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CN108715863B - 一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用 - Google Patents

一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用 Download PDF

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CN108715863B CN201810543497.XA CN201810543497A CN108715863B CN 108715863 B CN108715863 B CN 108715863B CN 201810543497 A CN201810543497 A CN 201810543497A CN 108715863 B CN108715863 B CN 108715863B
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Abstract

本发明涉及一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用，属于基因工程领域。该载体以pcDNA3.1质粒为基础，以筛选获得的最佳长度的人端粒酶逆转录酶启动子hTERT启动子替代其原有的CMV启动子，在其后可连接不同种类的肿瘤杀伤性基因序列，使用转染试剂将重组载体转染到不同种类肿瘤细胞，在体内及体外实验中均取得了一定的肿瘤杀伤作用。一种有效的可供外源基因在肿瘤部位靶向表达的非病毒载体，有望在肿瘤的基因治疗中实现应用。

Description

一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含hTERT启动子的用于肿瘤靶向基因治疗的载体、载体构建及其应用。
背景技术
近年来恶性肿瘤的发病率持续升高，已成为威胁人类健康的第二大类疾病，全世界每年约有13％的人数死于恶性肿瘤，中国也有60％以上的癌症死亡率。随着环境的恶化、工作压力加大、不良生活的方式以及世界人口老龄化，这一数字也将继续上升，据WHO估计，2007年到2030年间，新发癌症病例将由2007年的1130万例激增到2030年的1550万例，给家庭和社会造成无法弥补的损失。而目前临床上传统的手术、放疗和化疗等治疗方法和手段其效果难以令人满意。
手术和放疗为局部性的治疗，对肿瘤的复发与转移作用有限，化疗虽然为全身性的治疗手段，但是缺少靶向性，对人体健康细胞的伤害难以避免，Murray JC发表文章报道仅2％～5％到达肿瘤部位，大于90％药物被正常组织吸收，造成很大的毒副作用。因此开发靶向性的肿瘤治疗药物十分迫切。
目前肿瘤的靶向性治疗药物研究主要集中在以下几方面：1、针对与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号转导通路的关键酶(蛋白酪氨酸激酶、芳香化酶、拓朴异构酶等)为靶点，选择性作用于特定靶位的高效、低毒、特异性强的小分子化合物。2、抗体靶向药物。是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定受体特异性识别，从而把药物直接导向肿瘤细胞，提高药物的疗效，降低药物对循环系统及其它部位的毒性。根据其结构，抗肿瘤单克隆抗体类可以分为抗肿瘤单克隆抗体药物和抗肿瘤单克隆抗体偶联物。其中抗肿瘤单克隆抗体药物能结合到肿瘤细胞，通过直接的抗原抗体反应导致细胞死亡。抗肿瘤单克隆抗体偶联物，又称免疫偶联物，由单抗与“攻击”肿瘤的成分(化学药物、放射性核素、光敏剂、酶等)2部分偶联构成。3、靶向性给药载体系统。利用该系统药物可通过特殊载体或修饰基团的作用特异性地浓集于靶部位。这些特殊载体包括脂质体、纳米粒、胶束和纳米囊等，修饰基团包括抗体、糖蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、多肽类、叶酸等。4、靶向性基因治疗。使用特异的载体系统将治疗基因靶向性导入肿瘤细胞是目前国内外肿瘤靶向治疗的研究热点，也是很有可能获得突破性成果造福人类的领域之一。
为了实现靶向性基因治疗，需要将目的基因通过某种手段定向导入特定的组织、细胞或使其在某些特定的组织细胞中表达，从而准确消除肿瘤细胞，同时不损伤正常细胞，或尽量减少对正常细胞的损伤，以减轻由于外源基因导入带来的副作用，这除了在固定的有限的肿瘤部位进行治疗外，还要求治疗中使用的目的基因具有转移的靶向性以及在其转移后能靶向性的表达等。随着对载体研究的深入，人们发现单一通过载体很难满足靶向性的需要，而对于肿瘤特异性启动子的研究可以很好的填补运用单一载体的不足。正常细胞内由于并不含有该特异性转录激活因子，因而导入这些细胞中的治疗基因并不表达。关于特异性启动子报道较多的有：
