CN111979204B - 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途，该海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。重组溶瘤痘苗病毒的构建方法包括两个步骤：(A)将AVL的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB‑AVL质粒；(B)pCB‑AVL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。本发明的溶瘤痘苗病毒oncoVV‑AVL对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞以及胶质瘤细胞的体外抑制效果显著，且呈剂量依赖，同时对多种肿瘤动物模型也具有显著的治疗效果，因此本发明显著提高了溶瘤痘苗病毒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤能力。

Description

携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

背景技术

溶瘤病毒是指能够选择性感染并损伤肿瘤组织的有治疗价值的病毒。自1991年首次报导胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK)缺失的单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus,HSV)用于治疗鼠胶质母细胞瘤以来，至少已有分属10个病毒家族的溶瘤病毒进入临床试验，包括腺病毒(Adenovirus)、柯萨奇病毒(Coxackie virus)、单纯疱疹病毒、麻疹病毒(Measles virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、细小病毒(Parvovirus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、痘苗病毒(Vaccinia virus)与水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)。总体上，溶瘤病毒在临床试验中表现出了可观的安全性和有效性。

痘苗病毒是一种有被膜的双链DNA病毒，因具备全身用药稳定、瘤内快速复制和扩散、外源基因容量大以及多年来用作消除天花的疫苗表现出的安全性，从而成为一种理想的溶瘤病毒载体。进入临床前和临床试验的溶瘤痘苗病毒(oncolytic vacciniavirus,oncoVV)队伍正在日益增长。

目前常见的溶瘤痘苗病毒大都经过减毒改造，包括胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase，TK)基因缺失或TK/痘苗病毒生长因子基因双缺失的病毒株等。TK基因的缺失使痘苗病毒的复制更依赖于细胞内的TK水平，而癌细胞相比于正常细胞往往具有更高水平的TK；另外，痘苗病毒的复制还依赖于表皮生长因子受体EGFR/Ras通路的驱动，从而使其对癌细胞具有很强的选择性。痘苗病毒的几个特征还有助于它们在癌组织间的传播，例如，细胞外痘苗病毒的被膜有助于广泛扩散而且抵御中和抗体的攻击，而细胞内痘苗病毒的肌动蛋白尾巴则可帮助病毒进入邻近的癌细胞。溶瘤痘苗病毒在实验动物和人体上均表现出向癌组织靶向性聚集的能力。

海绵凝集素(Aphrocallistes vastus lectin，AVL)(GenBank:AJ276450.1)是一种钙离子依赖的C型凝集素，具有特异结合D-半乳糖的能力(Gundacker,D.,S.P.Leys,etal.(2001)."Isolation and cloning ofa C-type lectin from the hexactinellidsponge Aphrocallistes vastus:aputative aggregation factor."Glycobiology 11(1):21-29.)。在海绵中发现的凝集素见于抗HIV的应用研究。目前尚未见将AVL应用于制备抗肿瘤药物的相关研究，也尚未见将海绵凝集素基因与溶瘤痘苗病毒重组协同进行抗肿瘤的研究。

发明内容

本发明是为解决上述技术问题进行的，通过将海绵凝集素基因与溶瘤痘苗病毒进行结合，达到了对荷瘤小鼠更优的治疗效果，因而提供一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及应用。

本发明的第一方面提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒，该溶瘤痘苗病毒携带海绵凝集素基因，海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示：

atgaaagcactgctgattctgatcggaggcctggctatggcattcgcgatatcactggacacaaatgataaatatgcaaagatggagatggatatggcgactgacattgaggctgacattgaggctgatatcgagataaaatccaattataatatgactgctactcccctggaagacattgacctggaatatgttcacaaagagtgttttccttggggtgtacatgaatattgctacttccctcacataagcgttacatggggagatgctgaaacactttgccaacgttggggaggccatctagcttccatgaacagctatcatgagaggtgctttcttcaccaaaggttacacagacgtccatgttattggattggattcgtagataatagtggtacaaatactggataccaatggactgatgggagcggtggattcactttctggcatggtggacaaccagatcatcgtggaattcaaatgtgcaccagagtcattagtagacatggtacttgggataacattcattgttgggctggtcaaagggttctctgcaaaaagctcctgaggatataa

