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KR20160140075A - 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터 - Google Patents

폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터 Download PDF

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KR20160140075A
KR20160140075A KR1020150076197A KR20150076197A KR20160140075A KR 20160140075 A KR20160140075 A KR 20160140075A KR 1020150076197 A KR1020150076197 A KR 1020150076197A KR 20150076197 A KR20150076197 A KR 20150076197A KR 20160140075 A KR20160140075 A KR 20160140075A
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seq
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김수정
김민정
최환준
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코오롱생명과학 주식회사
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Abstract

본 발명은 폭스바이러스 유래 프로모터, 이를 포함하는 벡터, 상기 프로모터를 이용한 외래 유전자의 세포 내 발현 방법과 질병의 예방 또는 치료에 사용되는 벡터의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프로모터는 유전자의 발현을 강하게 유도하는 데에 이용될 수 있다.

Description

폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터{Promoter derived from the poxviridae and vector including the same}
본 발명은 폭스바이러스 유래 프로모터, 이를 포함하는 벡터, 상기 프로모터를 이용한 외래 유전자의 세포 내 발현 방법과 질병의 예방 또는 치료에 사용되는 벡터의 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프로모터는 유전자의 발현을 강하게 유도하는 데에 이용될 수 있다.
유전자 치료는 DNA 및 RNA 등의 유전물질을 인체 내에 투여하여 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암, 심혈관계 질환 등과 같은 각종 질환을 치료하거나 예방하는 방법이다. 유전자 치료제의 개발에 있어 효율적인 유전자 전달 및 유전자 발현의 유도 또는 조절이 중요하다. 유전자를 세포 내로 전달하기 위해 사용하는 물질을 벡터라고 부르는데, 유전자 전달 벡터는 크게 비-바이러스성 벡터와 바이러스 벡터의 두 영역으로 나뉜다.
포유동물에서 유전자 전달 또는 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노부속바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스 및 폭스바이러스 등이 사용되고 있다. 이 중 폭스바이러스는 삽입할 수 있는 유전자의 크기가 크고, 유전자 전달 및 발현 효율이 우수하며, 안전성이 높고, 높은 역가로 바이러스 생산이 가능해 유전자 전달 및 치료제 개발에 많이 활용되고 있다.
폭스바이러스과(poxviridae)에 속하는 바이러스로는, 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus) 및 수이폭스바이러스(suipoxvirus)속 등이 있으며, 오르쏘폭스바이러스 속에는 스몰폭스바이러스 및 백시니아 바이러스 등의 종이 포함된다. 오르쏘폭스바이러스 속에 속하는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 천연두 예방을 위해 사용되었던 백신으로 최근에는 유전자 재조합 기술을 이용하여 유전자 전달 벡터로 개발되고 있다.
주요 장점은 다른 바이러스에 비해 큰 유전자를 도입할 수 있으며 예를 들면 아데노부속 바이러스에 비해 10배 이상 큰 유전자의 도입이 가능하고 다양한 세포에 감염 가능하다는 것이다. 또한, 백시니아 바이러스는 효과적인 면역반응을 유도할 수 있기 때문에 백신 벡터로 사용하기에 이상적인 바이러스로 생각되고 있다. 대표적으로 Bavarian Nordic사의 경우 백신 벡터인 MVA에 PSA, PAP와 같은 암 항원을 실어 제작한 암 백신을 이용하여 전립선암 환자들을 대상으로 임상을 진행 중에 있으며, 그 외에도 탄저 백신, 출혈열 바이러스 백신, 구제역 바이러스 백신 등을 개발하고 있다. 또한 최근에 백시니아 바이러스는 유전자 재조합을 통해 종양살상 바이러스로도 개발되어 임상까지 진행되고 있다. 대표적으로 신라젠(구. Jennerex)의 경우 종양살상 바이러스인 JX-594를 개발하여 간암, 대장암, 소아암, 흑색종 환자들을 대상으로 다양한 임상을 완료 또는 진행 중에 있다.
이상적인 유전자 전달 벡터는 원하는 세포에 높은 전달 효율로 유전자를 전달 하며, 목적 유전자의 발현율이 높아 원하는 치료 효과를 얻을 수 있고, 제조 및 생산이 간편해야 한다. 특히, 항원 또는 치료 유전자의 발현을 통해 치료 효능을 높이기 위해서는 유전자의 발현율이 높아야 하며 이를 위해서는 유전자 전달 효율이 높은 벡터와 발현율이 우수한 프로모터가 필요하다.
벡터에 유전자를 실어 발현시키기 위해서는 별도의 프로모터가 필요한데, 일반적으로 사용되는 프로모터에는 HCMV, EF-1 alpha, CAG, PGK 프로모터 등이 있다. 하지만, 폭스바이러스의 경우 유전자 전사가 세포질에서 진행되므로 상기 서술한 프로모터들은 사용할 수 없고, 폭스바이러스 유래 프로모터를 사용해야 한다. 대표적인 폭스바이러스 유래 프로모터에는 p7.5, pE/L, pHyb, p11 프로모터 등이 있다.
본 발명은 폭스바이러스에서 목적 유전자를 높은 발현율로 발현할 수 있는, 유전자 발현 유도용 핵산분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유전자 발현 유도용 핵산분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은 유전자 발현 유도용 핵산분자와 상기 핵산분자에 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자가 도입된 벡터를 포함하는 조성물, 상기 조성물의 질병 치료 또는 예방 용도에 관한 것이다.