酪氨酸酶(Tyrosinase，Tyr)启动子：Tyr表现为特异地表达于黑色素瘤细胞，其基因由Tyr启动子通过特异地方式进行表达。如Swoboda等使用Try启动子与细胞周期依赖性抑制基因(cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN2A)结合，实现基因在小鼠黑色素瘤中的特异性表达。
存活素(survivin)启动子：存活素属于抑制凋亡蛋白，其具有肿瘤特异性。存活素启动子在肝癌的治疗中可以通过介导核苷酸探针发挥作用，还可以通过在其下游连接肿瘤杀伤基因，通过在肿瘤细胞内启动该杀伤基因表达起到有效灭杀肿瘤细胞的作用。
癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)启动子：CEA特异性表达于大肠癌、乳腺癌等肿瘤组织。有报道显示,使用CEA启动子调控载有抑癌基因的腺病毒可以有效杀伤结肠癌细胞。
人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子：端粒是位于真核生物的染色体线性DNA分子的末端结构，在染色体末端呈膨大颗粒状，由一段重复的非转录序列与多种蛋白结合共同组成，其作用是保持染色体完整性及控制细胞周期。通过对人和转基因老鼠衰老相关疾病的研究可以发现，端粒对细胞的扩增以及存活起着至关重要的作用，当端粒产生功能障碍时可能产生衰老或者癌症的病理学表现。端粒的延长或缩短受端粒酶调节。端粒酶的活性随细胞分化而被抑制。
近年来，端粒酶在细胞永生化和癌症发生中所起的作用引起了广泛关注，在85％以上的人肿瘤组织中都呈现高表达，而在大多数正常体细胞中未见表达，从而使得端粒酶作为肿瘤特异性标记物成为肿瘤治疗的新靶点。而且研究发现，hTERT启动子转录活性与巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子较为接近,这使得hTERT启动子调控的载体成为具有普遍适用、作用灵敏的肿瘤特异性启动子。目前并未见使用hTERT启动子直接构建非病毒重组载体并取得高效表达结果的应用。
发明内容
本发明提供一种肿瘤靶向性载体pcTERT及其构建方法及其应用。
本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
(1)以pcDNA3.1+为模板，设计上游引物：
5’-CTGACGCGTGGAGTTCCGCGTTAC-3’及
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’，经PCR反应，得到pcDNA3.1+质粒中的cmv enhancer片段，并使其5’端带有MluI位点而3’端带有NheI位点；
(2)以人基因组DNA为模板，设计上游引物：
5’-ATAACGCGTACCCTGGGAGCGCGAGCGGC-3’，及
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’，经PCR反应，得到长度为378bp的hTERT启动子片段，并使其5’端带有NheI位点而3’端带有HindⅢ位点；
(3)将pcDNA3.1+载体及PCR得到的增强子片段分别经MluI及NheI双酶切，T4DNA连接酶进行连接得到中间体1，将中间载体1与长度为378bp的启动子片段分别用NheⅠ及HindⅢ酶切后，T4DNA连接酶进行连接得到重组载体pcTERT。
将具有肿瘤杀伤作用的蜂毒素(Melittin)序列、绿脓杆菌外毒素(PEA)序列、noxa序列及puma序列分别连入重组载体，四种片段分别5’端带有HindⅢ酶切位点而3’端带有XbaⅠ酶切位点。
使用转染试剂将含蜂毒素的重组载体及含绿脓杆菌外毒素的重组载体分别转染人食管癌TE1细胞系，使用转染试剂将含noxa序列及puma序列的重组载体分别转染人肝癌HepG2细胞系，通过对肿瘤细胞形态学变化及相关分子水平的变化的检测，证实肿瘤靶向性载体pcTERT能够启动不同肿瘤杀伤性基因序列在不同的肿瘤细胞内高效表达。
本发明的优点在于，相较于已发现的其他肿瘤特异性启动子，载体中使用的hTERT启动子具有在正常、肿瘤细胞中活性差异大及片段长度小易于进行载体构建，且本载体内可连接较长的肿瘤杀伤片段序列，因此本发明为基因治疗药物的应用提供了一种很有前景的方法。
附图说明
图1是肿瘤靶向性载体pcTERT构建示意图；
图2是经PCR反应后得到的长度为406bp的增强子片段电泳图；
图3是经PCR反应后得到的长度为378bp的启动子片段电泳图；
图4A是使用含378bp长度的hTERT启动子的绿色荧光表达载体转染人食管癌TE1细胞荧光表达图；
图4B是使用含443bp长度的hTERT启动子的绿色荧光表达载体转染人食管癌TE1细胞荧光表达图；
图4C是使用含714bp长度的hTERT启动子的绿色荧光表达载体转染人食管癌TE1细胞荧光表达图；
图4D是使用含1100bp长度的hTERT启动子的绿色荧光表达载体转染人食管癌TE1细胞荧光表达图；
图5A是未经转染的Het-1a正常食管细胞光镜下照片；
