CN101831411A

CN101831411A - 表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒

Info

Publication number: CN101831411A
Application number: CN200910208520A
Authority: CN
Inventors: 保罗·豪利; 桑加·莱勒
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2010-09-15
Also published as: US20120039936A1; US20120178157A1; IL193087A; HK1076836A1; IL164177A0; KR101005630B1; IL193088A0; DK1407033T3; UA82479C2; AU2009200380C1; US20120082696A1; DK1506301T3; CN102719408A; EA007811B1; CN1653183B; WO2003097845A1; JP2010259446A; JP2011004755A; PL218318B1; DE60303218D1

Abstract

本发明涉及能够表达两个或多个同源外源序列的重组痘病毒载体，其中外源序列来源于微生物的不同变种，之间具有50％或更高的同源性。本发明进一步涉及制备这种重组痘病毒的方法以及这种重组痘病毒作为药物或疫苗的应用。此外，本发明还提供一种影响优选为诱导活体动物包括人的免疫反应的方法。

Description

表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒

本申请是2003年5月14日提交的名称为“表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒”的03811106.3发明专利申请的分案申请。

本发明涉及能够表达两个或多个同源外源基因的重组痘病毒，其中所述基因与病毒基因组异源，但相互之间具有同源性。所述基因尤其来源于微生物非常相关的变种或亚型。本发明进一步涉及制备这种重组痘病毒的方法以及这种重组痘病毒作为药物或疫苗的应用。此外，本发明还提供一种对活体动物包括人的免疫反应进行影响优选为诱导的方法。

发明背景

每一个活生物体经常受感染性或致病因子如细菌、病毒、真菌或寄生虫的挑战。生物体的所谓免疫系统能够阻止它们免受这些致病因子引起的持久感染、疾病或中毒。

哺乳动物的免疫系统可分成特异性和非特异性部分，虽然这两部分紧密交联。非特异性免疫反应能够介导对广泛不同的病原体或感染因子(agent)的即时防御。特异性免疫反应在当生物体第一次受到物质的挑战后，于迟滞期后形成。特异性免疫反应主要是因为产生了抗原特异性抗体，并形成巨噬细胞和淋巴细胞，如细胞毒素T-细胞(CTL)。之所以称为特异性免疫反应，是基于下述事实，生物体个体受到特异性感染后能够痊愈，但对其它感染病仍然易感。通常，同样的或非常类似的感染因子的第二次感染引起非常温和的症状或根本没有发病的症状。这种所谓的免疫持续非常长的时间，有的甚至持续终生。这种潜在效果通常称为免疫记忆，对此可以用于接种疫苗。

术语接种疫苗描述一种方法，其中用无毒、部分或失活形式的感染因子攻击个体，影响优选诱导所述个体的免疫反应，导致即使不是终生但长时间持续的对特异感染因子的免疫抵抗。

人所患的天花疾病是由于天花(Variola)病毒引起的。天花病毒属于痘病毒科(Poxviridae)，这是具有复杂DNA大的病毒科，可在脊椎动物和无脊椎动物细胞的细胞质中复制。

根据寄生在脊椎动物和昆虫的不同宿主范围，可将痘病毒科分成两个亚科即脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(Entomopoxvirinae)。脊椎动物痘病毒亚科包括正痘病毒属(Orthopoxviruese)和禽痘病毒属(Avipoxviruse)以及其它一些属的病毒(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，3rdedition 1996，ISBN：0-7817-0253-4，Chapter 83)。

正痘病毒属包括引起人患天花的病原即天花病毒，和其它非常重要的病毒，如骆驼痘病毒、牛痘病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、猴痘病毒和痘苗病毒。该属中的所有成员具有遗传相关性，相似的形态和宿主范围。限制性内切酶图谱甚至表明正痘病毒属的不同成员之间具有高至90％的序列同一性(Mackett&Archard，[1979]，J Gen Virol，45：683-701)。

使用了至少100年的针对天花的疫苗接种的疫苗称为痘苗病毒(VV)。不清楚的是，VV是否是来源于通过延长的连续传代的痘苗病毒或牛痘病毒-目前已根除的活的代表物或者是遗传重组的产物。此外，在VV的历史过程中，形成了许多痘苗株系。不同株系表现出不同的免疫原性，并涉及不同程度的潜在的并发症，最严重的可引起接种后脑炎。然而，许多这些株系用于针对天花的接种。例如NYCBOH、Western Reserve或Wyeth株系主要在美国使用，而Ankara、Bern、Copenhagen、Lister和MVA菌株在欧洲使用。WHO在1980年实施的VV不同株系的全球接种计划而最终宣告天花病毒被成功根除。

至今，VV主要在实验室中使用的实验菌株，除此之外，仍然被认为是正痘病毒属的原型，这也是为什么VV成为研究最为详细的病毒之一的原因所在(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-RavenPublishers，3rd edition 1996，ISBN：0-7817-0253-4，Chapter 83 and 84)。VV和其它最近应用的痘病毒已被用于插入和表达外源基因。将外源基因插入到活的感染性痘病毒的基本技术包括，供体质粒上位于侧接外源遗传元件的痘病毒DNA序列与拯救痘病毒中存在的同源序列之间的重组。遗传重组通常是两条DNA链中的同源部分之间的交换。某些病毒RNA可以取代DNA。核酸的同源部分可以是具有相同核苷酸碱基序列的核酸序列(DNA或RNA)。在被感染的宿主细胞中，新病毒基因组的产生和复制过程中可能自然发生遗传重组。因此，宿主细胞被两个或更多不同病毒或其它遗传构建体感染时，在病毒的复制循环过程中，病毒基因之间可能发生遗传重组。来自第一基因组的DNA序列部分在构建与第二共感染的病毒中交换使用，其中所述DNA与第一病毒基因组的DNA之间具有同源性。

通过修饰感染性病毒而使插入的DNA遗传序列的成功表达要求两个条件。第一，插入在病毒的非必需区域以使被修饰病毒仍然能够成活。表达所插入DNA的第二个条件是存在着与插入DNA合适关联的启动子。通常，启动子位于要表达的DNA序列的上游。

利用重组VV表达，如肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)、流感病毒血凝素(InfHA)、或诺尔斯氏疟原虫孢子体抗原(Plasmodium knowlesisporozoite antigen)，以作为活性疫苗预防疾病的感染，这些用途已被证实并已有综述(Smith，et al.[1984]Biotechnology and Genetic EngineeringReviews 2，383-407)。

VV的另一个优点是单VV基因组能够携带多个外源序列、基因或抗原的能力(Smith&Moss[1983]，Gene，25(1)：21-28)。而且，已有报道称用多价疫苗的单次接种能够激发对多个异源感染性疾病的免疫(Perkus etal.，[1985]，Science，Vol.229，981-984)。

利用单个VV表达多个抗原的一个实例如Bray等所描述。重组VV能够表达登革(Dengue)病毒血清型4的三个不同结构蛋白，即衣壳(C)、pre-membrane(prM)、包膜(E)蛋白，以及登革病毒血清型4的两个不同的非结构蛋白，即NS1和NS2a，其保护鼠抵抗对同源的登革病毒血清型4的攻击(Bray et al.，[1989]，Virology 2853-2856)。

登革病毒有4个血清型，即登革病毒血清型1(Den-1)至登革病毒血清型4(Den-4)。对于能够感染人而言，登革病毒是黄病毒(Flavivirus)属中重要的成员之一。登革病毒感染导致的疾病范围可以是从类流感症状疾病到严重疾病或致死疾病，休克症状(DSS)的登革出血热(DHF)。登革病毒爆发仍然是热带和亚热带人口密集地区公共健康的主要问题，因为这些地区有大量的传播媒介-蚊。

由于登革病毒感染和其它由蚊介导黄病毒导致的疾病在全球许多地区传播，因此投入很大努力来能阻止登革热(DF)和登革出血热(DHF)的登革病毒疫苗的进展，并使接种的个体能够抵抗由某些或所有蚊介导黄病毒导致的疾病。

而DF的大多数情况显现在4种血清型中任何一种的第一次感染，比较多的DHF病情发生在被不同于第一次登革病毒感染的血清型的血清型的第二次感染的受试者中。这种现象使得认为，具有对一个登革病毒血清型抗体的个体受不同病毒血清型在适当间隔的连续感染时，可能导致在相当多的情况下发生DHF。

因而，针对一种血清型接种疫苗，不能产生针对登革病毒感染完全保护，而只能针对的是同一登革病毒株系的感染。更为重要的是，接种了针对一种血清型的人，当该人受到不同血清型登革病毒的感染时更可能发生严重并发症如登革出血热。

