CN107709554A

CN107709554A - 重组经修饰痘苗病毒安卡拉(mva)口蹄疫病毒(fmdv)疫苗

Info

Publication number: CN107709554A
Application number: CN201680033523.3A
Authority: CN
Inventors: 罗宾·施泰格瓦尔德; M·卡拉
Original assignee: Bavarian Nordic Research Institute AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2018-02-16
Also published as: EP3307309A1; AU2016278806A1; US20180185466A1; BR112017026649A2; ZA201707985B; CA2987159A1; MX2017016273A; EA201890042A1; US11103570B2; US20210393766A1; AU2022205166A1; CL2017003224A1; WO2016202828A1

Abstract

本发明涉及经修饰痘病毒载体，以及涉及其制备和使用方法。特定来说，本发明涉及针对FMDV感染的基于重组经修饰痘苗病毒安卡拉(基于MVA)的疫苗，以及涉及相关产品、方法和用途。具体来说，本发明涉及经遗传工程改造(重组)MVA载体，其包含至少一个编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。本发明也涉及例如适于在受试者中诱导保护性免疫应答的其产品、方法和用途。

Description

重组经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)口蹄疫病毒(FMDV)疫苗

本发明根据由美国国土安全部采购和营运办公室(U.S.Dept.of HomelandSecurity Office of Procurement and Operations)授予的HSHQDC-12-C-00051在政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及改进的FMDV疫苗，其包括针对FMDV感染的基于重组经修饰痘苗病毒安卡拉(Ankara)(基于MVA)的疫苗，以及涉及相关产品、方法和用途。具体来说，本发明涉及经遗传工程改造(重组)MVA载体，其包含编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。本发明也涉及例如适于在受试者中诱导保护性免疫应答的其产品、方法和用途。

发明背景

口蹄疫(FMD)是一种影响农场动物的最具毒性和传染性的疾病。这个疾病是世界上众多国家的地方病，尤其在非洲、亚洲和南美洲。此外，流行性爆发可定期发生。这个疾病存在于某一国家中可具有由生产力损失，受感染畜群的重量和产奶量损失，以及对这些国家施加的贸易禁运所致的极其严重的经济后果。针对这个疾病所采取的措施由以下组成：严格施加进口限制，卫生控制和隔离，屠宰患病动物和使用失活疫苗进行疫苗接种程序，作为在全国性或区域性水平上的预防措施，或当流行性爆发发生时定期进行。

FMD的特征在于它的潜伏期短暂，它具有高度传染性质，在口中以及在足上形成溃疡，以及有时导致幼小动物的死亡。FMD影响许多动物物种，特别是牛、猪、绵羊和山羊。导致这个疾病的作用物是属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的核糖核酸(RNA)病毒(Cooper等,Intervirology,1978,10,165-180)。目前，已知至少7种类型的口蹄疫病毒(FMDV)：欧洲型(A、O和C)、非洲型(SATl、SAT2和SAT3)和亚洲型(Asia 1)。也已区分众多亚型(Kleid等Science(1981),214,1 125-1 129)。

FMDV是一种直径约25nm的裸二十面体病毒，含有具有正极性的由约8500个核苷酸组成的单链RNA分子。这个RNA分子包含单一开放阅读框(ORF)，其编码尤其含有也称为蛋白质P1或P88的衣壳前体的单一多聚蛋白。蛋白质P1在它的氨基末端被肉豆寇基化。在成熟过程期间，蛋白质P1由蛋白酶3C裂解成3种蛋白质，称为VP0、VP1和VP3(或分别是1AB、1D和1C；Belsham G.J.,Progress in Biophysics and Molecular Biology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白质VP0接着被裂解成2种蛋白质VP4和VP2(或分别是1A和1B)。蛋白质VP0转化成VP2和VP4以及形成成熟病毒粒子的机理是未知的。蛋白质VP1、VP2和VP3具有约26,000Da的分子量，而蛋白质VP4较小，为约8,000Da。

衣壳蛋白的简单组合形成原体或5S分子，其是FMDV衣壳的基本组分。这个原体接着复合成五聚体以形成12S分子。病毒粒子由通过装配12个12S五聚体以使基因组RNA分子衣壳化所产生，由此构成146S粒子。病毒衣壳也可在它内部不存在RNA分子下形成(下文称为“空衣壳”)。空衣壳也命名为粒子70S。形成空衣壳可在病毒复制期间天然发生，或可通过化学处理来人工产生。

已产生许多假设、研究途径和提议以试图设计针对FMD的有效疫苗。当前，唯一在售疫苗包含失活病毒。存在关于FMDV疫苗的安全性的担忧，因为FMD在欧洲的爆发已与疫苗制造中的短处相关联(King,A.M.Q.等,(1981)Nature 293:479-480)。失活疫苗不赋予长期免疫性，因此需要每年给予加强注射，或更常常在流行性爆发的情况下给予加强注射。此外，存在与在生产失活疫苗期间不完全失活和/或病毒逃脱相关联的风险(King,A.M.Q.,同上)。本领域中的目标已在于构建构象正确的缺乏感染性FMDV基因组的免疫原以制备有效和安全疫苗。

痘苗病毒已成功用于针对天花进行免疫，从而以在1980年全世界根除天花为终结。因此，痘病毒的新作用变得重要，即作为经遗传工程改造载体用于表达外来基因(Panicali和Paoletti,1982；Paoletti等,1984)。已在痘苗中表达编码异源性抗原的基因，常常导致针对由相应病原体进行的攻击的保护性免疫性(综述于Tartaglia等,1990中)。命名为MVA的高度减毒疫苗病毒株也已用作基于痘病毒的疫苗的载体。对MVA的使用描述于美国专利号5,185,146中。

由于MVA在人细胞中具有复制缺陷，所以它的卓越安全性概况已在许多临床试验中被证明，包括对免疫损害个体的疫苗接种，以及在1970年代的天花根除运动期间，当时有120,000人用MVA疫苗接种(A.Mayr等,“The smallpox vaccination strain MVA:marker,genetic structure,experience gained with the parenteral vaccination andbehavior in organisms with a debilitated defense mechanism,”Zentralbl.Bakteriol.B 167(5-6):375-390(1978))。从那时起，已产生许多不同重组MVA疫苗，并且测试其使动物和人针对感染性(例如HIV、疟疾)和非感染性(例如前列腺癌)疾病进行免疫的能力。因此，它的被证明的安全性和良好免疫原性使得MVA成为T细胞和B细胞诱导疫苗载体的主要候选者。

额外疫苗载体系统涉及使用禽痘病毒，其天然地是宿主受限痘病毒。鸡痘病毒(FPV；Taylor等1988a,b)与金丝雀痘病毒(CPV；Taylor等,1991和1992)两者均已被工程改造以表达外来基因产物。鸡痘病毒(FPV)是痘病毒科的禽痘属的原型病毒。所述病毒导致家禽经济上重大的疾病，其通过使用活体减毒疫苗从1920年代以来已得以良好控制。禽痘病毒的复制限于禽类物种(Matthews,1982)，并且在文献中不存在禽痘病毒在包括人的任何非禽类物种中导致增殖性感染的报道。这个宿主限制提供针对病毒向其它物种中传播的固有安全性屏障，并且使得在兽医学应用和人应用中使用基于禽痘病毒的疫苗载体成为具有吸引力的命题。

其它减毒痘病毒载体已通过对野生型病毒株的遗传修饰来制备。通过从哥本哈根(Copenhagen)痘苗病毒株缺失特定毒性和宿主范围基因来获得的NYVAC载体(Tartaglia等,1992)已被证明作为重组载体适用于引发针对所表达外来抗原的保护性免疫应答。另一工程改造的痘病毒载体是源于金丝雀痘病毒的ALVAC(参见美国专利号5,756,103)。ALVAC不在非禽类宿主中增殖性复制，这是一种被认为会改进它的安全性概况的特征(Taylor等,1991和1992)。ALVAC根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款以登录号VR-2547保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。另一工程改造的痘病毒载体是源于鸡痘病毒的TROVAC(参见美国专利号5,766,599)。

重组痘病毒可以本领域中已知以及与美国专利号4,769,330；4,722,848；4,603,112；5,110,587；5,174,993；5,494,807；和5,505,941中所述的用于产生痘病毒诸如痘苗病毒和禽痘病毒的合成重组体的方法类似的两个步骤构建，所述美国专利的公开内容以引用的方式并入本文。因此，可了解提供FMDV重组痘病毒以及其组合物和产品，特别是基于ALVAC或TROVAC的FMDV重组体以及其组合物和产品，尤其是含有FMDV的P1基因和/或3C蛋白酶基因的所述重组体以及其组合物和产品，将为超过当前技术状态的可高度合乎需要的进步。