图5B是pcTERT重组载体转染Het-1a正常食管细胞48h后光镜下照片，
图5C是含蜂毒素的重组载体(pcTERT-Melittin)转染Het-1a正常食管细胞48h后光镜下照片；
图5D是含绿脓杆菌外毒素的重组载体(pcTERT-PEA)转染Het-1a正常食管细胞48h后光镜下照片；
图5E是未经转染的HL7702正常肝细胞光镜下照片；
图5F是pcTERT重组载体转染HL7702正常肝细胞48h后光镜下照片；
图5G是含noxa的重组载体(pcTERT-noxa)转染HL7702正常肝细胞48h后光镜下照片；
图5H是含puma的重组载体(pcTERT-puma)转染HL7702正常肝细胞48h后光镜下照片；
图6A是未经转染的TE1食管癌细胞光镜下照片；
图6B是pcTERT重组载体转染TE1食管癌细胞48h后光镜下照片；
图6C是含蜂毒素的重组载体(pcTERT-Melittin)转染TE1食管癌细胞48h后光镜下照片；
图6D是含绿脓杆菌外毒素的重组载体(pcTERT-PEA)转染TE1食管癌细胞48h后光镜下照片；
图6E是未经转染的HepG2肝癌细胞光镜下照片；
图6F是pcTERT重组载体转染HepG2肝癌细胞48h后光镜下照片；
图6G是含noxa的重组载体(pcTERT-noxa)转染HepG2肝癌细胞48h后光镜下照片；
图6H是含puma的重组载体(pcTERT-puma)转染HepG2肝癌细胞48h后光镜下照片；
图7A是使用pcTERT，pcTERT-Melittin，pcTERT-PEA重组质粒分别转染人食管癌TE1细胞24h，48h，72h后细胞生存率检测结果；
图7B是使用pcTERT，pcTERT-Melittin，pcTERT-PEA重组质粒分别转染人正常食管Het-1a细胞24h，48h，72h后细胞生存率检测结果；
图7C是使用pcTERT，pcTERT-noxa，pcTERT-puma重组质粒分别转染人肝癌HepG2细胞24h，48h，72h后细胞生存率检测结果；
图7D是使用pcTERT，pcTERT-noxa，pcTERT-puma重组质粒分别转染人正常肝HL7702细胞24h，48h，72h后细胞生存率检测结果；
图8是构建裸鼠HepG2移植瘤模型后，瘤内注射含蜂毒素的重组质粒(pcTERT-Melittin)，肿瘤生长曲线图；
图9A是提取肿瘤组织蛋白，蛋白免疫印迹法分析蛋白caspase 3结果图；
图9B是提取肿瘤组织蛋白，蛋白免疫印迹法分析蛋白cleaved caspase 3结果图；
图9C是提取肿瘤组织蛋白，蛋白免疫印迹法分析蛋白cyclinD1结果图。
具体实施方式
实施例1构建所需引物设计
(1)设计引物，在pcDNA3.1+载体的CMV enhancer两端各设计一个酶切位点，使其5’端带有MluⅠ位点而3’端带有NheⅠ位点：
上游引物：5’-CTGACGCGTGGAGTTCCGCGTTAC-3’
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’
(2)设计引物，在hTERT promoter两端各设计一个酶切位点，使其5’端带有NheⅠ位点而3’端带有HindⅢ位点：
长度为378bp的启动子引物
上游引物：5’-ATAACGCGTACCCTGGGAGCGCGAGCGGC-3’
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’
长度为443bp的启动子引物
上游引物：5’-ATAGCTAGCACCCTGGGAGCGCGAGCGGC-3’
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’
长度为714bp的启动子引物
上游引物：5’-ATAACGCGTGTGTCAAGGAGCCCAAGTC-3’
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’
长度为1100bp的启动子引物
上游引物：5’-ATAACGCGTCTGTCCTGCGGTTGTG-3’
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’
所述长度为378bp的启动子、长度为443bp的启动子、长度为714bp的启动子和长度为1100bp的启动子均有文献报导。
(3)设计引物，在蜂毒肽两端各设计一个酶切位点，使其5’端带有HindⅢ酶切位点而3’端带有XbaⅠ酶切位点：
上游引物：5’-TATAAGCTTGCCACCATGGTCGCC-3’
下游引物：5’-TGCTCTAGATTATCACTTGGCCTTGGCC-3’
(4)设计引物，在绿脓杆菌外毒素序列两端各设计一个酶切位点，使其5’端带有HindⅢ酶切位点而3’端带有XbaⅠ酶切位点：
上游引物：5’-ATTAAGCTTGCCACCATGGTCGGCTACCACGGC-3’