본 발명은 목적 유전자의 발현을 강하게 유도할 수 있는 폭스바이러스 유래 프로모터, 이를 포함하는 플라스미드 벡터, 상기 플라스미드 벡터와 폭스바이러스 (변이형 폭스바이러스 포함) 게놈과의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 획득한 폭스바이러스 벡터, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 폭스바이러스 벡터에 치료 유전자 또는 항원을 도입한 항암제 또는 백신의 용도를 포함한다.
본 발명에 따른 유전자 발현 유도용 핵산분자, 즉 프로모터는 폭스바이러스 고유의 프로모터들 중, 알려진 프로모터에 비해 유전자의 발현을 높게 유도할 수 있는 프로모터를 의미한다. 따라서 이들을 폭스바이러스 벡터에 사용할 경우 상기 프로모터의 조절 하에 놓여있는 목적 유전자의 발현율을 높일 뿐만 아니라, 상기 프로모터를 포함하는 벡터의 치료 효능을 높일 수 있다. 폭스바이러스 벡터, 바람직하게는 백시니아 바이러스 벡터를 유전자치료제 개발에 이용할 경우 전달하는 유전자의 발현을 높이기 위한 목적으로 프로모터의 선택이 중요하다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일예에서, 폭스바이러스, 예를 들면 백시니아 바이러스에서 유래되며, 목적 유전자를 고효율로 발현할 수 있는, 유전자 발현 유도용 핵산분자, 즉 프로모터를 제공한다.
본 발명에 따른 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자일 수 있으며, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드를 필수로 포함하고, 서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 상이한 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 조합하여 연결된 핵산분자일 수 있으며, 예를 들면 본 발명에 따른 핵산분자는 5'에서 3'방향으로, 서열번호 1-서열번호 2의 융합 핵산분자, 서열번호 1-서열번호 3의 융합 핵산분자, 서열번호 1-서열번호 2-서열번호 3의 융합 핵산분자, 서열번호 1-서열번호 3-서열번호 2의 융합 핵산분자, 서열번호 2-서열번호 1의 융합 핵산분자, 서열번호 2-서열번호 1-서열번호 3의 융합 핵산분자, 서열번호 2-서열번호 3-서열번호 1의 융합 핵산분자일 수 있다.
상기 서열번호 1의 핵산분자는 백시니아 바이러스의 I1L 유전자 프로모터에서 유래된 것으로서, 하기 표 1에 나타낸 핵산서열을 포함한다. 상기 서열번호 2의 핵산분자는 백시니아 바이러스의 E3L 유전자 프로모터에서 유래된 것으로서, 하기 표 1에 나타낸 핵산서열을 포함한다. 상기 서열번호 3의 핵산분자는 백시니아 바이러스의 B19R 유전자 프로모터에서 유래된 것으로서, 하기 표 1에 나타낸 핵산서열을 포함한다.
일예에서, 본 발명에 따른 핵산분자는 5'에서 3'방향으로, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 연결된, 서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자일 수 있다.
프로모터 이름 염기서열 (5' -> 3') 서열번호
pI1L TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAA 1
pE3L TGAATAAAAAAAATGATAAAATAAATTAGTTTTATTA 2
pB19R TGTGTGTAAAAAAACTGATATTATATAAATATTTTAGTGCCGTATAA 3
pI1L-E3L TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAATGAATAAAAAAAATGATAAAATAAATTAGTTTTATTA 9
pI1L-B19R TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAATGTGTGTAAAAAAACTGATATTATATAAATATTTTAGTGCCGTATAA 10
본 명세서에서 사용되는 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리대 과에 속하는 바이러스를 지칭한다. 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 폭스바이러스는 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus) 및 수이폭스바이러스(suipoxvirus)속 등을 포함하며 바람직하게는 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus)속이며, 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus)는 스몰폭스바이러스, 및 백시니아 바이러스를 포함하나, 보다 바람직하게 백시니아 바이러스 종을 포함한다.
본 발명에 따른 폭스바이러스는 야생형 폭스바이러스 또는 다양한 변이형 폭스바이러스를 포함한다. 상기 변이형 폭스바이러스는 일부 유전자가 결실, 치환, 또는 삽입된 것일 수 있다. 예를 들면 백시니아 바이러스의 경우 특정 유전자의 유무에 따라 암세포에서만 복제가 가능하도록 조절함으로써 항암제로 개발하려는 시도가 많이 이루어지고 있어, 야생형 폭스바이러스 뿐만 아니라 다양한 변이형 폭스바이러스를 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 폭스바이러스 벡터는 목적 유전자의 폴리뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일예에서, 목적 유전자는 본 발명에 따른 프로모터의 조절하에서 유전자 발현이 유도되는 것으로서, 유전자의 전달 또는 세포 내 유전자의 발현에 따른 효과 달성을 위해 사용되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 유전자는 암 항원[예. MUC1, hTERT, Carcinoembryonic antigen(CEA)], 면역 반응 유도 인자[예. Interleukin(IL)-12, Granulocyte macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF), soluble PD-1], 암 성장 억제 인자[예. Vascular endothelial growth factor(VEGF) inhibitor, Pyruvate kinase isozymes M2(PKM2) inhibitor, Pyruvate dehydrogenase kinase(PDK) inhibitor], 세포 사멸 유도 인자[예. TRAIL, Thymidine kinase(TK), Cytosine deaminase(CD)], 또는 암 조직 내 바이러스의 활성 증대에 도움이 될 수 있는 인자[예. Matrix metalloproteinase(MMP), Hyaluronidase, Relaxin]의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 프로모터는 포유동물 세포에서 목적 유전자의 전사를 유도할 수 있는 프로모터이며, 바람직하게는 포유동물 세포의 세포질에서 목적 유전자의 전사를 유도하는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 추가 일예에서, 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 추가로 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 추가로 선별 마커인 EGFP, DsRed, LacZ, GusA 등의 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서 내에 사용된 바와 같이 "벡터", "유전자 전달 벡터", 또는 "유전자 벡터"는 외인성 유전자를 목적하는 세포 또는 생명체(organism)에 전달할 수 있는 물질을 나타낸다.