优选的，痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。

通过实验验证，oncoVV-AVL在体外对乳腺癌细胞4T1、肝癌细胞BEL-7404、结直肠癌细胞HCT116和胶质瘤细胞U87MG具有显著的抑制增殖效果(参见实施例2)，并且溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL在肿瘤细胞内的复制水平显著高于对照病毒oncoVV，说明AVL对于溶瘤痘苗病毒oncoVV在肿瘤细胞中的复制具有一定的促进作用，二者协同对肿瘤细胞的增殖进行抑制(参见实施例3)。在动物实验中，oncoVV-AVL能够显著抑制结直肠癌细胞小鼠皮下移植瘤的生长，显著抑制肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的生长(参见实施例4和5)。

本发明的第二方面提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的构建方法，该构建方法包括如下两个大步骤：(A)将AVL的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-AVL质粒；(B)pCB-AVL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。

优选的，步骤(B)中为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-AVL质粒的重组，构建获得oncoVV-AVL痘苗病毒。

在本发明的构建方法中，步骤(A)和步骤(B)中均可采用常规操作方法进行操作。步骤(B)中，重组时，痘苗病毒Western Reserve(WR)株和pCB-AVL质粒在293A细胞中进行重组，细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作；筛选时，采用黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸作为筛选药物进行重组病毒液的筛查，通过空斑实验分离重组病毒；鉴定时，利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定，获得纯化的溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL。

本发明的第三方面提供了携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，抗肿瘤药物为治疗乳腺癌、肝癌、结直肠癌或胶质瘤的药物。根据本发明实施例2和实施例3的记载，海绵凝集素基因和溶瘤痘苗病毒二者协同对肿瘤细胞的增殖进行抑制，通过MTT法检测，溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞以及胶质瘤细胞的体外抑制效果显著，且呈剂量依赖。通过动物实验验证，oncoVV-AVL对多种肿瘤动物模型也具有显著的治疗效果，在动物实验中效果显著。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明的第四方面，提供了一种携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物，其特征在于，还包括医学上可接受的药物载体。

本发明的重组病毒和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。

本发明中重组病毒及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。

本发明的有益保障及效果：

本发明提供了携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及其在制备抗肿瘤药物中的用途，通过实验证实，本发明的溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL对乳腺癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞以及胶质瘤细胞的体外抑制效果显著，且呈剂量依赖，同时对多种肿瘤动物模型也具有显著的治疗效果。因此本发明显著提高了溶瘤痘苗病毒在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤能力，在抑制肿瘤生长以及延长荷瘤小鼠生存时间上都得到了体现，为肿瘤的病毒治疗提供了新的靶点，具备广阔的临床应用前景。

此外，本发明中携带海绵凝集素基因的重组溶瘤痘苗病毒制备方法成熟，适合规模化标准化生产，为今后的临床应用提供了保障。

附图说明

图1为pCB-AVL质粒构建图谱。

图2为MTT方法检测oncoVV-AVL和对照病毒oncoVV在体外对多种肿瘤细胞的抑制效果，其中A为对乳腺癌细胞4T1的体外抑制效果，B为对肝癌细胞BEL-7404的体外抑制效果，C为对结直肠癌细胞HCT116的体外抑制效果，D为胶质瘤细胞U87MG的体外抑制效果。

图3为oncoVV-AVL和对照病毒oncoVV在肿瘤细胞内的复制水平比较结果，其中A为乳腺癌细胞4T1，B为肝癌细胞BEL-7404，C为结直肠癌细胞HCT116，D为胶质瘤细胞U87MG。