下游引物：5’-TGCTCTAGATAACGAGGGAATCACCACG-3’。
实施例2获得重组载体各片段时PCR反应体系及反应参数
(1)cmv enhancer PCR反应
Figure BDA0001679002380000061
Figure BDA0001679002380000074
(2)hTERT prompter PCR反应：
Figure BDA0001679002380000071
Figure BDA0001679002380000072
(3)蜂毒肽PCR反应：
Figure BDA0001679002380000073
Figure BDA0001679002380000081
(4)绿脓杆菌外毒素片段PCR反应
Figure BDA0001679002380000082
Figure BDA0001679002380000083
经PCR反应后得到cmv enhancer片段，如图2所示(M为DNA marker；1号泳道为cmvenhancer片段)，长度为378bp的hTERT启动子片段，如图3所示(M为DNA marker；1号泳道为hTERT启动子片段)。使用上述两个片段进行后续含蜂毒素，绿脓杆菌外毒素，noxa及puma重组质粒的构建。
实施例3启动子最优长度筛选
以pEGFP-N1质粒为模板，经PCR反应得到绿色荧光蛋白基因(EGFP)片段，并使其两端带有HindⅢ及XbaⅠ酶切位点，将该片段连入重组载体中得到EGFP重组质粒，发现连接有长度为378bp启动子的质粒荧光表达最强(图4A)，含有长度为378bp启动子的重组EGFP质粒转染细胞后荧光表达强度最强，最终选用长度为378bp的hTERT启动子用于构建重组载体，并将构建好的载体命名为pcTERT。
实施例4含肿瘤杀伤基因的重组质粒转染细胞检测hTERT启动能力
使用含肿瘤杀伤作用的蜂毒素及绿脓杆菌外毒素重组质粒，分别转染人食管癌TE1细胞及正常人食管细胞Het-1a，含noxa及puma的重组质粒转染人肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞HL7702步骤如下：
(1)转染前一天，细胞传至12孔板使第二天细胞汇合率达65％左右；
(2)转染前细胞更换新鲜DMEM培养液(含10％标准胎牛血清)；
(3)每孔100μl Opti-MEM稀释4μg质粒；
(4)每孔100μl Opti-MEM稀释2μglipo2000脂质体；
(5)将(3)、(4)步的稀释液混匀，室温静置15min；
(6)转染复合物加入12孔板，37℃，5％CO2培养箱中培养；
如图5A～5H所示，非肿瘤细胞Het-1a、HL7702在转染后细胞形态未发生明显变化。如图6A～6H所示，hTERT启动子启动肿瘤杀伤基因Melittin、PEA在肿瘤细胞TE1中表达，hTERT启动子启动肿瘤杀伤基因noxa、puma在肿瘤细胞HepG2中表达，使得肿瘤细胞表现出比较明显的凋亡细胞形态，表现为出现了更多的皱缩、变形及脱落的细胞，细胞透光率差，细胞间连接消失。
实施例5含肿瘤杀伤基因的重组质粒转染细胞后细胞增殖检测
(1)取对数生长期的细胞，常规消化，吹散细胞呈单细胞状态，以50000/ml，100μl/孔，接种于96孔板中，每组设4个复孔，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜；
(2)分别用pcTERT-Melittin(蜂毒素重组质粒)、pcTERT-PEA(绿脓杆菌外毒素重组质粒)和pcTERT转染人食管癌TE1细胞及正常食管细胞Het-1a；使用pcTERT-noxa、pcTERT-puma及pcTERT转染人肝癌HepG2细胞及正常肝细胞HL7702，放回培养箱中继续培养；
(3)取出处理不同时间点的培养板，每孔加入10μl CCK-8溶液。放回培养箱中继续培养1h，酶标仪检测450nm处每孔的吸光度；
(4)按以下公式计算细胞的存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％；
连有肿瘤杀伤作用基因的重组载体，分别对人食管癌TE1细胞(图7A)及人肝癌HepG2细胞(图7C)的增殖有较强的抑制作用，对正常食管细胞Het-1a(图7B)及正常肝细胞HL7702(图7D)的增殖基本无抑制作用。说明重组载体具有肿瘤特异性的启动后续基因表达作用。
实施例6连接蜂毒素序列的重组载体对肿瘤作用的体内研究
在裸鼠腋下接种HepG2细胞建立HepG2移植瘤模型，通过瘤内注射给药，发现pcTERT-Melittin载体对肿瘤生长具有一定的抑制作用。其步骤如下：
(1)10cm培养皿内HepG2细胞生长汇合度至80％，常规消化收集细胞；
(2)吸弃培养液，生理盐水重悬细胞至密度至5×107个/mL，左侧腋下注射200ul细胞悬液；
(3)肿瘤大小80mm3左右，随机分笼，生理盐水组4只，pcTERT组4只，pcTERT-Melittin组4只。瘤内注射转铁蛋白阳离子脂质体复合物。每三天注射一次，共注射三次；