상기 벡터는 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터를 모두 포함한다. 상기 비바이러스성 벡터는 플라스미드일 수 있다. 바이러스성 벡터의 예로는 폭스바이러스 벡터, 바람직하게는 백시니아 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 본 발명에 따른 프로모터가 도입된 폭스바이러스 벡터를 제공한다. 구체적인 일예에서, 본 발명에 따른 프로모터를 포함하는 플라스미드 벡터와, 야생형 폭스바이러스 또는 다양한 변이형 폭스바이러스를 유전자 상동 재조합하여 제조한 폭스바이러스 벡터를 제공한다.
상기 플라스미드 벡터와 폭스바이러스의 재조합 방법은 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 상기 플라스미드 벡터 또는 폭스바이러스 벡터를 포함하는 숙주에 관한 것으로서, 상기 숙주는 미생물, 포유동물, 포유동물의 세포, 또는 포유동물 유래의 세포주일 수 있으며, 상기 포유동물은 사람일 수 있다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명에 따른 폭스바이러스 벡터를 세포 내로 도입하는 단계, (ii) 상기 폭스바이러스 벡터가 제조될 수 있게 하기에 적절한 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 (iii) 상기 폭스바이러스 벡터를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 폭스바이러스 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.
폭스바이러스는 세포로부터 회수될 수 있지만, 또한 배양 상등액으로부터 회수될 수도 있다. 통상적으로 이용되는 방법 중 하나는 바이러스가 감염된 세포를 파쇄한 후 세포 파쇄 상등액에서 비리온을 수집하고, 그 다음 당업계의 기술 (크로마토그래피 방법, 초원심분리 방법 등)을 사용하여 비리온을 정제하는 것이다.
본 발명은 또한 제약학상 허용 가능한 부형제와 함께 본 발명에 따른 폭스바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 유전자 치료제로 다양한 질환들을 예방 또는 치료하는 용도를 가지며 보다 구체적으로는 유전자 결함, 암, 심혈관계 질환 및 바이러스 감염성 질환의 예방 또는 치료용도에 사용하고자 한다.
본 발명은 폭스바이러스, 바람직하게는 백시니아 바이러스에 치료 유전자 또는 항원을 도입하여 다양한 질환의 치료제 및 예방 또는 치료 백신개발에 적용될 수 있으며 또한 종양 살상 바이러스 개발에도 이용하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 국소적으로, 비경구적으로 또는 소화 경로로 투여할 목적으로 제조될 수 있으며 수많은 투여 경로가 가능하다. 언급될 수 있는 예는 위 내, 피하, 심장 내, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 종양 내, 비측, 폐 내 및 기관 내 경로이다. 투여는 단일 투여로 또는 특정한 시간 간격 후 1회 이상 반복되는 투여로 실시될 수 있다. 적절한 투여 경로 및 투여량은 각종 변수, 예를 들어 질환, 환자, 전달하는 벡터 또는 전달될 목적 유전자(들)에 따라 차이가 난다. 본 발명에 따른 바이러스(성) 입자에 기초한 제제는 104 및 1014 pfu (플라크-형성 단위), 유리하게 105 및 1013 pfu, 바람직하게 106 및 1012 pfu 사이의 투여량의 형태로 제제화될 수 있다.
조성물은 또한 제약학적 관점에서 허용가능한 희석제, 아쥬반트 또는 부형제, 및 가용화제, 안정화제 및 방부제들을 포함할 수 있다. 주사제 투여의 경우, 수성, 비수성 또는 등장성 용액내 제제가 바람직하다. 이는 적절한 희석제를 사용하여 사용 당시에 재구성될 수 있는 액체 또는 건조 (산제, 동결건조물 등) 형태로, 단일 투여로 또는 다중 투여로 제공될 수 있다.
본 명세서 내에 사용된 바와 같이 "유전자 전달"은 도입된 유전자가 그의 기능을 나타내는 방식으로, 원하는 천연의, 합성의 또는 재조합 유전자 또는 유전자 단편을 세포로 도입(생체 내 또는 실험실 내에서의)하는 것을 말한다. 본 발명에 따라 도입된 유전자 또는 유전자 단편은 특정한 서열을 지닌 DNA, RNA 또는 그의 합성적 상동물인 핵산을 포함한다.