因此，需求包括针对所有4个登革病毒血清型的多价疫苗。

至今有人建议通过一组重组VV制备多价疫苗，其中每一个VV编码不同病毒的序列(Moss，[1990]Immunology，2，317-327)。然而，这种多价疫苗有几个缺点。首先，获得数个独立的重组VV非常麻烦。除分别的产生程序之外，质量控制和质量保证非常耗费时间。其次，用表达不同序列的重组病毒的混合物进行感染总是存在感染不是特别平衡的问题。主要的风险在于只是单个重组体而不是多价疫苗中包含的所有不同的重组体感染靶细胞。其中一个原因可能是重组病毒分布不均匀。另一个原因是，在感染单细胞时，不同重组病毒之间可能存在干扰。这种干扰现象就是已知的称为超感染现象。这种情况下，只有某些抗原而不是多价疫苗中的所有不同抗原由被感染细胞最终表达，由此而呈递到患者的免疫系统。结果，只获得针对某些抗原的免疫保护，而远不能提供针对通过多价疫苗呈递或可呈递的各种不同抗原的完全免疫保护。

在针对登革病毒感染的疫苗中，不同序列的表达量不同或以未知的方式表达，也是使得多价疫苗具有缺点，如登革病毒2的包膜蛋白就显示有这种情况(Deuble et al.，[1988]，J.Virol 65：2853)，故这种接种对患者而言非常危险。利用重组痘苗病毒组的不完全接种，只能提供针对某些而不是所有血清型的登革病毒免疫保护。不幸的还有，在登革病毒的情况下不完全接种非常不能被接受，因为这增加了诸如登革出血热等致死并发症出现的机率。

发明目的

因此本发明的目的是提供一种稳定、有效和可靠的疫苗，可针对由多于一个株系、分化体(clade)、变种、亚型或血清型的致病微生物引起的感染性疾病的免疫保护。

本发明的进一步的目的是提供一种稳定、有效和可靠的针对登革病毒感染的疫苗，针对所有登革病毒血清型提供可靠的接种。

本发明的详细描述

本发明是基于来源于不同株系、分化体、变体、亚型或血清型的致感染病微生物包括在痘病毒同源基因中。正如上面已提到的，例如登革病毒的4个组、亚型或血清型均包括同一类型的基因，如编码衣壳(C)蛋白基因，编码pre-membrane(PrM)或包膜(E)蛋白的基因。然而，在4个血清型病毒的同一类型基因的核酸序列之间并不完全相同，也不完全同源，例如登革病毒血清型1、2、3和4(PrM1-4)的PrM基因之间的序列比较(Lasergene 4.05 Magalign，Macintosh)揭示序列同一性为66.5-72.9％，即同源性为65-75％。可以设想致感染病微生物的不同亚型的基因之间存在区别和变异，这是导致针对一种亚型的疫苗接种不能自发的提供针对同一微生物的其它变种感染的保护。因此，可以产生包括来源于不同株系、分化枝、变种、亚型或血清型的致传染病微生物的非常相关或同源基因的重组病毒。然而，正如上面已提及的，同源序列之间的同源重组可在病毒生活周期中发生，甚至不是完全同源的DNA序列部分之间也能发生。因而，可以预期同源基因的插入到单个病毒基因组中可以引起同源重组，由此，在插入的同源基因中产生缺失。

然而，当产生重组痘病病毒，其中包括在其基因组中至少两个具有至少60％同源性的外源基因时，未料到插入在病毒基因组中的所述同源基因仍然保持稳定。

甚至优选为至少50％同源性的同源基因插入到病毒基因组的不同插入位点，插入在病毒基因组中的所述同源基因仍然保持稳定插入到病毒基因组。这种情况中，期望所述同源基因之间发生的重组事件能够另外分别导致对于病毒的扩增或病毒生活周期重要的病毒基因的缺失，即期望病毒生活周期将严重受到损害。因此，此外，重组频率与两个连锁基因的距离成比例，预期位于不同插入位点的两个或多个同源基因之间的重组频率将非常高，且进而导致所述基因的缺失和/或受到严重干扰。相应地，非常吃惊的发现没有发生重组事件，而插入在病毒基因组中不同插入位点的所述同源基因仍然保持稳定。

根据以前技术，包含来自黄病毒，如日本脑炎病毒(JapaneseEncaphalitis)(JEV)、黄热病毒(YFV)和登革病毒的外源DNA的重组痘病毒是已知的(美国5514 375)。然而，每个来自黄病毒的基因只单次插入，且在同一个插入位点。此外，用适合的计算机软件(Lasergene 4.05Magalign，Macintosh)进行序列比较揭示插入到痘病毒基因组中的基因的同源性，表明来自JEV的基因具有20.2％-29.6％、来自YFV的具有29.2％-45.3％、来自登革病毒的具有22.8％-29.5％。

在WO 98/13500中有类似公开，其描述了登革病毒抗原插入到修饰痘苗病毒(Modified Vaccinia Virus)Ankara(MVA)的同一插入位点，尤其是插入到缺失位点II。

美国专利5338683描述了疱疹病毒(herpesvirus)的糖蛋白基因gp13和14插入到单个痘病毒的两个不同位点，然而，两个基因只具有25.2％的同源性。

流感病毒血细胞凝集素和插入到修饰痘苗病毒Ankara(MVA)的同一插入位点(缺失位入点III)核蛋白基因，两者的序列同源性为49.1％(美国专利5,676,950；Sutter et al.，[1994]，Vaccine 12：1032)。

美国专利5,891,442披露了包含infectious bursal disease的多蛋白VP2、VP3和VP4的编码序列的重组病毒。所述基因经过融合，插入到单个插入位点，所述基因之间的同源性为41.9％-50.3％。

最后美国专利6,217,882描述了包含插入到同一个位点，相互之间具有52.7％的同源性的假狂犬病抗原gp50和gp63的重组猪痘病毒载体。

总之，根据现有技术可以认为，具有至少50％同源性的同源基因或序列都是插入到病毒基因组的同一个或单个插入位点。

根据本发明，具有至少50％同源性的同源基因或序列，即是指同源性为50-100％，即至少有50％的核苷酸碱基相同。低于50％同源性的基因或序列被认为是异源的。在本发明上下文中，术语“同源”或“同源性”是用于描述当基因或序列之间进行比较时的情形，而术语“外源”基因、“外源性”或“异源”序列是当基因或序列与痘病毒基因组进行比较时的情形，即该术语指DNA序列在自然情况下与本发明使用的痘病毒通常不具有相关性。因此，本发明涉及包含至少两个相对于病毒基因组是异源的基因的重组痘病毒，但所述两个基因相互之间具有同源性。术语“基因”指编码序列，编码了如蛋白质、多肽、肽、抗原等。由同源基因翻译而来的蛋白质、多肽或肽完成相同的作用(task)，且表现出相同的功能特性。同源基因通常来自不同但相关的来源或生物体。根据本发明的一个实施例，编码序列的同源性优选为70％至80％，更优选为80％至90％或90％至100％。最优选地，具有65％至75％的同源性。

由于根据本发明的重组痘病毒，仅在单个感染单元或同一个病毒颗粒中包含了相关的遗传信息，因此不存在不均匀感染和不同的同源序列的不平衡表达的问题。因而，根据本发明的重组痘病毒，在一个感染细胞中包含并能表达几个紧密或甚至非常紧密的相关基因或几乎完全相同的序列，这对于产生多价疫苗尤其有好处。

该好处对于研制针对由几个紧密相关的株系或血清型的病毒如登革病毒引起的疾病的疫苗中非常有意义。包含不同登革病毒血清型的同源基因的重组痘病毒将在实施例中进行描述。

根据本发明的同源基因或序列可以来源于任何微生物，如除载体病毒之外的任何病毒、任何细菌、真菌或寄生虫。优选地，同源基因或序列来源感染性或病原微生物，最优选来源于所述微生物不同的株系或分化枝、变种、亚型或血清型。

术语“株系”或“分化枝”作为技术术语，用于描述微生物分类级别，对本领域技术人员而言非常熟知。至今分类体系将所有已鉴定的微生物分类到hierarchic顺序，科、属、种、株系(Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，4th edition 2001)。对科的成员的分类标准是它们的系统发育关系，属包括具有共同特性的所有成员，种被定义为多特性类(polythetic class)，组成复制谱系并存在于特定的生态位。术语“株系”或“分化枝”用于描述微生物即病毒的分类级别，是指具有共同特性，诸如基本形态或基因组结构或组织，但生物学性质，如宿主范围、组织向性、地理分布、减毒或致病性等方面不同。术语“变种”或“血清型”是对同一株系的成员作进一步区分，也叫“亚型”，对由于微小的基因组变异而表现出单个感染谱或抗原特性不同的成员进行区分。