考虑到动物(包括人，即使很少发生)对FMDV的易感性，预防FMDV感染以及保护动物的方法是必需的。因此，对针对FMDV的有效疫苗存在需要。

发明概要

在本发明中确定复制缺陷和/或无能力复制的载体的各种初免-加强组合产生针对FMDV感染的有效免疫保护。

因此，本发明的一个方面提供一种重组MVA，其包含编码至少一种口蹄疫病毒(FMDV)抗原的抗原决定簇的核苷酸序列。在一优选实施方案中，MVA是MVA-BN。

有利的是，FMDV抗原可为VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B和3C。有利的是，编码一种或多种口蹄疫病毒(FMDV)抗原的核酸分子是编码FMDV P1区的cDNA和编码FMDV的FMDV 3C蛋白酶的cDNA。在一个实施方案中，使FMDV抗原可操作地连接于启动子序列例如PrMVA095R启动子或Pr13.5长启动子。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含MVA和药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

本发明的另一方面涉及一种在受试者中引发对FMDV的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用本发明的MVA。

本发明的另一方面涉及一种治疗和/或预防受试者的由FMDV引起的疾病的方法。

在另一方面，本发明涉及一种包含本发明的MVA的疫苗和细胞。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包括在第一小瓶或容器中的用于第一施用(初免)以及在第二小瓶或容器中的用于第二施用(加强)的本发明的重组MVA和/或本发明的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种产生本发明的重组MVA或从所述MVA的基因组表达的抗原决定簇的方法。

本发明的这些和其它目标将与发明详述关联加以进一步详细描述。

附图简述

并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图说明本发明的若干实施方案，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。

图1显示两种示例性构建体：#7B(MVA-mBN360B)和#8A MVA-mBN361A)的示意图。

图2显示具有3C蛋白酶活性的P1-2AB抗原的表达和加工。

图3显示以构象特异性抗P1抗体以及检测共沉淀抗原VP3和VP0来对具有正确构象的衣壳材料进行的共IP。

发明详述

本发明者已确定包含重组经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)的疫苗提供能够诱导足以赋予针对FMDV的保护性免疫性的细胞应答与体液应答两者的FMDV疫苗，所述重组经修饰痘苗病毒安卡拉包含编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。

在一个方面，本发明涉及一种表达至少一个编码一种或多种FMDV抗原的核酸序列的经修饰重组MVA病毒。根据本发明的病毒载体优选是MVA病毒诸如MVA-BN。经修饰重组载体包含异源性核酸序列，其编码例如源于由P1(包含VP1、VP2、VP3、VP4和2A)、2B和/或3C区域编码的FMDV ORF的抗原性蛋白质。

在另一方面，本发明涉及一种经修饰重组MVA病毒，其在病毒基因组的非必需区域中包括至少一个编码一种或多种来自FMDV的抗原诸如P1基因(包含VP1、VP2、VP3、VP4、2A)、2B和/或3C的基因产物的异源性核酸序列。

在另一方面，本发明涉及在受试者中引发对FMDV的免疫应答的方法，其包括施用本发明的重组MVA载体。本发明也涉及在受试者中引发对FMDV的免疫应答的方法，其包括施用本发明的重组MVA病毒。

在一个方面，本发明涉及有利地在MVA病毒基因组的非必需区域中含有至少一个表达一种或多种来自FMDV的抗原的核酸序列的重组MVA病毒。MVA病毒可为减毒MVA病毒诸如MVA-BN。

根据本发明，重组MVA病毒载体表达至少一个编码一种或多种FMDV抗原的核酸序列。特定来说，编码FMDV抗原的任何或所有基因或开放阅读框(ORF)都可被分离、表征以及插入MVA重组体中。所得重组MVA病毒用于感染动物。在动物中表达FMDV抗原导致在动物中对FMDV的免疫应答。因此，本发明的重组MVA病毒可在免疫组合物或疫苗中用于提供诱导可为但无需为保护性的免疫应答的手段。使用的分子生物学技术由Sambrook等人(1969)所描述。

本发明也涵盖可以包含编码以及在体内表达FMDV抗原的核酸分子的裸DNA质粒或载体或DNA疫苗或免疫或免疫原性组合物形式递送的FMDV抗原。

目标FMDV抗原可从FMDV获得，或可由体外和/或体内重组表达FMDV基因或其部分获得。也可使用合成FMDV序列来提供目标FMDV抗原。目标FMDV抗原可为但不限于：U、Lab、P1-2A(包含VP1、VP2、VP3、VP4和2A)；P2(包含2B和2C)和P3(包含3A、3B、VPg、3C和3D)或其部分。在一优选实施方案中，FMDV抗原是P1和3C。在一特别优选实施方案中，FMDV抗原是P1-2A或P1-2A、2B。本文引用涉及FMDV基因组序列的分离的美国专利申请序列号10/327,481，其内容以引用的方式并入本文。

现将详细提及其实例在附图中加以说明的本发明的示例性实施方案。

在一个方面，本发明提供一种包含编码FMDV的抗原决定簇的核苷酸序列的重组经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)。在另一方面，本发明提供一种包含编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列的重组MVA载体。

MVA已通过采用鸡胚胎纤维母细胞对持续多年维持在土尔其安卡拉疫苗接种研究所(Vaccination Institute,Ankara,Turkey)的皮肤痘苗病毒株安卡拉[绒毛膜尿囊痘苗病毒安卡拉病毒，CVA；对于综述，参见Mayr等(1975),Infection 3,6-14]连续传代超过570次而产生，并且用作对人的疫苗接种的基础。然而，由于常常发生与痘苗病毒相关的重度疫苗接种后并发症，所以有若干尝试来产生减毒程度更大的更安全天花疫苗。

在1960年至1974年的时期期间，Anton Mayr教授通过在CEF细胞中进行超过570次连续传代来使CVA成功减毒[Mayr等(1975)]。在多种动物模型中显示所得MVA是无毒性的[Mayr,A.和Danner,K.(1978),Dev.Biol.Stand.41:225-234]。作为呈前天花疫苗形式的MVA的早期开发的一部分，有在处于由痘苗所致的不利反应的风险下的受试者中与ListerElstree组合使用MVA-517[Stickl(1974),Prev.Med.3:97-101；Stickl和Hochstein-Mintzel(1971),Munch.Med.Wochenschr.113:1149-1153]的临床试验。在1976年，源于MVA-571种子原液(对应于第571代)的MVA在德国被注册为采用两阶段胃肠外天花疫苗接种程序的初免疫苗。随后，MVA-572用于约120,000名白种人个体中，大多数儿童在1岁与3岁之间，未报道有重度副作用，尽管许多受试者处于具有与痘苗相关的并发症的高风险的群体之中(Mayr等(1978),Zentralbl.Bacteriol.(B)167:375-390)。MVA-572以ECACC V94012707保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)。

由于用于使MVA减毒的传代，视在CEF细胞中进行的传代的数目而定，存在许多不同病毒株或分离株。举例来说，MVA-572在德国在天花根除计划期间以小剂量用作前疫苗，而MVA-575被广泛用作兽医学疫苗。相较于祖先CVA病毒，MVA以及MVA-BN缺乏约15％(来自6个区域的31kb)的基因组。缺失影响许多毒性和宿主范围基因以及A型包涵体的基因。MVA-575于2000年12月7日以登录号V00120707保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)。通过采用原代鸡胚胎纤维母细胞使CVA连续增殖(超过570代)来获得减毒的CVA-病毒MVA(经修饰痘苗病毒安卡拉)。

尽管Mayr等人在1970年代期间证明MVA在人和哺乳动物中是高度减毒和无毒性的，但某些研究者已报道MVA在哺乳动物和人细胞系中并非完全减毒的，因为残余复制可能发生在这些细胞中[Blanchard等(1998),J.Gen.Virol.79:1159-1167；Carroll和Moss(1997),Virology 238:198-211；美国专利号5,185,146；Ambrosini等(1999),J.Neurosci.Res.55:569]。据设想这些出版物中报道的结果已用MVA的各种已知病毒株获得，因为所用病毒在它们的性质方面，特别是在它们于各种细胞系中的生长行为方面基本上不同。所述残余复制出于各种原因是不合需要的，所述原因包括与在人中使用关联的安全性担忧。

