ES2692519T3

ES2692519T3 - Método para tratar trastornos metabólicos

Info

Publication number: ES2692519T3
Application number: ES12736001.4T
Authority: ES
Inventors: Jerome FEIGE; David Glass; Shinji Hatakeyama; Brian Peter Richardson; Estelle Trifilieff
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: SI2726099T1; EP2726099A1; PL2726099T3; HUE040276T2; PT2726099T; JP2019059749A; JP2014523902A; DK2726099T3; US20140328848A1; US9365651B2; WO2013006437A1; EP2726099B1; JP6472999B2

Abstract

Una composición que comprende un anticuerpo antagonista que se une a ActRIIB para uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un sujeto, en la que el anticuerpo anti-ActRIIB aumenta el tejido adiposo marrón sin aumentar los niveles de glóbulos rojos en dicho sujeto y en el que el anticuerpo anti-ActRIIB comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 79 en la que el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, lipodistrofia, tolerancia alterada a la glucosa, concentración elevada de insulina en plasma, resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipertensión, enfermedad cardiovascular.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para tratar trastornos metabolicos Campo tecnico de la invencion

Esta invencion se encuentra en el campo de los anticuerpos anti-receptor de Activina IIB (ActRIIB). En particular, se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos anti-ActRIIB y su uso para aumentar la grasa marron en vertebrados, incluidos roedores y primates, y particularmente en humanos sin afectar significativamente a los parametros hematologicos.

Antecedentes de la invencion

Se pueden distinguir dos tipos de tejido adiposo que tienen caracteristicas y funciones muy distintas: tejido adiposo blanco (WAT) que almacena energia principalmente como trigliceridos en distintas ubicaciones anatomicas y tejido adiposo marron (BAT) especializado en gasto de energia basal e inducible a traves de la produccion de calor. BAT y WAT son distintos desde el punto de vista anatomico, histologico y funcional. Hasta hace poco, el tejido adiposo marron (BAT) se consideraba de importancia metabolica solo en mamiferos pequenos y recien nacidos humanos, ya que se pensaba que desaparecia rapidamente despues del nacimiento en humanos. Sin embargo, el tejido adiposo marron funcional se ha identificado y caracterizado en humanos adultos promoviendo un renovado interes en la termogenesis no temblorosa y el desarrollo de perspectivas futuras dirigidas a BAT para el tratamiento farmacologico de la obesidad y las enfermedades metabolicas.

La ultima decada ha sido testigo de un resurgimiento profundo en la investigacion del BAT con un claro enfasis en humanos adultos. La necesidad de un aumento tan dramatico se deriva de la tendencia cada vez mayor hacia la obesidad humana global. De hecho, actualmente se estima que las tasas de obesidad en los paises desarrollados, como los Estados Unidos, superan el 35% de la poblacion (Flegal, et al. 2010). La mayor incidencia de obesidad se asocia con una mayor prevalencia del Sindrome Metabolico, que incluye diabetes, hipertension y enfermedad coronaria, entre otros (Alberti, et al. 2009, Bruce y Hanson 2010). BAT es una gran promesa en la lucha contra la obesidad dada su capacidad metabolica sin precedentes. Aunque varios estudios anatomicos iniciales sugirieron que el tejido adiposo marron esta presente en humanos adultos (Astrup, et al. 1985), se creia que su relevancia fisiologica era marginal. Estudios controlados recientes demostraron que el BAT funcional es detectable en humanos adultos flacos, obesos y morbidamente obesos despues de la exposicion a un frio leve (Saito, et al. 2009, van Marken Lichtenbelt, et al. 2009, Vijgen, et al. 2011, Virtanen, et al. 2009). La actividad del BAT inducida por frio esta inversamente relacionada con el indice de masa corporal (IMC) y el porcentaje de grasa corporal (% de BF) (van Marken Lichtenbelt, et al. 2009, Saito, et al. 2009, Virtanen, et al. 2009, Yoneshiro, et al., Obesity, Vol. 19, No.1, enero de 2011). Se han reportado dos tipos de celulas de grasa marron: celulas de grasa marron que se originan en celulas progenitoras Myf5+ comunes a las celulas musculares y ejemplificadas por celulas grasas marron en lugares clasicos tales como celulas interescapulares y de grasa parda intercaladas en WAT derivadas de otro linaje y podria surgir de una celula precursora dormida o de una transdiferenciacion de la grasa blanca (Perwitz, et al. 2010, Seale, et al. 2008).