图4为oncoVV-AVL和oncoVV-TTL对结直肠癌细胞HCT116小鼠移植瘤的疗效比较结果，以PBS作为对照。

图5为oncoVV-AVL和oncoVV-GM-CSF对肝癌细胞BEL-7404细胞小鼠移植瘤的疗效比较结果，以PBS作为对照。

图6为利用NCBI数据库对AVL氨基酸序列进行保守区域分析的结果。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如PCR方法，那些用于构建载体和质粒的方法，将编码基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，具体实施方式文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL的构建和鉴定

1、将海绵凝集素(Aphrocallistes vastus lectin,AVL)的基因序列(SEQ ID NO:1)通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-AVL质粒。

pCB-AVL质粒图谱如图1所示。其中，vTK-L与vTK-R通过与野生型病毒的胸腺嘧啶激酶TK区同源重组，将外源基因插入TK区，同时造成TK缺失。此外，该质粒还带有黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(xanthine-guanine phoshporibosyl transferase，gpt)基因作为筛选基因，gpt基因来自大肠埃希菌，病毒或细胞在霉酚酸(MPA)存在的情况下，由于MPA可以阻断鸟嘌呤合成，使病毒或细胞核酸合成不能正常进行而死亡。而在gpt基因存在下，细胞或病毒可以利用次黄嘌呤(hypoxanthine)和黄嘌呤(xanthine)通过替代途径合成鸟嘌呤，使核酸合成不受限制。

2、Western Reserve(WR)株痘苗病毒和pCB-AVL质粒的重组，过程如下：

(1)在面积6cm²的培养皿内接种适当数量的293A细胞，使之能于次日长至80-90％成片。

(2)弃去培养液，沿侧壁轻轻加入1mL病毒液(0.05～0.1MOI，用含2％血清的培养基稀释病毒液)，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2～4小时，其间大约每15min摇匀一次，以防细胞局部干死。

(3)细胞转染按照试剂盒(Effectene)说明书进行操作，步骤如下：

将1μg的pCB-AVL补加buffer EC至150μL，再分别加8μL Enhance buffer，振荡1s，室温静置5min。在上述三份混合物中分别加入25μL的Effectene buffer，颠倒混匀5次，振荡10s，室温静置5～10min，然后向上述混合物中分别加入1mL的新鲜培养液(可含血清和抗生素)，上下颠倒两次。

与此同时，将步骤2中的病毒液弃去，加入4mL 10％FBS的新鲜培养液，并将混合好的转染液分别加入其中，然后将培养皿置于37℃，5％CO₂培养箱中培养6～18个小时后吸弃培养液，PBS洗一次，加入5mL的新鲜培养液继续培养。

(4)细胞完全病变后，在生物安全柜中收集病毒液，分装到离心管中，标记好，将离心管置-80℃和37℃反复冻融三次，彻底裂解细胞释放病毒，2000rmp离心5min收集上清，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

3、重组病毒的筛选，步骤如下：

(1)将生长状态良好的293A细胞接种于培养皿中，次日细胞密度可达约80％-90％。

(2)准备三种筛选药物：黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸。

(3)向(1)中每个培养皿沿侧壁小心加入500μL之前包装出来的病毒液，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养2-4h；约2～4h后，吸弃悬浮的病毒液，加入3mL新鲜培养液，其中含7.5μL的(1×)霉酚酸、75μL的(1×)黄嘌呤与7.5μL的(1×)次黄嘌呤。

(4)每天观察细胞病变情况，大约两三天后在生物安全柜中收集全部病变的细胞液，反复冻融三次，放置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

(5)每次收集的病毒液按照以上方法重复筛选3～4次。

4、病毒挑空斑及鉴定

(1)5％低溶点胶的配制：称取0.25g的低熔点胶溶于5mL的PBS中，将其121℃高压灭菌20min，然后放4℃冰箱保存备用。

(2)将状态良好的293A细胞接种于六孔板中，次日，待细胞密度达到90％左右时，将病毒液按照10^-4～10^-6梯度进行系列稀释，之后弃去六孔板中旧的培养液，向每孔加入1mL稀释好的病毒液使病毒吸附，置于培养箱中培养2～4h后将已煮沸的低熔点胶放置40℃水浴锅中保温；然后放入超净台，加入三倍体积的DMEM培养液使其最终浓度为1.25％，用吸管快速混匀并迅速用移液枪将板中的悬浮病毒液吸弃，而后用吸管沿侧壁小心加入2mL含1.25％低熔点胶的培液，注意不要将细胞吹起，然后将其置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱培养。