对于开发更安全产品诸如疫苗或药物来说具有增强的安全性概况的MVA病毒株已由Bavarian Nordic开发：MVA由Bavarian Nordic进一步传代并命名为MVA-BN。MVA-BN的代表性样品于2000年8月30日以登录号V00083008保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。MVA-BN进一步描述于WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中，所述专利两者均以引用的方式并入本文。

MVA-BN可附着于人细胞并进入人细胞，在所述人细胞中，病毒编码的基因被极其高效表达。MVA-BN强烈适合于原代鸡胚胎纤维母细胞(CEF)细胞，并且不在人细胞中复制。在人细胞中，病毒基因被表达，并且不产生感染性病毒。根据美国疾病控制和预防中心分类，MVA-BN被分类为1级生物安全性生物体。MVA-BN和衍生物的制剂已向许多类型的动物以及超过2000名人受试者(包括免疫缺陷个体)施用。所有疫苗接种都已被证明是大体上安全和良好耐受的。尽管MVA-BN具有高减毒性和降低的毒性，但在临床前研究中，已显示它会引发对痘苗和由克隆至MVA基因组中的基因编码的异源性基因产物的体液免疫应答与细胞免疫应答两者[E.Harrer等(2005),Antivir.Ther.10(2):285-300；A.Cosma等(2003),Vaccine 22(1):21-9；M.Di Nicola等(2003),Hum.Gene Ther.14(14):1347-1360；M.DiNicola等(2004),Clin.Cancer Res.,10(16):5381-5390]。

MVA的“衍生物”或“变体”是指与如本文所述的MVA展现基本上相同复制特征，但在它们的基因组的一个或多个部分方面展现差异的病毒。MVA-BN以及MVA-BN的衍生物或变体在人和小鼠中，甚至在重度免疫抑制小鼠中未能在体内进行繁殖性复制。更具体来说，MVA-BN或MVA-BN的衍生物或变体优选也能够在鸡胚胎纤维母细胞(CEF)中繁殖性复制，但不能够在人角质化细胞细胞系HaCat[Boukamp等(1988),J.Cell Biol.106:761-771]、人骨骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)和人子宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)中繁殖性复制。另外，在HeLa细胞和HaCaT细胞系中，MVA-BN的衍生物或变体具有的病毒扩增比率比MVA-575小的至少2倍，更优选小3倍。针对MVA变体的这些性质的测试和测定描述于WO 02/42480(US 2003/0206926)和WO 03/048184(US 2006/0159699)中。

术语“不能够繁殖性复制”或“无繁殖性复制的能力”例如描述于WO 02/42480中，所述专利也教导如何获得具有如上提及的所需性质的MVA。所述术语适用于在感染之后4天时具有的病毒扩增比率小于1的病毒，所述病毒扩增比率使用WO 02/42480中或美国专利号6,761,893中所述的测定获得。

术语“未能繁殖性复制”是指病毒在感染之后4天时具有的病毒扩增比率小于1。WO02/42480中或美国专利号6,761,893中所述的测定可应用于测定病毒扩增比率。

病毒的扩增或复制通常表示为由受感染细胞产生的病毒(输出)与当初原先用于感染细胞的量(输入)的比率，被称为“扩增比率”。扩增比率“1”阐释其中由受感染细胞产生的病毒的量与初始用于感染细胞的量相同的扩增状态，这意味着受感染细胞容许病毒感染和繁殖。相反，扩增比率小于1(即输出相较于输入水平降低)指示缺乏繁殖性复制以及因此病毒减毒。

基于MVA的疫苗的优势包括它们的安全性概况以及可用于大规模疫苗生产。临床前测试已揭示MVA-BN相较于其它MVA病毒株显示优越减毒性和功效(WO 02/42480)。MVA-BN病毒株的另一性质是当相较于DNA初免/痘苗病毒加强方案时，能够在痘苗病毒初免/痘苗病毒加强方案中诱导大致上相同水平的免疫性。

由于作为本文所述的最优选实施方案的重组MVA-BN病毒在哺乳动物细胞中明显缺乏复制以及它们的明确确定的无毒性，所以它们被视为是安全的。此外，除它的功效之外，工业规模制造的可行性也可为有益的。另外，基于MVA的疫苗可递送多种异源性抗原，并且允许同时诱导体液免疫性和细胞免疫性。

适用于本发明的MVA载体可使用本领域中已知的方法制备，所述方法诸如WO/2002/042480和WO/2002/24224中所述的那些，所述专利两者均以引用的方式并入本文。

在另一方面，适于产生重组病毒的MVA病毒株可为病毒株MVA-572、MVA-575或任何类似减毒的MVA病毒株。也适合的可为突变MVA，诸如经缺失绒毛膜尿囊痘苗病毒安卡拉(dCVA)。dCVA包含MVA基因组的del I、del II、del III、del IV、del V和del VI缺失位点。所述位点特别适用于插入多个异源性序列。dCVA可在人细胞系(诸如人293、143B和MRC-5细胞系)中繁殖性复制(扩增比率大于10)，此于是使得能够通过适用于基于病毒的疫苗接种策略的进一步突变来达成优化(参见WO 2011/092029)。

抗原决定簇

任何目标DNA或外来基因都可作为编码抗原决定簇的异源性核苷酸序列插入本文所述的病毒载体中。可使用用于分离所需基因的常规技术获得用于以可表达形式插入病毒基因组中的外来基因。对于含有DNA基因组的生物体，可从基因组DNA分离编码目标抗原的基因；对于具有RNA基因组的生物体，可从基因组的cDNA拷贝分离所需基因。抗原决定簇也可由基于天然存在的序列加以修饰例如以使抗原应答、基因表达等最优化的重组DNA编码。

术语“抗原决定簇”是指刺激宿主的免疫系统以产生无论是细胞应答还是体液抗体应答的抗原特异性免疫应答的任何分子。抗原决定簇可包括蛋白质；多肽；抗原性蛋白质片段；抗原和仍然在宿主中引发免疫应答并且形成抗原的一部分的表位；蛋白质、多肽和抗原性蛋白质片段、抗原和表位的同源物或变体，包括例如糖基化蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位；以及编码所述分子的核苷酸序列。因此，蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位不限于特定天然核苷酸或氨基酸序列，而是涵盖与天然序列同一的序列以及对天然序列的修饰，诸如缺失、添加、插入和取代。

术语“表位”是指抗原上由B细胞和/或T细胞对其起应答的单独或与另一蛋白质诸如像主要组织相容性复合物(“MHC”)蛋白质或T细胞受体联合的位点。表位可由连续氨基酸或通过蛋白质的二级和/或三级折叠而毗连的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丧失。表位通常包括至少5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸-但通常小于20个氨基酸-呈独特空间构象。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体分析法和2维核磁共振。参见例如“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology,第66卷,GlennE.Morris编(1996)。

优选地，在核苷酸或氨基酸序列的水平上，同源物或变体与参照蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位具有至少约50％、至少约60％或65％、至少约70％或75％、至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更通常至少约90％、91％、92％、93％或94％，并且甚至更通常至少约95％、96％、97％、98％或99％，最通常至少约99％同一性。

用于确定核酸之间和氨基酸之间的序列同一性的技术在本领域中是已知的。两个或更多个序列可通过确定它们的“同一性百分比”来比较。两个序列(无论是核酸还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度，并且乘以100。

关于本文所述的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在对齐序列以及必要时引入空位以获得最大序列同一性百分比，并且不将任何保守性取代考虑为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参照序列(即所述候选序列所源于的蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、抗原和表位)中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适于测量比对的参数，包括为历经所比较序列的全长实现最大对齐所需的任何算法。

在加以必要的变更下，同样的情况适用于“核苷酸序列同一性百分比(％)”。

举例来说，核酸序列的适当比对由Smith和Waterman,(1981),Advances inApplied Mathematics 2:482-489的局部同源性算法提供。通过使用由Dayhoff,Atlas ofProtein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,5附录3:353-358,NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发，并且由Gribskov(1986),Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763加以标准化的评分矩阵，这个算法可应用于氨基酸序列。用以确定序列同一性百分比的这个算法的一示例性执行程序由Genetics ComputerGroup(Madison,Wis.)在“BestFit”实用应用程序中提供。这个方法的缺省参数描述于第8版(1995)Wisconsin序列分析包程序手册(可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.获得)中。在本发明的情形下确定同一性百分比的一优选方法在于使用版权属于爱丁堡大学(University of Edinburgh)，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,California)销售的MPSRCH程序包。由这个程序包套件，可采用Smith-Waterman算法，其中缺省参数用于评分表(例如空位开放罚分12，空位延伸罚分1，以及空位6)。根据产生的数据，“匹配”值反映“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或类似性百分比的其它适合程序通常在本领域中是已知的，例如另一比对程序是BLAST，使用缺省参数。举例来说，BLASTN和BLASTP可使用以下缺省参数来加以利用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截断＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；分选依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于以下因特网地址处：http:// wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。