根据本发明的进一步实施方式，同源基因或序列选自于病毒，优选的是属于黄病毒属的病毒，如优选但不局限于登革病毒、西尼罗(West Nile)病毒或日本脑炎病毒；属于反转录病毒(Retroviruses)属的病毒，如优选但不局限于人免疫缺陷病毒(HIV)；属于肠道病毒(Enteroviruses)属的病毒，如优选但不局限于手(Hand)、足(Foot)和口腔(Mouth)疾病、EV71；属于轮状病毒(Rotaviruses)属的病毒或属于正粘病毒(Orthomyxoviruses)属的病毒，如优选但不局限于流感病毒。最优选来源于黄病毒的同源基因。

根据本发明的进一步实施方式，同源基因选自于登革病毒基因，优选为C、NS1和/或NS2，或优选为E，更优选为PrM。最优选来源于病毒的不同血清型的同源基因，其中所述基因可来自登革病毒所有4个血清型中的1、2、3或4个血清型。

根据本发明的进一步实施方式，同源基因选自不同HIV株系或分化枝。优选的同源基因选自gag/pol编码序列，更优选为env编码序列或更进一步优选为HIV的结构和/或调控性编码序列。

本发明所用的合适病毒载体选自痘病毒，它可容易的在所选择的宿主细胞如鸟宿主细胞中培养，但在人体或人细胞中高度复制缺陷型或实际上不能复制。

根据某些优选实施方案，本发明的痘病毒选自金丝雀痘(canarypox)病毒(Plotkin et al.[1995]Dev Biol Stand.vol 84：PP 165-170.Taylor et al.[1995]Vaccine，Vol 13.No.6：pp 539-549)、禽痘病毒(Afonso et al.[2000]JVirol，pp 3815-3831.Fields Virology，ed.by Fields B.N.，Lippincott-Raven Publishers，4th edition 2001，Chapter 85：page 2916)、企鹅痘(penguin pox)(Stannard et al.[1998]J Gen Virol，79，pp 1637-1649)或它们衍生物。由于这些病毒属于禽痘病毒(Avipoxviruses)属，因而在禽细胞中非常容易培养和增殖。然而，在人体或人细胞中它们属于复制缺陷型，而基本上不能或几乎不能产生感染性子代病毒。

根据本发明进一步的实施方式，痘苗病毒，优选为减毒痘苗病毒用于产生包含两个或多个同源基因的重组痘病毒。

虽然，已知痘苗病毒(VV)在存在短的同源序列时即可进行产生同源重组，进而缺失同源序列(Howley et al.，[1996]，Gene 172：233-237)，本发明提供包括稳定插入到其基因组中的同源序列或基因的重组痘苗病毒。该发现尤其预料不到，因为根据Howely等，短序列长至300碱基对(bp)即足以诱发痘苗病毒的基因组重排和同源序列的缺失。因而，本领域技术人员可以设想更长的序列将会有更大可能性地诱发重组。然而，根据本发明甚至包含完全同源基因的序列都能稳定的插入到痘苗病毒基因组中。

一个痘苗病毒的例子，是高度减毒且宿主范围受限的痘苗株系，即修饰痘苗病毒Ankara(MVA)(Sutter，G.et al.[1994]，Vaccine 12：1032-40)，但不局限于该例子。MVA是通过痘苗病毒Ankara(CVA)株系在鸡胚胎纤维原细胞中连续约570传代而获得的(综述参见Mayr，A.，et al.[1975]，Infection 3，6-14)。由于长期传代的CVA缺失了大约31kb的基因组序列。所获得的病毒株系，即MVA，被描述为宿主细胞高度受限(Meyer，H.etAL.，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。典型MVA株系是MVA 575，保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal CellCultures)，其保藏号为ECACC V00120707。

在另一个实施方式中，MVA-Vero株系或其衍生物可以用于本发明。MVA-Vero株系保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号ECACCV99101431和ECACC 01021411。MVA-Vero的生物学、化学和物理特性所反应出的安全性可参见国际专利申请PCT/EP01/02703。与常规MVA相比，MVA-Vero基因组还有另外一个缺失。

根据本发明，术语病毒的“衍生物”指子代病毒具有与亲本病毒相同的特征，但在其基因组中有一或多个部分的差异。

根据本发明的另外实施方式，使用MVA-BN。MVA-BN保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心，保藏号ECACC V00083008。通过使用MVA-BN或其衍生物，来产生特别安全的病毒疫苗，因为MVA-BN病毒是来自修饰痘苗Ankara病毒，且表现出极其减毒的病毒。因此，在最优选实施方式中，本发明的包含两个或多个同源基因的MVA-BN或其衍生物用作病毒载体。术语“MVA-BN的衍生物”是指与MVA-BN有相同功能特性的病毒。WO 02/42480中描述了MVA-BN的特征、用于评价MVA是否是MVA-BN或其衍生物的生物学分析方法及产生MVA-BN或其衍生物的方法(在此将该文献引入作为参考)。一个简便的检测MVA-BN或其衍生物的功能特性的方法是检测它对人HaCat细胞的减毒特性和在其中缺乏复制。

根据本发明的重组痘病毒，其外源序列表达的控制优选通过痘病毒转录调控元件，更优选通过MVA、金丝雀痘病毒、禽痘病毒或企鹅痘病毒转录调控元件，或最优选通过痘苗病毒启动子进行调控。根据本发明的痘病毒转录调控元件进一步包括在痘病毒系统中起作用的每一个转录调控元件。

根据本发明，外源序列优选插入到病毒基因组的非必需区域。非必需区域例如是痘病毒的基因座(loci)或开放阅读框(ORF)，这些区域对痘病毒的生活周期不是必需的。在本发明中，基因间序列即两个ORF之间的区域也认为是非必需区域。在本发明的另外实施方式中，外源序列插入到MVA基因组天然发生的缺失位点(公开于PCT/EP96/02926，将其引入本申请作为参考)。

插入DNA的方向对本发明的重组病毒的功能或稳定性没有影响。

由于根据本发明的重组痘病毒，其生长非常有限，因而高度减毒，因此是理想的适合治疗哺乳动物包括甚至免疫失常的人的候选疫苗。因此，本发明也提供一种药物组合物，和疫苗，用于诱导活动物体包括人的免疫反应。

药物组合物通常可包括一或多种药物学可接受和/或认可的载体、添加剂、抗生素、防腐剂(preservative)、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这些辅助成分可以是水、盐、甘油、乙醇、润湿剂(wetting)或乳化剂、pH缓冲物质等。合适的载体典型的是分子量高、代谢缓慢的分子如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸交酯酸(polyglycollic acids)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体(lipid aggregates)等。

为了制备疫苗，本发明的重组痘病毒被转换成一种生理学可接受形式。可基于针对天花的免疫接种中使用的痘病毒疫苗的制备经验来完成这一目的(可见于Stickl，H.et al.[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。例如，纯化病毒以5X10E8 TCID₅₀/ml的效价，制成约10mM Tris，140mMNaCl pH 7.4剂型，于-80℃保存。为制备疫苗颗粒(shot)，如在每一针药管(ampoule)中，优选为玻璃针药管中将10E2-10E8个病毒颗粒于含有2％蛋白胨和1％人血蛋白的100ml磷酸钠缓冲液(PBS)中冷冻。任选地，疫苗颗粒(shot)也可通过逐步冻干制剂中病毒来获得。这种制剂可以包含额外的适于体内给药的添加剂，如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或其它酸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清蛋白)。然后将玻璃针药管密封，可在4℃至室温下保存数月。然而，不需要使用的针药管优选在低于-20℃保存。

为了免疫接种或治疗之用，冻干物可以溶解于0.1至0.5ml水溶液中，优选溶于生理盐水或Tris缓冲液中，可通过系统或局部给药，即肠胃外给药、皮下、静脉、肌肉、通过破皮(scarification)给药或其它本领域技术人员熟知的方式进行给药。给药形式、剂量和给药次数可通过本领域已知方式来进行优化。然而，最常见的接种方式是在第一次接种后，隔约1月至6周进行第二次接种。

本发明的重组病毒可用于将外源编码序列导入到靶细胞中。将外源编码序列导入到靶细胞中可分别产生体外蛋白、多肽、肽、抗原和抗原表位。此外，同源或异源序列导入到细胞中的方法可适用于体外和体内治疗。对于体外治疗，分离在活体外(ex vivo)被本发明重组痘病毒感染的细胞，对活体动物给药以诱导免疫反应。对于体内治疗，本发明重组痘病毒直接对活体动物给药以诱导免疫反应。在这种情况中，接种位点周围的细胞直接被本发明病毒或其重组体所感染。感染之后，细胞合成外源编码序列编码的蛋白质、多肽、肽或抗原，继而这些物质或其部分呈递在细胞表面。免疫系统的特异性细胞识别上述蛋白质、多肽、肽、抗原和抗原表位的存在，进而启动特异的免疫反应。

