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DE3880468T2 - Rekombinante dns-expressionsvektoren. - Google Patents

Rekombinante dns-expressionsvektoren.

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Publication number
DE3880468T2
DE3880468T2 DE8888906008T DE3880468T DE3880468T2 DE 3880468 T2 DE3880468 T2 DE 3880468T2 DE 8888906008 T DE8888906008 T DE 8888906008T DE 3880468 T DE3880468 T DE 3880468T DE 3880468 T2 DE3880468 T2 DE 3880468T2
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DE
Germany
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gene
untranslated region
human cytomegalovirus
promoter
dna
Prior art date
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Application number
DE8888906008T
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DE3880468D1 (de
Inventor
Robert Bebbington
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Lonza Group AG
Original Assignee
Celltech Ltd
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Publication date
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Application filed by Celltech Ltd filed Critical Celltech Ltd
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Description

    Erfindungsbereich
  • Diese Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz aus dem größeren unmittelbaren frühen Gen des humanen Cytomegalovirus enthalten, betrifft Wirtszellen, die solche Vektoren enthalten, betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids durch Verwendung von Vektoren, die diese Sequenz enthalten, und betrifft die Verwendung dieser DNA-Sequenz.
    • Grundlagen der Erfindung
  • Es ist das Hauptziel aller mit dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie Befaßten, ein höchstmögliches Ausmaß der Produktion eines speziellen Polypeptids zu erzielen. Das gilt vor allem für kommerzielle Unternehmen, die sich der Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie zur Produktion solcher Polypeptide bedienen wollen, die in der Natur nicht sehr reichlich vorkommen.
  • Im allgemeinen bedingt der Einsatz der DNA-Technologie die Klonierung eines für das gewünschte Polypeptid codierenden Gens, die Einbringung des geklonten Gens in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion einer Wirtszell-Linie mit dem Vektor und die Züchtung der transfizierten Zell-Linie zur Produktion des Polypeptids. Es ist praktisch unmöglich vorherzusagen, ob irgendein spezieller Vektor oder eine Zell-Linie oder die Kombination derselben zu einem brauchbaren Ausmaß an Produktion führen wird oder nicht.
  • Im allgemeinen sind jene Faktoren, die die Menge an Polypeptid, die durch eine transfizierte Zell-Linie produziert wird, wirksam beeinflussen, folgende: 1. die Genkopienzahl, 2. die Effizienz, mit welcher das Gen transkribiert und die mRNA translatiert wird, 3. die Stabilität der mRNA und 4. die Effizienz der Proteinausscheidung.
  • Die Hauptzahl der auf die Steigerung der Expressionsausmaße von rekombinanten Polypeptiden gerichteten Arbeiten zielte auf die Verbesserung der Transkriptionsinitiationsmechanismen. Infolgedessen sind die eine wirksame Translation beeinflussenden Faktoren viel weniger genau erforscht und definiert und im allgemeinen ist es nicht möglich vorherzusagen, ob irgendwelche spezielle DNA-Sequenzen zur Erzielung einer wirksamen Translation verwendbar sein werden.
  • Versuche zur Erforschung der Translation bestanden hauptsächlich in der Variierung der DNA-Sequenz rund um das Consensus-Translationsstartsignal, um zu bestimmen, welche Wirkung dieses auf die Translationsinitiation ausübt (Kozak M Cell 41 283-292 (1986)).
  • Studien der Expression von gewünschten heterologen Genen verwenden normalerweise sowohl die Codierungssequenz als auch zumindest einen Teil der 5' -untranslatierten Sequenz des heterologen Gens, sodaß die Translationsinitiation von der natürlichen Sequenz des Gens erfolgt. Diese Versuchsweise erwies sich als unverläßlich, wahrscheinlich als Folge der "hybriden Natur" der 5' -untranslatierten Region und der Tatsache, daß die Anwesenheit von speziellen 5-untranslatierten Sequenzen zu einer spärlichen Initiation der Translation führen kann (Kozak M., Proc. Natl. Acad. Sci 83, 2850-2854 (1986) und Pelletier und Sonenberg Cell 40, 515-526 (1985)). Diese Veränderung in der Translation hat eine negative Auswirkung auf die Menge des produzierten Produktes.