본 발명에 있어서, 유전자 전달 벡터의 준비를 위해 사용된 바이러스는 야생형 혹은 변이형 바이러스일 수 있다. 본 명세서 내에 사용된 바와 같이 "유전자 전달 활성"은 벡터의 "유전자 전달" 활성을 나타내고, 지표로서 도입된 유전자의 기능(즉, 발현 벡터의 경우 인코드된 단백질의 발현 및/또는 그 단백질의 활성 등)을 사용함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 추가적인 관점에서 분리된 동물 조직으로의 유전자 도입을 위한 방법이 제공되고, 그 방법은 목적 유전자를 포함하는 유전자 전달 벡터를 준비하고, 유전자 전달 벡터를 통해 유전자를 동물 조직 내로 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 유전자 전달 벡터가 유전자 치료를 위한 조성으로 사용될 경우 본 발명에 따른 투여는 국소 투여(즉, 암조직 내, 간 내, 근육 내 및 뇌 내) 로 PBS(인산염 완충 식염수) 및 식염수 등의 용액 내에 부유한 벡터 현탁액의 직접 주사 또는 혈관 내 투여(즉, 동맥 내, 정맥 내 도는 문맥 내) 방법을 이용한다.
하나의 실시태양에서 유전자 전달 벡터는 일반적으로 단위 투약량으로 주사가 가능한 형태(수용액, 현탁액 또는 에멀젼(emulsion))로 제조되며, 유전자 전달 벡터와 약제적으로 허용 가능한 희석제를 혼합함으로써 제제화된다. 이 때, 바람직하게는 제제 내에 산화제 및 유전자 전달 벡터에 해로운 것으로 알려진 다른 성분을 포함하지 않는다. 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제적 조성은 일반적으로 단일- 또는 다중-투약량이 포함된 컨테이너(container)로 봉합된 앰플(ampule) 또는 바이알(vial) 내에 수용액 또는 동결건조 상태로 보관된다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 약제적 조성 중 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 컨테이너가 포함된 약제적 팩키지(package) 또는 키트(kit)를 제공한다. 더욱이 본 발명에 따른 벡터는 다른 치료 화합물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 전달 벡터를 포함하는 약제적 조성은, 환자 개인의 임상 조건(즉, 예방되거나 치료되는 조건), 유전자 전달 벡터를 포함하는 조성의 전달 부위, 목적 조직, 투여 방법, 투여 스케줄 및 당 분야에 알려진 다른 인자를 고려한 최적의 임상 디자인에 따라 투약될 것이다. 따라서 본 발명에 기술된 유전자 전달 벡터의 "효과적인 양" 또는 적당한 투약량은 이러한 고찰에 의해 결정된다.
본 발명은 폭스바이러스용 프로모터, 이를 포함하는 바이러스성 벡터 및 상기 바이러스성 벡터를 이용한 질병의 치료 또는 예방 용도에 관한 것으로서, 유전자의 발현을 강하게 유도함으로써 치료제의 효능을 증가시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 단일 프로모터가 도입된 플라스미드를 인체 자궁암 세포주인 HeLa 세포로 형질도입 후 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 조합 프로모터가 도입된 플라스미드인 pGL4.10-pI1L-E3L, pGL4.10-pI1L-B19R, 및 pGL4.10-pI1L-I1L를 자궁암 세포주인 HeLa 세포로 형질도입 후 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석한 그래프이다.
도 3는 본 발명에 일실시예에 따라 백시니아 바이러스 TK(-) 셔틀벡터에 대조군인 p7.5 프로모터가 도입된 pSP72-p7.5-Luc를 제작하고, 제한효소 NheI 또는 BamHI과 EcoRI을 처리하여 DNA 구조를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 일실시예에 따라 백시니아 바이러스 TK(-) 셔틀벡터에 본 발명의 실시예 3에서 얻은 I1L-E3L 프로모터가 도입된 pSP72-pI1L-E3L-Luc를 제작하고, 제한효소 NheI과 HindIII를 동시에 처리하여 DNA 구조를 확인한 결과이다.
도 5은 본 발명에 일실시예에 따라 백시니아 바이러스 TK(-) 셔틀벡터에 본 발명의 실시예 3에서 얻은 I1L-B19R 프로모터가 도입된 pSP72-pI1L-B19R-Luc를 제작하고, 제한효소 NheI과 HindIII를 동시에 처리하여 DNA 구조를 확인한 결과이다.
도 6는 대조군 프로모터 또는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 조합 프로모터가 도입된 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 TK(-)-pI1L-B19R-Luc를 제작하고, PCR을 통해 DNA 구조를 확인한 결과이다.
도 7는 대조군 프로모터 또는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 조합 프로모터가 도입된 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 TK(-)-pI1L-B19R-Luc를 제작하고, RT-PCR을 통해 루시퍼레이즈, GFP 또는 베타 액틴의 mRNA 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 대조군 프로모터 또는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 조합 프로모터가 도입된 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 TK(-)-pI1L-B19R-Luc를 제작하고, 서던 블랏팅을 통해 DNA 구조를 확인한 결과이다.
도 9은 대조군 프로모터 또는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 조합 프로모터가 도입된 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 TK(-)-pI1L-B19R-Luc를 제작하고, 이를 인체 자궁암 세포주인 HeLa 또는 인체 대장암 세포주인 SW620 세포에 처리한 후 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석한 그래프이다.
도 10a 내지 10c은 대조군 프로모터 또는 본 발명의 실시예 3에서 얻은 조합 프로모터가 도입된 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 TK(-)-pI1L-B19R-Luc의 유전자 개열지도이다.
