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CN119307505A - 针对人和犬ctla-4的犬源化抗体 - Google Patents

针对人和犬ctla-4的犬源化抗体 Download PDF

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CN119307505A
CN119307505A CN202411315030.1A CN202411315030A CN119307505A CN 119307505 A CN119307505 A CN 119307505A CN 202411315030 A CN202411315030 A CN 202411315030A CN 119307505 A CN119307505 A CN 119307505A
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M·莫尔塞耶
张远征
I·塔佩
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Intervet International BV
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Abstract

本发明提供具有特定序列和对犬CTLA‑4具有高结合亲和力的犬源化抗人CTLA‑4抗体。本发明还涉及这些抗体在治疗犬科动物和其它伴侣动物癌症中的用途。

Description

针对人和犬CTLA-4的犬源化抗体
本申请是申请日为2020年7月15日、申请号为202080050832.8、发明名称为“针对人和犬CTLA-4的犬源化抗体”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2019年7月15日提交的临时申请美国序列号62/874,287的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及共刺激或共抑制信号传导途径的蛋白质(包括CTLA-4)的抗体。更特别地，本发明进一步涉及针人CTLA-4的犬源化抗体(caninized antibodies)，其具有特异性序列和对犬CTLA-4的高结合亲和力。本发明还涉及本发明的抗体在治疗犬科动物的癌症中的用途。
发明背景
免疫应答的起始或终止经由信号传导途径介导，所述信号传导途径由在许多免疫细胞(最值得注意的是T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC))的表面上表达的一组蛋白质之间的复杂相互作用活化。共刺激信号传导途径导致免疫应答的发展，并且已经显示最重要的是通过T细胞表面上的CD28与APC表面上的B7.1(也称为CD80)和B7.2(也称为CD86)家族成员的相互作用介导的。B7.1和B7.2被认为执行类似的功能。
相反，共抑制途径导致免疫应答的抑制或终止，并且已经显示是通过T细胞上的CTLA-4和APC上的B7.1/B7.2蛋白之间的相互作用介导的。已经显示另外的共抑制信号传导途径是通过T细胞上的程序性细胞死亡受体1(PD-1)和APC上的程序性细胞死亡受体配体1或2(PD-L1/PD-L2)蛋白之间的相互作用介导的。此外，还已经显示PD-L1和B7.1之间的相互作用也可以在T细胞中产生抑制信号。
B7.1和B7.2是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员[Sharpe and Freeman,NatureReviews,2:116-126(2002)]。B7.1在活化的B细胞、活化的T细胞以及巨噬细胞和树突细胞上表达[Swanson and Hall,Eur J.Immunol.,23:295-298(1993)；Razi-Wolfe et al.,PNAS,89:4210-4214(1992)]。B7.2在树突状细胞、朗格汉斯细胞和B细胞上组成型表达。此外，B7.2在单核细胞上表达，并且在IFN-γ刺激之后上调[Larsen etal.,Immunol.,152:5208-5219(1994)；Inaba,J.Exp.Med.180:1849-1860(1994)]。
B7.1和B7.2结合CD 28和CTLA-4，具有不同的功能结果[Linsley et al.,PNAS,87:5031-5035(1990)；Linsley et al.,J.Exp.Med.,173:721-730(1991)；Azuma et al.,Nature 366:76-79(1993)；Freeman et al.,Science 262:909-912(1993)]。B7.1和B7.2与CTLA-4的结合比B7.1/B7.2与CD 28的结合具有高得多的亲和力[van der Merwe,J.Exp.Med.185:393-402(1997)]。
CD28是同源二聚体糖蛋白，其是Ig超家族的成员[Aruffo and Seed,PNAS,84:8573-8577(1987)]。成熟蛋白质具有134个氨基酸残基的单个细胞外可变结构域，其包含对反受体(counter receptor)结合必不可少的六肽基序MYPPPY[Riley and June,Blood,105:13–21(2005)]。CD28的41个氨基酸的胞质结构域含有四个酪氨酸残基，其在活化时可以被磷酸化[Sharpe and Freeman,Nat.Rev.Immunol.,2:116–126(2002)]。CD28在大多数CD4+T细胞和约50％的CD8+T细胞上表达[Gross et al.,J.Immunol.,149:380-388(1992)；Riley and June,Blood,105:13–21(2005)]。在T细胞受体(TCR)连接之后，B7.1/B7.2与CD28的结合为T细胞提供了关键的共刺激信号，从而允许T细胞活化和随后的免疫应答发展[Reiser et al.,PNAS,89:271-275(1992)；Jenkins et al.,J.Immunol.,147:2461-2466(1991)]。已经表明，在不存在CD28信号的情况下，T细胞经历细胞凋亡或进入无应答状态[Jenkins et al.,J.Exp.Med.165:302-319(1987)；Jenkins et al.,PNAS,84:5409-5413(1987)；Schwartz,Science,248:1349-1356(1990)]。CD28-B7.1/B7.2结合可以改变活化所需的TCR连接的阈值水平(例如，抗原-MHC复合物的量)，减少刺激初始细胞所需的时间并增强T细胞应答的幅度[Soskic et al.,Advances in Immunology,124:96-123(2014)]。
CTLA-4(CD152)也是Ig超家族的成员，并且由单个细胞外结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成[Swanson,Immunology；1010:169-177(2000)]。另外，CTLA-4与CD28共享约30％的氨基酸同一性。CTLA-4不在初始T细胞上组成型表达，尽管其在CD28连接和T细胞活化之后不久快速上调，其中CTLA-4的峰值表达水平在初始T细胞活化之后约48-96小时[Alegreet al.,J.Immunol.,157:4762-4770(1996)；Freeman et al.,J.Immunol.,149:3795-3801(1992)]。CTLA-4以比CD28高得多的亲和力结合B7.1和B7.2两者[van der Merwe et al.,J.Exp.Med.,185:393-402(1997)]。然而，与CD28结合B7.1或B7.2的刺激作用相反，CTLA-4作为抑制性受体起作用，其对于免疫应答的下调是至关重要的[Walnus et al.,Immunity,1:405-413(1994)；Walnus,J.Exp.Med.,183:2541-2550(1996)；Krummel和Allison,J.Exp.Med.,183:2533-2540(1996)]。CTLA-4介导其免疫抑制功能的机制与其充当CD28与B7.1/B7.2之间相互作用的竞争性抑制剂的能力有关[综述在Swanson,Immunology,1010:169-177(2000)中]。CTLA-4在免疫下调中的关键作用在CTLA-4缺陷的小鼠中得到证实，所述小鼠在3-5周龄时因为发展了以多个器官的T细胞浸润为特征的淋巴增殖性疾病而死亡[Tivol et al.,Immunity,3:541-5417(1995)；Waterhouse et al.,Science,270:985-988(1995)]。还证实CTLA-4敲除的后果取决于CD28与其配体B7.1和B7.2的相互作用，如在CTLA-4/B7-1/B7-2三重敲除小鼠中没有疾病所示[Mandelbrot et al.,J.Exp.Med.,189:435-440(1999)]。这也通过在CTLA-4敲除小鼠中重复施用CTLA-4Ig得到的抗淋巴增殖的保护得到证实[Tivol et al.,J Immunol.,158:5091-5094(1997)]。
另外，已经显示用抗体阻断CTLA-4的作用增强体外和体内的T细胞应答，并增加抗肿瘤免疫应答[Leach et al.,Science,271:1734-1736(1996)]。基于这些发现，进行CTLA-4阻断剂如单克隆抗体的开发以提供用于治疗癌症的治疗模态[Hodi et al.,PNAS,100(8):4712-4717(2003)；Phan GQ et al.,PNAS,100(14):8372-8377(2003)；Attia,Journalof Clinical Oncology,23(25):6043-6053(2005)；Comin-Anduix et al.,Journal ofTranslational Medicine,6:22-22(2008)；WO2000037504 A2；U.S.8,017,114B2；WO2010097597A1；WO2012120125A1；和Boutros et al.,Nat Rev Clin Oncol.,13(8):473-486(2016)]。
PD-1是CD28/CTLA-4免疫调节受体家族的成员。PD-1也是Ig超家族的成员，并且包含结合其配体的细胞外可变结构域和结合信号传导分子的胞质尾[综述在Zak et al.,Cell Structure,25:1163-1174(2017)]。PD-1的胞质尾包含两个酪氨酸基的信号传导基序[Zhang et al.,Immunity 20:337–347(2004)]。在未刺激的T细胞、B细胞或骨髓细胞上没有发现PD-1表达。然而，在活化之后，PD-1表达在这些细胞上上调[Chemnitz et al.,J.Immunol.,173:945–954(2004)；Petrvas et al.,J.Exp.Med.,203:2281-2292(2006)]。PD-1与CTLA-4最密切相关，共享约24％的氨基酸同一性[Jin et al.,Current Topics inMicrobiology and Immunology,350:17-37(2010)]。当与在APC表面上表达的PD-L1和PD-L2结合时，PD-1减弱T细胞活化。这些配体中的任一种与PD-1的结合负调节经由T细胞受体(TCR)的抗原信号传导。迄今为止，仅发现PD-L1和PD-L2充当PD-1的配体。与CTLA-4一样，PD-1结合似乎传递负免疫调节信号。通过PD-L1或PD-L2连接PD-1导致对TCR介导的增殖和细胞因子产生的抑制[Jin et al.,Current Topics in Microbiology and Immunology,350:17-37(2010)]。与CTLA-4缺陷的动物相反，PD-1缺陷的小鼠在生命中死亡迟得多，并显示自身免疫的迹象，尽管观察到的影响的严重程度不如CTLA-4缺陷的动物显示出的那些严重[Nishimura et al.,Immunity,11(2):141–151(1999)；Nishimura et al.,Science,291(5502):319–322(2001)]。尽管PD-1信号传导途径目前正在进行深入研究，但是迄今为止的研究表明PD-L1/PD-L2/PD-1相互作用参与一些免疫应答的负调节，因为TCR刺激下游的信号减少导致细胞因子分泌减少和T细胞增殖受损以及T细胞产生细胞毒性分子的减少[Freeman et al.,J.Exp.Med.,192(7):1027–1034(2000)]。
PD-L1(CD274)是1型膜蛋白，由IgV样和IgC样细胞外结构域、疏水性跨膜结构域和短胞质尾(由30个氨基酸组成)组成，具有未知的信号转导性质。PD-L1被认为是B7家族的成员，并且与B7家族成员共享约20％的氨基酸同一性。PDL1结合在活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞上发现的其受体PD-1。PD-L1还结合共刺激分子B7.1，但不结合CD86[Butte et al.,Immunology,45(13):3567–3572(2008)]。B7.1对于PD-L1的亲和力介于其对CD28和CTLA-4的亲和力之间。相关分子PD-L2对于CD80或CD86没有亲和力，但共享作为受体的PD-1。PD-L1与T细胞上的其受体PD-1的接合递送抑制TCR介导的IL-2产生和T细胞增殖的信号。PD-L1与PD-1的结合还有助于在向初始T细胞呈递抗原期间配体诱导的TCR下调。另外，PD-L1与T细胞上的B7.1结合导致T细胞凋亡。PD1和PD-L1作为T细胞活化抑制剂的作用已经在许多研究中得到证实。基于这些发现，进行PD-1和PD-L1阻断剂如单克隆抗体的开发，以提供用于治疗癌症和感染性疾病的治疗模式。