获得重组痘病毒或将外源编码序列插入痘病毒基因组中的方法是本领域技术人员非常熟知的。此外，实施例中也描述了这些方法，并且可以从下述参考文献中推导出或完全获得这些方法：

-Molecular Cloning，A laboratory Manual.Second Edition.By J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis.Cold Spring Harbor LaboratoryPress.1989：描述了标准分子生物学技术及知识，如DNA克隆、DNA和RNA的分离、Western印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术。

-Virology Methods Manual.Edited by Brian WJ Mahy and HillarO Kangro.Academic Press.1996：描述了处理和操作病毒的技术。

-Molecular Virology：A Practical Approach.Edited by AJ Davisonand RM Elliott.The Practical Approach Series.IRL Press at OxfordUniversity Press.Oxford 1993.Chapter 9：利用痘病毒载体表达基因。

-Current Protocols in Molecular Biology.Publisher：John Wileyand Son Inc.1998.Chapter 16，section IV：Expression of proteins inmammalian cells using Vaccinia viral vector：描述了对MVA进行处理、操作和遗传工程技术及知识。

为产生本发明的重组痘病毒，可以使用不同的方法：将欲插入到病毒的DNA序列置于E.coli质粒构建体，该质粒中已插入与痘病毒DNA部分同源的DNA。另外，欲插入的DNA序列连接有启动子。启动子-基因的连锁在质粒构建体中的方向以使该启动子-基因连锁两侧是与包含非必需基因座的区侧接的DNA序列同源的DNA。所获得的质粒构建体通过在大肠杆菌中生长而扩增和分离。分离出的包含欲插入的DNA基因序列的质粒与痘病毒一起转染到细胞培养物，如鸡胚胎纤维原细胞(CEF)中。质粒中的同源pox DNA与病毒基因组之间发生重组分别得到含外源DNA序列的修饰痘病毒。

根据一个更优选的方式，合适的细胞培养物的细胞，如CEF细胞，被痘病毒感染。被感染的细胞接着用包含外源基因的第一质粒载体进行转染，其中外源基因优选地受痘病毒表达调控元件的转录调控。如上所解释，质粒载体也包括这种序列，该序列能够指导将外源序列插入到痘病毒基因组中选定部位。可选地，质粒载体也可包括含可操作连接于痘病毒启动子的标记和/或选择基因的表达盒。合适的标记或选择基因例如是编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素、磷酸核糖基转移酶或其它标记的基因。使用选择或标记基因表达盒可简化对所产生的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，也可用PCR技术来鉴定重组痘病毒。接下来，用上述获得的重组痘病毒对细胞进一步感染并用包含与包括在第一载体中的基因同源的基因的第二载体进行转染。这种情况中，该基因应当包括在痘病毒的不同的插入位点，第二载体的指导同源基因整合到痘病毒基因组的序列也是不同的。在同源重组发生后，可以分离包含两个同源基因的重组病毒。用在先前感染步骤分离到的重组病毒和包括另外的用于转染的同源基因的另一载体来重复进行感染和转染，这样可以将两个以上的同源基因导入到重组病毒中。

任选地，上面描述的感染和转染步骤可以互换，即可以首先用包含外源基因的质粒载体转染合适的细胞，再用痘病毒感染该细胞。

进一步可选地，也可以将每一个同源基因导入不同病毒，再用所有获得的重组病毒共感染细胞，再筛选出包括所有同源基因的重组体。

本发明进一步提供包括两个或更多个质粒载体构建体的试剂盒，可以将可表达的同源基因整合进痘病毒基因组中。除有合适的克隆位点之外，这种质粒载体包括能够指导外源序列插入到痘病毒选定部位的序列。可选地，这种载体包括选择或标记基因表达盒。所述试剂盒进一步包括选择病毒的试剂和说明书，所述病毒是一或多个同源基因的重组体，并可选地选择或标记基因，通过所述载体构建体而插入。

根据本发明的另一实施方案，包括来自于或同源于本发明重组痘病毒的DNA序列或其部分。这种序列至少包括本发明的至少一个同源基因的片段的外源序列部分和至少包括本发明痘病毒基因组序列的片段，所述痘病毒基因组序列优选侧接外源序列。

这种DNA序列可以用于鉴定或分离病毒或其衍生物，如利用它们来产生PCR引物、杂交探针或用于矩阵技术中(array technologies)

附图简述

图1：根据实施例1，4个PrM(＝pre-membrane)基因(血清型1-4)在MVA基因组中的插入位点的示意图。

图2-9和12-17：显示插入质粒载体构建体，并注明载体名称、大小和目的序列位置，如AmpR＝氨苄青霉素抗性基因、bfp＝蓝色荧光蛋白基因、dA＝缺失A、dE＝缺失E、d2＝缺失2、Ecogpt＝E.coli鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因、EGFP＝增强型绿色荧光蛋白基因、F1＝侧翼序列1、F2＝侧翼序列2，I4L＝间隔区I4L、IGR＝间隔区、NPT II＝新霉素抗性基因、P＝痘病毒启动子、pr7.5＝痘苗启动子7.5、PrM＝登革病毒的pre-membrane基因，数值表示来自4个血清型中的哪一个、rpt＝重复侧翼序列。

图10：对4个不同插入载体(pBN49，PBN50，PBN40，PBN39)的载体克隆技术进行的PCR验证。每一个质粒用4个不同PCR引物组合进行检测。每一个组合特异于整合到一个明显不同插入位点的一个明显不同的PrM序列。

图11：包含4个同源登革病毒的PrM基因的重组痘病毒的PCR验证(实施例1)。在凝胶的上半部显示了重组病毒的不同PCR结果，下半部显示对照质粒的相同PCR反应的结果。包含在质粒中的同源序列分别命名为pBN39、pBN49或pBN50。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane基因，其中数值表示它来源于4个血清型中哪一个血型。dA＝缺失A、dE＝缺失E、d2＝缺失2、I4L＝间隔区I4L，用于描述外源DNA的插入位点。

图18：根据实施例2，3个PrM基因(血清型2-4)在MVA基因组中的插入位点示意图。

图19：包含3个同源登革病毒PrM基因插入到间隔区的重组痘病毒的PCR验证(Example 2)。上面凝胶图显示特异于PrM2的PCR反应结果，中间的凝胶图显示特异于PrM3的PCR反应结果，最下面的凝胶图显示特异于PrM4的PCR反应结果。泳道8显示对照质粒的相同PCR反应的结果。第2道显示空载体对照MVA。PrM代表插入的登革病毒pre-membrane基因，其中数值表示它来源于4个血清型中哪一个血清型。M＝分子量标记。

下面的实施例将进一步阐明本发明。本领域技术人员应当理解为所提供的实施例不以任何方式而将对本发明的应用限制在这些实施例。

实施例1

插入载体

缺失A的插入载体

为了在MVA基因组中相应的基因组位置7608-7609处的称为缺失A或缺失1的位点插入外源序列，构建了包含缺失位点A附近约600bp的侧翼序列的质粒载体。用合适的计算机程序(DNAsis，Hitashi softwareengeneering，San Bruno，USA)来设计合适PCR引物，以用于分离来自MVA-BN基因组的侧翼序列。这种引物包括延长有限制性酶切位点的突出(extension)，用于将侧翼序列克隆到载体质粒上。在侧翼序列之间，引入选择基因表达盒，如受痘病毒启动子转录调控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位点以便插入另外的欲插入到缺失位点A的基因或外源序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图2所示(pBNX10)。

缺失E的插入载体

为了在MVA基因组中相应的基因组位置170480-170481处的称为缺失E或缺失4的位点插入外源序列，构建了包含缺失位点E附近约600bp的侧翼序列的载体。按上述类似的方法设计和构建载体。在侧翼序列之间置有受痘病毒启动子转录调控下的EGFP基因(绿色荧光蛋白，Clonetech)。此外，具有克隆位点以便插入另外的欲插入到缺失位点E的基因或序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图3所示(pBNX32)。

缺失2的插入载体

为了在MVA基因组中相应于基因组位置120718-20719处的称为缺失2的位点插入外源序列，构建了包含缺失位点2附近约600bp的侧翼序列的载体。按上述类似的方法设计和构建载体。在侧翼序列之间置有受痘病毒启动子转录调控下的hbfp基因(人源化蓝色荧光蛋白，Pavalkis GNet al.)。此外，具有克隆位点以便插入另外的欲插入到缺失位点2的基因或序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图4所示(pBNX36)。

间隔区I4L的插入载体

为了在MVA基因组中的间隔区，即相应于基因组位置为56760处的ORF I3L和I4L之间插入外源序列，构建了包含在I4L基因座间隔区附近约600bp的侧翼序列的载体。按上述类似的方法设计和构建载体。在侧翼序列之间置有受痘病毒启动子转录调控下的Ecogpt基因(或gpt，代表分离自大肠杆菌的磷酸核糖基转移酶)。此外，其具有克隆位点以便插入另外的欲插入到I4L ORF之后间隔区的基因或序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图5所示(pBNX39)。