  • Verschiedene Studien (Boshart et al., Cell 41 521-530 (1985) und Pasleau et al., Gene 38 227-232 (1985), Stenberg et al., J. Virol. 49 (1) 190-199 (1984); Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 659-663 (1984) und Foecking und Hofstetter, Gene 45 101-105 (1986)) verwendeten Sequenzen aus der Stromaufwärts-Region des hCMV-MIE-Gens (human Cytomegalovirus major immediate early gene) in Expressionsvektoren. Diese Studien betrafen jedoch nur die Verwendung der Sequenzen als Promotoren und/oder Verstärker. Spaete und Mocarski (J. Virol. 56 (1) 135-143, 1985) verwendeten ein PstI bis PstI Fragment des hCMV-MIE-Gens, das den Promotor, den Verstärker und einen Teil der 5' -untranslatierten Region übergreift, als Promotor für die Expression von heterologen Genen. Zur Erzielung von Translation wurde die natürliche, 5' -untranslatierte Region des heterologen Gens verwendet.
  • In der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 260148 ist ein Verfahren zur kontinuierlichen Produktion eines heterologen Proteins beschrieben. Die konstruierten Expressionsvektoren enthalten einen Teil der 5' -untranslatierten Region des hCMV-MIE-Gens als Stabilisierungssequenz. Die Stabilisierungssequenz wird in die 5' -untranslatierte Region des für das gewünschte heterologe Protein codierenden Gens eingesetzt, d. h. die Lehre daraus ist wieder die Tatsache, daß die natürliche 5' -untranslatierte Region des Gens für die Translation essentiell ist.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung stellt diese einen Vektor zur Verfügung, der eine DNA-Sequenz enthält, die Promotor, Verstärker und im wesentlichen die vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des größeren unmittelbaren frühen Gens des humanen Cytomegalovirus enthält.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspektes der Erfindung umfaßt der Vektor eine Restriktionsstelle zur Insertion eines heterologen Gens.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß Vektoren, die eine DNA-Sequenz enthalten, die den Promotor, den Verstärker und die vollständige 5' -untranslatierte Region des größeren unmittelbaren frühen Gens des humanen Cytomegalovirus (hCMV-MIE) stromaufwärts eines heterologen Gens enthalten, zu einem hohen Expressionsausmaß des heterologen Genproduktes führen. Insbesondere haben wir unerwarteterweise gefunden, daß, wenn die von dem hCMV-MIE stammendende DNA direkt an die Codierungssequenz des heterologen Gens gebunden ist, hohe Ausmaße an mRNA-Translation erreicht werden. Diese wirksame Translation der mRNA wird übereinstimmend erreicht und scheint von dem speziellen heterologen Gen, das exprimiert werden soll, unahängig zu sein.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Vektor zur Verfügung gestellt, der eine DNA-Sequenz enthält, die den Promotor, den Verstärker und eine im wesentlichen vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des größeren unmittelbaren frühen Gens des humanen Cytomegalovirus stromaufwärts von einem heterologen Gen enthält.
  • Die von dem hCMV-MIE stammende DNA kann gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung von der Codierungssequenz des heterologen Gens durch dazwischenliegende DNA getrennt sein, wie beispielsweise durch die 5' -untranslatierte Region des heterologen Gens. Vorteilhafterweise kann die von dem hCMV-MIE stammende DNA direkt an die Codierungssequenz des heterologen Gens gebunden sein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung stellt diese einen Vektor zur Verfügung, der eine DNA-Sequenz enthält, die den Promotor, den Verstärker und die im wesentlichen vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des hCMV-MIE-Gens umfaßt und direkt an die DNA-Codierungssequenz des heterologen Gens gebunden ist.
  • Vorzugsweise umfaßt die von dem hCMV-MIE stammende Sequenz eine Sequenz, die ident mit dem natürlichen hCMV-MIE Translationsinitiationssignal ist. Es kann jedoch notwendig oder günstig sein, das natürliche Translationsinitiationssignal zu modifizieren, um die Bindung der Codierungssequenz des gewünschten Polypeptids an die hCMV-MIE-Sequenz zu erleichtern, d.h. durch Einführung einer geeigneten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Beispielsweise kann die Translationsinitiationsstelle vorteilhafterweise modifiziert sein, um eine NcoI-Erkennungsstelle zur Verfügung zu stellen.