在一些实施方案中，异源性核酸编码抗原性结构域或抗原性蛋白质片段而非整个抗原性蛋白质。这些片段可具有足以具有抗原性或免疫原性的任何长度。片段可为至少8个氨基酸长，优选是10-20个氨基酸，但可更长，诸如像至少50、100、200、500、600、800、1000、1200、1600、2000个氨基酸长，或介于之间的任何长度。

在一些实施方案中，将至少一个编码抗原性蛋白质片段或其免疫原性多肽的核酸片段插入本发明的病毒载体中。在另一实施方案中，将约2-6个编码不同抗原性蛋白质的不同核酸插入一个或多个病毒载体中。在一些实施方案中，可使用各种蛋白质的多个免疫原性片段或亚单位。举例来说，可从载体表达来自单一蛋白质的不同位点，或来自同一物种的不同蛋白质，或来自不同物种的蛋白质直系同源物的若干不同表位。

定义

在以下详述本发明之前，应了解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可变化。也应了解本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不意图限制本发明的将仅由随附权利要求限制的范围。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本领域普通技术人员通常理解相同的含义。

必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(该)(the)”包括复数个(种)指示物。因此，举例来说，提及“一个(种)抗原决定簇”包括一个(种)或多个(种)抗原决定簇，而提及“所述(该)方法”包括提及为本领域普通技术人员所知的可被修改或替代本文所述的方法的等效步骤和方法。

除非另外指示，否则位于一系列要素之前的术语“至少”应被理解为涉及所述系列中的每个要素。本领域技术人员将仅使用常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效物。所述等效物意图由本发明涵盖。

在整篇本说明书和随后权利要求中，除非上下文另外要求，否则用词“包含(comprise)”和变化形式(诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”)应理解为暗示包括一个陈述的整数或步骤或一组陈述的整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或任何其它组整数或步骤。当在本文中使用时，术语“包含”可被术语“含有”或“包括”替代，或有时当在本文中使用时被术语“具有”替代。任何以上提及的术语(包含、含有、包括、具有)无论何时在本文中在本发明的一方面或实施方案的情形下使用都可被术语“由…组成”替代，尽管优选程度较小。

当在本文中使用时，“由…组成”排除未在权利要求要素中指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

如本文所用，在多个叙述要素之间的连接术语“和/或”应被理解为涵盖个别选项与组合选项两者。举例来说，当两个要素由“和/或”联合时，第一选项涉及可在无第二要素下应用第一要素。第二选项涉及可在无第一要素下应用第二要素。第三选项涉及可同时应用第一要素和第二要素。这些选项中的任一者都应被理解为落在含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。可并行应用超过一个选项也应被理解为落在含义内，因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，“影响免疫应答”包括在受试者中产生对由重组MVA产生的蛋白质和/或多肽和/或包含本发明的重组MVA的组合物和/或疫苗的体液和/或细胞免疫应答。“体液”免疫应答，如这个术语在本领域中所熟知，是指包含抗体的免疫应答，而“细胞”免疫应答，如这个术语在本领域中所熟知，是指包含T淋巴细胞和其它白血细胞的免疫应答，尤其是由HLA限定的细胞溶解性T细胞即“CTL”达成的免疫原特异性应答。当经加工免疫原即肽片段与主要组织相容性复合物联合展示时发生细胞免疫应答。

术语“大致上类似”在本发明的FMDV抗原性蛋白质的情形下指示多肽包含历经具有10-20个氨基酸的比较窗与参照序列具有至少90％，优选至少95％序列同一性的序列。序列同一性百分比通过历经比较窗比较两个最优对齐序列来确定，其中相较于参照序列(其不包含添加或缺失)，比较窗中的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即空位)以达成两个序列的最优比对。通过以下方式来计算百分比：确定同一核酸碱基或氨基酸残基存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。

如本文所用，术语“可操作地连接”意指所述组分处于容许它们以它们的预定方式起作用的关系。

就“动物”来说，它意图是哺乳动物、鸟类等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自由以下组成的组：马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗、狼、狐狸、胡狼、豺狼)、猫科动物(例如狮、虎、家养猫、野生猫、其它大猫和其它猫科动物，包括猎豹和猞猁)、羊科动物(例如绵羊)、牛科动物(例如牛)、猪科动物(例如猪)、山羊科动物(例如山羊)、禽类(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如原猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)和鱼。术语“动物”也包括处于所有发育阶段(包括胚胎和胎儿阶段)的个别动物。

术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或分支单链或双链RNA或DNA或其杂合物。所述术语也涵盖RNA/DNA杂合物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰核苷酸诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶基、其它糖和连接基团诸如氟代核糖和硫醇化物、以及核苷酸分支。核苷酸序列可在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。包括在这个定义中的其它类型的修饰是加帽，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入用于使多核苷酸连接于蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体的手段。多核苷酸可通过化学合成来获得或由微生物产生。

术语“基因”广泛用于指代与生物功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因包括如基因组序列中的内含子和外显子，或仅包括如cDNA中的编码序列和/或为它们的表达所需的调控序列。举例来说，基因也指表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质，以及包括调控序列的核酸片段。

如本文所用，“异源性”基因、核酸、抗原或蛋白质应被理解为不存在于野生型痘病毒基因组(例如MVA或MVA-BN)中的核酸或氨基酸序列。技术人员了解当存在于痘病毒诸如MVA或MVA-BN中时，“异源性基因”将以下列方式并入痘病毒基因组中：在向宿主细胞施用重组痘病毒之后，它被表达为相应异源性基因产物，即表达为“异源性抗原”和\或“异源性蛋白质”。表达通常通过使异源性基因可操作地连接于允许在受痘病毒感染细胞中表达的调控元件来实现。优选地，调控元件包括天然或合成痘病毒启动子。

本发明进一步包括编码FMDV抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合的并具有任何长度，并且可含有呈任何组合形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。

术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换用于指代具有任何长度的氨基酸残基聚合物。聚合物可为线性或分支的，它可包含经修饰氨基酸或氨基酸类似物，并且它可间插有除氨基酸以外的化学部分。所述术语也涵盖已天然地或通过干预加以修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如是形成二硫键、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与标记组分或生物活性组分缀合。本发明涉及羊科动物、牛科动物、山羊科动物和猪科动物疫苗或药物或免疫组合物，其可包含有效量的重组FMDV抗原和药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

“药学上可接受的载体”例如描述于由E.W.Martin所编的Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)中。它们描述使用适于施用本文公开的载体和组合物的常规药学上可接受的载体的组合物和制剂。通常，所用载体的性质取决于所采用的特定施用模式。举例来说，胃肠外制剂通常包含可注射流体作为媒介物，所述流体包括药学和生理上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(诸如粉剂、丸剂、片剂或胶囊)，常规无毒固体载体包括例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。药物组合物也可含有少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，诸如像乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

术语“初免-加强疫苗接种”是指使用首先初免注射以特定抗原为目标的疫苗，随后在各种间隔下进行一次或多次相同疫苗的加强注射的疫苗接种策略。初免-加强疫苗接种可为同源或异源的。同源初免-加强疫苗接种使用包含相同免疫原和载体的疫苗进行初免注射与一次或多次加强注射两者。异源初免-加强疫苗接种使用包含相同免疫原的疫苗进行初免注射与一次或多次加强注射两者，但用于初免注射和一次或多次加强注射的载体不同。举例来说，同源初免-加强疫苗接种可使用包含表达α病毒抗原的相同核酸的重组MVA载体进行初免注射与一次或多次加强注射两者。相比之下，异源初免-加强疫苗接种可使用包含表达一种α病毒蛋白的核酸的重组MVA载体进行初免注射，并且使用不含于初免注射中的表达第二一种α病毒蛋白的另一重组MVA载体，或反之亦然。异源初免-加强疫苗接种也涵盖各种组合，诸如像在初免注射中使用编码免疫原的质粒，而在一次或多次加强注射中使用编码相同免疫原的重组MVA，或在初免注射中使用重组蛋白免疫原，而在一次或多次加强注射中使用编码相同蛋白质免疫原的重组MVA载体。