构建包含在其基因组中整合了数个同源基因的重组痘病毒

插入载体

为了将分别来自登革病毒4个血清型的4个PrM基因插入到MVA基因组中，使用了4个单独的重组载体。

如上面的详细描述，这些载体包含与MVA基因组同源的序列，以便通过同源重组而靶向插入。此外，每一个载体包含选择或报道基因表达盒。

登革病毒的4个血清型的PrM序列是通过寡核苷酸(oligo)退火和PCR扩增而合成的。将PrM序列克隆到痘病毒启动子元件的下游以形成表达盒。该表达盒接着克隆到相关插入载体构建体中的克隆位点。

结果，缺失A的插入载体构建体包含登革病毒血清型2的PrM基因(图6-pBN39)。缺失2的插入载体构建体包含登革病毒血清型1的PrM基因(图7-pBN49)。间隔区I4L的插入载体包含登革病毒血清型3的PrM基因(图8-pBN50)。对于缺失E的插入载体包含登革病毒血清型4的PrM基因(图9-pBN40)

插入载体的PCR验证

为了检验克隆策略是否成功，进行了PCR分析。为进行PCR分析，引物选择对如下引物组合：特异于结合与插入位点相关的侧翼序列的引物，第二条引物特异结合登革病毒的高同源性PrM基因之一。

对于包含登革病毒血清型2的PrM基因的缺失A的插入载体，所用的筛选引物是：oBN93(CGCGGATCCATGCTGAACATCTTGAACAGGAG ACGCAGA.SEQID NO.：1)和oBN477(CATGATAAGAGATTGTATCAG.SEQ ID NO.：2)。

对于包含登革病毒血清型1的PrM基因的缺失2的插入载体，所用的筛选引物是：oBN194(ATGTTGAACATAATGAACAGGAGGAAAAGATCTGTGACCATGCTCCTCATGCTGCTGCCCACAGCCCTGGCGTTCCATCT.SEQ ID NO.：3)和oBN476(GATTTTGCTATTCAGTGGACTGGATG.SEQ ID NO.：4)。

对于包含登革病毒血清型3的PrM基因的间隔区I4L的插入载体，所用的筛选引物是：oBN255(CCTTAATCGAATTCTCATGTCATGGATGGGGTAACCAGCATTAATAGT.SEQ ID NO.：5)和oBN479(GCTCCCATTCAATTCACATTGG.SEQ ID NO.：6)。

对于包含登革病毒血清型4的PrM基因的缺失E的插入载体，所用的筛选引物是：oBN210(ATCCCATTCCTGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGAGCGCTTCTCTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGGGTGCATGTCCCATAC.SEQID NO.：7)和oBN478(GTACATGGATGATATAGATATG.SEQ ID NO.：8)。

在PCR仪即Thermal cycler GeneAmp 9700(Perkin Elmer)中，用包含10x PCR缓冲液，MgCl₂缓冲液和Taq DNA聚合酶的Taq DNA聚合酶试剂盒(Roche，Cat.no.201205)或相当物来进行PCR实验。通常，PCR反应要求在50μl反应总体积中包含45ul的mastermix、样品DNA和ddH₂O。其中应当由30.75μl DdH₂O，5μl 10x buffer，1μl dNTP混合物(每一种10mM)，2.5μl每一种引物(5pmol/μl)，3μl MgCl₂(25mM)和0.25μl Taq-DNA聚合酶(5U/μl)来制备成mastermix。

按如下参数进行扩增反应：

1)变性：4分钟 94℃

2)30个循环：

变性： 30秒 94℃

退火： 30秒 55℃

延伸： 1-3分钟 72℃

3)延伸：7分钟 72℃

4)保存： 94℃；

根据插入基因的大小，延伸时间至少为1分钟/kb。

图10中显示的PCR结果，表明对于单个插入而使用的引物组合具有特异性。

oBN194/oBN476引物组合特异于缺失2和插入其中的PrM1。对质粒pBN49进行PCR扩增的片段预期为678bp(示于第3道，凝胶的上半部)。

oBN255/oBN479引物组合特异于间隔区I4L和插入其中的PrM3。对质粒pBN50进行PCR扩增的片段预期为825bp(示于第9道，凝胶的上半部)。

oBN210/oBN478引物组合特异于缺失E和作为插入物的PrM4。对质粒pBN40进行PCR扩增的片段预期大小为607bp(示于第5道，凝胶的下半部)。

oBN93/oBN477引物组合特异于缺失A和插入其中的PrM2。对质粒pBN39进行PCR扩增的片段预期为636bp(示于第11道，凝胶的下半部)。

经同源重组产生重组MVA

为通过重组MVA中表达外源基因，可通过称为同源重组的方法将需要表达的基因插入到病毒基因组中。为此目的，将目的外源基因克隆到如上所述的插入载体中。再将该载体转染已被MVA-BN感染的细胞。在被感染和转染的细胞质中发生重组。利用包含在插入载体中的选择和/或报道基因表达盒，可以鉴定和分离出含有重组病毒的细胞。

同源重组

为进行同源重组，BHK(幼仓鼠肾Baby hamster kidney)细胞或CEF(原生鸡胚胎纤维原)细胞在6孔平板上接种培养，所用培养基是DMEM(Dulbecco`s Modified Eagles Medium，Gibco BRL)+10％牛胎血清(FCS)或为了无血清生产程序，则用VP-SFM(Gibco BRL)+4mmol/l L-谷氨酸作培养基。

为了保持细胞处于生长阶段，并因此应当在转染那天达到60-80％融合(confluence)，在进行接种培养之前对细胞计数，作为已知细胞数来确定感染复数(moi)。

为了进行感染，MVA母液在DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸中稀释至500μl稀释液中大约含有的合适病毒数可获得0.01的moi。可设想细胞在培种培养后会分裂一次。去除培养基，于室温用500μl稀释病毒液感染1小时。去除接种物后，用DMEM/VP-SFM洗涤。被感染细胞分别置于1.6ml DMEM/FCS和VP-SFM/L-谷氨酸以用于转染反应(QiagenEffectene Kit)。

使用“Effectene”转染试剂盒(Qiagen)来进行转染。1-5μg线性化插入载体(多次转染的总量)于最终体积为150μl的缓冲液EC中而制备转染混合液。每μg DNA加入8.0μl Enhancer，旋涡后于室温培育5分钟。然后，在旋涡母液试管后，每μg DNA加入25μl Effectene，通过旋涡充分混匀溶液，并于室温培育10分钟。分别加入600μ DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸，混匀，接着整个转染混合液加入到已用培养基履盖的细胞。轻轻摇动平板，混合以进行转染反应。于37℃和5％CO₂条件下培育过夜。第二天去除培养基，用新鲜DMEM/FCS或VP-SFM/L-谷氨酸代替。持续培育直到第3天。

为了收集细胞，将细胞刮到培养基中进而悬浮，并将细胞悬浮液转移到适当试管中，若短期保存可于-20℃冷冻保存，若长期保存则在-80℃冷冻保存。

将PrM4插入到MVA中

在第一轮中，按上述程序用MVA-BN感染细胞，再用包含登革病毒血清型4的PrM基因和EGPF作为报道基因的插入载体pBN40进行感染。由于转染载体中含有报道基因EGFP，因此最迟在第3天即可在被重组病毒感染的细胞中检测到所合成的蛋白质。获得的重组病毒用噬斑纯化法进行纯化。

用移液管管尖分离被感染细胞(发荧光或染色)，在200μL PBS或培养基中重悬浮和抽吸，以进行噬斑纯化。然后，包含约10E6个细胞的新培养皿用100μl重悬浮噬斑进行感染。48小时后，细胞悬浮于300μl PBS中。从悬浮液中抽提DNA，用PCR分析进行筛选。选择出显示预期条带的克隆，并用该病毒以不同量感染新鲜6孔平板。用1％琼脂糖覆盖住孔以防止病毒的撒布。48小时后即可分离包含重组病毒克隆的被感染细胞。

重复该过程，直到用PCR不能检测到野生型MVA-BN为止。

经过4轮噬斑纯化后，用能够选择性扩增预期插入(如上所述的oBN210和OBN478)的引物对进行PCR分析，以鉴定重组病毒即MVA-PrM4，其中对照引物对能特异识别插入位点缺失E(oBN453：GTTGAAGGATTCACTTCCGTGGA，SEQ ID NO.：9和oBN454：GCATTCACAGATTCTATTGTGAGTC，SEQ ID NO.：10)。

