 4, wobei die heterologe, exogene DNA-Sequenz aus Dengue-Virus, Japanese-Encephalitis-Virus, Hepatitisvirus B, Hepatitisvirus C und/oder Immunschwächeviren, vorzugsweise menschlichem Immunschwächevirus (HIV), stammt.
  6. MVA nach Anspruch 5, wobei die aus Dengue-Virus stammende heterologe, exogene DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend NS1 und PrM.
  7. MVA nach Anspruch 6, wobei das NS1-Gen in den IGR zwischen den ORFs 064L–065L inseriert ist.
  8. MVA nach Anspruch 6 oder 7, wobei das PrM-Gen aus einem oder mehreren der 4 Dengue-Virus-Serotypen stammt.
  9. MVA nach Anspruch 6 bis 8, wobei das PrM-Gen in den IGR zwischen den ORFs, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 044L–045L, 136L–137L, 148R–149L, inseriert ist.
  10. MVA nach Anspruch 5, wobei die aus Immunschwächevirus stammende heterologe, exogene DNA-Sequenz für HIV-env codiert.
  11. MVA nach Anspruch 10, wobei das HIV-env-Gen in den IGR zwischen den ORFs 007R–008L inseriert ist.
  12. MVA nach Anspruch 1 bis 11, wobei es sich um das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte MVA handelt.
  13. MVA nach Anspruch 1 bis 12 zur Verwendung als Arzneimittel und/oder Impfstoff.
  14. Verwendung des MVA nach Anspruch 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels und/oder Impfstoffs zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Virusinfektion und/oder einer proliferierenden Erkrankung.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Virusinfektion um eine Infektion mit Dengue-Virus oder Immunschwächevirus, vorzugsweise mit HIV, handelt.
  16. Impfstoff, umfassend das MVA nach Anspruch 1 bis 13.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das MVA nach Anspruch 1 bis 13 sowie ein pharmazeutisch unbedenkliches Trägermittel, Verdünnungsmittel, Adjuvans und/oder Zusatzmittel.
  18. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, Polypeptids, Peptids, Antigens oder Epitops in vitro, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: – Infektion einer Wirtszelle mit dem rekombinanten MVA nach Anspruch 1 bis 13, – Kultivierung der infizierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen, – Isolierung und/oder Anreicherung des von der Wirtszelle produzierten Polypeptids, Proteins, Peptids, Antigens, Epitops und/oder Virus.
  19. Verfahren zur In-vitro- oder Ex-vivo-Einführung einer DNA-Sequenz in eine Zelle, wobei die DNA-Sequenz zum Genom der Zelle homolog und/oder heterolog ist, wobei die Zelle mit dem MVA nach Anspruch 1 bis 13 infiziert wird.
  20. Zelle in vitro oder ex vivo, umfassend das MVA nach Anspruch 1 bis 13.
  21. Plasmidvektor, umfassend – eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: a) eine DNA-Sequenz, umfassend eine zwischen zwei benachbarten ORFs des Virusgenoms eines MVA liegende IGR-Sequenz, und/oder b) eine DNA-Sequenz, umfassend flankierende IGR-Sequenzen von zwei benachbarten ORFs des Virusgenoms eines MVA; c) eine DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz a) und/oder b) homolog ist, wobei die homologe Sequenz die Insertion einer zum Genom des MVA-Virus heterologen DNA-Sequenz ("heterologe Sequenz") über homologe Rekombination in den IGR des Virusgenoms steuert; – eine heterologe Sequenz und – gegebenenfalls eine Reporter- und/oder Selektionsgencassette.
  22. Plasmidvektor nach Anspruch 21, wobei die IGR-Sequenz aus einem IGR zwischen den ORFs, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L, stammt.
  23. Plasmidvektor nach Anspruch 21 oder 22, wobei die aus dem IGR stammende Sequenz eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 527-608 der SegID No. 32; – Nr. 299-883 der SegID No. 33; – Nr. 339-852 der SegID No. 34; – Nr. 376-647 der SegID No. 35; – Nr. 597-855 der SegID No. 36; – Nr. 400-607 der SegID No. 37, umfaßt.
  24. Plasmidvektor nach Anspruch 21 bis 23, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L.
  25. Plasmidvektor nach Anspruch 21 bis 24, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 1-526 und 609-1190 der SegID No. 32; – Nr. 101-298 und 884-1198 der SegID No. 33; – Nr. 1-338 und 853-1200 der SegID No. 34; – Nr. 1-375 und 648-1200 der SegID No. 35; – Nr. 1-596 und 856-1200 der SegID No. 36; – Nr. 1-399 und 608-1081 der SegID No. 37, umfassen.
  26. Plasmidvektor nach Anspruch 21 bis 25, wobei es sich bei dem MVA-Virus um das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte MVA handelt.
  27. Verfahren zur In-vitro-Herstellung eines MVA nach Anspruch 1 bis 13, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: – Transfektion einer Zelle mit einem Plasmidvektor nach Anspruch 21 bis 26; – Infektion der transfizierten Zelle mit einem MVA; – Identifizierung, Isolierung und gegebenfalls Reinigung des MVA nach Anspruch 1 bis 13.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Zelle mit dem bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegten MVA infiziert wird.
  29. DNA, umfassend – eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: a) eine DNA-Sequenz, umfassend eine zwischen zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA liegende IGR-Sequenz, und/oder b) eine DNA-Sequenz, umfassend flankierende IGR-Sequenzen von zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA; c) eine DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz a) und/oder b) homolog ist, wobei die homologe Sequenz die Insertion einer zum Genom des MVA-Virus heterologen DNA-Sequenz ("heterologe Sequenz") über homologe Rekombination in den IGR des Virusgenoms steuert; und – eine heterologe Sequenz.