  • Das heterologe Gen kann ein für ein beliebiges eukaryotisches Polypeptid codierendes Gen sein, wie beispielsweise für ein Säugetier-Polypeptid, wie ein Enzym, z. B. Chymosin oder gastrische Lipase; einen Enzyminhibitor, z.B. Gewebeinhibitor von Metalloproteinase (TIMP); ein Hormon, z.B. Wachstumshormon; ein Lymphokin, z.B. ein Interferon; einen Plasminogenaktivator, z.B. Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) oder Prourokinase; oder ein natürliches, modifiziertes oder chimerisches Immunglobulin oder ein Fragment desselben, inklusive chimerischer Immunglobuline mit doppelter Aktivität, wie Antikörper-Enzym- oder Antikörper-Toxin-Chimere.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung werden Wirtszellen zur Verfügung gestellt, die mit Vektoren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung transfiziert sind.
  • Die Wirtszellen können beliebige eukaryotische Zellen sein, wie beispielsweise Pflanzen- oder Insektenzellen, jedoch sind sie vorzugsweise Säugetierzellen, wie beispielsweise CHO-Zellen oder Zellen von myeloidem Ursprung, z.B. Myelom- oder Hybridom-Zellen.
  • Gemäß einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids zur Verfügung, gemäß welchem eine nach dem dritten Aspekt der Erfindung transfizierte Zelle gezüchtet wird.
  • Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz vorgesehen, die den Promotor, den Verstärker und die im wesentlichen vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des hMCV-MIE-Gens für die Expression eines heterologen Gens umfaßt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des fünften Aspekts der Erfindung ist die von hCMV-MIE stammende DNA-Sequenz direkt an die DNA-Codierungssequenz des heterologen Gens gebunden.
  • Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen die Plasmide pCMGS, pHT. 1 und pEE6hCMV.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die angeschlossenen Zeichnung, ausschließlich in Form eines Beispiels beschrieben, wobei
  • Fig. 1 eine schematische Darstellung des Plasmids pSVLGS. 1,
  • Fig. 2 eine schematische Darstellung des Plasmids pHT. 1,
  • Fig. 3 eine schematische Darstellung des Plasmids pCMGS,
  • Fig. 4 die vollständige Sequenz des Promotor-Verstärker hCMV-MIE, inklusive sowohl des ersten Introns als auch einer modifizierten Translations -"Start"-Stelle und
  • Fig. 5 eine schematische Darstellung des Plasmids pEE6. hCMV zeigt.
    • Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen Beispiel 1
  • Das Pst-1m-Fragment von hCMV (Boshart et al. Cell 41 521-530 (1985), Spaete & Mocarski, J. Virol. 56 (1) 135-143 (1985)) enthält den Promotor- Verstärker und das meiste der 5' -untranslatierten Führung des MIE-Gens inklusive des ersten Introns. Der Rest der 5' -untranslatierten Sequenz kann neugeschaffen werden durch Anhängen einer kleinen zusätzlichen Sequenz von etwa 20 Basenpaaren.
  • Viele eukaryotische Gene enthalten eine Ncol-Restriktionsstelle (5' -CCATGG-3' ), die die Translationsstartstelle überlappt, da diese Sequenz häufig einen Teil eines bevorzugten Translationsinitiationssignals 5' ACCATGPu-3' darstellt. Das hCMV-MIE-Gen hat keine Ncol-Stelle am Beginn der Protein-Codierungssequenz, jedoch bedingt eine einzige Basenpaarveränderung, daß die Sequenz sowohl dem "Kozak"-Consensus-Initiationssignal ähnlicher ist als auch eine Ncol-Erkennungsstelle einführt. Daher wurde ein Paar von komplementären Oligonucleotiden der Sequenz
  • synthetisiert, die bei Fusion an das Pst-lm-Fragment von hCMV die vollständige 5' -untranslatierte Sequenz des MIE-Gens mit der einzigen Veränderung eines G zu einem C an der Position -1 relativ zum dem Translationsinitiationscodon wiederherstellt.