“载体”是指包含待在体外或在体内递送至靶标细胞中的异源性多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源性多核苷酸可出于预防或治疗的目的包含目标序列，并且可任选呈表达盒形式。如本文所用，载体无需能够在最终靶标细胞或受试者中复制。所述术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组”意指多核苷酸半合成或合成来源不存在于自然界中，或以不见于自然界中的排列连接于另一多核苷酸。

如本文所用，“治疗(treat/treating/treatment)”疾病意指预防、减轻、改善、部分或完全缓和、或治愈疾病，例如FMDV引起的疾病。这可为以下中的一者或多者：减轻疾病的严重性，限制或防止为所治疗疾病所特有的症状的发展，抑制为所治疗疾病所特有的症状的恶化，限制或防止疾病在先前已患有疾病的受试者中复发，以及限制或防止症状在受试者中复发。

在本说明书的整篇正文中引用若干文件。本文无论在上文还是在下文引用的各文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明书等)都据此以引用的方式整体并入本文。就以引用的方式并入的材料与本说明书抵触或不一致来说，说明书将替代任何所述材料。本文中没有内容应解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公开内容。

FMDV蛋白

在一个方面，本发明提供来自羊科动物、牛科动物、山羊科动物或猪科动物的FMDV多肽。在另一方面，本发明提供FMDV多肽及其变体或片段。

此外，来自羊科动物、牛科动物、山羊科动物或猪科动物的FMDV多肽的同源物意图在本发明的范围内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或类似功能，但已在无关生物体中分别进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种，但已通过物种形成来从共同祖先基因进化的两个多核苷酸或多肽。通常，直系同源物编码具有相同或类似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指由于在基因组内复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但这些功能可相关。野生型FMDV多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可由于翻译后修饰，由于氨基酸序列差异，或由于两者而不同于野生型FMDV多肽。特定来说，本发明的同源物将通常展现与野生型FMDV或多核苷酸序列的全部或一部分的至少80-85％、85-90％、90-95％、或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且将展现类似功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有导致蛋白质的氨基酸序列变化，以及存在于天然群体(例如病毒物种或品种)内的多态性的多核苷酸或多肽。所述天然等位基因变化可通常导致多核苷酸或多肽变化1-5％。等位基因变体可通过对许多不同物种中的目标核酸序列测序来鉴定，此可易于通过使用杂交探针以鉴定那些物种中的相同基因遗传基因座来进行。是天然等位基因变化的结果以及不改变目标基因的功能活性的任何和所有所述核酸变化和所得氨基酸多态性或变化都意图在本发明的范围内。

本文所用，术语“衍生物”或“变体”是指以下多肽或编码多肽的核酸：其具有一个或多个保守性氨基酸变化或其它微小修饰以使(1)相应多肽在相较于野生型多肽时具有大致上等效功能或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括具有FMDV多肽一级氨基酸序列的微小修饰的多肽，所述修饰可导致肽相较于未修饰对应多肽具有大致上等效活性。所述修饰可为故意的，如通过定点诱变，或可为自发的。术语“变体”进一步涵盖对序列的缺失、添加和取代，只要多肽起产生如本文定义的免疫应答的作用即可。

术语“保守性变化”表示氨基酸残基由另一生物类似残基替换，或替换核酸序列中的核苷酸以使所编码氨基酸残基不改变或是另一生物类似残基。就此而言，特别优选的取代将通常在性质上是保守的，如上所述。

本公开的多核苷酸包括由于遗传密码(例如使用对于特定宿主最优化的密码子)而具有简并性的序列。如本文所用，“最优化”是指多核苷酸经遗传工程改造以增加它在给定物种中的表达。为提供编码FMDV多肽的最优化多核苷酸，可修饰FMDV蛋白基因的DNA序列以1)包含由特定物种中高度表达的基因优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含一定A+T或G+C含量以达到大致上见于所述物种中的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除导致RNA的去稳定化、不适当多聚腺苷酸化、降解和终止，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。可通过利用真核生物和原核生物中或特定物种中密码子使用的分布频率来实现FMDV蛋白在所述物种中的表达增加。术语“优选密码子使用的频率”是指由特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸方面展现的偏好。存在20种天然氨基酸，其中大多数由超过一种密码子指定。因此，所有简并核苷酸序列都包括在本公开中，只要由核苷酸序列编码的FMDV多肽的氨基酸序列在功能上不变即可。

3C蛋白酶

在成熟过程期间，FMDV蛋白P1由蛋白酶3C裂解成3种蛋白质，称为VP0、VP1和VP3(或分别是1AB、1D和1C；Belsham G.J.,Progress in Biophysics and MolecularBiology,1993,60,241-261)。在病毒粒子中，蛋白质VP0接着被裂解成2种蛋白质VP4和VP2(或分别是1A和1B)。

高水平表达的3C蛋白酶可在细胞中导致毒性。预期真核细胞中的病毒中的残余3C活性较低，尽管它是wt-3C，因为预期在3C编码序列上游的HIV移码使翻译降低20倍，这意味着3C蛋白的量同等较低。为克服高水平表达的3C蛋白酶的毒性，本发明的发明者已发现以下策略。一种策略在于在编码FMDV 3C蛋白酶的cDNA中产生突变以使3C蛋白酶的表达水平相较于在未突变时3C蛋白酶的表达水平得以降低。另一策略在于在编码FMDV 3C蛋白酶的cDNA中产生突变以使3C蛋白酶的活性水平相较于在未突变时3C蛋白酶的表达水平得以改变。

根据一优选实施方案，编码3C蛋白酶的cDNA包含以下突变：C147T、C142L和/或C31A/L47A。

另一策略在于将表达盒克隆至低拷贝数质粒(pACYC177；例如可在New EnglandBiolabs商购获得)中。另一策略在于仔细选择导致3C蛋白酶的表达水平降低的启动子。根据一优选实施方案，通过应用弱启动子来使3C蛋白酶的表达水平降低。术语“弱启动子”是指使目标基因的表达水平弱化的启动子。

重组MVA

本文提供了包含源于FMDV的异源性或外来核酸序列的重组痘病毒(例如MVA或MVA-BN)，所述序列并入痘病毒(例如MVA或MVA-BN)基因组中的多种插入位点中。异源性核酸可编码一种或多种外来蛋白质和/或外来抗原，包括例如病毒抗原。

通常，如本文所述的“重组”MVA是指通过标准遗传工程改造方法产生的MVA，即本发明的MVA因此是经遗传工程改造或经遗传修饰MVA。因此，术语“重组MVA”包括在它们的基因组中具有优选呈转录单元形式的稳定整合的重组核酸的MVA。转录单元可包括启动子、增强子、终止子和/或沉默子。在诱导调控元件后，本发明的重组MVA可表达异源性抗原决定簇、多肽或蛋白质(抗原)。

在一个方面，本发明包括一种包含编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列的重组MVA载体。

对于如本文所述的实施方案，FMDV可源于毒性FMDV病毒株，有利的是FMDV01Manisa、01 BFS或Campos、A24 Cruzeiro、Asia 1Shamir、A Iran'96、A22 Iraq、SAT2Saudi Arabia病毒株。

