CN106591361A

CN106591361A - 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用

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Publication number: CN106591361A
Application number: CN201510677281.9A
Authority: CN
Inventors: 钱文斌; 王世兵; 雷文; 黄显博
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体涉及一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用。所述重组痘溶瘤病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一：构建pCB-Beclin-1质粒；步骤二：293细胞内同源重组痘溶瘤病毒；步骤三：重组痘溶瘤病毒的筛选；步骤四：重组痘溶瘤病毒的鉴定；步骤五：重组痘溶瘤病毒的扩增与保存。本发明利用自噬基因改造痘溶瘤病毒，达到诱导自噬性细胞死亡和病毒治疗结合的目的，将能显著提高痘溶瘤病毒的抗白血病效力。应用自噬基因改造痘溶瘤病毒，达到诱导自噬性细胞死亡和病毒治疗结合，显著提高了痘溶瘤病毒的抗白血病效力。

Description

一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体涉及一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用。

背景技术

目前，恶性肿瘤的新疗法研究是国际上的重点研究方向之一。病毒治疗主要是应用分子生物学手段改造一些种类的病毒如腺病毒等成为溶瘤病毒(Oncolytic Virus)，用于杀伤癌细胞，是近年来发展非常迅速的一种肿瘤生物治疗新方法。其中，体外和动物实验均证明溶瘤病毒具有较好的抗肿瘤作用，其安全性也在I-II期临床研究中证实。因此，溶瘤病毒具有很好的产业化前景。

痘溶瘤病毒是第三代溶瘤病毒。体外和动物实验研究表明，其具有以下优点：1)病毒感染细胞后8小时病毒复制产物就能释放出来，从而感染相邻肿瘤细胞；48-72小时就能破坏感染的肿瘤细胞；2)对肿瘤细胞的靶向性较广泛，能感染多种肿瘤细胞。它感染肿瘤细胞的方式与溶瘤腺病毒不一样，是以与细胞膜融合的方式感染细胞的；3)病毒DNA不能整合到人体染色体中；4)病毒感染细胞后的产物能自我包裹，很少有病毒蛋白裸露；5)病毒能通过血行感染远端肿瘤，因此具有很好的全身抗肿瘤作用；6)临床上常用的抗病毒药物能有效清除痘病毒感染，当痘溶瘤病毒治疗一旦发生副作用可用抗病毒药物控制；7)病毒基因组能容纳较大的外源性基因插入，容易应用分子生物学手段构建携带外源性抗肿瘤基因的溶瘤病毒，增强病毒抗肿瘤作用。但是，目前对痘溶瘤病毒能否感染并杀伤白血病细胞尚不清楚。

为了增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应，国际上采用的主要策略之一是“基因-病毒治疗”，即将外源性治疗基因导入溶瘤病毒，包括诱导细胞凋亡基因如p53和TRAIL、靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因等。这种策略不仅在病毒治疗研究领域开辟了新途径，也为癌症的基因治疗提供了新的载体，已经被广泛应用于肿瘤生物治疗研究。我们前期体外和动物实验研究证明，将TRAIL和IL-24等诱导凋亡基因导入CRAd能显著增强病毒抗白血病作用。痘溶瘤病毒包括美国惠氏公司的JX-594目前主要采用GM-CSF基因。携带TRAIL基因能显著增强痘溶瘤病毒杀伤结肠癌。但是，由于痘溶瘤病毒的研究刚刚起步，尚无其他治疗性基因的研究报道。另一方面，为了进一步提高痘溶瘤病毒的抗肿瘤作用以及研究其对耐凋亡肿瘤的作用，迫切需要研究新的“基因-病毒治疗”策略。

近年来研究表明，自噬性细胞死亡(Autophagic cell death)在抗肿瘤治疗中起重要作用，是诱导耐凋亡肿瘤细胞死亡的重要方式。对白血病而言，诱导自噬性细胞死亡是抗白血病研究的新方向。在白血病荷瘤小鼠中，能完全清除肿瘤，靶向自噬-基因病毒治疗是非常有前景的白血病病毒治疗新方法。

由此可见，能否构建出一种新型痘溶瘤病毒，提高其抗白血病及血液恶性肿瘤的效力，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明为了解决上述技术难题，提供一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用。本发明利用自噬基因改造痘溶瘤病毒，达到诱导自噬性细胞死亡和病毒治疗结合的目的，将能显著提高痘溶瘤病毒的抗白血病效力。应用自噬基因改造痘溶瘤病毒，达到诱导自噬性细胞死亡和病毒治疗结合，显著提高了痘溶瘤病毒的抗白血病效力。