已经开发了阻断犬PD-1、PD-L1和CTLA-4的结合和活性的人源化单克隆抗体，并且目前可用于治疗被诊断患有几种不同类型的癌症之一的人类受试者。类似地，还报道了阻断犬PD-1和PD-L1的结合和活性的犬源化单克隆抗体[U.S.9,944,704B2、U.S.10,106,607B2和U.S.2018/0237535A1，将其全部内容通过引用并入本文]。然而，迄今为止还没有阻断犬CTLA-4的结合和活性的犬源化单克隆抗体的任何报道。
本文对任何参考文献的引用不应当被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。
发明简述
本发明涉及犬源化抗人CTLA-4抗体，其对犬CTLA-4具有特异性结合亲和力，并且具有阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或CD86结合的能力。本发明还涉及这样的抗体在治疗疾病如癌症和/或由感染引起的疾病中的用途。
因此，本发明提供一种特异性结合CTLA-4的分离的犬源化抗体，其包含犬IgG重链和犬κ或λ轻链，或所述犬化抗体的抗原结合片段。在这种类型的特定实施方案中，所述犬κ或λ轻链包含三个轻链互补决定区(CDR)，即CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)，并且所述犬IgG重链包含三个重链CDR，即CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)，所有六个CDR均得自哺乳动物CTLA-4抗体。本发明犬源化抗体及其片段的特定实施方案结合犬CTLA-4和/或阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或CD86的结合。
在某些实施方案中，所述犬源化抗体的CDRL1包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列，和CDRL3包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在相关实施方案中，所述犬源化抗体的CDRH1包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列，CDRH2包含SEQ IDNO：50的氨基酸序列，和CDRH3包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在特定实施方案中，所述犬源化抗体的CDRL1由SEQ ID NO：53的核苷酸序列编码，CDRL2由SEQ ID NO：55的核苷酸序列编码，和CDRL3由SEQ ID NO：57的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述犬源化抗体的CDRH1由SEQ ID NO：47的核苷酸序列编码，CDRH2由SEQID NO：49的核苷酸序列编码，和CDRH3由SEQ ID NO：51的核苷酸序列编码。
在更特定的实施方案中，所述犬源化抗体的CDRL1包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，CDRL2包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列，和CDRL3包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，另外，所述犬源化抗体的CDRH1包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列，CDRH2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，和CDRH3包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
对于本发明的某些实施方案，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列，在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：33的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：34的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：34的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列，在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：35的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：36的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：36的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：38的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：38的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：40的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：40的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
对于本发明的某些实施方案，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列，在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：59的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：60的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：60的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：61的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：62的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：62的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：63的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：64的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：64的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的重链包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：65的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：66的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述重链在SEQ ID NO：66的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述犬源化抗体的犬轻链是κ链。在可替代的实施方案中，所述犬轻链是λ链。在特定的实施方案中，所述κ轻链包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列，在更特定的实施方案中，所述κ轻链由SEQ ID NO：41的核苷酸序列编码。在相关实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：42的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQID NO：58的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：42的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
在特定的实施方案中，所述犬源化抗体的κ轻链包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述κ轻链由SEQ ID NO：43的核苷酸序列编码。在相关的实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：44的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：44的氨基酸序列的功能保守变体内包含氨基酸序列SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58。
在仍然其它实施方案中，所述犬源化抗体的κ轻链包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，所述κ轻链由SEQ ID NO：45的核苷酸序列编码。在相关的实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：46的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在仍然其它实施方案中，所述κ轻链在SEQ ID NO：46的氨基酸序列的功能保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
本发明进一步提供犬源化抗体，其包含本发明的任何轻链和本发明的任何重链。在特定的实施方案中，所述分离的犬源化抗体包含重链和κ轻链，所述重链在SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：62的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：62的氨基酸序列或SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52氨基酸序列，并且所述κ轻链在SEQ IDNO：46的氨基酸序列的保守变异体内包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列或包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，分离的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的κ轻链。在其它特定的实施方案中，分离的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：62的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的κ轻链。
在其它特定的实施方案中，所述分离的犬源化抗体包含重链和κ轻链，所述重链包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：66的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：66的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52的氨基酸序列，所述κ轻链包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列或在SEQ ID NO：42的氨基酸序列的保守变体内包含SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：58的氨基酸序列。在更特定的实施方案中，分离的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的κ轻链。在仍然其它特定的实施方案中，分离的犬源化抗体包含含有SEQ ID NO：66的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的κ轻链。
本发明进一步提供编码本发明的犬源化抗体的任一轻链的分离的核酸。类似地，本发明进一步提供编码本发明的犬源化抗体的任一重链的分离的核酸。本发明进一步提供包含本发明的一种或多种分离的核酸的表达载体。本发明还提供包含一种或多种本发明的表达载体的宿主细胞。
在特定的实施方案中，抗体是重组抗体或其抗原结合片段。在相关的实施方案中，可变重链结构域和可变轻链结构域通过柔性接头连接，形成单链抗体。
在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab片段。
在其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是Fab'片段。在其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是(Fab')2片段。在仍然其它实施方案中，抗体或抗原结合片段是双抗体。在特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是结构域抗体。在更特定的实施方案中，抗体或抗原结合片段是骆驼源化的单结构域抗体。
在特定的实施方案中，犬源化抗人CTLA-4抗体或抗原结合片段增加治疗的犬受试者的免疫应答。
因此，本发明进一步提供编码如本文公开的犬源化抗人CTLA-4抗体或抗原结合片段的分离的核酸。在相关的实施方案中，这样的抗体或抗原结合片段可用于制备治疗犬科动物受试者中的癌症的药物。可替代地或联合地，本发明提供本发明的任何抗体或抗体片段用于诊断用途的用途。在仍然另外的实施方案中，提供包含本文公开的任何犬源化抗体或抗原结合片段的试剂盒。
