CN100494388C - 改进的安卡拉痘苗病毒(mva)基因组中作为插入位点的基因间隔区 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于将外源基因整合到改进的安卡拉痘苗病毒(MVA)基因组上的新插入位点。本发明还提供质粒载体来将外源DNA插入到MVA基因组。此外，本发明提供作为治疗剂或疫苗的重组MVA，其包含被插入到所述新插入位点的外源DNA序列。

Description

改进的安卡拉痘苗病毒(MVA)基因组中作为插入位点的基因间隔区

本发明涉及用于将外源DNA序列整合到MVA基因组中的新插入位点。

背景技术

改进的安卡拉痘苗病毒(MVA)是正痘病毒家族成员，通过痘苗病毒(CVA)的安卡拉病毒株在鸡胚成纤维细胞上连续传代约570代而得到(综述可参见Mayr，A.等[1975]，Infection 3，6-14)。作为传代的结果，得到的MVA病毒与CVA相比缺少31kb的基因组信息，并且对宿主具有高度选择性(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。MVA的特征在于其极度减毒，也就是说毒力和感染性下降，但是仍然具有良好的免疫原性。在各种动物模型中进行检测，证明MVA甚至在免疫受到抑制的个体中也是无致病力的。更加重要的是，MVA病毒株的优良特性已经在大量临床试验中被证实(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987])。在这些超过12万人参与的试验中，包括高危患者，没有产生副作用(Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。

在哺乳动物细胞中还发现，MVA在病毒复制周期的最后阶段被阻断(Sutter，G.和Moss，B.[1992]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851)。从而，MVA完全复制其DNA，合成早期、中期和晚期的基因产物，但是不能组装成熟的感染性病毒体，病毒体从被感染的细胞中释放出。因此，由于复制受到限制，MVA被推荐作为一种基因表达载体。

最近，MVA被用于生产重组疫苗，表达插入到MVA基因组的胸苷激酶(tk)基因位点上(US5,185,146)或者天然存在的缺失位点上(PCT/EP96/02926)的抗原性序列。

虽然tk插入位点被广泛地用于生产重组痘病毒的生产，特别用于生产重组痘苗病毒(Mackett等[1982]P.N.A.S.USA 79，7415-7419)。这种技术不适用于MVA。Scheiflinger等证明，与其他痘病毒相比，MVA对基因组的修饰更加敏感，这种修饰可用于生产重组痘病毒。Scheiflinger等特别证明了用于将异源DNA整合到痘病毒基因组中的最常用的位点之一，即胸苷激酶(tk)基因座，不能被用于生产重组MVA。任何生成的tk(-)重组MVA被证明是高度不稳定的，并且在纯化后立即删除插入的DNA以及MVA的DNA基因组的某些部分(Scheiflinger等，[1996]，Arch Virol，141：663-669)。

因此，不稳定性以及大概率的基因组重组是痘病毒学中的已知问题。事实上，MVA是在长期的传代过程中被建立，利用了CVA病毒基因组在组织培养细胞中体外复制时不稳定的事实。成千上万的核苷酸(31kb)已经从MVA基因组中被删除，与原始的CVA基因组相比，表现为6种主要的和无数小片段的缺失。

最近，MVA的基因组结构被描述(Antoine等，[1998]，Virology 244，365-396)。178kb的MVA基因组被密集地包裹，包含193个独立的开放阅读框(ORF)，编码长度至少为63个氨基酸的蛋白质。与高感染性的天花病毒以及称作哥本哈根(Copenhagen)病毒株的痘苗病毒原型相比，MVA的大多数ORF被切成片段或被截短(Antoine等，[1998]，Virology 244，365-396)。但是，极少例外，所有ORF被转录和翻译成蛋白质，包括片段化的和截短的ORF。在下文中，采用Antoine等的命名，适当时也指明了基于限制性酶消化的命名。

迄今，仅将外源DNA插入到MVA基因组的天然缺失位点上获得稳定的重组MVA(PCT/EP96/02926)。不幸的是，MVA基因组中仅有有限数量的天然缺失位点。此外，已经证明其他插入位点如tk基因座几乎不能被用于生产重组MVA(Scheiflinger等，[1996]，Arch Virol 141：663-669)。

发明目的

本发明的目的是确定MVA基因组的其他插入位点，并提供插入载体，该插入载体引导外源DNA序列插入到MVA基因组的所述新确定的位点上。

本发明还有一个目的是提供重组MVA，其包括被稳定地整合到MVA基因组的新插入位点上的外源DNA序列。

发明详述

本发明的发明者确定用于将外源DNA序列插入到改进的安卡拉痘苗(MVA)病毒基因组的新位点。新插入位点定位在病毒基因组的基因间隔区(IGR)，反过来说，其中所述IGR定位在MVA基因组的两个相邻开放阅读框(ORF)之间或与两个相邻的ORF侧面连接。

因此，本发明涉及包含插入到病毒基因组的IGR的异源DNA序列的重组MVA。按照本发明，一种或多种外源DNA序列可以被插入到一个或多个IGR中。

令人惊奇地发现，外源DNA序列实际上被稳定地插入到MVA基因组的IGR中：如上面已经指出，MVA基因组被认为是十分不稳定的。似乎，病毒繁殖不必需的基因或DNA序列都被删除或切割。尽管还惊奇地发现，当异源DNA序列被插入到MVA基因组的天然缺失位点时，得到了稳定的重组MVA(PCT/EP96/02926)，另一方面还发现，被广泛地用于生产其他重组痘病毒的宿主范围基因如tk-基因座不是MVA中的合适插入位点。Vero-MVA具有一个额外的基因组缺失的事实(PCT/EP01/02703)也说明了基因组在某种意义上是高效能的(dynamic)，它很容易删除繁殖所不需要的基因。因此，可以预料，将对于病毒繁殖来说不是必需的异源DNA序列插入ORF之间的位置上同样会被病毒删除。

ORF的核苷酸序列编码构成肽、多肽或蛋白质的氨基酸序列，两个ORF之间的IGR不具有编码能力，但是可能包含参与病毒基因表达的转录调控所必需的调控元件，结合位点，启动子和/或增强子序列。因此，IGR可能参与病毒生活周期的调控。然而，本发明的发明人也证明新的插入位点具有意想不到的优点，外源DNA序列可以被稳定地插入到MVA基因组中，而不影响或改变MVA的典型特征和基因表达。因为新的插入位点不会改变MVA的ORF或编码序列，所以是特别有用的。

而且，惊奇地发现被插入到IGR的外源基因的表达水平高于被插入到MVA基因组的缺失位点的外源基因的表达水平(另参见实施例1)。

ORF的核苷酸序列规律性地以起始密码子开始而且以终止密码子结束。根据两个邻近的ORF的方向，这些ORF之间的区域IGR与两个邻近的ORF的两个终止密码子侧面连接，或者与两个邻近的ORF的两个起始密码子侧面连接，或者与第一个ORF的终止密码子和第二个ORF的起始密码子侧面连接，或者与第一个ORF的起始密码子和第二个ORF的终止密码子侧面连接。

相应地，外源基因插入IGR的插入位点位于第一个ORF的下游或3’终止密码子端。当邻近ORF，也称作第二个ORF，具有与第一个ORF相同的方向时，位于第一个ORF的终止密码子下游的插入位点位于第二个ORF的起始密码子的上游或5’起始密码子端。

当第二个ORF具有与第一个ORF相反的方向时，也就是说两个邻近ORF的方向彼此相对时，那么插入位点位于两个ORF的终止密码子的下游。

作为第三种选择，在两个邻近的ORF以相反方向读取时，但是两个邻近的ORF的取向相互背离，这等同于这样的分布，其特征在于两个ORF的起始密码子相互邻近，外源DNA被插入到相对于两个起始密码子的上游。

MVA基因组中的ORF以两种编码方向存在。结果聚合酶从左到右地起作用即正向，和相应地从右到左起作用(反向)。这是痘病毒学中的常规操作，并且成为通过痘苗病毒在基因组的不同HindIII限制性消化片段上的方向和位置来确定ORF的标准分类。对于该命名，不同HindIII片段通过对应于其递减大小的递减首字母来命名。ORF从左到右在各个HindIII片段上编号，ORF的方向用大写字母L(表示转录从右到左)或R(表示转录从左到右)来表示。另外，较近公开的MVA基因组结构中采用了不同命名，从基因组的左边到右边简单命名ORF，用大写L或R表示它们的方向(Antoine等，[1998]，Virology244，365-396)。作为一个实例，按照老的命名I4L ORF对应于按照Antoine等命名的064L ORF。如果没有另外指出，本发明采用按照Antoine等的命名。