为了达到上述技术效果，本发明的技术方案包括：

一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：构建pCB-Beclin-1质粒：将Beclin-1基因序列克隆入pCB质粒载体中，构成pCB-Beclin-1质粒载体，插入的Beclin-1基因破坏TK基因，通过TK基因两端同源的DNA序列进行同源重组，所述pCB-Beclin-1质粒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

步骤二：293细胞内同源重组痘溶瘤病毒：接种野生型痘病毒到293细胞中，待野生型痘病毒吸附到293细胞上后，利用脂质体转染法将pCB-Beclin-1质粒载体转染至293细胞中，使293细胞完全病变；

步骤三：重组痘溶瘤病毒的筛选：待293细胞完全病变后，所述重组痘溶瘤病毒具有gpt基因，通过霉酚酸对重组痘溶瘤病毒进行筛选；

步骤四：重组痘溶瘤病毒的鉴定：对筛选出的重组痘溶瘤病毒进行PCR鉴定，其中第1对引物为野生型痘溶瘤病毒特异性配对引物，第2对引物为重组痘溶瘤病毒特异性配对引物；

步骤五：重组痘溶瘤病毒的扩增与保存：利用293细胞扩增重组痘溶瘤病毒，氯化铯梯度离心纯化重组痘溶瘤病毒，TCID50法测定纯化病毒滴度，-80℃保存。

进一步的，所述第1对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-atggaagggtctaaga-3’如SEQID NO.2所示，下游引物：5’-tcatttgttataaaattg-3’如SEQ ID NO.3所示；所述第2对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-tgtgaagacgataaattaatgatc-3’如SEQ ID NO.4所示，下游引物：5’-gtttgccatacgctcacag-3’如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，利用293细胞扩增重组痘溶瘤病毒的具体步骤包括：293细胞生长密度达90％时滴入溶瘤痘苗病毒，负压吸走70％的培养基，每100mm培养板滴0.5ml溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养60min，加复温的培养基5-8ml，24小时后出现病变效应，将所述293细胞从皿底吹落，移入离心管中，离心5000rpm，10分钟，吸弃上清，沉淀储存于-20℃或-80℃。

所述的培养基为含5％的胎牛血清。

一种重组痘溶瘤病毒，所述重组痘溶瘤病毒为向痘溶瘤病毒中插入诱导自噬基因Beclin-1，以T7为启动子，所述的重组痘溶瘤病毒采用上述构建方法所构建的重组痘溶瘤病毒。

重组痘溶瘤病毒的应用，所述的重组痘溶瘤病毒可在治疗血液恶性肿瘤疾病的药物中使用。

所述的血液恶性肿瘤疾病为白血病。

新型痘溶瘤病毒扩增技术方法及质量控制体系建立：①建立和完善扩增技术：293细胞扩增OncoPoxV-beclin-1病毒，氯化铯梯度离心纯化重组病毒，TCID50法测定纯化病毒滴度。主要是建立规范化实验流程。②质量控制体系：包括细胞株来源、传代历史、鉴定及基本生物学特征检查；细胞株进行致癌连续性细胞学试验；纯化方法：检查污染病毒、核酸、杂蛋白及其他杂质。病毒产品的理化指标检测。不同保存条件病毒活性的研究。

本发明的有益效果包括：

1.本发明将恶性肿瘤的基因治疗与病毒治疗有效结合起来，制备了可高效表达Beclin-1的溶瘤痘苗病毒，相对于单纯的基因疗法或病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。

2.本发明采用了肿瘤靶向治疗策略，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。从而大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

3.本发明采用病毒复制相关基因缺失的方式，确保病毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了溶瘤痘苗病毒载体的安全性。

4、本发明通过构建Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗血液恶性肿瘤的效果。完成新型痘溶瘤病毒治疗白血病的临床前研究，实现了对对远端肿瘤的靶向性及全身抗肿瘤作用，并完成病毒扩增及质量控制体系，为进一步的产业化奠定基础，本发明具有良好的产业化前景。本发明的技术在痘溶瘤病毒抗白血病研究领域步入国际领先地位，有助于提高本领域的学术地位。