在仍然另外的实施方案中，提供表达载体，其包含编码本发明的任何犬源化抗人CTLA-4抗体或抗原结合片段的分离的核酸。本发明还涉及包含本文所述的任何表达载体的宿主细胞。在特定的实施方案中，本发明的这些核酸、表达载体或多肽可用于制备抗体的方法中。
本发明进一步包括包含本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段与可药用载体或稀释剂的药物组合物。另外，本发明提供增加免疫细胞的活性的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的这样的药物组合物。在特定的实施方案中，受试者是犬科动物。在可替代的实施方案中，受试者是猫科动物。在仍然其它实施方案中，受试者是马科动物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗癌症。在其它实施方案中，所述方法用于治疗感染或感染性疾病。在仍然其它实施方案中，本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段用作疫苗佐剂。
通过参考以下附图简述和详细说明将更好地理解本发明的这些和其它方面。
附图简述
图1显示了针对一系列选择的嵌合抗体(如所指出的)用犬CTLA-4的ELISA结果，证实了它们的结合活性：·3B10,Δ8H5,▼611,▲10D1,▽3B3,O 418,411,1E2和+Iso-对照。各个嵌合抗体描述在下表1中。Iso-对照是针对与CTLA-4无关的抗原的犬源化鼠抗体。
图2显示一系列犬源化3B-10抗体(如所指出的)的ELISA结果，证实了犬源化3B-10抗体强结合犬CTLA-4·3B10 MC,c3B10L2-H3,▲c3B10L3-H3,▼c3B10L2-H2,Oc3B10L3-H2,c3B10L3-H4和Δc3B10L1-H1。L1、L2和L3分别对应于下表5中的VL1、VL2和VL3，并且H1、H2、H3和H4分别对应于下表4中的VH1、VH2、VH3和VH4。3B10 MC是与图1中描述的相同的嵌合抗体。
图3提供在嵌合体或犬源化3B10抗体存在下用犬CD86和犬CTLA-4的ELISA结果。·3B10 MC,c3B10L1-H1,▲c3B10L3-H2,▼c3B10L3-H4和Iso-对照。结果证实了针对犬CD86与嵌合体和犬源化3B10抗体两者的犬CTLA-4的结合相互作用的抗体阻断活性。Iso-对照是针对与CTLA-4无关的抗原的犬源化鼠抗体。
图4显示了犬PBMC在经选择的CTLA-4嵌合抗体活化后产生的IFNγ生成，如[1E2、3B10、10D1、8H5、611、411和418]所示和如上图1所述。
图5鉴定犬CTLA-4的表位，其包含现有技术SEQ ID NO：68的氨基酸序列，其与犬源化3B10L3H2(3B10 VL3VH2)抗体相互作用。
发明详述
缩写：
在本发明的整个详细说明和实施例中，将使用以下缩写：
ADCC抗体依赖性细胞毒性
CDC补体依赖性细胞毒性
CDR免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义
CHO中国仓鼠卵巢
EC50导致50％功效或结合的浓度
ELISA酶联免疫吸附测定
FR抗体构架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区。
HRP辣根过氧化酶
IFN干扰素
IC50导致50％抑制的浓度
IgG免疫球蛋白G
Kabat由Elvin A.Kabat[Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]开创的免疫球蛋白比对和编号系统
mAb单克隆抗体(也称为Mab或MAb)
MES2-(N-吗啉代)乙磺酸
MOA作用机制
PCR聚合酶链反应
PK药代动力学
SEB葡萄球菌肠毒素B
TT破伤风类毒素
V区在不同抗体之间在序列上可变的IgG链的区段。其延伸至轻链中的Kabat残基109和重链中的Kabat残基113。
VH免疫球蛋白重链可变区
VK免疫球蛋白κ轻链可变区
定义：
为了可以更容易地理解本发明，下面特别地定义了某些技术和科学术语。除非在本文中其它地方特别地定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
如本文(包括所附权利要求书)使用的，除非上下文另有明确规定，否则词语的单数形式比如“一”、“一个(种)”和“该”包括其相应的复数指代。
除非上下文另外指出或明确指出，否则“活化”在其应用于细胞或受体时指用配体活化或处理细胞或受体。“配体”涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和衍生自抗体的结合化合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可以指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞活化。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或受体的结合、催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性、其他分子活性的调节等。分子的“活性”还可以指调节或维持细胞与细胞相互作用(例如粘附)的活性，或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”还可以意味着比活性，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]、生物区室中的浓度等。“活性”可以指先天或适应性免疫系统的组分的调节。
“施用”和“处理”在其应用于动物(例如犬科动物实验对象)、细胞、组织、器官或生物流体时指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物(例如犬科动物受试者)、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。
“施用”和“处理”还指例如通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一种细胞对细胞的体外和离体处理。术语“受试者”包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如犬科动物、猫科动物或人)，最优选犬科动物。
“治疗(treat)”或“处理(treating)”指在内部或外部向例如具有一种或多种疾病症状或疑似患有疾病的犬科动物受试者或患者施用治疗剂，例如含有本发明的任何抗体或抗原结合片段的组合物，所述试剂对所述犬科动物受试者或患者具有治疗活性。通常，所述试剂以有效地减轻和/或改善受治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度上诱导这样的症状的消退或抑制这样的症状的进展。有效地减轻任何具体疾病症状的治疗剂的量(也被称为“治疗有效量”)可以根据因素比如患者(例如，犬科动物、猫科动物或马科动物)的疾病状态、年龄和重量以及药物组合物在受试者中引发期望应答的能力而变化。可以通过兽医或其他熟练的卫生保健提供者通常使用的任何临床测量以评估该症状的严重程度或进展状态来评价疾病症状是否已经减轻或改善。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不会在减轻每个受试者中的靶疾病症状中都有效，但是其应当减轻统计学上显著数目的受试者中的靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计学检验(例如学生t-检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U-检验、Kruskal-Wallis检验(H-检验)、Jonckheere-Terpstra-检验和Wilcoxon-检验)所确定的。
“治疗”在其应用于人、兽医(例如犬科动物)或研究受试者时，指治疗性处理以及研究和诊断应用。当其应用于人、兽医(例如犬科动物)或研究受试者或细胞、组织或器官时，“治疗”涵盖本发明的抗体或抗原结合片段与例如犬科动物或其他动物受试者(例如，猫科动物)、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
术语“免疫应答”指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对哺乳动物体(例如犬体)的癌细胞、感染病原体或侵入性病原体的细胞或组织的选择性损伤、破坏或消除。
犬源化抗人CTLA-4抗体
本发明提供结合犬CTLA-4的分离的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段，以及这样的抗体或片段的用途。
如本文使用的犬源化抗人CTLA-4抗体指特异性结合哺乳动物CTLA-4的犬源化抗体。特异性结合哺乳动物CTLA-4(特别是犬CTLA-4)的抗体是与这样的抗体：其显示出与其他抗原相比，优先结合哺乳动物CTLA-4，但这种特异性不需要绝对结合特异性。如果其结合决定了从犬科动物获得的生物样品中犬CTLA-4的存在，或者如果其能够改变犬CTLA-4的活性而不会过度干扰犬样品中其他无关犬蛋白质的活性，例如不会产生不期望的结果，例如在诊断背景中的假阳性或在治疗背景中的副作用，则认为犬源化抗人CTLA-4抗体对犬CTLA-4是“特异性的”。犬源化抗人CTLA-4抗体需要的特异性程度可取决于抗体的预期用途，并且至少由其用于预期目的的适用性来限定。预期方法的抗体或衍生自抗体的抗原结合位点的结合化合物与其抗原或其变体或突变蛋白结合的亲和力比与任何其他犬抗原的亲和力大至少两倍，优选至少10倍，更优选至少20倍，并且最优选至少100倍。然而，特异性结合犬CTLA-4的分离抗体可以与其它抗原交叉反应，特别是密切相关的抗原，例如猫CTLA-4、马CTLA-4和/或人CTLA-4。
如本文使用的，如果抗体结合包含犬CTLA-4的序列的多肽，但在任何地方几乎都不结合缺乏犬CTLA-4氨基酸序列的其它犬蛋白质，则认为抗体特异性结合包含给定序列(在这种情况下，为犬CTLA-4)的多肽。例如，特异性结合包含犬CTLA-4的多肽的抗体可以结合加标签形式的犬CTLA-4，但是不特异性结合其它加标签的犬蛋白。
如本文中使用的，除非另有说明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”指抗体的抗原结合片段，即保留特异性地结合被全长抗体结合的抗原(例如，犬CTLA-4)的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区域的片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；直链抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；纳米抗体(nanobodies)和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。
通常，当以摩尔基准表示活性时，本发明的犬源化抗体或其抗原结合片段保留其犬CTLA-4结合活性的至少10％(当与相应亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的犬CTLA-4结合亲和力。
本发明包括被称为具有确定氨基酸序列的抗体的“保守变体”的抗体。如本文使用的“保守抗体”相对于具有确定氨基酸序列的本发明犬源化抗体在其氨基酸序列中具有一个、两个、三个或更多个保守氨基酸取代。本发明进一步包括被称为具有确定氨基酸序列的犬源化抗体的“功能保守变体”的抗体。如本文使用的“功能保守变体”相对于犬源化抗体的氨基酸序列具有一个、两个、三个或更多个非保守氨基酸取代。术语“保守变体”和“功能保守变体”仅针对本发明的相应犬源化抗体的犬框架中的氨基酸残基变化而使用，而不针对犬源化抗体的特定CDR而使用。重要的是，"保守变体"和/或"功能保守变体"基本上不改变包含所定义氨基酸序列的本发明的相应犬源化抗体的生物活性。
“分离的抗体”指纯化状态，并且在这种情况下指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不旨在指完全不存在这种材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以实质上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体的抗原结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。
通常，重链和轻链两者的可变结构域包含位于相对保守的框架区(FR)内的三个高变区，也称为互补决定区(CDR)。CDR通常通过侧面为框架区，使得能够结合特定表位。通常，从N末端到C末端，轻链和重链可变域(区)均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。向每个结构域的氨基酸的分配通常是根据以下文献的定义：Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health,Bethesda,Md.,5th ed.,NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat,et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia,et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia,et al.,Nature 342:878-883(1989)。