按照本发明，异源DNA序列可以被插入到选自下组的两个邻近ORF之间的一个或多个IGR中，该组包括：

001L-002L，002L-003L，005R-006R，006L-007R，007R-008L，008L-009L，017L-018L，018L-019L，019L-020L，020L-021L，023L-024L，024L-025L，025L-026L，028R-029L，030L-031L，031L-032L，032L-033L，035L-036L，036L-037L，037L-038L，039L-040L，043L-044L，044L-045L，046L-047R，049L-050L，050L-051L，051L-052R，052R-053R，053R-054R，054R-055R，055R-056L，061L-062L，064L-065L，065L-066L，066L-067L，077L-078R，078R-079R，080R-081R，081R-082L，082L-083R，085R-086R，086R-087R，088R-089L，089L-090R，092R-093L，094L-095R，096R-097R，097R-098R，101R-102R，103R-104R，105L-106R，107R-108L，108L-109L，109L-110L，110L-111L，113L-114L，114L-115L，115L-116R，117L-118L，118L-119R，122R-123L，123L-124L，124L-125L，125L-126L，133R-134R，134R-135R，136L-137L，137L-138L，141L-142R，143L-144R，144R-145R，145R-146R，146R-147R，147R-148R，148R-149L，152R-153L，153L-154R，154R-155R，156R-157L，157L-158R，159R-160L，160L-161R，162R-163R，163R-164R，164R-165R，165R-166R，166R-167R，167R-168R，170R-171R，173R-174R，175R-176R，176R-177R，178R-179R，179R-180R，180R-181R，183R-184R，184R-185L，185L-186R，186R-187R，187R-188R，188R-189R，189R-190R，192R-193R。

按照老的命名，ORF006L对应于C10L，019L对应于C6L，020L对应于N1L，021L对应于N2L，023L对应于K2L，028R对应于K7R，029L对应于F1L，037L对应于F8L，045L对应于F15L，050L对应于E3L，052R对应于E5R，054R对应于E7R，055R对应于E8R，056L对应于E9L，062L对应于I1L，064L对应于I4L，065L对应于I5L，081R对应于L2R，082L对应于L3L，086R对应于J2R，088R对应于J4R，089L对应于J5L，092R对应于H2R，095R对应于H5R，107R对应于D10R，108L对应于DHL，122R对应于A11R，123L对应于A12L，125L对应于A14L，126L对应于A15L，135R对应于A24R，136L对应于A25L，137L对应于A26L，141L对应于A30L，148R对应于A37R，149L对应于A38L，152R对应于A40R，153L对应于A41L，154R对应于A42R，157L对应于A44L，159R对应于A46R，160L对应于A47L，165R对应于A56R，166R对应于A57R，167R对应于B1R，170R对应于B3R，176R对应于B8R，180R对应于B12R，184R对应于B16R，185L对应于B17L，187R对应于B19R。

优选地，异源序列被插入到与两个邻近ORF侧面连接的IGR中，所述两个邻近的ORF选自包含007R-008L、018L-019L044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

异源的或外源的DNA序列是实际上通常与本发明所用的痘病毒无关的序列。按照本发明的还有一个实施方案，外源DNA序列包含至少一个编码序列。该编码序列被可操作地与转录控制元件连接，优选连接到痘病毒转录控制元件上。另外，还可以采用痘病毒转录调控元件与例如内部核糖体进入位点的组合。

按照还有一个实施方案，外源DNA序列还可以包含两个或多条编码序列，被连接到一个或多个转录控制元件上。优选地，编码序列编码一种或多种蛋白质、多肽、肽、外源抗原或抗原表位，特别是那些具有治疗意义的基因。

按照本发明的治疗上有意义的基因可以是来自致病的病原体或感染性微生物的基因或者与之同源的基因。因此，在本发明的上下文中，这种治疗上有意义的基因被呈递给生物体的免疫系统来影响、优选诱导特定的免疫反应和，从而接种免疫或预防性地保护生物体抵抗微生物的感染。在本发明的还有一个优选实施方案中，治疗上有意义的基因选自感染性病毒的基因，例如但不限于登革病毒、日本脑炎病毒、乙肝病毒或丙肝病毒，或免疫缺陷病毒如HIV。

来源于登革病毒的基因优选为NS1和PrM基因，其中所述基因可以来自一种、两种、三种或所有的四种登革病毒血清型。NS1基因优选来源于登革病毒血清2型，并优选被插入到ORF 064L-065L(I4L-I5L)之间的IGR中。PrM基因优选来源于所有四种登革病毒血清型，并优选被插入到ORF之间的IGR中，所述ORF选自007R-008L、044L-045L、136L-137L或148R-149L。更加优选地，来自登革病毒血清1型的PrM(prM1)被插入到148R-149L之间的IGR中，PrM 2插入007R-008L之间的IGR中，PrM 3插入ORF 044L-045L之间的IGR中，和PrM 4插入IGR 136L-137L中。

按照本发明的还有一个方面，异源DNA序列来自HIV，并且编码HIVenV，其中HIV env优选被插入到ORF 007R-008L之间的IGR中。

而且，按照本发明的治疗上有意义的基因还包括疾病相关基因，其对增生紊乱、癌症或代谢疾病具有治疗作用。例如，与癌症相关的治疗上有意义的基因可以作为癌症抗原，能够诱导特定的抵抗癌症的免疫反应。

按照本发明的还有一个实施方案，编码序列包含至少一个标记或选择基因。

选择基因将特定抗性转导给细胞，从而能够使用一些选择方法。技术人员熟悉各种选择基因，它们可以被应用于痘病毒系统中。在这些基因中有新霉素抗性基因(NPT)或磷酸核糖转移酶基因(gpt)。

标记基因在被转导的细胞中诱导显色反应，可以用来确定被转导的细胞。技术人员熟悉各种标记基因，它们可以被应用于痘病毒系统。在这些基因中有编码例如β半乳糖苷酶(β-gal)、β-葡糖苷酶(β-glu)、绿色荧光蛋白(EGFP)或蓝色荧光蛋白的基因。

按照本发明的还有一个实施方案，外源DNA序列包含间隔序列(spacersequence)，间隔序列将痘病毒转录控制元件和/或外源DNA序列中的编码序列与邻近ORF的终止密码子和/或起始密码子分开。位于邻近ORF的终止/起始密码子和外源DNA的插入编码序列之间的间隔序列具有稳定插入外源DNA以及任何生成的重组病毒的优点。间隔序列的大小是可变的，只要该序列不具有自身编码或调控功能。

按照另一个实施方案，将痘病毒转录调控元件和/或外源DNA序列中的编码序列与邻近ORF的终止密码子分开的间隔序列至少为1个核苷酸长度。

按照本发明的另一个实施方案，将痘病毒转录调控元件和/或外源DNA序列中的编码序列与邻近ORF的起始密码子分开的间隔序列至少为30核苷酸。特别地，在典型的痘苗病毒启动子元件位于起始密码子的上游时，插入外源DNA不能将启动子元件与邻近ORF的起始密码子分开。典型的痘苗病毒启动子元件可以通过扫描例如晚期启动子序列“TAAAT”(Davison & Moss，J.Mol.Biol.1989；210：771-784)和早期启动子的富含A/T的结构域来鉴定。约30个核苷酸的间隔序列是保护位于ORF的起始密码子上游的痘病毒启动子不被干扰的优选距离。此外，按照另一个优选实施方案，插入的外源DNA和邻近ORF的起始密码子的距离约50个核苷酸，更优选为约100个核苷酸。

按照本发明的另一个优选实施方案，间隔序列包含其他痘病毒转录调控元件，其能够控制邻近ORF的转录。

可以按照本发明被用于制备重组MVA的典型MVA病毒株是MVA-575，其已经被保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection ofAnimal Cell Cultures)，保藏号为ECACC V00120707。

另一个优选MVA病毒株是MVA-Vero或其衍生物。MVA-Vero病毒株被保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号为ECACC V99101431和01021411。MVA-Vero的安全性通过生物的、化学的和物理的特性反映，如在国际专利申请PCT/EP01/02703中所描述。与其他MVA病毒株比较，Vero-MVA包括一个额外的基因组缺失。

还有另一种优选的MVA病毒株是MVA-BN。MVA-BN已经被保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号为ECACC V00083008。MVA-BN病毒是极度减毒的病毒，也是来源于改进的安卡拉痘苗病毒(还参见PCT/EP01/13628)。