(3)每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况，如果有孤立的病毒空斑出现，将其挑取置于提前铺好293A细胞的12孔板中，标记好，将其置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱培养，待其充分病变后，在安全柜收集病毒液于1.5mL离心管，置于-80℃超低温冰箱保存，以备下一步鉴定。

(4)利用野生型病毒具有完整的TK区而重组病毒却不具有的特征进行PCR鉴定(自己鉴定)，获得纯化的溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL。

实施例2：MTT法检测oncoVV-AVL对多种肿瘤细胞的体外抑制效果

本实验选用乳腺癌细胞4T1、肝癌细胞BEL-7404、结直肠癌细胞HCT116和胶质瘤细胞U87MG，分别按5×10³/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入90μL细胞培养液培养过夜，分别加入1、2、5或10MOI oncoVV-AVL病毒或对照病毒oncoVV，设置6个重复孔，实验对照组为不加病毒的细胞，空白组为不含细胞的培液。

37℃，5％CO₂培养，72小时后避光每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。培养箱静置4h，吸去每组的培液后，每孔加入150μL二甲基亚砜，放在摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。置酶联检测仪上测定OD值，检测波长490nm。

根据所测OD值计算细胞存活率，公式为：细胞存活率＝(处理组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100％。

分析结果如图2所示，oncoVV-AVL在体外显著抑制多种肿瘤细胞的增殖，抑瘤效果显著优于对照病毒oncoVV。

实施例3：溶瘤痘苗病毒oncoVV-AVL在肿瘤细胞内的复制水平显著高于对照病毒oncoVV

将乳腺癌细胞4T1、肝癌细胞BEL-7404、结直肠癌细胞HCT116或胶质瘤细胞U87MG按5×10³/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入90μL细胞培养液培养过夜，分别加入5MOIoncoVV-AVL病毒或对照病毒oncoVV，每个时间梯度设置3个以上重复孔。将细胞和培液一起收集，利用TCID50法(半数组织培养感染量)对oncoVV-AVL和对照病毒oncoVV在肿瘤细胞内的复制效率进行了检测。

检测结果如图3所示：与对照组对比，实验组oncoVV-AVL病毒在肿瘤细胞内的复制效率显著高于对照病毒oncoVV。

实施例4：oncoVV-AVL显著抑制结直肠癌细胞小鼠皮下移植瘤的生长

选取4周龄雌性BALB/c裸鼠，在其前肢腋端皮下注射8×10⁶个/100μL的HCT116结直肠癌细胞，待肿瘤体积大于100mm³时，将其按照体积大小均匀的分组：PBS组，oncoVV-TTL(为本研究组之前构建的携带鲎凝集素Tachypleus tridentatus Lectin基因的溶瘤痘苗病毒：Li,G.,J.Cheng,et al.(2018)."Tachypleus tridentatus Lectin EnhancesOncolytic Vaccinia Virus Replication to Suppress In Vivo HepatocellularCarcinoma Growth."Marine Drugs 16(6).)组，oncoVV-AVL组，每组各6-8只裸鼠。分完组之后，oncoVV-AVL组和oncoVV-TTL组裸鼠瘤内注射1×10⁷PFU病毒，PBS对照组瘤内注射100μLPBS。定期测量肿瘤的体积，计算方式：肿瘤体积(mm³)＝(长×宽²)/2。

如图4所示：相比于PBS对照和oncoVV-TTL，oncoVV-AVL治疗显著抑制肿瘤生长。而且，oncoVV-TTL对结直肠癌动物模型未表现出显著的治疗效果。