附图说明

图1所示为本发明诱导自噬基因Beclin-1结构示意图。

图2所示为本发明MTT法检测血液肿瘤细胞HL-60存活率分析图。

图3所示为本发明MTT法检测血液肿瘤细胞K562存活率分析图。

图4所示为本发明MTT法检测血液肿瘤细胞P210存活率分析图。

图5所示为发明重组痘溶瘤病毒对正常肝细胞增殖活性的影响图。

图6所示为对照组对自噬病毒RFP-GFP-LC3细胞自噬作用图，图6A所示为检测细胞绿色荧光表达情况图，图6B所示为检测细胞红色荧光表达情况图。

图7所示为空载重组溶瘤痘苗病毒(VV)对自噬病毒RFP-GFP-LC3细胞促自噬作用图，图7A所示为检测细胞绿色荧光表达情况图，图7B所示为检测细胞红色荧光表达情况图。

图8所示为5MOI重组溶瘤痘苗病毒(VV-Beclin-1)对自噬病毒RFP-GFP-LC3细胞促自噬作用图，图8A所示为检测细胞绿色荧光表达情况图，图8B所示为检测细胞红色荧光表达情况图。

图9所示为10MOI重组溶瘤痘苗病毒(VV-Beclin-1)对自噬病毒RFP-GFP-LC3细胞促自噬作用图，图9A所示为检测细胞绿色荧光表达情况图，图9B所示为检测细胞红色荧光表达情况图。

图10所示为重组痘溶瘤病毒感染血液肿瘤细胞U266的Beclin-1基因的表达水平及自噬相关蛋白P62、LC3的表达水平免疫印迹图。

图11所示为重组痘溶瘤病毒感染血液肿瘤细胞K562的Beclin-1基因的表达水平及自噬相关蛋白P62、LC3的表达水平免疫印迹图。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

本文中的VV指代未携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒组，VV-Beclin-1指代携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒组。

实施例1

一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：构建pCB-Beclin-1质粒：将Beclin-1序列克隆入pCB质粒载体中，构成pCB-Beclin-1质粒载体，插入的Beclin-1基因破坏TK基因，通过TK基因两端同源的DNA序列进行同源重组；

步骤五：重组痘溶瘤病毒的扩增与保存：利用293细胞扩增重组痘溶瘤病毒，具体步骤包扩：利用293细胞扩增重组痘溶瘤病毒的具体步骤包括：293细胞长到培养基的90％时滴入溶瘤痘苗病毒，负压吸走70％的培养基，每100mm培养板滴0.5ml溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养60min，加复温的培养基5-8ml，24小时后出现病变效应，将所述293细胞从皿底吹落，移入离心管中，离心5000rpm，10分钟，吸弃上清，沉淀储存于-20℃或-80℃；氯化铯梯度离心纯化重组痘溶瘤病毒，TCID50法测定纯化病毒滴度，-80℃保存。

所述第1对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-atggaagggtctaaga-3’，下游引物：5’-tcatttgttataaaattg-3’；所述第2对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-tgtgaagacgataaattaatgatc-3’下游引物：5’-gtttgccatacgctcacag-3’。一种重组痘溶瘤病毒的应用，所述的重组痘溶瘤病毒可在治疗血液恶性肿瘤疾病的药物中使用，所述的血液恶性肿瘤疾病为白血病。

按照上述制备方法得到重组溶瘤痘苗病毒，所述重组痘溶瘤病毒为向痘溶瘤病毒中插入诱导自噬基因Beclin-1，以T7为启动子，如图1所示，诱导自噬基因Beclin-1结构示意图，其表达框为pT7-Beclin-1-polyA；其中pT7表示启动子T7，Beclin-1表示诱导自噬基因，polyA表示多聚腺苷酸尾；该病毒的TK基因部分缺失。图1中，TKL是TK基因左边部分，Promoter是目的基因上游的T7启动子，gpt是药物筛选基因，TKR是TK基因的右边部分。

一种上述重组痘溶瘤病毒的应用，所述的重组痘溶瘤病毒可在治疗血液恶性肿瘤疾病的药物中使用。优选地，所述的血液恶性肿瘤疾病为白血病。

实施例2重组溶瘤痘苗病毒对血液肿瘤细胞HL-60、K562和P210增殖活性的影响

血液肿瘤细胞HL-60、K562和P210(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、未携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒组(VV)、携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒组(VV-Beclin-1)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入VV(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)和VV-Beclin-1(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图2～4所示，随着剂量的增加，VV和VV-Beclin-1对血液肿瘤细胞HL-60、K562和P210增殖抑制效应愈加显著，且VV-Beclin-1对血液肿瘤细胞HL-60、K562和P210增殖抑制效应显著强于VV。