El fenotipo termogenico del BAT se confiere esencialmente al desacoplar la proteina 1 (UCP1). UCP1 desacopla la sintesis de adenosina-5'-trifosfato (ATP) a partir de la oxidacion del sustrato en adipocitos marrones.

El tejido adiposo marron (BAT) es el principal sitio para la termogenesis inducida por frio y por dieta, lo que contribuye significativamente al control de la temperatura corporal y el gasto de energia, al menos en pequenos roedores como el raton, la rata y el hamster (Cannon y Nedergaard 2004), (Klingenspor 2003), (Himms-Hagen 1990). En los seres humanos, el BAT esta presente en los recien nacidos, pero desaparece rapidamente durante los periodos postnatales y, en los adultos, es bastante dificil de identificar mediante examenes anatomicos convencionales.

El tejido adiposo marron tiene una absorcion muy alta de glucosa por gramo de tejido, lo que significa que a pesar de que la cantidad total de tejido adiposo marron en el cuerpo no sea grande, puede ser potencialmente un organo significativo para eliminar la glucosa. Las condiciones fisiologicas en las que los niveles de insulina en plasma estan elevados muestran un aumento de la absorcion de glucosa en el tejido adiposo marron. El tejido adiposo marron es uno de los tejidos mas sensibles a la insulina con respecto a la estimulacion de la absorcion de glucosa (Cannon, Barbara y Jan Nedergaard. Brown Adipose Tissue: Function and Physiological Significance; Physiol Rev 84: 277359, 2004). Debido a la importancia del tejido adiposo marron como sumidero para la absorcion de glucosa, la manipulacion del BAT abre nuevas oportunidades para el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades metabolicas como la obesidad y la diabetes tipo 2 (Kajimura et al., Nature 460, 1154-1158, 2009).

Se ha descubierto que la formacion y/o actividad de adipocitos marrones termogenicos se incremento en tejido de grasa blanca de ratones tratados con antagonistas de ActRIIB (documento WO2010144452 o US201310577). Sin embargo, tambien se ha descubierto que el tratamiento con antagonistas de ActRIIB, por ejemplo, proteinas ActRIIB solubles produce cambios hematologicos estadisticamente significativos, que incluyen niveles elevados de reticulocitos y valores amplios de distribucion de globulos rojos. El aumento excesivo en los niveles de globulos rojos o niveles amplios de hemoglobina en las celulas o los niveles de hematocrito pueden (i) causar aumentos en la

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presion arterial, (ii) disminuir la velocidad de la sangre y (iii) aumentar el riesgo de sedimentacion, trombosis o accidente cerebrovascular. En consecuencia, se ha recomendado restringir la dosificacion de antagonistas de ActRIIB a pacientes que tienen parametros hematologicos apropiados o pacientes que tienen tanto anemia como perdida muscular (documento WO/2009/158025). Ademas, se ha desarrollado un metodo para tratar a los pacientes tratados con un antagonista de ActRIIB, que comprende controlar los parametros hematologicos que se correlacionan con el aumento de los niveles de globulos rojos (documento WO2009/158025). En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar metodos novedosos para el tratamiento de trastornos metabolicos como el sindrome metabolico, la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes mellitus tipo 2 y/o el aumento del tejido adiposo marron (BAT) en un paciente sin inducir cambios hematologicos significativos en dicho sujeto.