하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 프로모터의 제조
1-1: 프로모터 유전자 확보 및 플라스미드 제작
각각의 프로모터는 유전자 합성을 통하여 확보하였다. 염기서열은 아래와 같고, 유전자 합성은 마크로젠에 의뢰하였으며, 합성기기는 Bioautomation 제조사의 MM192E를 사용하였다. 프로모터 유전자는 WR genomic DNA 서열(GenBank: AY243312.1)를 참고하였으며, 각 프로모터의 부위를 하기 표 2에 나타냈다.
프로모터 이름 염기서열 (5' -> 3') 서열번호
pI1L TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAA 1
pE3L TGAATAAAAAAAATGATAAAATAAATTAGTTTTATTA 2
pB19R TGTGTGTAAAAAAACTGATATTATATAAATATTTTAGTGCCGTATAA 3
pF11L GGTAAAATTATATAAAAAGTGAAAAACAATATTATTTTTATCGTTGGTTGTTT 4
pC11R AATTAACAATATATTATAGTTTATATTACTGAATTAATAATATAAAATTCCCA 5
p7.5 TCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCCATAAATAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGG 6
pE/L AAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAGCTAGCTCGAG 7
p11 ATATAGTAGAATTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAAAT 8
플라스미드 제작을 위하여 pE/L과 pI1L 프로모터 염기서열의 말단에는 KpnI과 XhoI 서열을, 이 둘을 제외한 프로모터 염기서열의 말단에는 NheI과 HindIII 서열을 각각 추가하였다. 상기 합성을 통해 확보한 pE/L과 pI1L 프로모터 유전자들은 KpnI과 XhoI으로 절단한 pGL4.10[luc2] 벡터(Promega, USA)에 각각 삽입하여 플라스미드 pGL4.10-pE/L 또는 pGL4.10-pI1L을 완성하였다.
상기 합성을 통해 얻은 p7.5, p11, pE3L, pC11R, pF11L, pB19R 프로모터 유전자들은 NheI과 HindIII로 절단한 pGL4.10[luc2] 벡터에 각각 삽입하여 플라스미드 pGL4.10-p7.5, pGL4.10-p11, pGL4.10-pE3L, pGL4.10-pC11R, pGL4.10-F11L, pGL4.10-pB19R을 완성하였다.
1-2: 단일 프로모터 활성평가
실시예 1-1에서 제조한 8개 종류의 플라스미드에서 단백질 발현양을 측정하여 프로모터 활성을 평가하였다. pI1L, pE3L, pC11R, pF11L, pB19R 프로모터를 포함하는 플라스미드와, 대조군으로서 기존에 알려진 p7.5, pE/L 또는 p11 프로모터를 도입한 플라스미드를 사용하였다.
구체적으로, 상기 플라스미드들의 프로모터 활성을 알아보기 위하여 인체 자궁암 세포주인 HeLa 세포에, 실시예 1-1에서 제조한 8개 종류의 프로모터가 도입된 각각의 플라스미드를 형질 도입한 후 루시퍼레이즈의 발현양을 측정하였다. 10%의 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지에서 배양한 HeLa 세포를 24 well 배양 플레이트에 각 well당 6 X 104 개씩 접종하였다. 다음날 세포에 백시니아 바이러스를 감염시키고 6시간 후 바이러스 프로모터가 도입된 플라스미드들을 트랜스펙션 용액을 이용하여 이미 바이러스에 감염된 세포에 처리하였다. 24시간 후 세포 주변의 배지를 제거하고 세포 용해제를 처리하여 얻은 세포 용해물의 일부를 루시퍼레이즈 측정용 96 well 배양 플레이트에 옮긴 후 루시퍼레이즈 효소의 기질인 루시페린을 처리하였다. 루시퍼레이즈 분석기기를 이용하여 기질분해로 인해 발생되는 빛의 양을 측정하였으며, 각 프로모터에 대한 측정된 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1은 인체 자궁암 세포주인 HeLa 세포를 각각의 프로모터가 도입된 플라스미드로 형질도입 후 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석한 그림이다. p7.5, pE/L, p11은 대조군으로 기존에 이용되던 프로모터이며, pE3L, pC11R, pF11L. pB19R, pI1L은 실험군으로 이용된 후보 프로모터이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 기존에 이용되던 백시니아 바이러스 프로모터인 p7.5, pE/L 또는 p11 프로모터가 도입된 대조군 플라스미드에 비해 pI1L이 도입된 플라스미드에 의한 유전자의 발현양이 약 3배 가량 높았으며, pE3L 또는 pB19R이 도입된 플라스미드에 의한 유전자 발현양은 대조군과 비슷한 정도임을 알 수 있었다.
1-3: 조합 프로모터 유전자 확보
프로모터의 활성을 증가시키기 위하여 실시예 1-2에서 단일 프로모터로서 활성이 가장 높았던 프로모터인 I1L과 비교적 활성이 높았던 E3L 또는 B19R 프로모터를 결합하여 재조합 프로모터를 구성하였다. 각각의 프로모터는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 유전자 합성을 통하여 확보하였으며 염기서열은 아래와 같다.