按照本发明，术语病毒的“衍生物”是指具有与亲本病毒相同的典型特征，但是在基因组的一个或多个部分不同的后代病毒。术语“MVA衍生物”表述一种病毒，其具有一些与MVA相同的功能特征。例如，MVA-BN衍生物具有MVA-BN的典型特征。MVA-BN或其衍生物的这些特征之一是其在人HaCat细胞中毒力下降并不能复制。

本发明的重组MVA可以用作药物或疫苗。按照另一个实施方案，重组MVA被用于将外源编码序列导入到目标细胞中，所述序列与目标细胞的基因组同源或异源。

可以在体外将外源编码序列导入到目标细胞中来制备蛋白质、多肽、肽、抗原或抗原表位。这种方法包括用本发明的重组MVA感染宿主细胞，在合适条件下培养被感染的宿主细胞，和分离和/或富集由所述宿主细胞生产的多肽、肽、蛋白质、抗原、表位和/或病毒。

而且，将一种或多种同源的或一种或多种异源序列导入细胞的方法可应用于体外和体内治疗。例如，在体外治疗中，按照本发明用重组MVA在先(离体(ex vivo))感染的分离细胞被施用给活动物机体来影响，优选诱导免疫反应。对于体内治疗，按照本发明的重组痘病毒被直接施用到活动物机体中来影响，优选诱导免疫反应。在这种情况下，接种部位周围的细胞以及病毒通过如血流转运到达的细胞被按照本发明的重组MVA在体内直接感染。感染后，这些细胞合成治疗性基因的蛋白质、肽或抗原表位，由外源编码序列编码并随后将它们或其部分呈递到细胞表面。免疫系统的特化细胞(specializedcell)识别这种异源蛋白、肽或表位的存在，并发动特异的免疫反应。

由于MVA是高度生长受限的，和极度减毒的，因此，其可以被用于治疗广大哺乳动物包括人，包括免疫受损的动物或人。本发明还提供用于在活动物机体包括人中诱导免疫反应的药物组合物和疫苗。

药物组合物通常包括一种或多种药学上可接受的和/或允许的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这种辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的分子如蛋白质、多糖、多聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物等。

对于疫苗制备，按照本发明的重组痘病毒被转化为生理上可接受形式。这可以根据在制备用于免疫接种抵抗天花的痘病毒疫苗的经验来进行(如Stickl，H.等，[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所描述)。例如纯化的病毒以5×10E8 TCID₅₀/ml的滴度配制在约10mM Tris，140mM NaCl pH7.4中，保存在-80℃。对于制备疫苗散粒(vaccine shot)，如病毒的10E2-10E8颗粒被冻干在安瓿中的含有2％蛋白胨和1％人白蛋白的100ml磷酸缓冲液(PBS)中。可选择地，疫苗散粒可以通过逐步冷冻干燥制剂中的病毒来制备。这种制剂可以含有其他添加剂，例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他适合于体内施用的酸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(如人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿密封，可以在4℃和室温之间保存数月。但是，只要不被使用，安瓿优选保存在低于-20℃温度。

用于免疫接种或治疗，冻干物可以溶解在0.1-0.5ml的水溶液中，优选在生理盐水或Tris缓冲液中，系统地或局部地施用，即胃肠外、皮下、肌肉内，通过划痕或技术人员知晓的其他施用路径。施用的模式、剂量和次数可以由本领域技术人员以已知方式优化。但是，最常规的是在第一次免疫接种注射(shot)后约一个月到六周进行第二次注射免疫接种患者。

本发明还涉及质粒载体，其可以被用于制备本发明的重组MVA，还涉及一些DNA序列：

一般地，位于两个邻近ORF之间或者与两个邻近ORF侧面连接的IGR包括其中可插入目标外源DNA序列的苷酸序列。相应地，本发明的质粒载体包含来源于MVA基因组或与MVA基因组同源的DNA序列，其中所述DNA序列包含位于或侧面连接于病毒基因组的两个邻近ORF之间的IGD序列的完整或部分片段。优选地，质粒载体包含在所述IGR来源序列的至少一个克隆位点插入目标外源DNA序列和，优选地，插入被连接到所述异源DNA序列的痘病毒转录控制元件。可选择地，质粒载体包含报道和/或选择基因表达盒。质粒载体优选还包含侧面连接所述IGR序列的完整或部分片段的两个邻近ORF的序列。

已经确定了一些不包括核苷酸序列的IGR。在这种情况下，质粒载体包含IGR侧翼序列(IGR flanking sequence)的DNA序列，即两个邻近ORF的DNA序列。优选地，用于插入异源DNA序列的克隆位点被插入到IGR中。IGR侧翼序列的DNA被用于引导外源DNA序列插入到MVA基因组的相应IGR中。这种质粒载体还包括IGR序列的完整或部分片段，IGR序列包含用于插入异源DNA序列和可选择地插入报道和/或选择基因表达盒的克隆位点。

IGR-DNA序列以及两个邻近ORF序列的IGR侧翼序列优选地分别从选自001L-002L、002L-003L、005R-006R、006L-007R、007R-008L、008L-009L、017L-018L、018L-019L、019L-020L、020L-021L、023L-024L、024L-025L、025L-026L、028R-029L、030L-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、036L-037L、037L-038L、039L-040L、043L-044L、044L-045L、046L-047R、049L-050L、050L-051L、051L-052R、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079R、080R-081R、081R-082L、082L-083R、085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、092R-093L、094L-095R、096R-097R、097R-098R、101R-102R、103R-104R、105L-106R、107R-108L、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、122R-123L、123L-124L、124L-125L、125L-126L、133R-134R、134R-135R、136L-137L、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、162R-163R、163R-164R、164R-165R、165R-166R、166R-167R、167R-168R、170R-171R、173R-174R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R、188R-189R、189R-190R、192R-193R的IGR和ORF中选择。

更加优选地，这些序列从分别选自007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148L-149L的IGR和ORF中选择。IGR来源的序列优选选自核苷酸序列

-Seq ID No.32的527-608

-Seq ID No.33的299-883

-Seq ID No.34的339-852

-Seq ID No.35的376-647

-Seq ID No.36的597-855

-Seq ID No.37的400-607。

与两个邻近ORF序列侧面连接的IGR优选地选自核苷酸序列

-Seq ID No.32的1-525和609-1190

-Seq ID No.33的101-298和884-1198

-Seq ID No.34的1-338和853-1200

-Seq ID No.35的1-375和648-1200

-Seq ID No.36的1-596和856-1200

-Seq ID No.37的1-399和608-1081。

DNA序列优选来源于保藏在ECACC的保藏号为V00083008的MVA的基因组或与该基因组同源。

为了制备本发明的质粒载体，所述序列被分离并克隆到常规克隆载体上，如pBluescript(Stratagene)，其中这些序列位于将被插入到MVA基因组中的外源DNA的侧面。可选择地，这种质粒载体包含选择或报道基因盒，由于所述表达盒中包括了重复序列，表达盒可以从最终的重组病毒中被删除。

通过质粒载体将外源DNA序列导入MVA基因组的方法以及获得重组MVA的方法是本领域技术人员熟知的，此外，可以从如下参考文献中得到：

-“分子克隆实验手册”，第二版，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis编写，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：描述如何进行常规分子生物学技术的技术和知识，如DNA克隆、RNA分离、western印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术。

-“病毒学方法手册”，由Brian WJ Mahy和Hillar0 Kangro编写，Academic Press，1996：描述病毒的处理和加工技术；

-“分子病毒学操作方法”，由AJ Davison和RM Elliott编写，ThePractical Approach Series.IRL Press at Oxford University Press.Oxford 1993，第9章：通过痘苗病毒载体表达基因；

-“分子生物学常用方法”，出版者：John Wiley和Son Inc.1998，第16章，第IV节：采用痘苗病毒载体在哺乳动物细胞中表达蛋白质：描述如何处理、加工和遗传工程MVA的技术和知识。

本发明的MVA，优选为以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA，通过用本发明的质粒载体转染细胞，用MVA感染被转化的细胞，和接着鉴定、分离和，任选可选择地纯化本发明的MVA来制备。

本发明的DNA序列可以被用于鉴定或分离本发明的MVA或其衍生物和用本发明的MVA感染的细胞或个体。所述DNA序列例如被用于制备PCR引物、杂交探针或被用于阵列技术。