  • Dieses synthetische DNA-Fragment wurde zwischen dem hCMV Pst-lm Promotor-Verstärker-Führungsfragment und einer Glutaminsynthetase-(GS)-Codierungssequenz durch Ligation des Pst-lm-Fragmentes und des synthetischen Oligomers mit Ncol-abgebautem pSV2.GS eingesetzt, um ein neues Plasmid pCMGS zu schaffen (Die Herstellung von pSV2. GS ist in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 8704462 beschrieben. ) pCMGS ist in Fig. 3 gezeigt. pCMGS enthält somit eine hybride Transkriptionseinheit, die aus folgendem besteht: dem synthetischen, oben beschriebenen Oligomer stromaufwärts des hCMV-MIE Promotor-Verstärkers (wo es ausschließlich als günstiger Pstl-Ncol "Adapter" fungiert), dem hCMV-MIE-Promotor und der vollständigen 5' -untranslatierten Region des MIE-Gens, inklusive des ersten Introns, direkt an die GS-Codierungssequenz an der Translationsinitiationsstelle fusioniert.
  • pCMGS wurde in CHO-KI-Zellen durch Calciumhosphat-mediierte Transfektion eingesetzt und das Plasmid wurde auf seine Fähigkeit zur Verleihung von Resistenz gegen den GS-Inhibitor Methioninsulfoximin (MSX) untersucht. Die Ergebnisse eines Vergleichs mit pSV2. GS sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Es ist klar ersichtlich, das pCMGS bei ähnlicher Frequenz dem pSV2.GS Resistenz gegen 20 M MSX verleihen kann, was zeigt, daß aktives GS-Enzym tatsächlich in diesem Vektor exprimiert wird. Tabelle 1 Ergebnisse der Transfektion von GS-Expressionsvektoren in CHO-KI-Zellen. Vektor Anzahl Kolonien/10&sup6; Zellen resistent gegen 20uM MSX Vergleich
    • Beispiel 2
  • Die TIMP-cDNA und das SV40-Polyadenylierungssignal, wie sie in pTIMP 1 (Docherty et al (1985) Nature 318, 66-69) verwendet wurden, wurden in pEE6 zwischen die einzigen HindIII- und BamHI-Stellen zur Bildung von pEE6TIMP eingesetzt. pEE6 ist ein bakterieller Vektor, aus dem die Sequenzen, die die Replikation in Säugetierzellen inhibieren, entfernt worden waren. Es enthält den XmnI- bis BclI-Anteil von pCT54 (Emtage et al, 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3671-3675) mit einem pSP64 (Melton et al., 1984: Nucleic Acids Res. 12, 7035) Polylinker, eingesetzt zwischen den HindIII- und EcoRI-Stellen. Die BamHI- und SalI-Stellen wurden aus dem Polylinker durch Abbau, Auffüllen mit Klenow-Enzym und Religation entfernt.
  • Das BclI- bis BamHI-Fragment ist ein 237 bp SV40 frühes Polyadenylierungssignal (SV40 2770 bis 2533). Das BamHI- bis BglI-Fregment stammt aus pBR328 (375 bis 2422) mit einer zusätzlichen Deletion zwischen der SalI- und der AvaI-Stelle (651 bis 1425) im Anschluß an die Addition eines SalI-Linkers an die AvaI-Stelle. Die Sequenz von der BglI- zu der XmnI-Stelle stammt aus dem ß-Lactamase-Gen von pSP64.
  • Das 2129 Basenpaare Ncol-Fragment, das den hCMV-MIE Promotor-Verstärker und die 5' -untranslatierte Sequenz enthält, wurde aus pCMGS durch teilweisen Ncol-Abbau isoliert und an der Ncol-Stelle, das Translationsinitiationssignal von TIMP in pEE6. TIMP überlappend, eingesetzt, um das Plasmid pHT. 1 zu erzeugen (in Fig. 2 gezeigt).
  • Es wurde ein GS-Gen in pHT. 1 eingesetzt, um Selektion permanenter Zell-Linien zu gestatten, indem das 5,5K Pvul-BamHI-Fragment von pSVGS. 1 (Fig. 1) an der BamHI-Stelle von pHT. 1 eingeführt wird nach Addition eines synthetischen BamHI-Linkers an Pvul-abgebautes PSVGS. 1, wobei pHT-1GS gebildet wird. In diesem Plasmid transkribieren die hCMV-TIMP- und GS-Transkriptionseinheit in gleicher Orientierung.