Sumario de la invencion

Existe la necesidad de desarrollar nuevas composiciones farmaceuticas y metodos para el tratamiento de trastornos metabolicos como el sindrome metabolico, la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes mellitus tipo 2 y/o el aumento del tejido adiposo marron (BAT) en un paciente sin inducir cambios hematologicos significativos en dicho sujeto. Este objetivo se logra mediante los metodos y composiciones proporcionados dentro de esta divulgacion.

Un primer objetivo de la divulgacion se refiere por lo tanto a una composicion que comprende un anticuerpo antagonista que se une a ActRIIB para uso en el tratamiento de un trastorno metabolico en un sujeto, donde el anticuerpo anti-ActRIIB aumenta el tejido adiposo marron sin aumentar los niveles de globulos rojos en dicho sujeto y en donde el anticuerpo anti-ActRIIB se une a un dominio de union que consiste en los aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181 (SEQ ID NO: 182); y donde el trastorno metabolico se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes tipo 2, sindrome metabolico, lipodistrofia, tolerancia alterada a la glucosa, concentracion elevada de insulina en plasma, resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertension, enfermedad cardiovascular y afecciones respiratorias.

Las composiciones divulgadas tambien son adecuadas para tratar a un sujeto que padece un trastorno metabolico y muscular. En una realizacion, el trastorno muscular es una atrofia muscular seleccionada del grupo que consiste en sarcopenia asociada a la obesidad, sarcopenia o atrofia muscular asociada a la diabetes.

En otra realizacion, la composicion comprende un anticuerpo anti-ActRIIB que se une a un dominio de union que consiste en los aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181 (SEQ ID NO: 182), o a un epitopo que comprende o que consiste en (a) aminoacidos 78-83 de la SEQ ID NO: 181 (WLDDFN - SEQ ID NO: 188); (b) aminoacidos 76-84 de la SEQ ID NO: 181 (GCWLDDFNC - SEQ ID NO: 186); (c) aminoacidos 75-85 de la SEQ ID NO: 181 (KGCWLDDFNCY - SEQ ID NO: 190); (d) aminoacidos 52-56 de la SEQ ID NO: 181 (EQDKR - SEQ ID NO: 189); (e) aminoacidos 49-63 de la SEQ ID NO: 181 (CEGEQDKRLHCYASW - SEQ ID NO: 187); (f) aminoacidos 29-41 de la SEQ ID NO: 181 (CIYYNANWELERT - SEQ ID NO: 191); (g) aminoacidos 100 - 110 de la SEQ ID NO: 181 (YFCCCEGNFCN - SEQ ID NO: 192); o (h) aminoacidos 78-83 de la SEQ ID NO: 181 (WLDDFN) y aminoacidos 5256 de la SEQ ID NO: 181 (EQDKR).

En aun otra realizacion alternativa, las composiciones mencionadas anteriormente comprenden un anticuerpo anti- ActRIIB que se une a ActRIIB con una afinidad 10 veces o mayor que con la que se une a ActRIIA.

Ademas, la divulgacion se refiere a una composicion en la que el anticuerpo anti-ActRIIB comprende una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-14; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-28; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 43-56; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 57-70; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 71-84.

En ciertas realizaciones, la divulgacion proporciona composiciones en las que el anticuerpo anti-ActRIIB comprende: (a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 15; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 29; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 43; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 57; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 71, (b) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 2; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 16; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 30; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 44; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 58; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 72, (c) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 31; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 45; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 59; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 73, (d)

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una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 32; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 46; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 60; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 74, (e) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 5; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 33; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 61; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 75, (f) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 6; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 20; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 48; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 76, (g) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 21; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 35; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 49; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 63; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 77, (h) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 22; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 36; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 50 una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 78, (i) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 79, (j) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 10; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 24; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 38; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 66; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 80, (k) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 25; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 39; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 53; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 81, (I) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 26; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 40; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 54; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 68; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 82, (m) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 13; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 27; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 41; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 55; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 69; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 83, o (n) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 28; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 42; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 56; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 70; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 84.