프로모터
이름		 염기서열 (5' -> 3') 서열번호
pI1L-E3L TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAATGAATAAAAAAAATGATAAAATAAATTAGTTTTATTA 9
pI1L-B19R TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAATGTGTGTAAAAAAACTGATATTATATAAATATTTTAGTGCCGTATAA 10
pI1L-I1L TTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAATTTGTATTTAAAAGTTGTTTGGTGAACTTAAATGGCGGAA 11
플라스미드 제작을 위하여 각각의 재조합 프로모터 염기서열의 말단에는 NheI과 HindIII 서열을 추가하였다.
상기 합성을 통해 확보한 pI1L-E3L, pI1L-B19R, pI1L-I1L 재조합 프로모터 유전자들은 NheI과 HindIII로 절단한 pGL4.10[luc2] 벡터에 삽입하여 각각 플라스미드 pGL4.10-pI1L-E3L, pGL4.10-pI1L-B19R, 및 pGL4.10-pI1L-I1L을 완성하였다.
실시예 2: 프로모터 활성평가
실시예 1-3에서 제조한 3개 종류의 플라스미드에서 단백질 발현양을 측정하여 프로모터 활성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 플라스미드들의 프로모터 활성을 알아보기 위하여 인체 자궁암 세포주인 HeLa 세포에 프로모터가 도입된 각각의 플라스미드를 형질 도입한 후 루시퍼레이즈의 발현양을 측정하였다. 10%의 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지에서 배양한 HeLa 세포를 24 well 배양 플레이트에 각 well당 6 × 104개씩 접종하였다. 다음날 세포에 백시니아 바이러스를 감염시키고 6시간 후 백시니아 바이러스 프로모터가 도입된 플라스미드들을 트랜스펙션 용액을 이용하여 이미 바이러스에 감염된 세포에 처리하였다. 2시간 후 세포 주변의 배지를 제거하고 세포 용해제를 처리하여 얻은 세포 용해물의 일부를 루시퍼레이즈 측정용 96-well 배양 플레이트에 옮긴 후 루시퍼레이즈 효소의 기질인 루시페린을 처리하였다. 루시퍼레이즈 분석기기를 이용하여 기질분해로 인해 발생되는 빛의 양을 측정하였으며, 각 프로모터에 대한 측정된 결과를 도 2 및 표 4에 나타냈다. 도 2는 실시예 1에서 활성이 가장 높았던 pI1L을 기반으로 활성이 비교적 높은 pE3L 또는 pB19R을 조합하여 제작한 재조합 프로모터의 활성을 비교 분석한 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 p7.5 프로모터가 도입된 플라스미드에 비해, 재조합 프로모터인 pI1L-E3L 또는 pI1L-B19R이 도입된 플라스미드에 의한 유전자 발현양은 약 6배 가량 높았고, pI1L 단일 프로모터가 도입된 플라스미드에 비해 약 2.4배 가량 높았다. 또한, 프로모터 활성이 높았던 pI1L 프로모터를 2 copy 조합하여 제작한 pI1L-I1L 플라스미드의 경우 pI1L 단일 프로모터가 도입된 플라스미드에 비해 1.5배 정도 발현양이 증가하였다.
구분 루시퍼레이즈 활성 (단위 : RLU/mg)
Vector 10,946
p7.5 1,747,383
p1L 5,337,647
pI1L-E3L 11,834,807
pI1L-B19R 12,274,591
pI1L-pI1L 8,661,349
실시예 1-2에서 활성이 가장 높은 pI1L을 2 copy 조합한 pI1L-I1L의 경우, 루시퍼레이즈 활성이 8,661,349 로서, pI1L에 비해 활성이 2배로 증가하지 못했으나, pI1L과 E3L 또는 B19R과 결합시에는 그 이상 활성이 증가하였다. 또한, 도 1의 결과에서 볼 수 있듯이 기존의 프로모터 중 p7.5의 활성이 가장 높았으나, 도 2에서 실험에 이용된 프로모터 모두 p7.5에 비해서 활성이 증가하여 우수함을 확인하였다.
실시예 3: 프로모터가 도입된 바이러스 벡터
3-1: 바이러스 벡터용 셔틀벡터 제작
재조합 프로모터가 도입된 플라스미드를 이용하여 측정한 프로모터의 활성평가 결과가 바이러스에서도 동일하게 적용되는지 알아보기 위하여, TK 유전자가 제거된 바이러스 셔틀벡터인 pSP72-TK(-)에 본 발명에 따른 바이러스 프로모터와 리포터 유전자인 루시퍼레이즈를 함께 도입하였다.
실시예 1-1에서 대조군으로 이용된 pGL4.10-p7.5와, 실시예 1-3에서 얻은 pGL4.10-pI1L-E3L 및 pGL4.10-pI1L-B19R 각각을 NheI과 XbaI으로 절단하여 프로모터와 루시퍼레이즈 유전자를 얻었다. 상기 얻어진 유전자를 NheI과 XbaI으로 절단한 pSP72-TK(-) 셔틀벡터에 삽입하여 최종적으로 각각 pSP72-TK(-)-p7.5-Luc, pSP72-TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 pSP72-TK(-)-pI1L-B19R-Luc을 완성하였다.
3-2: 재조합 백시니아 바이러스의 제작
실시예 3-1에서 제작된 재조합 셔틀 벡터를 야생형의 백시니아 바이러스와 함께 세포에 처리하여 재조합 바이러스를 제작하였다. 백시니아 바이러스의 TK 유전자 위치에 상동성 재조합으로 삽입되어, 재조합 백시니아 바이러스가 제조되었다.