  • pHT. 1 GS wurde in CHO-K1-Zellen durch Calciumphosphat-mediierte Transfektion eingeführt und die gegen 20 uM MSX resistenten Klone wurden 2 bis 3 Wochen nach der Transfektion isoliert. Die TIMP-Ausscheidungsraten wurden bestimmt durch Testen der Kulturüberstände in einem speziellen Zwei- Stellen-ELISA, der basiert auf einem polyklonalen Schaf-Anti-TIMP-Antikörper als fangendem Antikörper, einem monoklonalen Maus-TIMP als Erkennungsantikörper, wobei die Bindung des monoklonalen Antikörpers durch Verwendung eines Schaf-Anti-Maus-IgG Peroxidase-Konjugates erkennbar gemacht wird. Es wurde gereinigtes natürliches TIMP als Standardeichung für den Assay verwendet und alle Kurven waren im Bereich von 2 bis 20 ng/ml linear. Die nichtspezifische Reaktion war in konditioniertem Medium von CHO-Zellen feststellbar.
  • Eine Zell-Linie GS. 19 wurde anschließend neuerlich geklont und ein Subklon GS 19-12 scheidet TIMP in einem sehr hohen Ausmaß von 3 x 10&sup8; Molekülen/Zelle/Tag aus. Die gesamte genomische DNA, die von dieser Zell-Linie extrahiert worden war, wurde mit einer TIMP-Sonde in einer Southern-Blot- Analyse unter Verwendung von Standardmethoden hybridisiert und es zeigte sich, daß eine einzige intakte Kopie der TIMP-Transkriptionseinheit pro Zelle (ebenso wir zwei umgeordnete Plasmidbanden) enthalten war. Diese Zell-Linie wurde auf Resistenz gegen höhere Gehalte von MSX selektiert und in der ersten Selektion wurde ein Pool von Zellen, die gegen 500 uM MSX resistent waren, isoliert und neuerlich geklont. Der Klon GS-19.6(500)14 scheidet 3 x 10&sup9; Moleküle TIMP/Zelle/Tag aus. Die Vektorkopienzahl in dieser Zell-Linie liegt bei etwa 20 bis 30 Kopien/Zelle. Anschließende Selektionsrunden für weitere Genamplifizierung führten zu keiner weiteren Steigerung der TTMP-Ausscheidung.
  • Auf diese Weise scheint es, daß die hCMV-TIMP-Transkriptionseinheit von pHT. 1 sehr wirkungsvoll in CHO-KI-Zellen mit einer etwa einzigen Kopie pro Zelle exprimiert werden kann und daß eine einzige Genamplifizierungsrunde zu Ausscheidungsraten führt, die unter Verwendung gängiger Verfahren maximal sind.
    • Beispiel 3
  • Um zu untersuchen, ob die hMCV-MIE-Promotor-Verstärker-Führung zur Lenkung der wirksamen Expression anderer Proteinsequenzen verwendet werden kann, wurden zwei unterschiedliche, aber verwandte Plasminogenaktivator-Codierungssequenzen (mit der Bezeichnung PA-1 und PA-2) in CHO-KI-Zellen mit Hilfe von Vektoren eingeführt, in welchen die Proteincodierungssequenzen direkt an die hCMV-Sequenz fusioniert waren.
  • In beiden Fällen lag keine Ncol-Stelle am Beginn der translatierten Sequenz vor und daher wurden synthetische Oligonucleotide zur Wiederherstellung der authentischen Codierungssequenz aus geeigneten Restriktionsstellen innerhalb der translatierten Region verwendet. Die Sequenz des modifizierten hCMV-Translationsinitiationssignals, wie sie in pHT. 1 verwendet worden war, wurde ebenfalls in das synthetische Oligonucleotid eingebaut, das dann mit einer Pst-1-Restriktionsstelle endete. Das Pst-1m-Fragment von hCMV wurde dann an dieser Stelle eingesetzt, um die vollständige Promotor- Verstärker-Führungssequenz zu schaffen.
  • Die hCMV-Plasminogenaktivator-Transkriptionseinheiten wurden in CHO- KI-Zellen eingeführt, nachdem ein GS-Gen wie oben an der einzigen BaxnH1- Stelle eingesetzt worden war, und es wurden MSX-resistente Zell-Linien, die Plasminogenaktivator ausschieden, isoliert.