如本文使用的术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(即轻链可变结构域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链可变结构域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。[参见Kabat et al.Sequences of Proteinsof Immunological Interest,，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，通过序列定义抗体的CDR区；还参见Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，通过结构定义抗体的CDR区]。
如本文使用的术语“框架”或“FR”残基指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。犬源化抗体的框架表示犬框架的一部分。
除非另有说明，否则如本文使用的术语“犬科动物”包括所有家养狗、家犬(Canislupus familiaris或Canis familiaris)。
如本文使用的术语“猫科动物”指猫科的任何成员。家猫、纯种和/或杂种伴侣猫、以及野猫(wild cats)或野生猫(feral cats)都是猫科动物。
如本文使用的术语“犬框架”指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的犬抗体的重链和轻链的氨基酸序列。对于犬源化抗体，在大多数实施方案中，天然犬CDR的氨基酸序列在两条链中都被相应的外源CDR(例如，来自小鼠抗体的CDR)取代。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可包含一些外源非CDR残基，例如，以便保持犬抗体内的外源CDR的构象，和/或修饰Fc功能，如下讨论的。
存在四种已知的狗IgG的IgG重链亚型，称为IgG-A、IgG-B、IgG-和IgG-D。两种已知的轻链亚型被称为λ和κ。
除了结合和活化犬免疫细胞之外，针对CTLA-4的犬或犬源化抗体也可以为设计为具有两个另外的属性：
1.缺乏效应子功能，如抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒性作用(CDC)，以及
2.易于使用工业标准技术(例如基于蛋白A色谱的技术)大规模纯化。
没有一种天然存在的犬IgG同种型满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgGA弱结合A蛋白，但也显示出不期望的ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D不显示ADCC活性。(IgG-C具有相当大的ADCC活性)。本发明通过提供对CTLA-4具有特异性的突变犬IgG-B抗体克服了这一困难[参见，U.S.10,106,607B2，将其全部内容通过参考引入本文]。这些抗体都缺乏效应子功能如ADCC，并且可以使用工业标准蛋白A色谱容易地纯化。
如本文使用的术语“犬源化抗体”指包含来自非犬来源的三个重链CDR和三个轻链CDR的抗体，例如抗人CTLA-4抗体以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个氨基酸变化。在某些实施方案中，修饰的犬框架进一步优化犬源化抗体的效力，例如，增加其与犬CTLA-4的结合和/或其阻断犬CTLA-4与犬CD80和/或CD86结合的能力。
“同源性”指当两个多核苷酸序列或两个多肽序列最佳比对时它们各自之间的序列相似性。当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共有的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，当将序列最佳地比对时，如果两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的，则所述两个序列是60％同源的。通常，当比对两个序列以给出最大同源性百分比时，做出所述比较。
如本文使用的，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二氨基酸序列100％“相同”或具有100％“同一性”。因此，当两个氨基酸序列的50％氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二氨基酸序列50％"相同"。在给定蛋白包含的连续氨基酸残基段中执行序列对比，例如，对比蛋白或多肽的部分。在一个特定的实施方案中，考虑选择的缺失或插入，其否则会改变两个氨基酸序列之间的对应性。
“分离的核酸分子”指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其与在自然界中其中发现分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分无关，或与在自然界中没有与其连接的多核苷酸连接。为了本公开的目的，应当理解，“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列之外，还可以包括多达10种或甚至多达20种或更多种其他蛋白质或其部分或片段的编码序列，或者可以包括可操作地连接的调节序列，其控制所列举的核酸序列的编码区的表达，和/或可以包括载体序列。
短语“控制序列”指对于可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一个核酸序列发生功能关联时，所述核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地连接多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点处连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。还应容易理解，当本文提供核酸序列时，其可包括终止密码子。然而，由于终止密码子是可互换的，在序列中包含特定终止密码子不应被视为该序列的必要部分。
如本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换地使用，并且所有这些名称都包括子代。因此，词语“转化子”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其衍生出的培养物，而不考虑转移的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，并非所有子代都将具有精确相同的DNA含量。包括具有如与在最初转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的突变体子代。在预期不同名称的情况下，从上下文中将是清楚的。
如本文使用的“种系序列”指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排的免疫球蛋白序列的任何合适的来源。人种系序列可以例如在美国国立卫生研究院(theUnited States National Institutes of Health.)的国家关节炎和肌肉骨骼疾病和皮肤疾病研究所(the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and SkinDiseases)的网站上从种系数据库得到。小鼠种系序列可以例如如在Giudicelli et al.[Nucleic Acids Res.33:D256-D261(2005)]中描述的得到。
示例性的犬源化抗人CTLA-4抗体的性质
本发明提供分离的犬源化抗人CTLA-4抗体及所述抗体或其抗原结合片段在治疗疾病(例如，治疗犬科动物中癌症)中的使用方法。结合犬CTLA-4的犬源化抗人CTLA-4抗体的实例包括，但不限于：包含犬IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ轻链连同抗人CTLA-4CDR的抗体。因此，本发明提供分离的犬源化抗人CTLA-4和/或其抗原结合片段，其结合犬CTLA-4并阻断犬CTLA-4与犬CD86和/或犬CD80的结合。
“保守修饰的变体”或“保守取代”指蛋白质中的氨基酸被具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得可以经常进行变化而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，一般而言，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性[参见，例如Watson et al.,Molecular Biologyof the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。本发明的抗体或抗原结合片段的各种实施方案包含具有本文公开的序列例如SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、60、62、64或66的多肽链，或在非CDR区域中包含多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20或更多个保守氨基酸取代的多肽链。示例性保守取代列在表A中。
表A
示例性的保守氨基酸取代
本发明还考虑了本发明抗体的功能保守变体。如本文使用的“功能保守变体”指其中一个或多个氨基酸残基已经被改变而不改变期望性质(如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。这样的变体包括，但不限于用具有相似性质的氨基酸替换氨基酸，比如上表A的保守氨基酸取代。
核酸
本发明进一步包括编码本文公开的犬源化抗人CTLA-4抗体的免疫球蛋白链及其抗原结合片段的核酸。例如，本发明包括下表中列出的所有新核酸。
本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法(其中选择算法的参数以在相应参照序列的整个长度上给出相应序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的抗体的犬框架的氨基酸序列至少约70％相同，优选地至少约80％相同，更优选地至少约90％相同和最优选地至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的犬框架的氨基酸序列。本发明进一步提供编码免疫球蛋白多肽的核酸，当与BLAST算法(其中选择算法的参数以在相应参照序列的整个长度上给出相应序列之间的最大匹配)执行对比时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似性，优选至少约80％相似性，更优选至少约90％相似性，最优选至少约95％相似性(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，所述核酸也包括在本发明中。
序列同一性是指当两个序列最佳比对时，两个多肽在等同位置的氨基酸是相同的程度。序列相似性包括相同的残基和不相同的生化相关的氨基酸。具有相似性质并且可以互换的生化相关氨基酸为上文讨论的。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLASTALGORITHMS:Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.,et al.,Nature Genet.3:266-272(1993)；Madden,T.L.,et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.,etal.,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.,et al.,Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.,et al.,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.et al.,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,etal.,"A modelof evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein SequenceandStructure,第5卷，增刊3，M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,et al.,"Matrices fordetecting distant relationships."in Atlas of ProteinSequence and Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.,et al.,Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.,et al.,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；和Altschul,S.F."Evaluating the statisticalsignificance ofmultipledistinct local alignments."in Theoretical andComputational Methods inGenome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)。
本发明还提供了包含本发明核酸的表达载体，其中核酸可操作地连接控制序列，当宿主细胞用载体转染时，所述控制序列被宿主细胞识别。还提供了包含本发明的表达载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在培养基中培养携带编码抗体或抗原结合片段的表达载体的宿主细胞，和从所述宿主细胞或培养基分离所述抗原或其抗原结合片段。