其它病毒株可包括FMDV病毒株A 10-61、A5、A 12、A24/Cruzeiro、C3/Indaial、01、Cl-Santa Pau、C1-C5、A22/550/Azerbaij an/65、SAT1-SAT3、A、A/TNC/71/94、A/IND/2/68、A/IND/3/77、A/IND/5/68、A/IND/7/82、A/IND/16/82、A/IND/17/77、A/IND/17/82、A/IND/19/76、A/TND/20/82、A/IND/22/82、A/IND/25/81、A/IND/26/82、A/IND/54/79、A/IND/57/79、A/TND/73/79、A/IND/85/79、A/IND/86/79、A/APA/25/84、A/APN/41/84、A/APS/44/05、A/APS/50/05、A/APS/55/05、A/APS/66/05、A/APS/68/05、A/BIM/46/95、A/GUM/33/84、A/ORS/66/84、A/ORS/75/88、A/TNAn/60/947/Asia/l、A/IRN/05、Asia/IRN/05、O/HK/2001、O/UKG/3952/2001、O/UKG/4141/2001、Asia l/HNK/CHA/05(GenBank登录号EF149010，以引用的方式并入本文)、Asia I/XJ(Li,ZhiYong等Chin Sci Bull,2007)、HK/70(Chin Sci Bull,2006,51(17):2072—2078)、O/UKG/7039/2001、O/UKG/9161/2001、O/UKG/7299/2001、O/UKG/4014/2001、O/UKG/4998/2001、O/UKG/9443/2001、O/UKG/5470/2001、O/UKG/5681/2001、O/ES/2001、HKN/2002、05India、O/BKF/2/92、K/37/84/A、KEN/1/76/A、GAM/51/98/A、A10/Holland、O/KEN/1/91、O/IND49/97、O/IND65/98、O/IND64/98、O/IND48/98、O/IND47/98、O/IND82/97、O/IND81/99、O/IND81/98、O/IND79/97、O/IND78/97、O/IND75/97、O/IND74/97、O/IND70/97、O/IND66/98、O/IND63/97、O/IND61/97、O/IND57/98、O/IND56/98、O/IND55/98、O/IND54/98、O/IND469/98、O/IND465/97、O/IND464/97、O/IND424/97、O/IND423/97、O/IND420/97、O/IND414/97、O/IND411/97、O/IND410/97、O/IND409/97、O/IND407/97、O/IND399/97、O/IND39/97、O/IND391/97、O/IND38/97、O/IND384/97、O/IND380/97、O/IND37/97、O/IND352/97、O/IND33/97、O/IND31/97、O/IND296/97、O/IND23/99、O/IND463/97、O/IND461/97、O/IND427/98、O/IND28/97、O/IND287/99、O/IND285/99、O/IND282/99、O/IND281/97、O/IND27/97、O/IND278/97、O/IND256/99、O/IND249/99、O/IND210/99、O/IND208/99、O/IND207/99、O/IND205/99、O/IND185/99、O/IND175/99、O/IND170/97、O/IND164/99、O/IND160/99、O/IND153/99、O/IND148/99、O/IND146/99、O/SKR 2000、A22/India/17/77。

这些FMDV病毒株的其它细节可见于欧洲生物信息学信息(EMBL-EBI)网页上，并且所有相关核苷酸序列都以引用的方式并入本文。本发明者预期所有FMDV病毒株(本文所列的FMDV病毒株与尚有待于鉴定的那些FMDV病毒株两者)都可根据本公开的教导加以表达以产生例如有效疫苗组合物。同源病毒株与异源病毒株两者均用于攻击以测试疫苗的功效。动物可以真皮内、皮下、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或口服方式被攻击。

在另一方面，本发明包括一种包含编码如上所述的FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列，并且进一步包含编码为形成病毒样粒子(VLP)所需的额外蛋白质的异源性核苷酸序列的重组MVA载体。

向MVA中的整合位点

可将编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列插入MVA的一个或多个基因间区域(IGR)中。在某些实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR136/137和IGR 148/149。在某些实施方案中，重组MVA的小于5、4、3或2个IGR包含编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。异源性核苷酸序列可另外或替代地插入一个或多个天然存在的缺失位点中，特别是插入MVA基因组的主要缺失位点I、II、III、IV、V或VI中。在某些实施方案中，重组MVA的小于5、4、3或2个天然存在的缺失位点包含编码FMDV的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。

包含编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列的MVA的插入位点的数目可为1、2、3、4、5、6、7个或更多个。在某些实施方案中，将异源性核苷酸序列插入4、3、2个或更少个插入位点中。优选地，使用两个插入位点。在某些实施方案中，使用三个插入位点。优选地，重组MVA包含插入2或3个插入位点中的至少2、3、4、5、6或7个基因。

本文提供的重组MVA病毒可通过本领域中已知的常规方法来产生。用以获得重组痘病毒或将外源性编码序列插入痘病毒基因组中的方法为本领域技术人员所熟知。举例来说，标准分子生物学技术诸如克隆DNA、DNA和RNA分离、蛋白质印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术的方法描述于Molecular Cloning,A laboratory Manual(第2版)[J.Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]中，并且用于处理和操作病毒的技术描述于Virology Methods Manual[B.W.J.Mahy等(编),Academic Press(1996)]中。类似地，用于处理、操作和遗传工程改造MVA的技术和诀窍描述于Molecular Virology:A PracticalApproach[A.J.Davison和R.M.Elliott(编),The Practical Approach Series,IRL Pressat Oxford University Press,Oxford,UK(1993)(参见例如第9章:Expression of genesby Vaccinia virus vectors)]以及Current Protocols in Molecular Biology[JohnWiley&Son,Inc.(1998)(参见例如第16章,第IV节:Expression of proteins inmammalian cells using vaccinia viral vector)]中。

对于产生本文公开的各种重组MVA，不同方法可为可应用的。可将待插入病毒中的DNA序列放置至其中已插入与MVA的一段DNA同源的DNA的大肠杆菌(E.coli)质粒构建体中。单独地，可使待插入的DNA序列连接于启动子。启动子-基因连接可位于质粒构建体中以使启动子-基因连接在两端由与侧接于MVA DNA的含有非必需基因座的区域的DNA序列同源的DNA侧接。所得质粒构建体可通过在大肠杆菌细菌内增殖来扩增并分离。可将含有待插入的DNA基因序列的经分离质粒转染至例如鸡胚胎纤维母细胞(CEF)的细胞培养物中，同时，所述培养物用MVA感染。在质粒中的同源性MVA DNA与病毒基因组之间的重组分别可产生由于存在外来DNA序列而经修饰的MVA。

根据一优选实施方案，可用痘病毒感染适合细胞培养物的细胞，如例如CEF细胞。受感染细胞可随后用包含一个或多个优选处于痘病毒表达控制元件的转录控制下的外来或异源性基因的第一质粒载体转染。如上所说明，质粒载体也包含能够引导外源性序列插入痘病毒基因组的所选部分中的序列。任选地，质粒载体也含有包含可操作地连接于痘病毒启动子的标记和/或选择基因的盒。适合的标记或选择基因是例如编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸核糖基转移酶或其它标记的基因。选择盒或标记盒的使用使对产生的重组痘病毒的鉴定和分离简化。然而，重组痘病毒也可通过PCR技术来鉴定。随后，其他细胞可用如上所述获得的重组痘病毒感染，并且用包含一个或多个第二外来或异源性基因的第二载体转染。在这个情况下，这个基因应被引入痘病毒基因组的不同插入位点中，第二载体也在引导一个或多个第二外来基因整合至痘病毒的基因组中的痘病毒同源性序列方面不同。在已发生同源性重组之后，可分离包含两个或更多个外来或异源性基因的重组病毒。对于将额外外来基因引入重组病毒中，感染和转染步骤可通过使用在先前感染步骤中分离的重组病毒，以及通过使用用于转染的包含一个或多个其它外来基因的另一载体加以重复。

或者，如上所述的感染和转染步骤可互换，即适合细胞可首先用包含外来基因的质粒载体转染，接着用痘病毒感染。作为另一替代方案，也有可能将各外来基因引入不同病毒中，用所有所得重组病毒共同感染细胞，并且筛选包括所有外来基因的重组体。第三替代方案是在体外连接DNA基因组和外来序列，以及使用辅助病毒重建重组痘苗病毒DNA基因组。第四替代方案是在大肠杆菌或另一细菌物种中在以细菌人工染色体(BAC)形式克隆的痘苗病毒基因组与侧接有与侧接于痘苗病毒基因组中所需整合位点的序列同源的DNA序列的线性外来序列之间同源性重组。

表达异源性FMDV基因

在某些实施方案中，一个、更多个或所有编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列的表达受控于一个或多个痘病毒启动子。在某些实施方案中，痘病毒启动子是Pr7.5启动子、杂合早期/晚期启动子、PrS启动子、PrS5E启动子、合成或天然早期或晚期启动子、或牛痘病毒ATI启动子。在某些实施方案中，痘病毒启动子选自由PrS启动子(SEQ IDNO:1)、PrS5E启动子(SEQ ID NO:2)、Pr7.5(SEQ ID NO:3)、PrLE1启动子(SEQ ID NO:4)、Pr13.5长启动子(SEQ ID NO:5)和PrMVA095R启动子组成的组。适合启动子进一步描述于随本文一起以引用的方式完全并入的WO 2010/060632、WO 2010/102822、WO 2013/189611和WO 2014/063832中。

编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列可以单一转录单元形式表达。举例来说，可使编码FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核苷酸序列可操作地连接于痘苗病毒启动子和/或连接于痘苗病毒转录终止子。

在某些实施方案中，将“转录单元”独自插入MVA基因组中的插入位点中。在某些实施方案中，将“转录单元”与其它转录单元一起插入MVA基因组中的插入位点中。“转录单元”不天然存在(即它是异源性、外源性或外来的)于MVA基因组中，并且能够在受感染细胞中转录。