附图说明

附图1：载体构建体BNX39(附图1a)、pBNX70(附图1b)和pBN84(附图1c)的限制性酶切图，包含与位于I4L ORF后的插入位点侧面连接的约600bp的MVA序列。所述质粒在侧翼序列Flank 1(F1 I4L-I5L)和Flank 2(F2 I4L-I5L)之间还包含在痘病毒启动子P)转录调控下的外源DNA(分别为Ecogpt和hBFP)。Flrpt链是Flank 1的重复序列，以便从生成的重组病毒上删除报道表达盒。pBN84(附图1c)还编码登革病毒NS1蛋白(NS1 DEN)。其他缩写：AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；bps＝碱基对。

附图2：载体构建体BNX51(附图2a)、pBNX67(附图2b)和pBN27(附图2c)的限制性酶切图，包含与位于ORF 137L后的插入位点侧面连接的约600bp的MVA序列(Flank 1：F1136-137对应于MVA基因组的129340-129930；Flank 2：F2136-137对应于MVA基因组的129931-130540)。此外，载体pBNX67(附图2b)在侧翼序列之间包含受痘病毒启动子P)转录调控下的外源DNA(NPT II基因＝新霉素抗性)。F2rpt链是Flank 2的重复序列，以从生成的重组病毒中删除报道表达盒。pBN27(附图2c)还编码在痘病毒启动子调控下的登革病毒PrM4。其他缩写：AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；bps＝碱基对；IRES内部核糖体进入位点；EGFP＝增强绿色荧光蛋白基因。

附图3：载体构建体pBNX79(附图3a)、pBNX86(附图3b)、pBNX88(附图3c)、pBN34(附图3d)和pBN56(附图3e)的限制性酶切图，包含与位于ORF007R和008L之间的插入位点侧面连接的约600bp的MVA序列(Flank 1：F1IGR 07-08起始于MVA基因组的12200；Flank 2：F2 IGR 07-08终止于MVA基因组的13400)。F2rpt链为Flank 2的重复序列，以从生成的重组病毒上删除报道表达盒。另外载体pBNX88(附图3c)和pBNX86(附图3b)在侧翼序列之间包含受痘病毒启动子P)调控的外源DNA(分别是BFP+gpt和NPTII+EGFP)。F2rpt链是Flank 2的重复序列，以从生成的重组病毒上删除报道表达盒。PBN56(附图3e)还编码HIV-1env蛋白，而pBN34(附图3d)含有在痘病毒调控下的登革病毒PrM2编码序列。其他缩写：AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；bps＝碱基对。

附图4：载体构建体pBNX80(附图4a)、pBNX87(附图4b)和pBN47(附图4c)的限制性酶切图，包含与位于ORF 044L和045L之间的插入位点侧面连接的600/640bp的MVA序列(Flank 1：F1IGR44-45起始于MVA基因组的36730；Flank 2：F2 IGR 44-45终止于MVA基因组的37970)。此外，载体pBNX87(附图4b)在侧翼序列之间包含受痘病毒启动子P)转录调控的外源DNA(NPTII基因+EGFP)。F2rpt链为Flank 2的重复序列，以从生成的重组病毒上删除报道表达盒。PBN47(附图4c)还编码受痘病毒启动子调控的登革病毒PrM3。其他缩写：AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；bps＝碱基对。

附图5：载体构建体pBNX90(附图5a)、pBNX92(附图5b)和pBN54(附图5c)的限制性酶切图，包含与位于ORF 148R和149L之间的插入位点侧面连接的596/604的MVA序列(Flank 1：F1IGR148-149起始于MVA基因组的136900；Flank 2：F2 IGR 148-149终止于MVA基因组的138100)。此外，载体pBNX92(附图5b)在侧翼序列之间包含受痘病毒启动子P)转录调控的外源DNA(gpt+BFP)。PBN54(附图5c)还编码登革病毒PrM1。F2rpt链为Flank 2的重复序列，以从生成的重组病毒上删除报道表达盒。其他缩写：AmpR＝氨苄青霉素抗性基因；bps＝碱基对。

附图6：MVA(Genbank Ac.U94848)的整合插入位点的示意图。

附图7：重组MVA中的IGR I4L-I5L的PCR分析，在IGR I4L-I5L中插入登革NS1。泳道“BN”表示使用MVA-BN空载体的PCR产物。使用NS1重组MVA，较大的片段是可检测的(1、2、3、4：不同浓度DNA)。M＝分子量标记，H₂O水阴性对照。

附图8：附图8a：PCR分析重组MVA中的IGR 136-137，在IGR 136-137中插入登革病毒PrM4。泳道“BN”表示采用MVA-BN空载体的PCR产物。使用PrM4重组MVA，较大片段是可检测的(mBN23，1/10，1/100：不同浓度DNA)。M＝分子量标记，H₂O＝水阴性对照，pBN27＝质粒阳性对照。

附图8b：MVA-BN空载体和在IGR 136-137中插入PrM4的重组MVA(MVA-mBN23)的多步生长曲线。

附图9：附图9a：PCR分析重组MVA中的IGR 07-08，在IGR07-08中插入登革PrM2。泳道3表示采用MVA-BN空载体的PCR产物。使用PrM2重组MVA，较大片段是可检测的(泳道2)。M＝分子量标记，泳道1＝水阴性对照。

附图9b：MVA-BN空载体和在IGR 07-08中插入PrM2的重组MVA(MVA-mBN25)的多步生长曲线。

附图10：PCR分析重组MVA中的IGR 07-08，在IGR 07-08中插入HIVenv。泳道BN表示采用MVA-BN空载体的PCR产物。使用PrM2重组MVA，较大片段是可检测的(泳道1、2、3)。M＝分子量标记，-＝水阴性对照，+＝质粒阳性对照。

附图11：附图11a：PCR分析重组MVA中的IGR 44-45，在IGR 44-45中插入登革病毒PrM3。泳道BN表示采用MVA-BN空载体的PCR产物。使用PrM3重组MVA，较大片段是可检测的(泳道1-4，不同浓度DNA)。M＝分子量标记，-＝水阴性对照。

附图11b：MVA-BN空载体和在IGR 44-45中插入PrM3的重组MVA(MVA-mBN28)的多步生长曲线。

附图12：附图12a：PCR分析重组MVA中的IGR 148-149，在IGR 148-149中插入登革病毒PrM1。泳道BN表示采用MVA-BN空载体的PCR产物。使用PrM1重组MVA，较大片段是可检测的(泳道1)。M＝分子量标记，-＝水阴性对照，+＝质粒阳性对照。

附图12b：MVA-BN空载体和在IGR 44-45中插入PrM1的重组MVA(MVA-mBN33)的多步生长曲线。

如下实施例将进一步阐明本发明。任何一位本领域技术人员将能够理解，所提供的实施例决不被解释为在某种程度上将本发明限制在这些实施例中。本发明的保护范围仅仅由附随的权利要求书的全部保护范围来限定。

实施例1

插入载体pBNX39、pBNX70和pBN84

为了将外源序列插入到邻近MVA的065L ORF的基因间隔区(插入位点在基因组的56760)，构建包含邻近于该插入位点的约1200bp的侧翼序列的载体。这些侧翼序列被分成两个侧翼(flank)，在一个侧翼上包含约610bp的065L ORF(另一种命名：I4L ORF)和在另一个上包含065L ORF后的约580bp的基因间隔区以及最近的ORF的部分。在这些侧翼序列之间，Ecogpt基因(从大肠杆菌中分离的磷酸核糖转移酶基因的gpt链)和BFP(蓝色荧光蛋白)分别位于痘病毒启动子的转录调控之下。此外，至少有一个用于插入其他基因或序列的克隆位点被插入到I4L ORF后的基因间隔区。按照本发明的示例性载体构建体被公开在附图1a)和b)中(pBNX39，pBNX70)。在载体pBN84(附图1c)中，登革病毒NS1的编码序列被插入到pBNX70的克隆位点上(附图1b)。

通过同源重组制备重组MVA

外源基因可以通过同源重组被插入到MVA基因组中。为了将目的外源基因克隆到质粒载体中，如上所述。该载体被转染到MVA感染的细胞中。在被感染和被转染的细胞的细胞质中发生重组。借助插入载体中还含有的选择和/或报道表达盒，包括重组病毒的细胞被鉴定和分离。

为同源重组，BHK(幼年仓鼠肾)细胞或CEF(原始鸡胚成纤维细胞)被种植在6孔平板中，使用DMEM(Dulbecco′s Modified Eagles Medium，GibcoBRL)+10％胎牛血清(FCS)或VP-SFM(Gibco BRL)+4mmo l/l L-谷氨酰胺用于无血清制备过程。