表位结合和结合亲和力
本发明进一步提供与犬源化抗人CTLA-4抗体结合犬CTLA-4上相同表位的抗体或其抗原结合片段，所述犬源化抗人CTLA-4包含SEQ ID NO：36和/或SEQ ID NO：46的氨基酸序列。犬源化抗人CTLA4抗体或其抗原结合片段能够抑制犬CTLA4与犬CD80和/或CD86的结合。
犬源化抗人CTLA-4抗体可以通过如下实施例中所述的方法重组产生。可以用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本实施例熟知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系例如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地允许抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间来产生抗体。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强本发明的抗体(或来自其的其他部分)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。全部或部分地结合欧洲专利号0216 846、0 256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4讨论GS系统。
一般而言，在特定细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中生产的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于生产所述抗体的特定的细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，与抗体可能具有的糖基化模式无关。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为已经显示这些抗体在体外和体内均通常显示出比其岩藻糖基化对应物更有效的功效[参见例如，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775]。
本发明还包括本文公开的犬源化抗人CTLA-4抗体的抗体片段。所述抗体片段包括F(ab)2片段，其可以通过例如胃蛋白酶酶促切割IgG来产生。Fab片段可以通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。Fab片段是通过二硫键附加至VH-CH1链的VL-CL链。F(ab)2片段是又通过两个二硫键附加的两个Fab片段。F(ab)2分子的Fab部分包括二硫桥位于其之间的Fc区的一部分。Fv片段是VL或VH区域。
在一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如，犬恒定区，比如IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D犬重链恒定区或其变体。在另一个实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如，犬轻链恒定区，比如λ或κ犬轻链区域或其变体。作为举例，且非限制性地，所述犬重链恒定区可以来自IgG-B[例如，修饰的IgG-B，U.S.10,106,607B2，将其全部内容通过引用并入本文]，并且所述犬轻链恒定区可以来自κ。
抗体工程
本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体已经经过工程化以包括对亲本(即，犬)单克隆抗体的可变结构域内的犬框架(包括犬框架残基)的修饰，例如以改善抗体的性质。
实验和诊断用途
本发明的犬源化抗人CTLA-4或其抗原结合片段也可以用在犬CTLA-4蛋白的诊断测定中，例如，检测其在特定肿瘤细胞、组织或血清中的表达。这样的诊断方法可用于各种疾病诊断，特别是犬科动物的某些癌症。
例如，这种方法包括以下步骤：
(a)用犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段包被基质(例如，微孔滴定板孔的表面，例如，塑料板)；
(b)向所述基质施加待测试犬CTLA-4的存在的样品；
(c)洗涤所述板，使得所述样品中未结合的物质被去除；
(d)施加可检测地标记的抗体(例如，酶连接的抗体)，其也对CTLA-4抗原具有特异性；
(e)洗涤所述基质，使得未结合的、标记的抗体被去除；
(f)如果标记的抗体是酶连接的，则施用被所述酶转化成荧光信号的化学物质；和
(g)检测所述标记的抗体的存在。
在一个进一步的实施方案中，标记的抗体用过氧化物酶标记，所述过氧化物酶与ABTS[例如，2,2'-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]或3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应以产生可检测的颜色变化。可替代地，所述标记的抗体用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记，所述放射性同位素可以在闪烁剂存在下用闪烁计数器检测。本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体可以用在蛋白质印迹或免疫蛋白印迹程序中。
这样的程序形成本发明的一部分，且包括例如：
(i)使待测试结合的犬CTLA-4或其片段的存在的膜或其他固体基质与本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触。这样的膜可以采用基于硝酸纤维素或乙烯基[例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)]膜的形式，在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中待测试犬CTLA-4存在的蛋白质已经转移到该膜上(例如，在凝胶中电泳分离之后)。在膜与犬源化鼠抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触之前，任选地用例如脱脂奶粉等封闭膜，以便结合膜上的非特异性蛋白质结合位点。
(ii)将所述膜洗涤一次或多次以除去未结合的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段和其他未结合的物质；和
(iii)检测结合的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
可以通过将抗体或抗原结合片段与可检测标记的第二抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合，然后检测第二抗体的存在来检测结合的抗体或抗原结合片段。
本文公开的犬源化抗人CTLA-4抗体和其抗原结合片段也可用于免疫组织化学。这样的方法形成本发明的一部分，并且包括例如(1)使待测试犬CTLA-4的存在的细胞与例如本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触；和(2)检测细胞上或细胞中的抗体或片段。
如果抗体或抗原结合片段本身被可检测地标记，则可以直接检测。可替代地，抗体或抗原结合片段可以被检测的可检测标记的第二抗体结合。
本文公开的某些犬源化抗人CTLA4抗体及其抗原结合片段也可用于体内肿瘤成像。这种方法可以包括将放射性标记的犬源化抗人CTLA4抗体或其抗原结合片段注射到待测试与犬CTLA-4表达相关的肿瘤的存在的犬科动物的身体中，随后对患者的身体进行核成像以检测标记的抗体或抗原结合片段的存在，例如在包含与肿瘤结合的高浓度抗体或抗原结合片段的基因座处。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层扫描)或PET成像(正电子发射断层扫描)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)，例如与SPECT成像结合，或11C、13N、15O或18F，例如与PET成像结合，或铟-111[参见例如Gordon et al.,InternationalRev.Neurobiol.67:385-440(2005)]。
药物组合物和施用
为了制备犬源化鼠抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物或无菌组合物，可以将其与可药用载体或赋形剂混合[参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)]。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以制备成例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式[参见，例如Hardman,et al.(2001)Goodmanand Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,MarcelDekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weinerand Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,MarcelDekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗CTLA-4抗体在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至合适的浓度，并加入NaCl或蔗糖以改善张力。可以加入另外的试剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80以增强稳定性。
单独或与另一种试剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过标准药物操作在细胞培养物或实验动物中确定，例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数(LD50/ED50)。在特定方面，显示出高治疗指数的抗体是期望的。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于犬科动物的剂量范围。这样的化合物的剂量优选在包括ED50且几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和施用途径。
施用模式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠内、肠胃外；肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内。
在特定的实施方案中，犬源化鼠抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步的实施方案中，犬源化鼠抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段或其药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如口服，例如以丸剂、胶囊或片剂)施用也在本发明的范围内。
可以用本领域已知的医疗装置施用组合物。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针(包括例如预填充注射器或自动注射器)注射来施用。本文公开的药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用；比如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。
本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。用于施用药物组合物的熟知的植入物和模块形式的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员熟知的。
可替代地，可以以局部而不是全身方式施用犬源化抗人CTLA-4抗体，例如，通过将抗体直接注射到特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病变中，经常以贮库或持续释放制剂。而且，可以以靶向药物递送系统施用所述抗体，例如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，所述组织特异性抗体靶向例如特征在于免疫病理学的关节炎关节或病原体诱导的病变。所述脂质体将选择性地靶向患病组织和被患病组织摄入。
施用方案取决于若干因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以实现目标疾病状态的改善，同时使不期望的副作用最小化。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重程度。选择治疗性抗体的适当剂量的指导是可获得的[参见，例如，WawrzynczakAntibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,MarcelDekker,New York,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal AntibodiesandPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert,et al.New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom et al.NewEngl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon et al.New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz et al.New Engl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh et al.NewEngl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky et al.New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。