实施例5：oncoVV-AVL显著抑制肝癌细胞小鼠皮下移植瘤的生长

选取4周龄雌性BALB/c裸鼠，在其前肢腋端皮下注射8×10⁶个/100μL的BEL-7404肝癌细胞，待肿瘤体积大小在120mm³左右时，将其按照体积大小均匀的分组：PBS组，oncoVV-GM-CSF组，oncoVV-AVL组，每组各6-8只裸鼠。

oncoVV-GM-CSF类似于已进入临床III期的溶瘤痘苗病毒药物Pexa-Vec(先前名为JX-594)，依据文献报导自行构建(Parato,K.A.,C.J.Breitbach,et al.2012.Theoncolytic poxvirus JX-594 selectively replicates in and destroys cancer cellsdriven by genetic pathways commonly activated in cancers.Mol Ther 20(4):749-758.)。分完组之后，oncoVV-AVL组和oncoVV-GM-CSF组裸鼠瘤内注射1×10⁷PFU病毒，PBS对照组瘤内注射100μL PBS。定期测量肿瘤的体积，计算方式：肿瘤体积(mm³)＝(长×宽²)/2。

如图5所示：相比于PBS对照，oncoVV-AVL治疗显著抑制肿瘤生长，且优于oncoVV-GM-CSF。

实施例6：AVL的保守结构域分析

利用美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的保守结构域数据库(Conserved Domain Database，CDD)对AVL的氨基酸序列进行分析，获得AVL的保守结构域信息。

结果如图6所示：AVL蛋白包含1个保守结构域，为位于第77-187位氨基酸的C型凝集素样结构域。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 杭州功楚生物科技有限公司

<120> 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途

<130> 权利要求书 说明书

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atgaaagcac tgctgattct gatcggaggc ctggctatgg cattcgcgat atcactggac 60

acaaatgata aatatgcaaa gatggagatg gatatggcga ctgacattga ggctgacatt 120

gaggctgata tcgagataaa atccaattat aatatgactg ctactcccct ggaagacatt 180

gacctggaat atgttcacaa agagtgtttt ccttggggtg tacatgaata ttgctacttc 240

cctcacataa gcgttacatg gggagatgct gaaacacttt gccaacgttg gggaggccat 300

ctagcttcca tgaacagcta tcatgagagg tgctttcttc accaaaggtt acacagacgt 360

ccatgttatt ggattggatt cgtagataat agtggtacaa atactggata ccaatggact 420

gatgggagcg gtggattcac tttctggcat ggtggacaac cagatcatcg tggaattcaa 480

atgtgcacca gagtcattag tagacatggt acttgggata acattcattg ttgggctggt 540

caaagggttc tctgcaaaaa gctcctgagg atataa 576

Claims (6)

1.携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗肿瘤药物为治疗乳腺癌、肝癌、结直肠癌或胶质瘤的药物。

2.根据权利要求1所述的携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：

其中，所述的痘苗病毒为痘苗病毒Western Reserve株、痘苗病毒天坛株、痘苗病毒Wyeth株、痘苗病毒Copenhagen株、痘苗病毒Lister株或痘苗病毒NYCBH株。

3.根据权利要求1或2所述的携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，构建方法包括如下步骤：

(A)将海绵凝集素的基因序列通过Xba I和Bgl II位点插入pCB质粒，获得pCB-AVL质粒；

(B)pCB-AVL质粒和痘苗病毒通过在细胞内的重组，经筛选和鉴定后，获得所述携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒。

4.根据权利要求3所述的携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：

其中，步骤B为痘苗病毒Western Reserve株和pCB-AVL质粒的重组，构建获得oncoVV-AVL痘苗病毒。

5.根据权利要求1所述的携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：

其中，所述抗肿瘤药物是以携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒作为唯一活性成分或者是包含携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物。

6.含有携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒的药物组合物，其特征在于，以携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒作为活性成分，还包括医学上可接受的药物载体，所述海绵凝集素基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。