细胞需要仍处于生长阶段并且在转染当天达到60-80％汇合。细胞在植入之前计数，获知细胞数量决定感染复数(moi)。

用于感染，MVA母液在DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酰胺中被稀释，使得500μl的稀释液中含有大约产生0.1-1.0moi的病毒含量。假定细胞在植入后分裂一次。去除培养液，细胞用500μl稀释的病毒感染1h，在室温下旋转。去除接种物，用DMEM/VP-SFM洗涤细胞。被感染的细胞分别溶解在1.6ml DMEM/FCS和VP-SFM/L-谷氨酰胺中，而开始转染反应(QiagenEffectene Kit)。

对于转染，使用＂Effectene＂转染试剂盒(Qiagen)。转染混合物用1-2μg线性化插入载体(多次转染的总量)与缓冲液EC制备，最终体积为100μl。加入3.2μl Enhancer，摇晃并在室温下温育5min。然后，在摇晃母液管后加入10μlEffectene通过摇晃和在室温下温育10min来充分混合溶液。分别加入600μlDMEM/FCS和VP-SFM/L-谷氨酰胺，混合，接着将全部转染混合液加入到细胞中，这些细胞已经浸没在培养液中。轻轻地摇动培养皿来混合转染反应液。在37℃、5％CO2中培养过夜。第二天，去除培养液，用鲜新的DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酰胺替换。继续培养直到第3天。

回收时，细胞被刮到培养液中，然后将细胞悬浮液转移到适当试管中，冻存在-20℃以短期保存或者在-80℃长期保存。

在MVA的I4L插入位点插入Ecogpt

在第一轮中，细胞用MVA按照上述方案感染，并且另外用含有作为报道基因的Ecogpt基因(Ecogpt或者被切短为gpt磷酸核糖转移酶基因的链)的插入载体pBNX39(附图1a)转染。生成的重组病毒通过三轮噬斑纯化来纯化，在磷酸核糖转移酶代谢选择条件下加入霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤。霉酚酸(MPA)抑制的次黄苷单磷酸脱氢酶，并导致嘌呤合成中断和大部分细胞系中病毒复制被抑制。这种中断可以通过由组成型启动子表达Ecogpt并提供底物黄嘌呤和次黄嘌呤来克服。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增预期插入位点的引物对。为了扩增I4L插入位点，使用引物对BN499(CAA CTC TCTTCT TGA TTA CC，SEQ ID NO：1)和BN500(CGA TCAAAG TCA ATC TAT G，SEQ ID NO：2)。当空载体病毒MVA被扩增的情况下，期望的PCR片段长为328个核苷酸(nt)，在重组MVA被扩增的情况下，片段相应地被扩大，重组MVA在I4L插入位点上具有并入的外源DNA。

在MVA的IGR064L-065L(I4L-I5L)插入位点上插入NS1

在第一轮中，按照上述操作用MVA感染细胞，并再用含有用于选择的Ecogpt基因和作为报道基因的BFP(蓝色荧光蛋白)的插入载体pBN84(附图1c)转染。生成的重组病毒通过七轮噬斑纯化来纯化，在磷酸核糖转移酶代谢选择条件下加入霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤。霉酚酸(MPA)抑制的次黄苷单磷酸脱氢酶，并导致嘌呤合成中断和大部分细胞系中病毒复制被抑制。这种中断可以通过由组成型启动子表达Ecogpt并提供底物黄嘌呤和次黄嘌呤来克服。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增预期插入位点的引物对。为了扩增I4L插入位点，使用引物对BN499(CAA CTC TCTTCT TGA TTA CC，SEQ ID NO：1)和BN500(CGA TCAAAG TCA ATC TAT G，SEQ ID NO：2)。当空载体病毒MVA被扩增的情况下，期望的PCR片段长为328个核苷酸(nt)，在NS1的重组MVA被扩增的情况下，重组MVA在I4L插入位点上具有并入的登革病毒NS1编码区，片段预期为1683bp。附图7中的PCR结果清楚表明在17轮病毒扩增后，NS1稳定地插入I4L插入位点。

体外检测包括NS1的recMVA(MVA-BN22)

T25烧瓶装有的约80％汇合的单层BHK细胞与100μl在具有1％FCS的MEMα中稀释到1×10⁷的病毒母液培养，在室温下旋转30min。在各个烧瓶中加入5 ml具有3％ FCS的MEMα，在CO₂培养箱中、30℃培养。48h后回收烧瓶。从烧瓶中取出上清液，在4℃下以260g旋转10min。上清液以等分试样保存在-80℃。沉淀用5mllxPBS洗涤两次，然后再悬浮在1ml含有1％TX100的低渗douncing缓冲液中。回收细胞溶解产物，并以16,000g旋转5min，上清液在-80℃保存在微型离心管中。

培养了包括GFP的MVA、缺失位点上包括NS1基因的MVA(MVA-BN07)的烧瓶，以及模拟被感染的烧瓶也用上面描述的相同方法来处理。

细胞/病毒溶解产物和上清液在不加热/加热条件下，在非还原/还原样本缓冲液中处理。在10％SDS PAGE上分离蛋白质，并转移到硝化纤维膜上。斑点是用收集的康复期的患者血清(PPCS)以1:500稀释后探查过夜。在用1X PBS洗涤3次后，斑点用抗人IgG-HRP(DAKO)在室温温育2h。在如前面描述洗涤斑点之后，用4氯-1-萘酚显色。

Western印迹结果表明，MVA-BN22中的NS1被大量表达。NS1以正确的构象被表达，在不加热条件下作为二聚体，在加热条件下为单体。

在MVA-BN22和MVA-BN07中比较NS1的表达。BHK细胞用相同pfu培养，在48h后回收。结果表明BN22中NS1的表达大大地高于BN07。Western印迹结果还表明与BN07相比，在BN22构建体的上清液中有更多被分泌的NS1。

这些结果还表明在用BN22感染的细胞中表达的NS1具有抗原性，被收集的康复期的患者血清识别。

结果，NS1在用BN22感染的BHK细胞中大量地并且以正确构象表达。二聚体和单体都具有抗原性，并被收集的康复期的患者血清识别。

实施例2

插入载体pBNX67和pBN27

与ORF136L和137L之间的新插入位点(基因组的129940位置)邻近的MVA序列通过目标序列的标准PCR扩增方法分离，采用如下引物：

oBN543(TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT；SEQ IDNO：3)和

oBN544(TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT；SEQ IDNO：4)来分离Flank 1；oBN578(CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC；SEQ ID NO：5)和

oBN579(CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG；SEQ ID NO：6)分离Flank 2。

包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和XbaI处理，并连接到SacII/XbaI消化的脱磷酸基础载体上，如pBluescript(Stratagene)。

生成的质粒用XhoI/ApaI消化，脱磷酸化，并连接到用Xhol/Apal消化的包含Flank 2的PCR片段上。

可选择地，Flank 2的重复序列通过PCR分离，采用引物

oBN545(CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC；SEQID NO：7)

和oBN546(CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT；SEQ IDNO：8)，并用HindIII/PstI消化，被插入到生成的载体的HindIII/PstI位点上。附图2a)表示该载体(pBNX51)。

包含合成的启动子、NPT II基因(新霉素抗性)、poly-A区、IRES、EGFP基因(Ps-NPTII-polyA-IRES-EGFP)的报道基因表达盒用Ec1136II/XhoI消化，并被插入到插入载体的HindIII/XhoI位点上，其中HindIII位点用T4DNA聚合酶(Roche)末端补平，按照本实施例的示例性载体的限制性酶切图公开在附图2b)中(pBNX67)。

为了构建pBN27(附图2c)，血清4型的登革病毒PrM被插入到pBNX67的单个PacI位点上。

通过同源重组制备重组MVA

载体pBNX67(附图2b)可以被用于制备重组MVA，采用上述方法-例如采用pBN27(附图2c)来同源重组，获得在两个邻近ORE之间的基因间隔区中含有登革病毒P1M4的重组MVA。

将PrM4插入到MVA的IGR136-137插入位点上

在第一轮中，细胞按照上面描述的方法用MVA感染，并且还用含有用于选择的NPT基因和作为报道基因的EGFP(增强绿色荧光蛋白)的插入载体pBN27(附图2c)转染。得到的重组病毒通过G418选择下四次噬菌斑纯化来纯化。