适当剂量的确定由兽医进行，例如使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，并且此后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用获得期望或最佳的效果。重要的诊断措施包括例如炎症症状或产生的炎性细胞因子水平的的那些。
本文公开的抗体或其抗原结合片段可以通过连续输注或通过施用的剂量提供，例如每天、每周1-7次、每周、每两周、每月、每两月、每季度、每半年、每年等。可以例如静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。每周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如Yang,et al.New Engl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold,et al.New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu,et al.J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji,et al.Cancer Immunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以实现受试者血清中犬源化抗人CTLA-4抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其它实施方案中，本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体每周、每两周、“每4周”、每月、每两月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者皮下或静脉内施用。
如本文使用的“抑制(inhibit)”或“治疗(treat)”或“处理(treatment)”包括与病症有关的症状的发展的延迟和/或这样的病症的症状的严重程度的减少。该术语还包括改善现有的不受控制的或不想要的症状，预防另外的症状，以及改善或预防这些症状的潜在原因。因此，该术语表示已经赋予具有病症、疾病或症状或具有发展这种病症、疾病或症状的潜力的脊椎动物受试者有益的结果。
如本文使用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段的量，当单独或与另外的治疗剂组合施用于细胞、组织或受试者时，所述量有效引起疾病或病症的一种或多种症状或这样的疾病或病症的进展的可测量的改善。治疗有效剂量进一步指足以导致症状的至少部分改善，例如相关医学病症的治疗、愈合、预防或改善，或这样的病症的治疗、愈合、预防或改善速率的增加的结合化合物的量。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合施用、连续施用还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，和最优选至少50％。在使用主观测量来评估疾病严重程度的情况下，有效量还可以导致主观测量的改善。
其它组合疗法
如前所述，犬源化抗人CTLA4抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种治疗剂(例如化疗剂)共同施用。抗体可以与试剂连接(作为免疫复合物)或可以与试剂分开施用。在后一种情况下(单独施用)，抗体可以在试剂之前、之后或与试剂同时施用，或者可以与其它已知疗法共同施用。
试剂盒
进一步提供试剂盒，其包含一种或多种组分，所述组分包括但不限于与一种或多种另外的组分(包括，但不限于可药用载体和/或化疗剂，如本文讨论的)联合的特异性结合CTLA-4(例如，本发明的犬源化抗人CTLA-4抗体或其抗原结合片段)的如本文讨论的抗体或抗原结合片段。所述结合组合物和/或化疗剂可以配制为纯组合物或与可药用载体组合在药物组合物中。
在一个实施方案中，试剂盒包括本发明的结合组合物(例如，在一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的犬源化鼠抗人CTLA-4抗体(包含SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：46的氨基酸序列)和在另一个容器中(例如，在无菌玻璃或塑料小瓶中)的其药物组合物和/或化疗剂。
在另一个实施方案中，试剂盒包含本发明的组合，其包括结合组合物组分(例如，包含SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：46的氨基酸序列的犬源化抗人CTLA-4抗体)以及可药用载体，任选地与一种或多种治疗剂组分组合，一起任选地在单一的共同容器中配制成药物组合物。
如果试剂盒包括用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则试剂盒还可以包括用于进行这种施用的装置。例如，试剂盒可以包括一个或多个皮下注射针或如上所述的其他注射装置。试剂盒还可以包括包装插页，其包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，这样的信息有助于宠物主人和兽医有效且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，可以在插页中提供关于本发明的组合的以下信息：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告、注意事项、不良反应、过量用药、适当剂量和施用、供应规格、适当储存条件、参考文献、生产商/分销商信息和专利信息。
为了方便起见，本文公开的抗体或特异性结合剂可以在试剂盒中提供，即预定量的试剂与用于进行诊断或检测测定的说明书的包装组合。当抗体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可能包括其它添加剂，比如稳定剂、缓冲剂(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂在溶液中的浓度。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
实施例
实施例1
抗CTLA-4嵌合抗体的构建
认为有可能的是，发现针对人CTLA-4产生的现有技术的单克隆抗体能结合人CTLA-4并阻断人CTLA-4与人CD86的结合，也能结合犬CTLA-4，并且可预期阻断犬CTLA-4与犬CD86的结合。为了测试这种可能性，将对应于抗人CTLA-4单克隆抗体的重链可变区的已知核苷酸序列3B10(如在WO2012120125中公开的)融合到修饰的犬恒定重链(CH1-铰链-CH2-3)的核苷酸序列，以产生嵌合小鼠-犬重链核苷酸序列，命名为SEQ ID NO：1。将编码对应于抗人CTLA-4单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列的第二种已知核苷酸序列融合到犬κ轻链恒定区的核苷酸序列，以产生嵌合的小鼠-犬轻链核苷酸序列，命名为SEQ ID NO：3。由嵌合的鼠-犬重链核苷酸序列编码的蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，由嵌合的鼠-犬轻链核苷酸序列编码的蛋白质包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。使用标准分子生物学技术，将嵌合的人-犬重链和轻链克隆到单独的表达质粒中。将含有重链和轻链基因的质粒转染到HEK293细胞中，并使用蛋白A从HEK293细胞上清液中纯化表达的抗体。
类似地，也如通过重链和轻链与分别在SEQ ID NO：5至8中列出的DNA和氨基酸序列的组合形成的抗体示例的，构建了含有先前在WO2012120125中公开的可变结构域的嵌合抗体8H5。另外，如通过具有如分别在SEQ ID NO：9-20中列出的核酸和氨基酸序列的重链和轻链组合形成的抗体示例的，构建了含有在WO2000037504中公开的可变结构域的嵌合抗体411、418和611。如通过具有分别如SEQ ID NO：21-28中列出的核苷酸和氨基酸序列的重链和轻链组合形成的抗体示例的，还构建了含有U.S.8,017,114B2中公开的可变结构域的嵌合抗体10D1和1E2。此外，构建了含有WO2010097597中公开的可变区的嵌合抗体3B3，如通过具有分别如SEQ ID NO：29-32中列出的核苷酸和氨基酸序列的重链和轻链组合形成的抗体所示例的。嵌合抗体的氨基酸序列识别号提供在下表1中。
表1嵌合抗体的氨基酸序列
实施例2
抗CTLA-4嵌合抗体的反应性
将实施例1的嵌合抗体在Expi293细胞[得自THERMO FISHER的Expi293表达系统]中表达，并用蛋白A柱纯化。然后，通过ELISA对嵌合抗体测试与犬CTLA-4的反应性，如下：
1.在免疫板中包被200ng/孔的CTLA-4，并在4℃下，将所述板孵育过夜。
2.用含有0.05％的吐温20的PBS(PBST)洗涤所述板3次。
3.在室温下，用PBS中的0.5％BSA封闭所述板45-60分钟。
4.用PBST洗涤所述板3次。
5.将稀释板的每列或每行中的抗体三倍稀释。
6.将稀释的抗体转移到免疫板的每列或每行中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
7.用PBST洗涤所述板3次。
8.将1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗犬IgG Fc加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板孵育45-60分钟。
9.用PBST洗涤所述板3次。
10.将TMB底物加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板孵育10至15分钟以显色。
11.将100μL的1.5M磷酸加入到每个孔中以终止反应。
12.使用540nm的参考波长在450nm读板。
ELISA结果描述在图1中，表明所选择的抗体可以结合犬CTLA-4。此外，发现3B10嵌合抗体是该组嵌合抗体中最好的结合剂。
实施例3
犬源化抗人CTLA-4单克隆抗体3B10的构建
确定3B10嵌合抗体对犬CTLA-4具有最强的结合亲和力(参见图1)，选择该嵌合抗体的6个CDR的组加入犬框架中。为了进行犬源化过程，测定了编码犬IgG重链和轻链的DNA序列[参见U.S.10,106,607B2，将其全部内容通过引用并入本文]。犬重链和轻链的DNA和蛋白质序列是本领域已知的，并且可以通过搜索NCBI基因和蛋白质数据库获得。存在狗IgG的四种已知IgG亚型，它们被称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。犬抗体中有两类轻链，称为κ和λ。
表2犬源化抗体中的现有技术CDRS的DNA序列
CDR 核苷酸序列 SEQ ID NO:
H-1 gattataacatggat 47
H-2 aacattaacccgaacagcgaaagcaccagctataaccagaaatttaaaggc 49
H-3 gatggcaaccgctatgatgcgtggtttgcgtat 51
L-1 agcgcgagcagcagcgtgacctatatgcat 53
L-2 agcaccagcattctggcgagc 55
L-3 cagcagcgcaccagctatccgctgacc 57
表31犬源化抗体中的现有技术CDRS的氨基酸序列
不受任何特定方法的束缚，制备犬源化重链和轻链的整个过程可以包括以下方案，所述犬源化重链和轻链可以以不同的组合混合以产生犬源化抗人CTLA-4mAb：
i)鉴定期望的抗CTLA-4mAb的H和L链的CDR。将CDR的氨基酸序列翻译回成合适的DNA序列。
ii)鉴定犬IgG的H和L链(例如，如US10,106,607B2中所述的IgG-B的修饰重链和轻κ链)的合适DNA序列。
iii)鉴定编码上述序列的犬IgG H和L链DNA的内源CDR的DNA序列。
iv)用编码期望的抗人CTLA-4CDR的DNA序列替换编码内源犬H和L链CDR的DNA序列。当使用修饰的犬IgG B时，如先前在U.S.10,106,607B2(将其全部内容并入本文)中所述，在犬IgG B中进行如SEQ ID NO：69中编号的D31A和N63A的修饰。此外，用编码来自期望的抗人CTLA-4mAb犬区域的选定氨基酸残基的DNA任选地替换编码一些犬框架氨基酸残基的DNA。这个过程被称为回复突变。开发了表4和5中列出的用于每个重链的两组四个变体和用于轻链可变区的一组三个
变体，其中组中的每个变体含有不同的回复突变位点。
v)合成步骤(iv)的DNA，并将其克隆到合适的表达质粒中。
vi)将含有期望的犬源化H和L链的质粒转染到HEK293细胞中。
vii)从HEK293上清液中纯化表达的犬源化抗体。
viii)测试纯化的犬源化抗体与犬CTLA-4的结合。
开发了一组犬源化的H和L链序列。SEQ ID NO：列在下表4和5中。
表4犬源化3B10重链的SEQ ID NO.
表5犬源化3B10轻链的SEQ ID NO.