优选地，重组MVA包含1、2、3、4、5个或更多个插入MVA基因组中的转录单元。在某些实施方案中，重组MVA稳定表达编码由1、2、3、4、5个或更多个转录单元编码的丝状病毒蛋白质的抗原决定簇的异源性核苷酸序列。在某些实施方案中，重组MVA包含2、3、4、5个或更多个在MVA基因组中的1、2、3个或更多个插入位点处插入MVA基因组中的转录单元。

FMDV疫苗和药物/兽医学组合物

因为本文所述的重组MVA病毒的复制高度受限以及因此高度减毒，所以它们是用于治疗广泛范围的哺乳动物(包括人以及甚至免疫损害的人)的理想候选物。因此，本文提供用于在包括人的活动物体中诱导免疫应答的药物/兽医学组合物和疫苗。另外，提供一种用于治疗和/或预防FMDV引起的疾病的包含编码FMDV蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列的重组MVA载体。

疫苗优选包含在10⁴至10⁹TCID₅₀/ml、10⁵至5x10⁸TCID₅₀/ml、10⁶至10⁸TCID₅₀/ml、或10⁷至10⁸TCID₅₀/ml的浓度范围内以溶液形式配制的任何本文所述的重组MVA病毒。用于人的一优选疫苗接种剂量包括在10⁶至10⁹TCID₅₀之间，包括10⁶TCID₅₀、10⁷TCID₅₀或10⁸TCID₅₀的剂量。

本文提供的药物/兽医学组合物可通常包括一种或多种药学/兽医学上可接受的和/或核准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。所述辅助物质可为水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适合载体通常是代谢缓慢的大分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。

对于制备疫苗，可使本文提供的重组MVA病毒转变成生理上可接受的形式。这可基于如由H.Stickl等,Dtsch.med.Wschr.99:2386-2392(1974)所述，在制备用于针对天花进行疫苗接种的痘病毒疫苗方面的经验来进行。

举例来说，纯化病毒可以5x10⁸TCID₅₀/ml的效价于约10mM Tris、140mM NaCl(pH7.4)中配制来储存在-80℃下。对于制备疫苗注射物，例如可在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在下在安瓿优选玻璃安瓿中将10²-10⁸或10²-10⁹个病毒粒子于100ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。或者，疫苗注射物可通过逐步冷冻干燥病毒来以制剂形式产生。这个制剂可含有适于体内施用的额外添加剂，诸如甘露糖醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它助剂，诸如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。接着将玻璃安瓿密封，并且可在4℃与室温之间储存数月。然而，在不存在需要时，优选将安瓿储存在低于-20℃的温度下。

对于疫苗接种或治疗，可将冻干物溶解于水溶液优选是生理盐水或Tris缓冲液中，并且全身性或局部施用，即胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内或为熟练从业者所知的任何其它施用路径。施用模式、施用剂量和次数可由本领域技术人员以已知方式进行最优化。

使用同源/异源初免-加强方案的疫苗

本文所述的疫苗和方法也可用作同源初免-加强方案的一部分。在同源初免-加强中，依次给予第一初免疫苗接种和一次或多次随后加强疫苗接种。加强疫苗接种被配置以通过施用在第一疫苗接种中使用的相同重组痘病毒来加强在第一疫苗接种中产生的免疫应答。

在一个示例性实施方案中，可采用同源初免-加强方案，其中以第一剂量施用如本文定义的MVA病毒载体。可给予一次或多次随后施用如本文定义的MVA病毒载体以加强在第一施用中提供的免疫应答。优选地，一个或多个抗原决定簇与第一施用的那些抗原决定簇相同或类似。

根据本发明的MVA重组病毒载体也可与另一痘病毒载体组合用于异源初免-加强方案中，其中一次或多次初始初免疫苗接种用如本文定义的MVA或另一痘病毒载体进行，并且一次或多次随后加强疫苗接种用未用于初免疫苗接种中的痘病毒载体进行，例如如果本文定义的MVA载体在初免加强中给予，那么随后加强疫苗接种将用其它痘病毒载体，并且反之亦然。

包含重组MVA病毒的疫苗和试剂盒

本文也提供包含任何一种或多种本文所述的重组MVA的疫苗和试剂盒。试剂盒可包括一个或多个具有重组MVA的容器或小瓶，以及向处于FMDV感染的风险下的受试者施用重组MVA的说明书。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA以单次剂量或以多次(即2、3、4次等)剂量向受试者施用。在某些实施方案中，说明书指示重组MVA病毒以第一(初免)和第二(加强)施用向首次用于实验的或非首次用于实验的受试者施用。优选地，试剂盒包括至少两个用于初免/加强免疫的小瓶，其包含在第一小瓶/容器中的用于第一接种(“初免接种”)以及在第二和/或其他小瓶/容器中的用于至少第二和/或第三和/或进一步接种(“加强接种”)的如本文所述的重组MVA。

本发明的其它实施方案将由考虑本文公开的本发明的说明书和实施而为本领域技术人员显而易知。意图说明书和实施例仅被视为具有示例性，其中本发明的真正范围和精神由随附权利要求指示。

实施例

随后的详细实施例意图促进对本发明的更充分理解。然而，本发明不受限于实施例。本发明的其它实施方案将由考虑本文公开的本发明的说明书和实施而为本领域技术人员显而易知。

实施例1：构建重组MVA

以下章节描述包含一个或多个表达FMDV蛋白的抗原决定簇的异源性核酸的两种重组MVA的构建。本文所述的所有其它构建体都使用类似方法制备。

1.1克隆和产生两种重组MVA--FMDV构建体

对于将外来基因插入MVA-基因组中，BN已构建一组质粒。这些基础质粒含有MVA-基因组的涵盖MVA病毒骨架的缺失位点或基因间区域的特定区域、启动子和不同选择盒。为克隆重组MVA--FMDV疫苗候选物，将转基因插入这些基础质粒中的一者中，从而产生用于通过同源性重组来促进转基因插入MVA基因组内特定位点中的最终重组质粒。为允许在质粒与MVA基因组之间同源性重组，原代CEF细胞用MVA感染，并且随后用相应重组质粒转染。在同源性重组期间，质粒的侧接序列与MVA-病毒基因组中的插入位点的同源性序列重组，并且使质粒序列靶向至相应位点中。在插入序列内存在选择盒允许对重组MVA病毒进行正性选择。在选择性条件下进行初始扩增和3-4次噬斑纯化步骤之后，获得含有FMDV源性转基因和选择盒的重组产物。通过在非选择性条件下进行进一步扩增和噬斑纯化步骤，选择盒被去除，并且最终疫苗候选物得以分离。选择最终噬斑纯化的克隆，并且在2-3个T175组织培养烧瓶中扩增以产生预备主病毒原液，其将如章节1.2中所述加以广泛表征。

在两种重组MVA-FMDV候选物中，3C蛋白酶使用单独启动子以反式表达。将7个转基因插入一个基础质粒中，所述质粒支持同源性重组至上述MVA的一个明确确定的插入位点中。

提出的构建体中的核苷酸序列的密码子优化涉及鉴定和移除可影响构建体的稳定性的同源性序列，以及使密码子使用最优化以达成转基因在相应宿主中的最优表达。这与高度具有经验的CRO(GeneArt AG,Regensburg,Germany)合作进行。

1.2对重组MVA-FMDV的遗传分析

在通过同源性重组和噬斑纯化来产生重组MVA--FMDV构建体之后，选择最终克隆，并且在T175组织培养烧瓶中扩增以产生预备主病毒原液。通过聚合酶链式反应(PCR)分析确认存在重组插入物、在靶向基因组位点中正确插入以及在预备主病毒原液中不存在亲本MVA病毒。通过序列分析确认重组插入物的正确序列。对包括侧接区域(各自超过600bp，涵盖如重组质粒中含有的同源性重组位点)的重组插入物进行测序。进行巢式PCR以证实不存在在同源性重组期间使用的选择盒。

1.3对插入的FMDV蛋白的表达和加工的分析

在产生两种有活力的MVA--FMDV病毒之后，通过分析它们的所表达重组蛋白来证明它们的功能性。FMDV蛋白的表达和加工为强力诱导免疫应答所必需。BN将通过蛋白质印迹来分析表达和加工，并且通过免疫共沉淀测定来分析经加工蛋白质相互作用的能力。由PIADC使用电子显微镜检查法来评估对VLP形成的进一步分析。基于这些分析，