实施例3重组溶瘤痘苗病毒对正常肝细胞增殖活性的影响

正常肝细胞QSG-7701(购自中国科学院细胞库)在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640(购自Gibco)中培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)，取第四代细胞按1×10⁴/ml的浓度接种100μl于96孔培养板。设定对照组、重组溶瘤痘苗病毒组(VV)、携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒组(VV-Beclin-1)，每组均做3复孔。待细胞生长密度达60-70％，分别加入VV(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)和VV-Beclin-1(1MOI、2MOI、4MOI、8MOI)，继续培养72小时后，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl溶液，继续培养4小时后，终止培养，离心去除培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min后，在Thermo Varioskan Flash全自动酶标仪上选择波长490nm测定各孔吸光值(A值)，上述实验重3次。根据A值计算细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组A值-加药组A值)/阴性对照组A值×100％。

结果见图5，随着剂量的增加，VV和VV-Beclin-1对正常肝细胞QSG-7701无明显抑制效应。

实施例4重组溶瘤痘苗病毒对血液肿瘤细胞的促自噬作用

六孔板中接种5×10⁵个/mL的U266细胞，并加入自噬双荧光指示病毒RFP-GFP-LC3，分别加入5MOI和10MOI的携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒(VV-Beclin-1)和空载重组溶瘤痘苗病毒(VV)，对照组中加入等量的PBS，37℃、5％CO₂培养，48h后使用激光共聚焦显微镜检测细胞绿色荧光(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)表达情况。

结果见图6～9所示，VV-Beclin-1能诱导细胞自噬，且高浓度VV-Beclin-1促自噬作用更加显著。

实施例5免疫印迹实验检测携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒感染血液肿瘤细胞K562和U266，Beclin-1基因的表达水平及自噬相关蛋白P62、LC3的表达水平。

携带Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒(VV-Beclin-1)分别以1MOI、2MOI、4MOI的剂量感染K562和U266细胞，37℃，5％CO₂条件下培养24小时，按照标准Western Blot操作方法用蛋白裂解液预处理细胞并收集细胞及其上清于1.5ml离心管中。-20℃保存或定量后直接使用。将蛋白样品用BCA蛋白定量试剂盒定量后，每孔加入10μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后按半干法将电泳产物转印到NC膜上。5％BSA室温封闭3h，加一抗(1比1000稀释)，室温孵育2h，TBST洗膜10min×3次后，加荧光二抗(1比15000稀释)，室温孵育1h，TBST洗膜10min×3次后，红外扫描仪(odessay infrared imaging syetem)扫描目的蛋白的表达。

结果如图10～11所示，在K562和U266细胞中，随着VV-BECN1剂量增大，Beclin-1表达水平明显升高，P62蛋白显著降低，LC3II蛋白表达上升。

本发明通过构建Beclin-1基因的重组溶瘤痘苗病毒，发挥了较好的抗血液恶性肿瘤的效果。完成新型痘溶瘤病毒治疗白血病的临床前研究，实现了对对远端肿瘤的靶向性及全身抗肿瘤作用，并完成病毒扩增及质量控制体系，为进一步的产业化奠定基础，本发明具有良好的产业化前景。本发明的技术在痘溶瘤病毒抗白血病研究领域步入国际领先地位，有助于提高本领域的学术地位。

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims

1.一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，所述第1对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-atggaagggtctaaga-3’，下游引物：5’-tcatttgttataaaattg-3’；所述第2对引物的核苷酸序列为：上游引物：5’-tgtgaagacgataaattaatgatc-3’下游引物：5’-gtttgccatacgctcacag-3’。

3.根据权利要求1所述的一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，利用293细胞扩增重组痘溶瘤病毒的具体步骤包括：293细胞生长密度达90％时滴入溶瘤痘苗病毒，负压吸走70％的培养基，每100mm培养板滴0.5ml溶瘤痘苗病毒，放入孵箱培养60min，加复温的培养基5-8ml，24小时后出现病变效应，将所述293细胞从皿底吹落，移入离心管中，离心5000rpm，10分钟，吸弃上清，沉淀储存于-20℃或-80℃。

4.根据权利要求3所述的一种重组痘溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，所述的培养基为含5％的胎牛血清。

5.一种重组痘溶瘤病毒，其特征在于，所述重组痘溶瘤病毒为向痘溶瘤病毒中插入诱导自噬基因Beclin-1，以T7为启动子，所述的重组痘溶瘤病毒为采用权利要求1～4任一项所述的构建方法所构建的重组痘溶瘤病毒。

6.一种权利要求5所述的重组痘溶瘤病毒的应用，其特征在于，所述的重组痘溶瘤病毒可在治疗血液恶性肿瘤疾病的药物中使用。

7.根据权利要求6所述的一种重组痘溶瘤病毒的应用，其特征在于，所述的血液恶性肿瘤疾病为白血病。