犬源化轻链 SEQ ID NO:核酸 SEQ ID NO:氨基酸
3B10 VL1 41 42
3B10VL2 43 44
3B10VL3 45 46
本发明提供犬源化抗体，其通过上表4和5中列出的犬源化重链与轻链的任何组合形成。接着，在Expi293细胞中表达抗体，然后纯化。图2中显示的ELISA结果证实3B10已经成功犬源化，3B10L3H2、3B10L3H3和3B10L3H4都具有与3B10的亲本小鼠-犬嵌合抗体相似的紧密结合活性。
实施例4
嵌合的和犬源化抗体3B10对犬CD86和CTLA-4相互作用的阻断活性
为了确保犬源化3B10抗体保持如亲本抗体的对犬CTLA-4的中和活性，通过ELISA测试犬源化抗体对犬CD-80和犬CTLA-4相互作用的阻断活性，如下：
1.在免疫板中包被200ng/孔的CTLA-4，并在4℃下，将所述板孵育过夜。
2.用含有0.05％的吐温20的PBS(PBST)洗涤所述板3次。
3.在室温下，用PBS中的0.5％BSA封闭所述板45-60分钟。
4.用PBST洗涤所述板3次。
5.将稀释板的每列或每行中的抗体三倍稀释，然后加入100ng/孔生物素化的CD86，并与抗体混合。
6.将稀释的抗体和CD-86混合物转移到免疫板的每列或每行中，并在室温下，将所述板培养45-60分钟。
7.用PBST洗涤所述板3次。
8.将1:2000稀释的辣根过氧化物酶结合的链亲和素加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板培养45-60分钟。
9.用PBST洗涤所述板3次。
10.将TMB底物加入所述板的每个孔中，并在室温下，将所述板培养10至15分钟以允许显色。
11.将100μL的1.5M磷酸加入到每个孔中以终止反应。
12.使用540nm的参考波长在450nm读板。
描绘在图3中的ELISA板的结果图表明犬源化3B10变体具有与亲本3B10类似的阻断活性。
实施例5
嵌合抗体活化的犬PBMC的IFNγ生成引言：
干扰素-γ(IFN-γ；也称为II型干扰素)主要由活化的T淋巴细胞和可能地由自然杀伤细胞产生。这一特性通过在基于ELISA上定量检测IFN-γ产生而广泛用作T细胞活化的指征。为了鉴定CTLA-4的功能性抗体(抗CTLA-4抗体)，使用以下方案对选择的抗体测试其刺激犬外周血单核细胞上IFN-γ产生的活性。
实验和结果
犬外周血单核细胞的分离：
1.将～20mL的全血收集在EDTA或肝素钠试管中。
2.将血液转移到50mL的聚苯乙烯管中，并用Hank's平衡盐溶液(HBSS)稀释50:50。
3.将15mL的Ficoll-Plaque加入到四个×50mL SepMateTM管中。然后，缓慢地加入～10mL的50:50稀释的血液，并加入到每个含Ficoll的SepMateTM管的侧面。
4.以1200×g离心管20分钟。
5.从梯度界面收获细胞，并将细胞转移至50mL的聚丙烯管。将HBSS加入40-45mL的标记物，并将细胞以800×g离心10分钟。
6.弃去上清液，将细胞再悬浮在40-45mL的HBSS中，并将管再次以800x g离心10分钟。
7.弃去上清液，用2mL的犬淋巴细胞培养基(来自同一动物的合并细胞)再悬浮来自各管的细胞。
8.取小等份细胞悬浮液，将其与0.04％的锥虫蓝混合，并计数细胞数目。
9.将细胞悬浮液储存在2-7℃下直到使用[但在使用前不超过24小时。]
犬外周血单核细胞的细胞增殖测定：
1.将抗体稀释在犬淋巴细胞培养基[RPMI培养基，购自LONZA，目录号12-167Q，或等同物]中，得到40μg/mL的终浓度(制备160μg/mL)，并使用0.2μm针筒式过滤器将其灭菌。将两倍稀释的抗体置于无菌稀释板下，然后将它们放在一边。
2.将细胞在犬淋巴细胞培养基中稀释至2.5×106个细胞/mL，并以100μL/孔分配到整个96孔组织培养板中。
3.将Con A稀释在犬淋巴细胞培养基中，得到终浓度250ng/mL(制备的1000ng/mL)，使用0.2μm针筒式过滤器将其灭菌，并将50μL加入所有孔中。(注意-对于仅有细胞的对照，没有将Con A加到八个孔的一列，预期对于细胞+仅mAb的对照，也没有加到八个孔的一列)。
4.将100μL/孔犬淋巴细胞培养基加入到仅有细胞的孔中，并将
50μL培养基加入到含Con A的对照孔(Con A+细胞，无mAb处理)的柱中。
5.向一式两份孔中加入50μL稀释的mAb。
6.在湿润的培养箱中，在36±2℃、4.0-6.0％CO2下孵育所述板68至124小时。
IFN-γELISA:
1.在68-124小时孵育后，将所述板以800×g离心10分钟。
2.从各孔收集上清液并合并重复。可以将这些样品在≤-50℃下冷冻供随后使用或立即测试。
3.如果需要，适当稀释上清液样品，并根据犬IFN-γQuantikinTM
ELISA试剂盒的说明书[R&D Systems目录号CAIF00]ELISA。
图4中提供的结果证实测试的嵌合抗体，尤其是3B10、411和611，显著地活化犬T细胞产生IFN-γ。
实施例6
犬源化3B10抗体的表位定位
通过化学交联和质谱对犬CTLA-4(NCBI参考序列：NP_001003106；SEQ ID NO：68)上的犬源化抗体3B10L3H2的结合表位进行定位。结果显示所述抗体结合抗原CTLA-4上的两个分开的线性区域，包括氨基酸R33、R38、S42、T45、R83、T87、Y90、K93和Y98(参见图5)。在图5中，犬源化抗体3B10L3H2结合的CTLA-4的非连续表位的氨基酸残基显示为由两个线性部分组成，分别为氨基酸残基30至50和氨基酸残基80至100。
序列
SEQ ID NO:1:嵌合小鼠-犬重链DNA(3B10)：
SEQ ID NO:2:嵌合小鼠-犬重链氨基酸序列(3B10)：
SEQ ID NO:3:嵌合小鼠-犬轻链DNA(3B10)：
SEQ ID NO:4:嵌合小鼠-犬轻链氨基酸序列(3B10)：
SEQ ID NO:5:嵌合小鼠-犬重链DNA(8H5)：
SEQ ID NO:6.嵌合小鼠-犬重链氨基酸序列(8H5)：
SEQ ID NO:7:嵌合小鼠-犬轻链DNA(8H5)：
SEQ ID NO:8:嵌合小鼠-犬轻链氨基酸序列(8H5)：
SEQ ID NO:9:嵌合人-犬重链DNA(411)
SEQ ID NO:10:嵌合人-犬重链氨基酸序列(411)：
SEQ ID NO:11.嵌合人-犬轻链DNA(411)：
SEQ ID NO:12:嵌合人-犬轻链氨基酸序列(411)：
SEQ ID NO:13.嵌合人-犬重链DNA(418)：
SEQ ID NO:14.嵌合人-犬重链氨基酸序列(418)：
SEQ ID NO:15嵌合人-犬轻链DNA(418)：
SEQ ID NO:16.嵌合人-犬轻链氨基酸序列(418)：
SEQ ID NO:17.嵌合人-犬重链DNA(611)：
SEQ ID NO:18:嵌合人-犬重链氨基酸序列(611)：
SEQ ID NO:19:嵌合人-犬轻链DNA(611)
SEQ ID NO:20.嵌合人-犬轻链氨基酸序列(611)：
SEQ ID NO:21.嵌合人-犬重链DNA(10D1)：
SEQ ID NO:22.嵌合人-犬重链氨基酸序列(10D1)：
SEQ ID NO:23.嵌合人-犬轻链DNA(10D1)：
SEQ ID NO:24.嵌合人-犬轻链氨基酸序列(10D1)：
SEQ ID NO:25.嵌合人-犬重链DNA(1E2)：
SEQ ID NO:26.嵌合人-犬重链氨基酸序列(1E2)
SEQ ID NO:27:嵌合人-犬轻链DNA(1E2)：
SEQ ID NO:28:嵌合人-犬轻链氨基酸序列(1E2)：
SEQ ID NO:29:嵌合小鼠-犬重链DNA(3B3)：
SEQ ID NO:30.嵌合小鼠-犬重链氨基酸序列(3B3)：
SEQ ID NO:31:嵌合小鼠-犬轻链DNA(3B3)：
SEQ ID NO:32:嵌合小鼠-犬轻链氨基酸序列(3B3)：
SEQ ID NO:33:犬源化3B10重链DNA(VH1)
SEQ ID NO:34.犬源化3B10重链氨基酸序列(VH1)
SEQ ID NO:35:犬源化3B10重链DNA(VH2)
SEQ ID NO:36:犬源化3B10重链氨基酸序列(VH2)
SEQ ID NO:37:犬源化3B10重链DNA(VH3)
SEQ ID NO:38.犬源化3B10重链氨基酸序列(VH3)
SEQ ID NO:39:犬源化3B10重链DNA(VH4)
SEQ ID NO:40:犬源化3B10重链氨基酸序列(VH4)
SEQ ID NO:41:犬源化3B10轻链DNA(VL1)
SEQ ID NO:42:犬源化3B10轻链氨基酸序列(VL1)
SEQ ID NO:43:犬源化3B10轻链DNA(VL2)
SEQ ID NO:44:犬源化3B10轻链氨基酸序列(VL2)
SEQ ID NO:45:犬源化3B10轻链DNA(VL3)
SEQ ID NO:46:犬源化3B10轻链氨基酸序列(VL3)
SEQ ID NO:59:犬源化3B10重链IgGBm DNA(VH1)
SEQ ID NO:60:犬源化3B10重链IgGBm氨基酸序列(VH1)
SEQ ID NO:61:犬源化3B10重链IgGBm DNA(VH2)
SEQ ID NO:62:犬源化3B10重链IgGBm氨基酸序列(VH2)
SEQ ID NO:63:犬源化3B10重链IgGBm DNA(VH3)
SEQ ID NO:64:犬源化3B10重链IgGBm氨基酸序列(VH3)
SEQ ID NO:65:犬源化3B10重链IgGBm DNA(VH4)
SEQ ID NO:66:犬源化3B10重链氨基酸IgGBm序列(VH4)
SEQ ID NO:67:犬CTLA-4NA序列(NCBI参考序列：NP_001003106)
ATGGCGGGCTTTGGCTTTCGCCGCCATGGCGCGCAGCCGGATCTGGCGAGCCGCACCTGGCCGTGCACCGCGCTGTTTAGCCTGCTGTTTATTCCGGTGTTTAGCAAAGGCATGCATGTGGCGCAGCCGGCGGTGGTGCTGGCGAGCAGCCGCGGCGTGGCGAGCTTTGTGTGCGAATATGGCAGCAGCGGCAACGCGGCGGAAGTGCGCGTGACCGTGCTGCGCCAGGCGGGCAGCCAGATGACCGAAGTGTGCGCGGCGACCTATACCGTGGAAGATGAACTGGCGTTTCTGGATGATAGCACCTGCACCGGCACCAGCAGCGGCAACAAAGTGAACCTGACCATTCAGGGCCTGCGCGCGATGGATACCGGCCTGTATATTTGCAAAGTGGAACTGATGTATCCGCCGCCGTATTATGTGGGCATGGGCAACGGCACCCAGATTTATGTGATTGATCCGGAACCGTGCCCGGATAGCGATTTTCTGCTGTGGATTCTGGCGGCGGTGAGCAGCGGCCTGTTTTTTTATAGCTTTCTGATTACCGCGGTGAGCCTGAGCAAAATGCTGAAAAAACGCAGCCCGCTGACCACCGGCGTGTATGTGAAAATGCCGCCGACCGAACCGGAATGCGAAAAACAGTTTCAGCCGTATTTTATTCCGATTAAC
SEQ ID NO:68:犬CTLA-4AA序列(NCBI参考序列：NP_001003106).
MAGFGFRRHGAQPDLASRTWPCTALFSLLFIPVFSKGMHVAQPAVVLASSRGVASFVCEYGSSGNAAEVRVTVLRQAGSQMTEVCAATYTVEDELAFLDDSTCTGTSSGNKVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLITAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN
SEQ ID NO:69:犬IgG B的遗传修饰的cFc区域(来自U.S.10,106,107B2)
LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
在所有前述核苷酸序列中，可变区以粗体表示，而在相应的氨基酸序列中，可变区的序列以粗体表示，CDR以下划线和粗体表示。