  • Die Ausscheidungsraten der besten anfänglichen transfizierten Zell- Linien in jedem Fall sind in Tabelle 2 angegebene. Daraus ist ersichtlich, daß die hCMV-Promotor-Verstärker-Führung auch zur Lenkung der wirksamen Expression dieser beiden Plasminogenaktivator-Proteine verwendet werden kann. Tabelle 2 Ausscheidungsraten für die verschiedenen Plasminogenaktivator-Proteine aus tranfektanten CHO-Zell-Linien. Plasminogenaktivator ausgeschiedene Moleküle/Zelle/Tag
    • Beispiel 4
  • pEE6hCMV wurde hergestellt, indem das Pst-1m-Fragment von hCMV, HindIII-abgebautes pEE6 und die komplementären Oligonucleotide der Sequenz
  • einer cDNA, die für eine leichte Immunglobulinkette codiert, an die EcoRI- Stelle von pEE6. hCMV eingesetzt wurde, sodaß die hCMV-MIE Promotor-Verstärker-Führung die Expression der cDNA lenken konnte, und es wurde ein selektierbares Marker-Gen, das den SV40-Replikationsursprung enthielt, an der BamHI-Stelle jedes Plasmids eingesetzt.
  • Dieses Plasmid wurde in einem Standard-DEAE-Dextran-Transfektionsverfahren in COS-1-Affennierenzellen transfiziert und die transiente Expression wurde 72 Stunden nach der Transfektion überwacht. Es wurden leichte Ketten in einer Menge von mindestens 100 ng/ml in das Medium ausgeschieden, was darauf hindeutet, daß die leichte Kette tatsächlich von einer Transkriptionseinheit exprimiert werden kann, die die gesamte hCMV-MIE 5' - untranslatierte Sequenz bis zu, jedoch nicht inklusive, der Translationsinitiation ATG enthält, wobei 15 Basen der natürlichen 5' -untranslatierten Sequenz des Gens der leichten Kette von Maus-Immunoglobulin anschließen.

Claims (10)

1. Vektor zur Verwendung in eukaryotischen Zell-Linien, der eine DNA-Sequenz, umfassend den Promotor, den Verstärker und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des größeren unmittelbar-frühen (major immediate-early) Gens des humanen Cytomegalovirus enthält, wobei die 5' -untranslatierte Region nicht direkt an die DNA-Codierungssequenz des natürlichen größeren unmittelbar-frühen Gens des humanen Cytomegalovirus gebunden ist.
2. Vektor zur Verwendung in eukaryotischen Zell-Linien, der eine DNA-Sequenz enthält, die den Promotor, den Verstärker und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des größeren unmittelbar-frühen Gens des humanen Cytomegalovirus enthält, wobei die 5' -untranslatierte Region direkt an die DNA-Codierungssequenz eines heterologen Gens gebunden ist.
3. Vektor nach Anspruch 2, welcher eine Restriktionsstelle enthält, um die Excision und/oder Insertion der Codierungssequenz eines heterologen Gens zu gestatten.
4. Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die größere unmittelbarfrühe DNA des humanen Cytomegalovirus ein Translationsinitiationssignal enthält.
5. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche transfiziert ist.
6. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Polypeptids, bei welchem Verfahren eine Wirtszelle nach Anspruch 4 gezüchtet wird.
7. Verwendung einer DNA-Sequenz, die den Promotor, den Verstärker und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region, inklusive des ersten Introns, des größeren unmittelbar- frühen Gens des humanen Cytomegalovirus umfaßt, zur Expression eines heterologen Gens in einer eukaryotischen Zell- Linie, wobei die von dem größeren unmittelbar-frühen Gen des humanen Cytomegalovirus stammende DNA direkt an die Codierungssequenz des heterologen Gens gebunden ist.
8. Plasmid zur Verwendung in einer eukaryotischen Zell-Linie, das den größeren unmittelbar-frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region des größeren unmittelbar-frühen Gens, inklusive des ersten Introns, direkt an eine Glutaminsynthase-Codierungssequenz an der Translationsinitiationsstelle fusioniert enthält.
9. Plamid, das den größeren unmittelbar-frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region des größeren unmittelbar-frühen Gens, inklusive des ersten Introns, direkt an die Codierungssequenz eines Gewebeinhibitors von Metalloproteinase (TIMP) an der Translationsinitiationsstelle fusioniert enthält.
10. Plasmid, das den größeren unmittelbar-frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus und die funktionell vollständige 5' -untranslatierte Region des größeren unmittelbar-frühen Gens, inklusive des ersten Introns, enthält, wobei die 5' -untranslatierte Region eine Translationsstartstelle enthält, die mit einer NCO1-Restriktionsstelle zusammenfällt.
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