구체적으로, 10%의 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지에서 배양한 HeLa 세포를 6 well 배양 플레이트에 각 well당 3 X 105 개씩 접종하였다. 다음날 백시니아 바이러스 셔틀벡터인 pSP72-TK(-)-p7.5-Luc, pSP72-TK(-)-pI1L-E3L-Luc, 및 pSP72-TK(-)-pI1L-B19R-Luc 를 트랜스펙션 용액을 이용하여 처리함과 동시에 백시니아 바이러스를 0.05 MOI로 감염시키고 4시간 후 5%의 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지로 교체한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양한 세포는 배지를 제거한 후 얼렸다 녹였다를 3회 반복하여 1차 바이러스를 얻고 이를 플라크 분리 방법으로 3회 반복하여 순수한 재조합 바이러스의 클론을 얻었다.
획득한 바이러스는 Vero 세포에서 TCID50 방법을 이용하여 역가를 측정하였고, RT-PCR, genomic DNA PCR, 서열 분석, southern blot을 통하여 구조를 확인한 후 실험에 이용하였다. 이를 통해 최종적으로 각각의 프로모터와 루시퍼레이즈가 도입된 재조합 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc (도 10a), TK(-)-pI1L-E3L-Luc(도 10b), TK(-)-pI1L-B19R-Luc(도 10c)를 확보하였다.
3-3: 바이러스의 역가 측정
감염성이 있는 바이러스의 농도는 배양 숙주 세포 50%에서 감염을 일으키는 희석배수를 50% tissue culture infectious dose (TCID50)로 표시하기로 하였고, 이에 TCID50 방법을 이용한 바이러스의 역가를 측정한 후 그 결과를 토대로 재조합 바이러스의 특성을 분석하였다.
구체적으로, 96 well plate에 Vero 세포를 5 x 103 cells/well로 배양한 후에, 각각의 바이러스를 1/10, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105, 1/106, 1/107, 및 1/108 씩 희석한 후 각 well에 처리하였다. 바이러스 처리 4일 뒤에 CPE(Cytopathic effect)가 나타난 well의 개수를 세어 바이러스의 역가를 계산하였으며 얻어진 최종 역가는 다음의 표 5에 나타냈다.
재조합 바이러스 종류 바이러스 역가 (TCID50/ml)
TK(-) p7.5-luc virus 6.9 x 107
TK(-) I1L-E3L-luc virus 9.4 x 107
TK(-) I1L-B19R-luc virus 8.7 x 107
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 세 종류의 재조합 바이러스 모두 비슷한 역가를 나타내는 것으로 보아 바이러스의 생산에 문제가 없음을 확인하였다.
3-4: 재조합 바이러스 구조확인
게놈 DNA의 PCR를 수행하고자, 바이러스의 genomic DNA을 추출한 후 PCR을 통해 TK 유전자 대신 삽입된 외부유전자의 사이즈를 확인하였다. 야생형 바이러스인 IHD-W와 비교하여 재조합 여부를 확인하였다.
상기 실험결과를 도 6에 나타냈다. 도 6에 나타낸 바와 같이, PCR 결과 야생형 바이러스의 경우 966 bp의 단편이 증폭됨을 확인할 수 있었으며, 재조합 바이러스의 경우 유전자 도입에 의해 증폭된 단편의 길이가 3.1~3.2 Kb로 증가하였음을 확인함으로써 DNA 구조에 이상이 없음을 알 수 있었다.
바이러스 RNA의 RT-PCR을 수행하고자, HeLa 세포를 6 well 배양용기에 3 x 105 cells/well로 배양하고, 상기 역가 측정이 완료된 재조합 바이러스를 0.05 MOI 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 이 후 트리졸(trizol)을 처리하여 세포를 용해시키고 RNA을 추출한 후 이를 이용하여 시험관 상에서 cDNA을 합성하였다. 이 DNA을 주형으로 사용한 PCR을 통해 외부유전자의 구조를 분석하여, 재조합 여부를 확인하였다. RT-PCR 결과 얻어진 DNA를 전기영동한 사진을 도 7에 나타냈다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 외부 유전자가 도입되지 않은 야생형 바이러스와 달리 세 종류의 재조합 바이러스 모두 외부 유전자인 루시퍼레이즈 및 EGFP의 mRNA가 잘 발현되고 있음을 확인하였다.
서던 블랏팅 분석법을 수행하고자, HeLa 세포를 75T 배양용기에 2 x 106 cells/well로 배양하고, 상기. 역가 측정이 완료된 재조합 바이러스를 0.05 MOI 처리 후 72시간 동안 배양하였다. 세포의 배지를 제거한 후, 세포를 얼렸다 녹였다를 3회 반복하여 바이러스를 얻었다. 상기 바이러스의 게놈 DNA를 추출하여 Hind III 제한효소로 잘라 0.8% 아가로즈에서 밴드를 분리하고 나이론 멤브레인으로 옮겨, 120℃에서 고정시킨 후 DIG-labeling probe와 혼성화시켰다. 세척 및 블록킹 과정을 거쳐 최종 기질과 접촉시켜 선택적인 DNA 밴드를 확인하였다. 서던 블랏분석법 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 야생형 바이러스의 경우 5005 bp의 DNA 단편에 probe가 결합하였으나 이와 달리, 재조합 바이러스의 경우 유전자 도입에 의해 1337 bp로 감소된 DNA 단편에 probe가 결합하였음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 외부 유전자가 도입된 부위의 DNA 구조에 이상이 없음을 알 수 있었다. Probe가 결합하는 부위는 파란색 화살표로 나타내었다.