得到的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性扩增期望位点的引物对。为了扩增IGR136-137插入位点，采用引物对BN900(cgttcgcatgggttacctcc，SEQ ID NO：9)和BN901(gacgcatgaaggctgaac，SEQ IDNO：10)。当空载体病毒MVA的DNA被扩增的情况下，期望的PCR片段长度为88个核苷酸(nt)，当PrM4的重组MVA被扩增时，片段有望达到880bp，该重组MVA在IGR136-137插入位点上插入了登革病毒PrM4编码序列。附图8a)中的PCR结果清楚表明，在22轮病毒扩增后，在IGR136-137插入位点上稳定地插入了PrM4。重组MVA还具有与MVA-BN相同的生长特征。这种病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中复制，并在哺乳动物细胞中减毒地生长(附图8b)。

实施例3

插入载体pBNX79、pBNX86、pBNX88、pBN34和pBN56

邻近ORF 007R和008L的新插入位点(在基因组12800)的MVA序列通过标准PCR扩增目标序列来分离，采用如下引物：

IGR07/08 Flup

(CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC；SEQ ID NO：11)和IGR07/08 Flend(AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT；SEQ ID NO：12)来分离Flank 1；

IGR07/08 F2up

(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC；SEQ ID NO：13)和IGR 07/08 F2end(CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG；SEQ ID NO：14)来分离Flank 2。

包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI来处理，并被连接到用SacII/SacI消化和脱磷酸的基础载体上，如pBluescript(Stratagene)。

得到的质粒用XhoI/ApaI消化，脱磷酸，并被连接到用XhoI/ApaI消化的含有Flank2的PCR片段上。

可选择地，Flank2的重复序列通过PCR分离，采用引物IGR 07/08F2up(CC GCTC GAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC；SEQ IDNO：13)和IGR 07/08 F2mid(TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA；SEQID NO：15)，并用BamHI/PstI消化，并插入到得到的载体的BamHI/PstI位点上。

任何包含报道或治疗性基因的表达盒，具有如痘病毒启动子、标记基因、poly-A区域和可选择的IRES元件、其他基因，如表达治疗活性物质或基因产物，该表达盒在限制性消化后用T4 DNA聚合酶(Roche)末端补平，并被插入到质粒载体的合适克隆位点上。按照本实施例的示例性限制性酶切图公开在附图3a)中(pBNX79)。插入NPT/EGFP选择性表达盒得到载体pBNX86(附图3b)，而插入gpt/BFP选择性表达盒得到载体pBNX88(附图3c)。鉴于治疗性基因的表达单位包含治疗性基因和被可操作地连接的启动子，这种表达单位被插入到PacI位点上。为了构建pBN34(附图3d)，登革病毒PrM2被克隆到pBNX88中(附图3c)来合成pBN56(附图3e)，HIV env编码区被通过PacI克隆到pBNX86中(附图3b)。

通过同源重组制备重组MVA

载体pBNX86(附图3b)和pBNX88(附图3c)分别被用于制备重组MVA，采用上述的方法。采用pBN34(附图3d)进行同源重组，得到在两个邻近ORF之间的基因间隔区中含有登革病毒PrM2的重组MVA。用MVA-BN基因组重组pBN56(附图3e)得到重组MVA，其在相应的IGR中含有HIV env基因。

在MVA的IGR07-08插入位点中插入PrM2

在第一轮中，细胞按照上面描述的方法用MVA感染，并且用含有用于选择的gpt基因和作为报道基因的BFP的插入载体pBN34(附图3d)转染。生成的重组病毒如实施例1所描述在霉酚酸选择下通过三轮噬菌斑纯化来纯化。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增期望插入位点的引物对。为了扩增IGR07-08插入位点，采用引物对BN902(ctggataaatacgaggacgtg，SEQ ID NO：16)和BN903(gacaattatccgacgcaccg，SEQ IDNO：17)。在扩增空载体病毒MVA的DNA情况下，预期的PCR片段的长度为190个核苷酸(nt)，当扩增PrM2的重组MVA时，片段有望达到950bp，该重组MVA在IGR07-08插入位点上插入了登革病毒PrM2、编码区。附图9a)中的PCR结果清楚表明，在20轮病毒扩增后，在IGR07-08插入位点上稳定地插入了PrM2。重组MVA还具有与MVA-BN相同的生长特性。其在鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中复制，并在哺乳动物细胞中减毒生长(附图9b)。

在MVA的IGR07-08插入位点上插入HIV env

在第一轮中，细胞按照上述方法用MNA感染，并还用含有用于选择的NPT基因和作为报道基因的EGFP的插入载体pBN56(附图3e)转染。生成的重组病毒在G418选择下通过六轮噬菌斑纯化来纯化。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增期望插入位点的引物对。为了扩增IR07-08插入位点，采用引物对BN902(ctggataaatacgaggacgtg，SEQ ID NO：16)和BN903(gacaattatccgacgcaccg，SEQID NO：17)。在扩增空载体病毒MVA的DNA情况下，预期的PCR片段长度为190个核苷酸(nt)，当扩增env的重组MVA时，片段有望达到2.6kp，该重组MVA在IGR07-08插入位点上插入了HIV env编码区。附图10中的PCR结果清楚表明，在20轮病毒扩增后，在IGR07-08插入位点上稳定地插入了env。

实施例4

插入载体pBNX80、pBNX87和pBN47

邻近ORF 044L和045L的新插入位点(在基因组37330)的MVA序列通过标准PCR扩增目标序列来分离，采用如下引物：

IGR44/45Flup(CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA；SEQ IDNO：18)和

IGR44/45Flend(AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG；SEQ IDNO：19)来分离Flank 1；IGR44/45F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT；SEQ ID NO：20)和IGR44/45F2end(CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT；SEQ ID NO：21)来分离Flank 2。

包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI来处理，并被连接到用SacII/SacI消化和脱磷酸的基础载体上，如pBluesoript(Stratagene)。

得到的质粒用XhoI/ApaI消化，脱磷酸，并被连接到用XhoI/ApaI消化的含有Flank2的PCR片段上。

可选择地，Flank 2的重复序列通过PCR分离，采用引物IGR44/45F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT；SEQ ID NO：20)和IGR44/45F2mid(TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG；SEQ IDNO：22)，并用BamHI/PstI消化，并插入到得到的载体的BamHI/PstI位点上。

任何包含报道或治疗性基因的表达盒，具有例如痘病毒启动子、标记基因、poly-A区域和可选择的IRES元件、其他基因，例如表达治疗活性物质的基因或基因产物，这些表达盒在限制性消化后用T4DNA聚合酶(Roche)末端补平，并被插入到质粒载体的合适克隆位点上。考虑到报道基因表达盒，Flank 2和Flank-2-重复序列之间的PstI、EcoRI、EcoRV、HindIII、Aval或XhoI限制性酶切位点优选作为克隆位点。为了构建pBNX87(附图4b)，NPT/EGFP选择表达盒被插入到pBNX80中(附图4a)。

用于治疗性基因的表达单位包含治疗性基因和可操作地连接的启动子，该表达单位被插入到PacI位点。

按照本实施例的示例性限制性酶切图公开在附图4a)和b)中(pBNX80，pBNX87)。

按照上面描述的方法，载体可以被用于制备在两个邻近ORF之间的基因间隔区中含有外源序列的重组MVA。为了构建pBN47(附图4c)，登革病毒血清型3的PrM被克隆到pBNX87中(附图4b)。

在MVA的IGR44-45插入位点中插入PrM3

在第一轮中，细胞按照上面描述方法用MVA感染，并还用含有用于选择的NPT基因和作为报道基因的EGFP的插入载体pBN57(附图4c)转染。生成的重组病毒在G418选择下通过三轮噬菌斑纯化来纯化。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增期望插入位点的引物对。为了扩增IGR44-45插入位点，采用引物对BN904(cgttagacaacacaccgacgatgg，SEQ ID NO：23)和BN905(cggatgaaaaatttttggaag，SEQ ID NO：24)。在扩增空载体病毒MVA的DNA情况下，预期的PCR片段长度为185个核苷酸(nt)，当扩增PrM3的重组MVA时，片段有望达到850bp，该重组MVA在IGR44-45插入位点上插入了登革病毒PrM3编码区。附图11a)中的PCR结果清楚表明，在19轮病毒扩增后，在IGR44-45插入位点上稳定地插入了PrM3。重组MVA还具有与MVA-BN相同的生长特性。其在鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中复制，并在哺乳动物细胞中减毒生长(附图11b)。