1.3.1抗原的表达和加工：蛋白质印迹

用于分析在各种细胞类型中由MVA表达的重组蛋白的蛋白质印迹用于关于FMDV蛋白的大小对它们进行检测，以及也用于对由相应重组MVA-载体获得的表达水平进行相对估计。视FMDV特异性抗体的性质而定，可检测天然或变性FMDV蛋白的表达。因为对非结构蛋白质以及对毒性FMDV具有特异性的抗体仅可对于血清型O1商购获得，所以BN推荐使用由PIADC提供的FMDV抗体(血清型A24)。就实际应用而言，细胞将用MVA--FMDV在确定的MOI下感染，并且在24小时之后收集。将制备细胞提取物，并且通过SDS-PAGE来分析。测定的结果将确认重组FMDV蛋白的表达和它们的正确大小(指示正确加工)。

1.3.2蛋白质的相互作用：IP-蛋白质印迹

在FMDV的感染周期期间结构蛋白质的相互作用为形成感染性高度免疫原性病毒粒子所必需。因此，从MVA-表达的FMDV蛋白形成非感染性病毒样粒子(VLP)可合乎需要，并且需要特定蛋白质，构建和评估重组MVA-FMDV候选物修订工作陈述(Construction and Evaluation of Recombinant MVA-FMDV Candidates RevisedStatement of Work)

实施例2：构建两种重组MVA-BN-FMDV构建体(MVA-mBN360B和mBN361A)

图1中所示的两种构建体作为用于动物实验的候选物加以产生。构建体#7B被选作候选物，并且进行MVB和FDP的产生。如在以上标题1.1下所公开来产生重组MVA-BN构建体。

根据Bavarian Nordic的SOP在3个滚瓶中产生构建体#7B的主病毒库。使细胞溶解，并且将产物等分并储存在-80℃下待稍后使用。通过基于PCR的方法和测序确认对身份、纯度以及不存在空载体和选择盒的遗传分析。此外，进行无菌测试和基于PCR的关于不存在支原体的测试。MVA-mBN360B(#7B)的MVB通过所有测试。MVB材料的效价被测定为8.25x10⁶TCID₅₀/ml，此被视为足以进行BDS生产。

最后是对FDP材料的品质测试，包括表达分析(图2)、共IP(图3)滴定，后者产生1.47x10⁹TCID₅₀/ml的效价。

3C蛋白酶和P1-2AB由MVA-mBN360B(构建体#7)在HeLa细胞中表达，并且将溶解产物应用于蛋白质印迹。VP2特异性蛋白质印迹显示P1被加工成VP0，此指示3C蛋白酶活性，并且VP3特异性WB显示VP3通过3C从P1前体高效释放(图2)。

将MVA-BN360B构建体#7的FDP材料应用于用P1构象特异性抗体进行的共沉淀。用VP3抗体检测到VP3特异性条带，此指示衣壳的处于‘良好’构象结构的VP3单一蛋白的相互作用。用VP2抗体检测到VP0特异性条带指示处于‘良好’构象结构的P0成熟前蛋白的相互作用(图3)。

实施例3：牛中的MVA-BN-FMDV(MVA-mBN360B)

在第0天和在第21天用10⁹TCID₅₀剂量的MVA-mBN360B使牛免疫。在第4天，用10⁴pfu的病毒株A24Cruzeiro攻击动物，并且分析感染征象(舌部)和全身疾病，如由每个动物受感染足的数目所评分。

表1：对用或未用MVA-mBN360B疫苗免疫的牛的疾病评分。

所有疫苗接种动物都完全被保护免遭FMDV攻击，而非疫苗接种动物都未被保护。^a动物无舌部病变^b全身性疾病以受FMDV感染的足的数目给出(最大评分＝4)。

序列表描述

SEQ ID NO:1[PrS启动子的DNA序列]

SEQ ID NO:2[PrS5E启动子的DNA序列：1x(PrS)+5x(Pr7.5e)]

SEQ ID NO:3[Pr7.5启动子的DNA序列]

SEQ ID NO:4[PrLE1启动子的DNA序列–5X-ATI+Pr7.5e]

SEQ ID NO:5[Pr13.5启动子序列]

序列表

<110> 罗宾·施泰格瓦尔德(Steigerwald, Robin)

<120> 重组经修饰痘苗病毒安卡拉（MVA）口蹄疫病毒（FMDV）疫苗

<130> BN91PCT

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 启动子序列

<400> 1

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 40

<210> 2

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 启动子序列

<400> 2

aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata aaaaattgaa aaactattct 60

aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acggtccggt 120

aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct 180

aatttattgc acggtccggt aaaaattgaa aaactattct aatttattgc acgg 234

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 启动子序列

<400> 3

tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60

aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104

<210> 4

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 启动子序列

<400> 4

gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60

tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120

gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180

tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227

<210> 5

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

<223> 启动子序列

<400> 5

taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60

agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120

agta 124

Claims

1.一种重组经修饰痘苗病毒安卡拉(MVA)，其包含编码至少一种口蹄疫病毒(FMDV)抗原的抗原决定簇的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的重组MVA，其中所述MVA是能够在体外在鸡胚胎纤维母细胞(CEF)细胞中繁殖性复制，但不能够在人角质化细胞细胞系HaCat、人骨骨肉瘤细胞系143B、人胚肾细胞系293和人子宫颈腺癌细胞系HeLa中繁殖性复制的MVA-BN病毒或衍生物。

3.如权利要求1-2所述的重组MVA，其中所述MVA是如以登录号V00083008保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)的MVA-BN。

4.如权利要求1-3所述的重组MVA，其中所述抗原选自由VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B和3C组成的组。

5.如权利要求4所述的重组MVA，其中编码所述FMDV抗原的核酸分子是编码FMDV P1区的cDNA和编码FMDV 3C蛋白酶的cDNA。

6.如权利要求1-5所述的重组MVA，其中使所述抗原可操作地连接于启动子序列。

7.如权利要求6所述的重组MVA，其中所述启动子是弱启动子。

8.如权利要求6-7所述的重组MVA，其中所述启动子选自由PrS、PrS5E、Pr7.5、PrLE1、Pr13.5和PrMVA095R组成的组。

9.一种组合物，其包含如权利要求1-8所述的重组MVA和药学或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。

10.如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物，其用于治疗和/或预防FMDV引起的疾病。

11.如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物，其用于影响受试者中的免疫应答。

12.如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物，其用作药剂或疫苗。

13.一种疫苗，其包含如权利要求1-8所述的重组MVA。

14.一种细胞，其包含根据权利要求1-8所述的重组MVA。

15.如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防受试者的由FMDV引起的疾病的药剂或疫苗。

16.一种用于影响受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物。

17.如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物，其中如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物将被施用一次、两次、三次或四次。

18.一种试剂盒，其包括在第一小瓶或容器中的用于第一施用(初免)以及在第二小瓶或容器中的用于第二施用(加强)的如权利要求1-8所述的重组MVA和/或如权利要求9所述的组合物。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其在第三、第四或其他小瓶或容器中包括用于第三、第四或进一步施用的所述重组MVA。

20.一种用于产生根据权利要求1-8所述的重组MVA病毒或从所述重组MVA病毒的基因组表达的所述抗原决定簇的方法，其包括以下步骤

(a)用如权利要求1-8所述的重组MVA病毒感染宿主细胞或用如权利要求1-8所述的重组MVA病毒的重组DNA转染所述细胞，

(b)培养所述受感染或经转染细胞，以及

(c)从所述细胞分离所述MVA病毒和/或所述抗原决定簇。

21.一种重组MVA病毒和/或抗原决定簇，其由根据权利要求20所述的方法获得。

22.一种产生重组MVA载体的方法，其包括以下步骤：

(a)用MVA病毒感染宿主细胞，

(b)用包含至少一个编码权利要求1-8中的任何蛋白质的抗原决定簇的核苷酸序列的重组载体转染所述受感染细胞，所述核酸序列进一步包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，以及

(c)鉴定、分离和任选地纯化所述产生的重组MVA病毒。

23.一种产生用于治疗和/或预防FMDV引起的疾病的重组MVA病毒的方法，其包括以下步骤：

(a)用MVA病毒感染宿主细胞，

(b)用包含至少一个编码权利要求1-8中的任何FMDV蛋白的抗原决定簇的核苷酸序列的重组载体转染所述受感染细胞，所述核酸序列进一步包含能够引导所述至少一个核苷酸序列整合至所述MVA病毒基因组中的基因组MVA病毒序列，以及

(c)鉴定、分离和任选地纯化所述产生的重组MVA病毒。