优选的实施方式：
1.一种特异性结合犬CTLA-4的分离的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含犬IgG重链和犬κ轻链；其中所述犬κ轻链包含三个轻链互补决定区(CDR)：CDR轻链1(CDRL1)、CDR轻链2(CDRL2)和CDR轻链3(CDRL3)；所述犬IgG重链包含三个重链CDR：CDR重链1(CDRH1)、CDR重链2(CDRH2)和CDR重链3(CDRH3)：
(a)其中CDRL1包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列；
(b)其中CDRL2包含含有SEQ ID NO：56的氨基酸序列；
(c)其中CDRL3包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列；
(d)其中CDRH1包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列；
(e)其中CDRH2包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列；和
(f)其中CDRH3包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
2.项目1的分离的犬源化抗体，其中所述犬IgG重链包含选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66。
3.项目1或2的分离的犬源化抗体，其中所述κ轻链包含选自SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：44和SEQ ID NO：46的氨基酸序列。
4.项目1的分离的犬源化抗体，其中所述犬IgG重链包含SEQID NO：36的氨基酸序列并且所述犬κ轻链包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列。
5.项目1的分离的犬源化抗体，其中所述犬IgG重链包含SEQID NO：62的氨基酸序列并且所述犬κ轻链包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列。
6.一种分离的核酸，其编码项目1、2、3、4或5的犬源化抗体的犬κ轻链。
7.一种分离的核酸，其编码项目1、2、3、4或5的犬源化抗体的犬IgG重链。
8.表达载体，其包含项目6或7的分离的核酸。
9.宿主细胞，其包含一种或多种项目8的表达载体。
10.药物组合物，其包含项目1、2、3、4或5的抗体和可药用载体或稀释剂。
11.一种增加免疫细胞的活性的方法，其包括向需要其的受试者施用治疗有效量的项目10的药物组合物。
12.项目11的方法，其中所述方法用于：
a)治疗癌症；
b)治疗感染或感染性疾病；或
c)作为疫苗佐剂。
13.一种产生特异性结合CTLA-4的犬源化抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
a.在其中表达核酸的条件下在培养基中培养项目9的宿主细胞，从而产生包含轻链和重链可变区的多肽；以及
b.从宿主细胞或培养基回收所述多肽。

Claims (14)

1.一种核酸，其包含选自SEQ ID NO:1、33、35、37、39、59、61、63和65的第一编码序列。
2.一种核酸，其包含选自SEQ ID NO:3、41、43和45的第二编码序列。
3.一种核酸，其包含权利要求的第一编码序列和权利要求2的第二编码序列。
4.一种核酸，其包含：
(a)SEQ ID NO:1的第一编码序列和SEQ ID NO:3的第二编码序列；
(b)SEQ ID NO:33的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(c)SEQ ID NO:33的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(d)SEQ ID NO:33的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(e)SEQ ID NO:35的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(f)SEQ ID NO:35的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(g)SEQ ID NO:35的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(h)SEQ ID NO:37的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(i)SEQ ID NO:37的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(j)SEQ ID NO:37的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(k)SEQ ID NO:39的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(l)SEQ ID NO:39的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(m)SEQ ID NO:39的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(n)SEQ ID NO:59的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(o)SEQ ID NO:59的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(p)SEQ ID NO:59的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(q)SEQ ID NO:61的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(r)SEQ ID NO:61的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(s)SEQ ID NO:61的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(t)SEQ ID NO:63的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(u)SEQ ID NO:63的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；
(v)SEQ ID NO:63的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列；
(w)SEQ ID NO:65的第一编码序列和SEQ ID NO:41的第二编码序列；
(x)SEQ ID NO:65的第一编码序列和SEQ ID NO:43的第二编码序列；或
(y)SEQ ID NO:65的第一编码序列和SEQ ID NO:45的第二编码序列。
5.一种特异性结合犬CTLA-4的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链；其中：
(a)所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(b)所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(c)所述重链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(d)所述重链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(e)所述重链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(f)所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(g)所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(h)所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(i)所述重链包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(j)所述重链包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(k)所述重链包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(l)所述重链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(m)所述重链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(n)所述重链包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(o)所述重链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(p)所述重链包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(q)所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(r)所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；
(s)所述重链包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(t)所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(u)所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列；或
(v)所述重链包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
6.一种特异性结合犬CTLA-4的嵌合犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链；其中所述重链包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
7.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的核酸和可药用载体或稀释剂。
8.药物组合物，其包含权利要求5或6的抗体和可药用载体或稀释剂。
9.表达载体，其包含权利要求1-4中任一项的核酸。
10.宿主细胞，其包含一种或多种权利要求1-4中任一项的核酸或者一种或多种权利要求9的表达载体。
11.一种产生特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(a)在其中表达核酸的条件下在培养基中培养权利要求10的宿主细胞，从而产生一种或多种多肽；以及
(b)从宿主细胞或培养基回收所述多肽。
12.权利要求11的方法，其中所述特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段是犬源化抗体或嵌合抗体。
13.权利要求11或12的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合犬CTLA-4。
14.权利要求7或8的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于增加需要其的受试者中免疫细胞的活性。
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