  30. DNA-Sequenz nach Anspruch 29, wobei die IGR-Sequenz aus einem IGR zwischen den ORFs, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L, stammt.
  31. DNA-Sequenz nach Anspruch 29 oder 30, wobei die aus dem IGR stammende Sequenz eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 527-608 der SegID No. 32; – Nr. 299-883 der SegID No. 33; – Nr. 339-852 der SegID No. 34; – Nr. 376-647 der SegID No. 35; – Nr. 597-855 der SegID No. 36; – Nr. 400-607 der SegID No. 37, umfaßt.
  32. DNA-Sequenz nach Anspruch 29 bis 31, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L.
  33. DNA-Sequenz nach Anspruch 29 bis 32, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 1-526 und 609-1190 der SegID No. 32; – Nr. 101-298 und 884-1198 der SegID No. 33; – Nr. 1-338 und 853-1200 der SegID No. 34; – Nr. 1-375 und 648-1200 der SegID No. 35; – Nr. 1-596 und 856-1200 der SegID No. 36; – Nr. 1-399 und 608-1081 der SegID No. 37, umfassen.
  34. DNA-Sequenz nach Anspruch 29 bis 33, wobei es sich bei dem MVA-Virus um das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte MVA handelt.
  35. Verwendung eines Plasmidvektors, umfassend: – eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: a) eine DNA-Sequenz, umfassend eine zwischen zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA liegende IGR-Sequenz, und/oder b) eine DNA-Sequenz, umfassend flankierende IGR-Sequenzen von zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA; c) eine DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz a) und/oder b) homolog ist, wobei die homologe Sequenz die Insertion einer zum Genom des MVA-Virus heterologen DNA-Sequenz ("heterologe Sequenz") über homologe Rekombination in den IGR des Virusgenoms steuert; und – eine in die IGR-Sequenz inserierte Klonierungsstelle zur Insertion der heterologen Sequenz und – gegebenenfalls eine Reporter- und/oder Selektionsgencassette, zur Erzeugung und/oder Herstellung eines rekombinanten MVA nach Anspruch 1 bis 13.
  36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei die IGR-Sequenz aus einem IGR zwischen den ORFs, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L, stammt.
  37. Verwendung nach Anspruch 35 oder 36, wobei die aus dem IGR stammende Sequenz eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 527-608 der SegID No. 32; – Nr. 299-883 der SegID No. 33; – Nr. 339-852 der SegID No. 34; – Nr. 376-647 der SegID No. 35; – Nr. 597-855 der SegID No. 36; – Nr. 400-607 der SegID No. 37, umfaßt.
  38. Verwendung nach Anspruch 35 bis 37, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L.
  39. Verwendung nach Anspruch 35 bis 38, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 1-526 und 609-1190 der SegID No. 32; – Nr. 101-298 und 884-1198 der SegID No. 33; – Nr. 1-338 und 853-1200 der SegID No. 34; – Nr. 1-375 und 648-1200 der SegID No. 35; – Nr. 1-596 und 856-1200 der SegID No. 36; – Nr. 1-399 und 608-1081 der SegID No. 37, umfassen.
  40. Verwendung nach Anspruch 35 bis 39, wobei es sich bei dem MVA-Virus um das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte MVA handelt.
  41. Verwendung einer DNA, umfassend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: a) eine DNA-Sequenz, umfassend eine zwischen zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA liegende IGR-Sequenz, und/oder b) eine DNA-Sequenz, umfassend flankierende IGR-Sequenzen von zwei benachbarten ORFs des Genoms eines MVA; c) eine DNA-Sequenz, die zu der DNA-Sequenz a) und/oder b) homolog ist, wobei die homologe Sequenz die Insertion einer zum Genom des MVA-Virus heterologen DNA-Sequenz ("heterologe Sequenz") über homologe Rekombination in den IGR des Virusgenoms steuert, zur Erzeugung und/oder Herstellung eines Plasmidvektors nach Anspruch 21 bis 26 und/oder zur Erzeugung und/oder Herstellung eines rekombinanten MVA nach Anspruch 1 bis 13.
  42. Verwendung nach Anspruch 41, wobei die IGR-Sequenz aus einem IGR zwischen den ORFs, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L, stammt.
  43. Verwendung nach Anspruch 41 oder 42, wobei die aus dem IGR stammende Sequenz eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 527-608 der SegID No. 32; – Nr. 299-883 der SegID No. 33; – Nr. 339-852 der SegID No. 34; – Nr. 376-647 der SegID No. 35; – Nr. 597-855 der SegID No. 36; – Nr. 400-607 der SegID No. 37, umfaßt.
  44. Verwendung nach Anspruch 41 bis 43, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend: 007R–008L, 018L–019L, 044L–045L, 064L–065L, 136L–137L, 148R–149L.
  45. Verwendung nach Anspruch 41 bis 44, wobei die flankierenden IGR-Sequenzen der zwei benachbarten ORFs eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nukleotidsequenzen – Nr. 1-526 und 609-1190 der SegID No. 32; – Nr. 101-298 und 884-1198 der SegID No. 33; – Nr. 1-338 und 853-1200 der SegID No. 34; – Nr. 1-375 und 648-1200 der SegID No. 35; – Nr. 1-596 und 856-1200 der SegID No. 36; – Nr. 1-399 und 608-1081 der SegID No. 37, umfassen.
  46. Verwendung nach Anspruch 41 bis 45, wobei es sich bei dem MVA-Virus um das bei der ECACC unter der Hinterlegungsnummer V00083008 hinterlegte MVA handelt.
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