将PrM2插入到MVA-PrM4

按上面描述的方法用MVA-PrM4感染细胞，并进一步用包含登革病毒血清2的PrM基因和NPT II(新霉素抗性基因)作为选择基因的插入载体pBN39进行感染。为了纯化表达抗生素抗性基因的重组MVA，推荐最好是病毒在选择条件下扩增3轮再进行噬斑纯化步骤。因此加入G418到培养基中，以选择新霉素磷酸转移酶。G418是新霉素的衍生物，通过干扰核糖体的功能而抑制蛋白质的合成。NPT基因的活性可通过磷酸化而使G418失活。

在新霉素选择存在下，进行16轮噬斑纯化后，用能够选择性扩增预期插入(如上所述的oBN93和oBN477)的引物进行PCR分析，以鉴定重组病毒即MVA-PrM4/PrM2，其中对照引物对特异性识别插入位点缺失A(如上的oBN477)和oBN452：GTTTCATCAGAAATGACTCCATGAAA，SEQ ID NO.：11)。此外，PrM4在缺失E的插入用下述引物对进行验证：oBN210-oBN478和oBN453-oBN454。

将PrM1插入MVA

在第一轮中，按上述程序用MVA-BN感染细胞，再用含有登革病毒血清型1的PrM基因和hbfp作为报道基因(人源化蓝色荧光蛋白基因)的插入载体pBN49进行转染。在用重组病毒感染细胞的第3天即可检测到合成的hbfp蛋白。获得的重组病毒用噬斑纯化法进行纯化。

经过10轮噬斑纯化后，用能够选择性扩增预期插入(如上所述的oBN194和OBN476)的引物对进行PCR分析，以鉴定重组病毒即MVA-PrM4，其中对照引物对能特异识别插入位点缺失2(oBN54：CGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGAGGCATC，SEQID NO.：12和oBN56：AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAATTAT，SEQ IDNO.：13)。

将PrM3插入MVA

在第一轮中，按上述程序用MVA-BN感染细胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM基因和Ecogpt基因(Ecogpt或简写成gpt，代表磷酸核糖基转移酶基因)作为报道基因的插入载体pBN50进行感染。获得的重组病毒通过3轮噬斑纯化，选择条件上添加霉酚酸、叶黄素和次黄嘌呤以对磷酸核糖基转移酶代谢进行选择。霉酚酸抑制次黄苷单磷酸脱氢酶，导致嘌呤合成受阻，因而在大部分细胞系中抑制病毒复制。可以通过组成性启动子的Ecogpt的表达以及提供叶黄素和次黄嘌呤作为底物可克服这种受阻。

用能够选择性扩增预期插入(如上所述的oBN255和oBN479)的引物进行PCR分析，以鉴定获得的重组病毒即MVA-PrM3，其中对照引物对能特异识别插入位点I4L(oBN499：CAACTCTCTTCTTGATTACC，SEQID NO.：14和oBN500：CGATCAAAGTCAATCTA TG，SEQ ID NO.：15)。

MVA-PrM1和MVA-PrM3的共感染

用等量的按上述方法获得的MVA-PrM1和MVA-PrM3感染细胞。在用磷酸核糖基转移酶代谢选择重组病毒的蓝色荧光克隆，如此进行3轮噬斑纯化，对纯化的重组病毒用引物对(如上述的oBN255和oBN479、oBN499和oBN500、oBN194和oBN476、oBN54和oBN56)进行PCR分析。获得的重组病毒称为MVA-PrM1/PrM3。

MVA-PrM1/PrM3和MVA-PrM2/PrM4的共感染

用等量的按上述方法获得的MVA-PrM1/PrM3和MVA-PrM2/PrM4感染细胞。在用磷酸核糖基转移酶代谢和新霉素选择以进行噬斑纯化。分离出能产生绿色和蓝色荧光的重组病毒，并用引物对(如上述的oBN255和oBN479、oBN499和oBN500、oBN194和oBN476、oBN54和oBN56、oBN93和oBN477、oBN477和oBN452、oBN210和oBN478、oBN453和oBN454)进行PCR分析。

如图11所示，对重组病毒(Clone 20)的PCR分析表明，包含所有4个PrM基因。凝胶的上半部显示了对重组病毒进行不同PCR的结果，下半部分显示对照质粒进行的相同PCR反应的结果(如所标出的)。第1、10和11道为1kb和100bp分子量标记。

引物组合oBN210/oBN478特异于缺失E和插入其中的PrM4。对重组病毒和质粒pBN40进行PCR的扩增片段预期为607bp(示于第2道)。

引物组合oBN453/oBN454特异于缺失E。对重组病毒进行PCR的扩增片段预期为2.7kp，对于野生型病毒为2.3kb(示于第3道)。在凝胶上半部也显示有野生型病毒的特异性条带。这表明制备的重组病毒还没有完全去除野生型病毒。有必要进一步进行噬斑纯化。

引物组合oBN93/oBN477特异于缺失A和插入其中的PrM2。对重组病毒和质粒pBN39进行PCR的扩增片段预期为636bp(示于第4道)。

引物组合oBN477/oBN452特异于缺失A。对重组病毒进行PCR的扩增片段预期为4.1kb，对于野生型病毒为2.7kb(示于第5道)。凝胶上部分可以鉴定特异于野生型病毒的条带。

引物组合oBN255/oBN479特异于间隔区I4L和插入其中的PrM3。对重组病毒和质粒pBN50进行PCR的扩增片段预期为825bp(示于第6道)。

引物组合oBN499/oBN500特异于间隔区I4L。对重组病毒进行PCR的扩增片段预期为1.0kb，对于野生型病毒为0.3kb(示于第7道)。

引物组合oBN194/oBN476特异于缺失2和插入其中的PrM1。对重组病毒和质粒pBN49进行PCR的扩增片段预期为678bp(示于第8道)。

引物组合oBN54/oBN56特异于缺失2。对重组病毒进行PCR的扩增片段预期为1.6kp，对于野生型病毒为0.9kb(示于第9道)。在凝胶上半部也显示鉴定的野生型病毒的特异性条带。

任选地，可以产生4个不同病毒，用这4个病毒共感染的细胞，再筛选出重组体。

也可对重组载体进行改善，而包含另外的选择或抗性标记。

实施例2

插入载体

间隔区136-137(IGR136-137)的重组载体

为了将外源序列插入到MVA基因组中的相应于基因组位置129940处的称为间隔区(IGR)136-137，构建了包含该插入位点附近约600bp的侧翼序列的质粒载体。设计合适的PCR引物以便分离MVA-BN基因组DNA中的侧翼序列。这种引物含有限制性酶位点的突出端(extension)，用于将侧翼序列克隆到载体质粒上。在侧翼序列之间，引入选择基因表达盒，如受痘病毒启动子(P)转录调控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位点以便插入另外的欲插入到IGR 136-137(PacI)的基因或外源序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图12所示(pBNX67)。

间隔区07-08(IGR07-08)的重组载体

为了将外源序列插入到MVA基因组中的相应于基因组位置12800处的称为间隔区(IGR)07-08，构建了包含该插入位点附近约600bp的侧翼序列的质粒载体。设计合适的PCR引物以便分离MVA-BN基因组DNA中的侧翼序列。这种引物有限制性酶位点的突出，用于将侧翼序列克隆到载体质粒上。在侧翼序列之间，引入选择基因表达盒，如受痘病毒启动子(P)转录调控下的Ecogpt基因(鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因)。此外，具有克隆位点(PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 07-08的基因或外源序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图13所示(pBNX88)。

间隔区44-45(IGR 44-45)的重组载体

为了将外源序列插入到MVA基因组中的相应于基因组位置37330处的称为间隔区(IGR)44-45，构建了包含该插入位点附近约600bp的侧翼序列的质粒载体。设计合适的PCR引物以便分离MVA-BN基因组DNA中的侧翼序列。这种引物有限制性酶位点的突出，用于将侧翼序列克隆到载体质粒上。在侧翼序列之间，引入选择基因表达盒，如受痘病毒启动子(P)转录调控下的NPT II基因(新霉素抗性基因)。此外，具有克隆位点(PacI)以便插入另外的欲插入到IGR 44-45的基因或外源序列。根据本发明的一个如此载体构建体如图14所示(pBNX87)。

构建在基因组中包含整合了数个同源基因的重组痘病毒

插入载体

为了将分别来自登革病毒3个血清型即血清型2、3和4的3个PrM基因插入到MVA基因组中，使用了3个独立的重组载体。

登革病毒的3个血清型的PrM序列按实施例1中描述的方法合成。

结果，IGR136-137的插入载体构建体包含登革病毒血清型4的PrM基因(图15-pBN27)。IGR 07-08的插入载体构建体包含登革病毒血清型2的PrM基因(图16-pBN34)。IGR 44-45的插入载体构建体包含登革病毒血清型3的PrM基因(图17-pBN47)。