(4)观察记录小鼠活动状态及肿瘤生长情况。
通过体内实验的研究可以发现重组载体连接具有肿瘤杀伤作用的蜂毒素序列构建得到的质粒可以在体内稳定表达，并起到抑制肿瘤组织生长的作用。如图8所示肿瘤生长受到明显抑制，如图9A～9C所示肿瘤细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3表达量升高，周期相关蛋白cyclinD1表达量下降。
以上所述为本发明相关实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种构建肿瘤靶向性载体pcTERT的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)以pcDNA3.1+为模板，设计上游引物：
5’-CTGACGCGTGGAGTTCCGCGTTAC-3’及
下游引物:5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’，经PCR反应，得到pcDNA3.1+质粒中的长度为406bp的cmv增强子片段，并使其5’端带有MluI位点而3’端带有NheI位点；
⑵以人基因组DNA为模板，设计上游引物：
5’-ATAACGCGTACCCTGGGAGCGCGAGCGGC-3’，及
下游引物：5’-CGCGCTAGCCAAAACAAACTCCCATTG-3’，经PCR反应，得到长度为378bp的hTERT启动子片段，并使其5’端带有NheI位点而3’端带有HindIII位点；
(3)将pcDNA3.1+载体及PCR得到的cmv增强子片段分别经MluI及NheI双酶切，T4DNA连接酶进行连接得到中间体1，将中间体1与长度为378bp的hTERT启动子片段分别用NheI及HindIII酶切后，T4DNA连接酶进行连接得到重组载体pcTERT。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110372780B (zh) * 2019-07-08 2020-06-02 吉林大学 抗肿瘤多肽及其在抗肿瘤领域的应用
CN114540416A (zh) * 2022-02-18 2022-05-27 上海交通大学 一种表达载体、脂质纳米粒、抗肿瘤药物及其制备方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101565718A (zh) * 2009-06-11 2009-10-28 浙江理工大学 三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用
EP0954585B1 (en) * 1996-10-01 2009-11-25 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase promoter
CN107012158A (zh) * 2017-03-28 2017-08-04 东南大学 一种端粒酶启动基因表达方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0954585B1 (en) * 1996-10-01 2009-11-25 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase promoter
CN101565718A (zh) * 2009-06-11 2009-10-28 浙江理工大学 三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用
CN107012158A (zh) * 2017-03-28 2017-08-04 东南大学 一种端粒酶启动基因表达方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"不同修饰型 hTERT 启动子在多种肿瘤细胞中的转录活性研究";司少艳等;《现代肿瘤医学》;20120531;第20卷(第5期);第916-921页 *
Cloning of Human Telomerase Catalytic Subunit (hTERT) Gene Promoter and Identification of Proximal Core Promoter Sequences Essential for Transcriptional Activation in Immortalized and Cancer Cells;Masahiro Takakura等;《[CANCER RESEARCH 》;19990201;第59卷;551-557 *
hTERT 片段真核表达质粒的构建;刘红梅等;《郑州大学学报(医学版)》;20040531;第39卷(第3期);458-460 *

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