实施例5

插入载体pBNX90、pBNX92和pBN54

邻近ORF 148R和149L的新插入位点(在基因组137496的位置)的MVA序列通过标准PCR扩增目标序列来分离，采用如下引物：

IGR148/149Flup(TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG；SEQ IDNO：25)和

IGR148/149Flend(CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC；SEQ ID NO：26)来分离Flank 1；IGR148/149F2up(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC；SEQ ID NO：27)和IGR148/149F2end(TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG；SEO ID NO：28)来分离Flank 2。

包含Flank 1的PCR片段用限制性酶SacII和SacI来处理，并被连接到用SacII/SacI消化和脱磷酸的基础载体上，如pBluescript(Stratagene)。

得到的质粒用HindIII/ApaI消化，脱磷酸，并被连接到用HindIII/ApaI消化的含有Flank2的PCR片段上。

可选择地，Flank 2的重复序列通过PCR分离，采用引物GR148/149F2up(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC；SEQ IDNO：27)和IGR148/149F2mid(TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC；SEQID NO：29)，并用BamHI/PstI消化，并插入到得到的载体的BamHI/PstI位点上。

任何包含报道或治疗性基因的表达盒，具有例如痘病毒启动子、标记基因、poly-A区域和可选择的IRES元件、其他基因，如表达治疗活性物质的基因或基因产物，该表达盒在限制性消化后用T4 DNA聚合酶(Roche)末端补平，并被插入到质粒载体的合适克隆位点上。为了构建pBNX92(附图5b)，gpt/BFP表达盒被插入到该克隆位点上。考虑到报道基因表达盒，Flank2和Flank-2-重复序列之间的PstI、EcoRI、EcoRV、HindIII限制性酶切位点优选作为克隆位点。治疗性基因的表达单位包含治疗性基因和被可操作地连接的启动子，该表达单位被插入到PacI位点上。为了构建pBNX54(附图5c)，登革病毒PrM1被插入到该PacI位点上。

按照本实施例的示例性载体构建体的限制性酶切图被公开在附图5a)和b)中(pBNX90，pBNX92)。

按照上面描述的方法，载体可以被用于制备在两个邻近ORF之间的基因间隔区中含有外源序列的重组MVA。为了制备表达登革病毒prM1的重组MVA，pBN54(附图5c)被用于同源重组。

在MVA的IGR148-149插入位点中插入PrM1

在第一轮中，细胞按照上面描述方法用MVA感染，并还用含有用于选择的gpt基因和作为报道基因的BFP的插入载体pBN54(附图5c)转染。生成的重组病毒在霉酚酸选择下通过三轮噬菌斑纯化来纯化。

生成的重组病毒通过标准PCR分析来鉴定，采用选择性地扩增期望插入位点的引物对。为了扩增IGR148-149插入位点，采用引物对BN960(ctgtataggtatgtcctctgcc，SEQ ID NO：30)和BN961(gctagtagacgtggaaga，SEQ ID NO：31)。在扩增空载体病毒MVA的DNA情况下，预期的PCR片段长度为450个核苷酸(nt)，当扩增PrM1的重组MVA时，片段有望达到1200bp，该重组MVA在IGR148-149插入位点上插入了登革病毒PrM1编码区。附图12a)中的PCR结果清楚表明，在23轮病毒扩增后，在IGR148-149插入位点上稳定地插入了PrM1。重组MVA还具有与MVA-BN相同的生长特性。其在鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中复制，并在哺乳动物细胞中减毒生长(附图12b)。

序列表

<110>   巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)

<120>   改进的安卡拉痘苗病毒(MVA)基因组中作为插入位点的基因间隔区

<130>   BN45PCT

<150>   DK PA 2002 00752

<151>   2002-05-16

<160>   37

<170>   PatentIn version 3.1

<210>   1

<211>   20

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   1

<210>   2

<211>   19

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   2

<210>   3

<211>   33

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   3

<210>   4

<211>   33

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   4

<210>   5

<211>   29

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   5

<210>   6

<211>   32

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   6

<210>   7

<211>   35

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   7

<210>   8

<211>   34

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   8

<210>   9

<211>   20

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   9

<210>   10

<211>   18

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   10

<210>   11

<211>   27

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   11

<210>   12

<211>   29

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   12

<210>   13

<211>   36

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   13

<210>   14

<211>   24

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   14

<210>   15

<211>   28

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   15

<210>   16

<211>   21

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   16

<210>   17

<211>   20

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   17

<210>   18

<211>   29

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   18

<210>   19

<211>   27

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   19

<210>   20

<211>   36

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   20

<210>   21

<211>   26

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   21

<210>   22

<211>   31

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   22

<210>   23

<211>   24

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   23

<210>   24

<211>   21

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   24

<210>   25

<211>   29

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   25

<210>   26

<211>   35

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   26

<210>   27

<211>   39

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   27

<210>   28

<211>   26

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   28

<210>   29

<211>   26

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   29

<210>   30

<211>   22

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   30

<210>   31

<211>   18

<212>   DNA

<213>   引物

<400>   31

<210>   32

<211>   1192

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒(vaccinia virus)

<220>

<221>   0RF C 64L片段

<222>   (1)..(526)

<223>

<220>

<221>   IGR 64-65

<222>   (527)..(608)

<223>

<220>

<221>   ORF C 65L片段

<222>   (609)..(1190)

<223>

<400>   32

<210>   33

<211>   1200

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒

<220>

<221>   ORF 135R 片段

<222>   (1)..(96)

<223>

<220>

<221>   ORF C 136L

<222>   (101)..(298)

<223>

<220>

<221>   IGR 136-137

<222>   (299)..(883)

<223>

<220>

<221>   ORF C 137L片段

<222>   (884)..(1198)

<223>

<400>   33

<210>   34

<211>   1200

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒

<220>

<221>   ORF 07R 片段

<222>   (1)..(338)

<223>

<220>

<221>   IGR 07-08

<222>   (339)..(852)

<223>

<220>

<221>   ORF C 08L片段

<222>   (853)..(1200)

<223>

<400>   34

<210>   35

<211>   1200

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒

<220>

<221>   ORF C 44L片段

<222>   (1)..(375)

<223>

<220>

<221>   IGR 44-45

<222>   (376)..(647)

<223>

<220>

<221>   ORF C 45L片段

<222>   (648)..(1200)

<223>

<400>   35

<210>   36

<211>   1200

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒

<220>

<221>   ORF 148R 片段

<222>   (1)..(596)

<223>

<220>

<221>   IGR 148-149

<222>   (597)..(855)

<223>

<220>

<221>   ORF C 149L 片段

<222>   (856)..(1200)

<223>

<400>   36

<210>   37

<211>   1200

<212>   DNA

<213>   痘苗病毒

<220>

<221>   ORF 018L 片段

<222>   (1)..(399)

<223>

<220>

<221>   IGR 018L-019L

<222>   (400)..(607)

<223>

<220>

<221>   ORF C 019L 片段

<222>   (608)..(1081)

<223>

<220>

<221>   非编码区

<222>   (1082)..(1200)

<223>

<400>   37

Claims (54)

1.改进的重组安卡拉痘苗病毒(MVA)，包含被插入到该病毒基因组的基因间隔区(IGR)的异源DNA序列。

2.按照权利要求1的MVA，其中异源DNA序列被插入到选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组的两个邻近的开放阅读框(ORF)之间的IGR中。

3.按照权利要求1或2的MVA，其中异源DNA序列包含至少一个编码序列。

4.按照权利要求3的MVA，其中编码序列在痘病毒转录调控元件的转录控制之下。

5.按照权利要求1-4中任一项的MVA，其中异源DNA序列编码一种或多种蛋白质、多肽、肽、外源抗原或抗原表位。

6.按照权利要求1-5中任一项的MVA，其中异源DNA序列来源于登革病毒、日本脑炎病毒、乙肝病毒或丙肝病毒和/或免疫缺陷病毒。

7.按照权利要求6中的MVA，其中异源DNA序列来源于人免疫缺陷病毒HIV。

8.按照权利要求6的MVA，其中来源于登革病毒的异源DNA序列选自包含NS1和PrM的组。

9.按照权利要求8的MVA，其中NS1基因被插入到ORF 064L-065L之间的IGR中。

10.按照权利要求8的MVA，其中PrM基因来源于4种登革病毒血清型中的一种或多种登革病毒血清型。

11.按照权利要求8-10中任一项的MVA，其中PrM基因被插入到选自包含007R-008L、044L-045L、136L-137L、148R-149L的组的ORF之间的IGR中。