经同源重组产生重组MVA

通过同源重组制备重组MVA的方法按实施例1的方法进行。图18中表明了PrM4、PrM3和PrM2在MVA基因组中的插入位点。

将PrM4插入到MVA

在第一轮中，按上述程序用MVA-BN感染细胞，再用含有登革病毒血清型4的PrM基因和EGFP作为报道基因的插入载体pBN27进行转染。由于被转染的载体包含报道基因即EGFP，因而最迟在第3天即可在被重组病毒感染的细胞中检测到其合成的蛋白质。获得的重组病毒需要按实施例1描述的噬斑纯化法进行纯化。经过4轮噬斑纯化后，用能够选择性扩增插入位点IGR136-137的引物对对重组病毒MVA-PrM4进行PCR鉴定(oBN1008：GATACCGATCACGTTCTA.SEQ ID NO.：16和oBN1009 ggatatgattatgtagag.SEQ ID NO.：17)。

将PrM2插入到MVA

按上述程序用MVA-PrM4感染细胞，再用含有登革病毒血清型2的PrM基因和BFP基因作为报道基因的插入载体pBN34进行转染。由于被转染的载体包含报道基因BFP，因而最迟在第3天即可在被重组病毒感染的细胞中检测到其合成的蛋白质。获得的重组病毒需要按实施例1描述的噬斑纯化法进行纯化。经过6轮噬斑纯化后，重组病毒MVA-PrM4+PrM2进一步传代、增殖，并制备粗原液。用能够选择性扩增插入位点IGR07-08的引物对对该重组体进行PCR鉴定(oBN 903：CTGGATAAATACGAGGACGTG.SEQ ID NO.：18和oBN904：GACAATTATCCGACGCACCG；SEQ ID NO.：19)。

将PrM3插入到MVA

按上述程序用MVA-PrM2+4感染细胞，再用含有登革病毒血清型3的PrM基因和EGFP基因作为报道基因的插入载体pBN47进行转染。由于被转染的细胞包含报道基因EGFP，因而最迟在第3天即可在被重组病毒感染的细胞中检测到其合成的蛋白质。获得的重组病毒需要按实施例1描述的噬斑纯化法进行纯化。经过3轮噬斑纯化后，用能够选择性扩增插入位点IGR44-45的引物对(oBN904：CGTTAGACAACACACCGACGATGG.SEQ ID NO.：20和oBN905CGGATGAAAAATTT TTGGAAG.SEQ ID NO.：21)对重组病毒MVA-PrM4+3+2进行PCR鉴定。

对包含3个登革病毒PrM基因重组病毒进行PCR分析，其结果如图19所示。PCR实验按实施例1描述的方式进行。引物组合oBN1008和oBN1009特异于IGR136-137，其包含PrM4的插入(图19下面的凝胶图)。对重组病毒进行PCR，预期扩增片段为1kb(示于第4、5和6道)，用质粒作阳性对照(泳道8)。对于不含Prm4的空载体对照，预期扩增片段为190bp(泳道2)。M泳道为分子量标记，而泳道1、3和7为空。引物组合oBN902和oBN903特异于IGR07-08，其包含PrM2插入(图19上部的凝胶图)。对重组病毒进行PCR，预期片段为960bp(示于泳道4-6)，质粒阳性对照(泳道8)。对于不含Prm2的空载体对照，预期扩增片段为190bp(泳道2)。引物组合oBN904和oBN905特异于IGR44-45，其包含Prm3插入(图19中间的凝胶图)。重组病毒预期的PCR片段的大小为932bp(示于泳道4-6)，质粒阳性对照(泳道8)。对于不含Prm2的空载体对照，预期片段为185bp(泳道2)。

申请人或代理人档案号 BN 46 PCT

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

由受理局填写由国际局填写

PCT/RO/134表(1992年7月)

附录3

第14页

布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏国际局表格

收件人：

BAVARIAN NORDIC RESEARCH

INSTITUTE GMBH

FRAUNHOFERSTRASSE 18B

D-82152 MARTINSRIED

德国

保藏人的姓名和地址

当适用于细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位的资格被认定的日期。

表格bp/4(只此一页)

附录3

第24页

收件人：存活证明

BAVARIAN NORDIC RESEAR 由下一页所指明的国际保藏单位

INSTITUTE GMBH 根据细则10.2出具

FRAUNHOFERSTRASSE 18B

D-82152 MARTINSRIED

德国

保藏人的姓名和地址

1指的是初始保藏日，或者，当进行了新的保藏或保藏的转换时，指的是最相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。

2对于那些法规10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情况，指的是最近的存活性检验。

3用打叉表示选定。

表格BP/4(第1页)

附录3

第25页

4如果要求该信息并且如果检验结果为阴性，则填写此项。

分析试验的证书

产物描述MVA-575

保藏号 00120707

试验描述：对在支原体猪血清琼脂和支原体马血清肉汤中分离的支原体进行检测。SOP QC/MYCO/01/02接受标准/说明：所有阳性对照(肺炎支原体(M.pneumoniae)和口腔支原体)必须显示支原体迹象，为在琼脂板上形成典型的集落。将培养物在支原体猪血清琼脂板上进一步培养，以便评估由典型集落的形成指示的支原体迹象。所有阴性对照必须无微生物生长迹象。阳性检验结果的标准是，在琼脂板上形成典型集落所指示的支原体迹象。阴性结果将显示无此迹象。试验号：21702日期：12/02/01结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

批准人：______：ECACC质量主管

日期：______

分析试验的证书

产物描述MVA-575

保藏号 00120707

试验描述：使用Vero指示细胞系和Hoechst33258荧光检测系统检测支原体SOP QC/MYCO/07/05接受标准/说明：阴性对照中，Vero细胞可以清楚地观察到有荧光的核而细胞质无荧光。阳性对照(口腔支原体(M.orale))中必须显示支原体的迹象，即荧光核以及外加的支原体DNA的核荧光。阳性检验结果表现为外加的支原体DNA核荧光。阴性结果显示无细胞质荧光。试验号：21702日期：12/02/01结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

试验描述：对在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在液体巯基乙酸培养基(FTGM)中分离的细菌和真菌进行检测。SOP QC/BF/01/02接受标准/说明：所有阳性对照(枯草芽孢杆菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))显示微生物生长迹象(混浊)，而阴性对照不显示微生物生长迹象(清亮)。阳性检验的标准是，在任一种试验培养基中混浊。阴性检验结果必须是在所有培养基中清亮。试验号：21702日期：12/02/01结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

批准人：______：ECACC质量主管

日期：______

申请人或代理人档案号 BN46 PCT

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

由受理局填写由国际局填写

PCT/RO/134表(1992年7月)

附录3

第14页

收件人：

PROF DR ANTON MAYR

WEILHEIMER STR.1

D-82319 STARNBERG

德国

保藏人的姓名和地址

Form BP/4(只此一页)

附录3

第24页

收件人：

PROF DR ANTON MAYR 存活证明

WEILHEIMERSTR.1 由下一页所指明的国际保藏

D-82319 STARNBERG 单位根据细则10.2出具

德国

保藏人的姓名和地址

3用打叉表示选定。

BP/4表格(第一页)

附录3

第25页

4如果要求该信息并且如果检验结果为阴性，则填写此项。

BP/9表格(第二页和最后一页)

申请人或代理人档案号 BN 46 PCT

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

由受理局填写由国际局填写

PCT/RO/134表(1992年7月)

附录3

第14页

收件人：

PROF.DR.DR，H.C.MULT.ANTON MAYR

WELHEIMER STR.1

D-82319 STARNBERG

德国

保藏人的姓名和地址

BP/4表格(只此一页)

附录3

第24页

收件人：

PROF.DR.DR，H.C.MULT.ANTON MAYR 存活证明

WELHEIMER STR.1 由下一页所指明的国际保藏

D-82319 STARNBERG 单位根据细则10.2出具

德国

保藏人的姓名和地址

3用打叉表示选定。

附录3

第25页

4如果要求该信息并且如果检验结果为阴性，则填写此项。

BP/9表格(第二页和最后一页)

申请人或代理人档案号 BN 46 PCT

国际申请号

关于微生物保藏的说明

(细则13之二)

由受理局填写由国际局填写

PCT/RO/134表(1992年7月)

附录3

第25页

4如果要求该信息并且如果检验结果为阴性，则填写此项。

附录3

第24页

收件人：

BAVARIAN NORDIC RESEARCH 存活证明

INSTITUTE GMBH 由下一页所指明的国际保藏

FRAUNHOFERSTRASSE 18B 单位根据细则10.2出具

D-823152 MARTINSRIED

德国

应接到此存活证明的

单位的名称和地址

3用打叉表示选定。

附录3

第14页

收件人：

BAVARIAN NORDIC RESEARCH

INSTITUTE GMBH

FRAUNHOFERSTRASSE 18B

D-82152 MARTINSRIED

德国

保藏人的姓名和地址

Bp/4表格(只此一页)