실시예 4: 재조합 바이러스의 단백질 발현양 평가
실시예 3-2에서 제작한 재조합 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, TK(-)-pI1L-B19R-Luc을, 인체 자궁암 세포주인 HeLa 또는 인체 대장암 세포주인 SW620에 처리하여 각각의 프로모터에 의해 조절된 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석하였다.
구체적으로, 10%의 우태아 혈청이 포함된 MEM 배지에서 배양한 HeLa 세포 또는 SW620 세포를 12 well 배양 플레이트에 각 well당 2 X 105 개씩 접종하였다. 다음날 각각의 재조합 바이러스(야생형 WT, p7.5, I1L-E3L, I1L-B19R)를 1 MOI로 감염시키고 6시간 후 세포 주변의 배지를 제거하고 세포 용해제를 처리하여 얻은 세포 용해물의 일부를 루시퍼레이즈 측정용 96 well 배양 플레이트에 옮긴 후 루시퍼레이즈 효소의 기질인 루시페린을 처리하였다. 루시퍼레이즈 분석기기를 이용하여 기질분해로 인해 발생되는 빛의 양을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9는 재조합 백시니아 바이러스인 TK(-)-p7.5-Luc, TK(-)-pI1L-E3L-Luc, TK(-)-pI1L-B19R-Luc 를 인체 자궁암 세포주인 HeLa 또는 인체 대장암 세포주인 SW620 세포에 처리한 후 루시퍼레이즈의 발현양을 비교 분석한 그림이다.
도 9의 그래프에 나타낸 바와 같이, 대조군인 p7.5 프로모터가 도입된 바이러스에 비해, HeLa 세포 또는 SW620 세포에서 pI1L-B19R가 도입된 바이러스에 의한 루시퍼레이즈의 발현양이 약 2배 가량 높았다.
<110> KOLON LIFE SCIENCE, INC. <120> Promoter derived from the poxviridae and vector including the same <130> DPP20150336KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pI1L promoter <400> 1 tttgtattta aaagttgttt ggtgaactta aatggcggaa 40 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pE3L promoter <400> 2 tgaataaaaa aaatgataaa ataaattagt tttatta 37 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pB19R promoter <400> 3 tgtgtgtaaa aaaactgata ttatataaat attttagtgc cgtataa 47 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pF11L promoter <400> 4 ggtaaaatta tataaaaagt gaaaaacaat attattttta tcgttggttg ttt 53 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pC11R promoter <400> 5 aattaacaat atattatagt ttatattact gaattaataa tataaaattc cca 53 <210> 6 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p7.5 promoter <400> 6 tccaaaccca cccgcttttt atagtaagtt tttcacccat aaataataaa tacaataatt 60 aatttctcgt aaaagtagaa aatatattct aatttattgc acgg 104 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pE/L promoter <400> 7 aaaattgaaa ttttattttt tttttttgga atataaatag ctagctcgag 50 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pI1 promoter <400> 8 atatagtaga atttcatttt gtttttttct atgctataaa t 41 <210> 9 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pI1L-E3L promoter <400> 9 tttgtattta aaagttgttt ggtgaactta aatggcggaa tgaataaaaa aaatgataaa 60 ataaattagt tttatta 77 <210> 10 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pI1L-B19R promoter <400> 10 tttgtattta aaagttgttt ggtgaactta aatggcggaa tgtgtgtaaa aaaactgata 60 ttatataaat attttagtgc cgtataa 87 <210> 11 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pI1L-I1L promoter <400> 11 tttgtattta aaagttgttt ggtgaactta aatggcggaa tttgtattta aaagttgttt 60 ggtgaactta aatggcggaa 80

Claims (16)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산분자는
    서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드와,
    서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 핵산분자는 5'에서 3'방향으로, 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드의 3'-말단에 연결된,
    서열번호 2 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 핵산분자.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 핵산분자는 적어도 하나의 말단에, 제한효소인식부위가 추가로 포함하는 것인 핵산분자.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산분자는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자.
  6. 제 1 항 에 있어서, 상기 핵산분자는 포유동물 세포에서 목적 유전자의 전사를 유도할 수 있는 프로모터인 핵산분자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 핵산분자는 포유동물 세포의 세포질에서 발현되는 목적 유전자의 프로모터인 핵산분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스인 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 벡터는 폭스바이러스과 바이러스 유래인 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 폭스바이러스과 바이러스는 오르쏘폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus) 및 수이폭스바이러스(suipoxvirus)속 바이러스로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 벡터.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 폭스바이러스는 백시니아 바이러스인 벡터.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 핵산분자에 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자를 추가로 포함하는 것인 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 목적 유전자는 암 항원, 면역 반응 유도 인자, 암 성장 억제인자, 세포 사멸 유도 인자, 또는 암 조직 내 바이러스의 활성 증대에 도움이 될 수 있는 인자의 폴리뉴클레오타이드인 벡터.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 숙주는 미생물, 포유동물, 포유동물의 세포, 또는 포유동물 유래의 세포주인 숙주.
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