12.按照权利要求6或7的MVA，其中来源于免疫缺陷病毒的异源DNA序列编码HIV env。

13.按照权利要求12的MVA，其中HIV env基因被插入到ORF007R-008L之间的IGR中。

14.按照权利要求1-13中任一项的MVA，为以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA。

15.用作治疗剂和/或疫苗的按照权利要求1-14的MVA。

16.按照权利要求1-15中任一项的MVA在制备用于治疗和/或预防病毒感染和/或增生性疾病的治疗剂和/或疫苗中的用途。

17.按照权利要求16的用途，其中所述治疗剂和/或疫苗是用于治疗或预防登革病毒感染或免疫缺陷病毒感染的治疗剂和/或疫苗。

18.按照权利要求17的用途，其中所述治疗剂和/或疫苗是用于治疗或预防HIV感染的治疗剂和/或疫苗。

19.包含按照权利要求1-15中任一项的MVA的疫苗。

20.一种药物组合物，其包含按照权利要求1-15中任一项的MVA和药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或添加剂。

21.按照权利要求1-15中任一项的MVA在制备用于在包括人的活动物机体中影响免疫应答的药物组合物和/或疫苗中的用途。

22.按照权利要求21的用途，其中所述药物组合物和/或疫苗是用来在包括人的活动物机体中诱导免疫应答的药物组合物和/或疫苗。

23.一种体外制备多肽、肽、抗原或表位的方法，包括步骤：

-用按照权利要求1-15中任一项的重组MVA感染宿主细胞，

-在合适条件下培养被感染的宿主细胞，

-分离和/或富集由所述宿主细胞生产的多肽、肽、抗原、表位和/或病毒。

24.体外或离体将DNA序列导入细胞的方法，所述DNA序列与所述细胞的基因组同源和/或异源，其中该细胞用按照权利要求1-15中任一项的MVA感染。

25.包含按照权利要求1-15中任一项的MVA的细胞。

26.一种质粒载体，包含：

-选自下组的DNA序列：

a)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF之间的IGR序列的DNA序列；和/或

b)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF的IGR侧翼序列的DNA序列；

c)与a)和/或b)的DNA序列同源的DNA序列，其中该同源序列引导与MVA病毒的基因组异源的DNA序列(“异源序列”)通过同源重组插入到位于该MVA基因组的两个邻近ORF之间的IGR中，和

-所述异源序列。

27.按照权利要求26所述的质粒载体，其中所述载体还包含报道基因和/或选择基因表达盒。

28.按照权利要求26-27中任一项的质粒载体，其中IGR序列来源于选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组的ORF之间的IGR。

29.按照权利要求26-28中任一项的质粒载体，其中IGR来源的序列包含从由核苷酸序列

-Seq ID No.32的527-608；

-Seq ID No.33的299-883；

-Seq ID No.34的339-852；

-Seq ID No.35的376-647；

-Seq ID No.36的597-855；

-Seq ID No.37的400-607构成的组选择的序列。

30.按照权利要求26-29中任一项的质粒载体，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

31.按照权利要求26-30中任一项的质粒载体，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的1-526和609-1190；

-Seq ID No.33的101-298和884-1198；

-Seq ID No.34的1-338和853-1200；

-Seq ID No.35的1-375和648-1200；

-Seq ID No.36的1-596和856-1200；

-Seq ID No.37的1-399和608-1081构成的组的序列。

32.按照权利要求26-31任一项的质粒载体，其中DNA序列引导异源序列插入到以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA的基因组的IGR中。

33.一种体外制备按照权利要求1-15中任一项的MVA的方法，包含步骤：

-用按照权利要求26-32中任一项的质粒载体转染细胞；

-用MVA感染被转染的细胞；

-鉴定、分离按照权利要求1-15中任一项的MVA。

34.根据权利要求33的方法，进一步包含纯化按照权利要求1-15中任一项的MVA的步骤。

35.按照权利要求33或34的方法，其中细胞用以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA感染。

36.一种DNA，包含：

-选自下组的DNA序列：

a)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF之间的IGR序列的DNA序列；和/或

b)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF的IGR侧翼序列的DNA序列；

c)与a)和/或b)的DNA序列同源的DNA序列，其中该同源序列引导与MVA病毒的基因组异源的DNA序列(“异源序列”)通过同源重组插入到位于该MVA基因组的两个邻近ORF之间的IGR中，和

-所述异源序列。

37.按照权利要求36的DNA序列，其中IGR序列来源于ORF之间的IGR，所述ORF选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

38.按照权利要求36-37中任一项的DNA序列，其中IGR来源的序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的527-608；

-Seq ID No.33的299-883；

-Seq ID No.34的339-852；

-Seq ID No.35的376-647；

-Seq ID No.36的597-855；

-Seq ID No.37的400-607构成的组的序列。

39.按照权利要求36-38中任一项的DNA序列，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

40.按照权利要求36-39中任一项的DNA序列，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的1-526和609-1190；

-Seq ID No.33的101-298和884-1198；

-Seq ID No.34的1-338和853-1200；

-Seq ID No.35的1-375和648-1200；

-Seq ID No.36的1-596和856-1200；

-Seq ID No.37的1-399和608-1081构成的组的序列。

41.按照权利要求36-40中任一项的DNA序列，其中DNA序列引导异源序列插入到以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA的基因组的IGR中。

42.一种质粒载体用于生产和/或制备按照权利要求1-15中任一项的重组MVA的用途，所述载体包括：

-选自下组的DNA序列：

a)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF之间的IGR序列的DNA序列；和/或

b)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF的IGR侧翼序列的DNA序列；

c)与a)和/或b)的DNA序列同源的DNA序列，其中该同源序列引导与MVA病毒的基因组异源的DNA序列(“异源序列”)通过同源重组插入到位于该MVA基因组的两个邻近ORF之间的IGR中，和

-在所述IGR序列中插入的用以插入所述异源序列的克隆位点。

43.按照权利要求42的用途，其中所述载体还包含报道基因和/或选择基因表达盒。

44.按照权利要求42或43的用途，其中IGR序列来源于选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组的ORF之间的IGR。

45.按照权利要求42-44中任一项的用途，其中IGR来源的序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的527-608；

-Seq ID No.33的299-883；

-Seq ID No.34的339-852；

-Seq ID No.35的376-647；

-Seq ID No.36的597-855；

-Seq ID No.37的400-607组成的组的序列。

46.按照权利要求42-45中任一项的用途，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

47.按照权利要求42-46中任一项的用途，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的1-526和609-1190；

-Seq ID No.33的101-298和884-1198；

-Seq ID No.34的1-338和853-1200；

-Seq ID No.35的1-375和648-1200；

-Seq ID No.36的1-596和856-1200；

-Seq ID No.37的1-399和608-1081构成的组的序列。

48.按照权利要求42-47中任一项的用途，其中DNA序列引导异源序列插入到以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA的基因组的IGR中。

49.一种DNA用于生产和/或制备按照权利要求26-32中任一项的质粒载体和/或生产和/或制备按照权利要求1-15中任一项的重组MVA的用途，

该DNA选自：

a)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF之间的IGR序列的DNA序列；和/或

b)包含MVA病毒基因组两个邻近ORF的IGR侧翼序列的DNA序列；

c)与a)和/或b)的DNA序列同源的DNA序列，其中该同源序列引导与MVA病毒的基因组异源的DNA序列(“异源序列”)通过同源重组插入到位于该MVA基因组的两个邻近ORF之间的IGR中。

50.按照权利要求49的用途，其中IGR序列来源于选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组的ORF之间的IGR。

51.按照权利要求49-50中任一项的用途，其中IGR来源的序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的527-608；

-Seq ID No.33的299-883；

-Seq ID No.34的339-852；

-Seq ID No.35的376-647；

-Seq ID No.36的597-855；

-Seq ID No.37的400-607组成的组的序列。

52.按照权利要求49-51任一项的用途，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列选自包含007R-008L、018L-019L、044L-045L、064L-065L、136L-137L、148R-149L的组。

53.按照权利要求49-52中任一项的用途，其中两个邻近ORF的IGR侧翼序列包含选自由核苷酸序列

-Seq ID No.32的1-526和609-1190；

-Seq ID No.33的101-298和884-1198；

-Seq ID No.34的1-338和853-1200；

-Seq ID No.35的1-375和648-1200；

-Seq ID No.36的1-596和856-1200；

-Seq ID No.37的1-399和608-1081构成的组的序列。

54.按照权利要求49-53中任一项的用途，其中DNA序列引导异源序列插入到以保藏号V00083008保藏在ECACC的MVA的基因组的IGR中。

Images