分析试验的证书

产物描述MVA-BN

保藏号 00083008

试验描述：对在支原体猪血清琼脂和支原体马血清肉汤中分离的支原体进行检测。SOP QC/MYCO/01/02接受标准脱明：所有阳性对照(肺炎支原体(M.pneumoniae)和口腔支原体)必须显示支原体迹象，为在琼脂板上形成典型的集落。将培养物在支原体猪血清琼脂板上进一步培养，以便评估由典型集落的形成指示的支原体迹象。所有阴性对照必须无微生物生长迹象。阳性检验结果的标准是，在琼脂板上形成典型集落所指示的支原体迹象。阴性结果将显示无此迹象。试验号：21487日期：27/11/00结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

试验描述：使用Vero指示细胞系和Hoechst 33258荧光检测系统检测支原体SOP QC/MYCO/07/05接受标准/说明：阴性对照中，Vero细胞可以清楚地观察到有荧光的核而细胞质无荧光。阳性对照(口腔支原体(M.orale)中必须显示支原体的迹象，即荧光核以及外加的支原体DNA的核荧光。阳性检验结果表现为外加的支原体DNA核荧光。阴性结果显示无细胞质荧光。试验号：21487日期：27/11/00结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

批准人：______：ECACC质量主管

日期：______

分析试验的证书

产物描述MVA-BN

保藏号 00083008

试验描述：对在Tryptone Soya Broth(TSB)上和在液体巯基乙酸培养基(FTGM)中分离的细菌和真菌进行检测。SOP QC/BF/01/02接受标准/说明：所有阳性对照(枯草芽孢杆菌(Bacillis subtilus)，生孢梭菌(Clostridium sporogenes)和白色念珠菌(Candida albicans))显示微生物生长迹象(混浊)，而阴性对照不显示微生物生长迹象(清亮)。阳性检验的标准是，在任一种试验培养基中混浊。阴性检验结果必须是在所有培养基中清亮。试验号：21487日期：27/11/00结果：阳性对照：阳性阴性对照：阴性检验结果：阴性总体结果：通过

^＊＊＊证明完毕^＊＊＊

批准人：_____：ECACC质量主管：______日期：______

序列表

<110>巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)

<120>表达插入痘病毒基因组中的同源基因的重组痘病毒

<130>BN 46 PCT

<160>21

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

cgcggatcca tgctgaacat cttgaacagg agacgcaga 39

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

catgataaga gattgtatca g 21

<210>3

<211>80

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

atgttgaaca taatgaacag gaggaaaaga tctgtgacca tgctcctcat gctgctgccc 60

acagccctgg cgttccatct 80

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

gattttgcta ttcagtggac tggatg 26

<210>5

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

ccttaatcga attctcatgt catggatggg gtaaccagca ttaatagt 48

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

gctcccattc aattcacatt gg 22

<210>7

<211>80

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

atcccattcc tgaatgtggt gttaaagcta ctgagcgctt ctctcgtctc cgttctccgc 60

tctgggtgca tgtcccatac 80

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

gtacatggat gatatagata tg 22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

gttgaaggat tcacttccgt gga 23

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

gcattcacag attctattgt gagtc 25

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

gtttcatcag aaatgactcc atgaaa 26

<210>12

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

cggggtaccc gacgaacaag gaactgtagc agaggcatc 39

<210>13

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

aactgcagtt gttcgtatgt cataaattct ttaattat 38

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

caactctctt cttgattacc 20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

cgatcaaagt caatctatg 19

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

gataccgatc acgttcta 18

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

ggatatgatt atgtagag 18

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

ctggataaat acgaggacgt g 21

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>19

gacaattatc cgacgcaccg 20

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

cgttagacaa cacaccgacg atgg 24

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

cggatgaaaa atttttggaa g 21

Claims

1.一种重组修饰痘苗Ankara(MVA)病毒，至少包含两段具有至少50％同源性的同源序列，其中每一个所述序列插入到所述病毒基因组的不同插入位点。

2.一种重组MVA病毒，至少包含两段同源序列，所述序列之间具有至少60％的同源性。

3.根据权利要求1或2的重组MVA病毒，其中所述序列之间具有65-75％的同源性。

4.根据权利要求1至3任一项的重组MVA病毒，其中所述序列为同源基因。

5.根据权利要求4的重组MVA病毒，其中所述同源基因来源于黄病毒。

6.根据权利要求5的重组MVA病毒，其中所述黄病毒是登革病毒。

7.根据权利要求5或6的重组MVA病毒，其中所述基因是至少两个来源于所述病毒至少两个不同血清型的同源基因。

8.根据权利要求5-7任一项的重组MVA病毒，其中所述基因是至少两个PrM基因。

9.根据权利要求8的重组MVA病毒，其中所述基因是4个PrM基因。

10.根据权利要求4-9任一项的重组MVA病毒，其中所述同源基因每一个均受到相同启动子的转录调控。

11.根据权利要求10的重组MVA病毒，其中所述同源基因每一个均受到所述痘苗病毒早期/晚期启动子p7.5的转录调控。

12.根据权利要求1-11任一项的重组MVA病毒，其中用于形成所述重组病毒的所述MVA为如保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)、保藏号为V00083008的MVA-BN。

13.根据权利要求1-12任一项的重组MVA病毒，其中所述MVA在哺乳动物细胞中属于复制缺陷型或不能复制。

14.根据权利要求13所述的重组MVA病毒，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。

15.根据权利要求1-14任一项的重组MVA病毒，其中所述序列插入到所述MVA病毒基因组中的天然存在的缺失位点和/或间隔区。

16.一种疫苗，包含根据权利要求1至15任一项的重组MVA病毒。

17.一种药物组合物，包含根据权利要求1至15任一项的重组MVA病毒和药物学可接受载体、稀释剂、佐剂和/或添加剂。

18.根据权利要求1至15任一项的重组MVA病毒在制备药物中的应用。

19.根据权利要求1-15任一项的重组MVA病毒、根据权利要求16的疫苗或权利要求17的组合物在制备影响活体动物的免疫反应的药物中的用途。

20.根据权利要求19的用途，其中所述活体动物为人。

21.根据权利要求1-15任一项的重组MVA病毒、根据权利要求16的疫苗或权利要求17的组合物在制备诱导活体动物的免疫反应的药物中的用途。

22.根据权利要求21的用途，其中所述活体动物为人。

23.包含有根据权利要求1-15任一项所述的重组MVA病毒的细胞。

24.一种产生权利要求1-15任一项所述的重组MVA病毒的方法，包括如下步骤：

-用MVA病毒感染细胞；

-用第一载体构建体转染被感染细胞，其中第一载体构建体包含待引入到所述MVA病毒的基因组中的序列和能够指导待插入到所述MVA病毒基因组中的插入位点的所述序列的整合的MVA病毒基因组序列；

-鉴定和分离所产生的重组MVA病毒；

-用上述感染所述细胞的步骤所获得的重组MVA病毒和另一载体构建体重复上述步骤，所述另一载体构建体包含有另外的待引入到所述MVA病毒基因组中的序列，所述序列与第一载体构建体的所述序列是同源的。

25.权利要求24的方法，还包括纯化所形成的重组MVA病毒的步骤。

26.一种试剂盒，包括：

-两个或更多个载体构建体，每一个构建体包含一段序列，其中包含在不同载体中的所述序列是具有至少50％同源性的同源序列，并且其中每一段序列侧接有能够指导将所述同源序列整合到所述MVA病毒基因组中的MVA病毒DNA序列；和

-鉴定和/或选择所述同源序列已整合到其基因组中的重组MVA病毒的试剂。

27.根据权利要求26的试剂盒，其中每一段同源序列侧接有能够指导将每一个载体构建体中的所述同源序列整合到所述MVA病毒基因组中不同插入位点的MVA病毒DNA序列。

28.来源于权利要求1-15任一项的重组MVA病毒之重组MVA病毒基因组的DNA序列，其中所述DNA序列包括所述至少两段同源序列和所述MVA病毒基因组的至少部分序列。

29.一种体外或在活体外检测由权利要求1-15任一项的重组MVA病毒感染的细胞的方法，所述方法包括将权利要求28的DNA序列给予所述细胞。

30.一种体外或在活体外鉴定权利要求1-15任一项的重组MVA病毒的方法，所述方法包括将权利要求28的DNA序列给予所述病毒。

31.一种鉴定由权利要求4-15任一项的重组MVA病毒感染的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与选择性扩增所述同源基因和/或所述基因插入位点相关侧翼序列的DNA引物相接触。

32.一种鉴定权利要求4-15任一项的重组MVA病毒的方法，所述方法包括使含有所述重组MVA病毒的细胞与选择性扩增所述同源基因和/或所述基因插入位点相关侧翼序列的DNA引物相接触。