En aun otra realizacion, el anticuerpo anti-ActRIIB mencionado anteriormente comprende (i) una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de longitud completa que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 146 -150 y 156-160, (ii) una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de longitud completa que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 141-145 y 151-155 o (iii) (a) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 99 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 85; (b) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 100 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 86; (c) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 101 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 87; (d) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 102 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 88; (e) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 89; (f) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 104 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 90; (g) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 105 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91; (h) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 106 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 92; (i) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 107 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 93; (j) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 108 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 94; (k) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 109 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 95; (I) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 110 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 96; (m) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 111 y la secuencia de la cadena

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ligera variable de la SEQ ID NO: 97; o (n) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 112 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 98.

En ciertos aspectos, la divulgacion se refiere a las composiciones descritas anteriormente, en donde el anticuerpo anti-ActRIIB comprendido comprende (a) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 146 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 141; (b) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 147 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 142; (c) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 148 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 143; (d) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 149 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 144; (e) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 150 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 145; (f) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 156 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 151; (g) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 157 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 152; (h) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 158 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 153; (i) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 159 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 154; o (j) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 160 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 155.

Un objetivo adicional de la divulgacion se refiere a la composicion, donde (i) el anticuerpo anti-ActRIIB bloquea en forma cruzada o es bloqueado en forma cruzada por uno de los anticuerpos descritos anteriormente, (ii) tiene una funcion efectora alterada a traves de la mutacion de la region Fc y/o (iii) se une a un epitopo reconocido por uno de los anticuerpos descritos anteriormente.

En aun otra realizacion, la composicion divulgada comprende un anticuerpo anti-ActRIIB codificado por pBW522 (DSM22873) o pBW524 (DSM22874).

Ademas, la divulgacion proporciona un metodo para disminuir la concentracion promedio de glucosa en plasma en un sujeto mientras no aumenta los niveles de globulos rojos y/o sin producir un cambio clinicamente inaceptable en los niveles de hematocrito u otros parametros sanguineos, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une a ActRIIB. En ciertos aspectos, la concentracion promedio de glucosa en plasma se detecta midiendo los niveles de hemoglobina glicada (hemoglobina glicosilada).

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para tratar un trastorno metabolico, como los descritos anteriormente, en un sujeto, en el que el sujeto padece un trastorno metabolico y un trastorno muscular. En otra realizacion, el trastorno muscular mencionado anteriormente es una atrofia muscular seleccionada del grupo que consiste en sarcopenia asociada a la obesidad, sarcopenia, o atrofia muscular asociada a la diabetes.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: El receptor de activina IIB inhibe la diferenciacion de los adipocitos marrones primarios. Los preadipocitos marrones primarios aislados de tejido adiposo marron interescapular de raton se diferenciaron durante 9 dias utilizando un medio adipogenico clasico (AM) que contiene insulina y hormona tiroidea para todo el protocolo e IBMX, 3-isobutil-1-metilxantina, dexametasona e indometacina por los primeros dos dias. Medio adipogenico (AM), AM + miostatina (Mstn; 10 ng/mL), un anticuerpo monoclonal contra el receptor de activina IIB (AM + MOR08159 (anticuerpo que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 146 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 141), 10 pg/mL) o una combinacion de ambos (AM + MOR08159 + Mstn); se anadio al medio adipogenico y medio fresco y los tratamientos se reemplazaron cada 2 dias. El nivel de diferenciacion se evaluo midiendo la expresion de ARNm de marcadores clasicos de grasa marron como UCP1 de 2 cultivos independientes para cada condicion (PRDM16: dominio PR que contiene 16, PGC-1a/b: receptor activado proliferativo de peroxisoma, gamma, coactivador 1 alfa).

Figura 2: la inhibicion de ActRIIB en ratones aumenta la cantidad de grasa marron pero no la blanca. Se trataron ratones SCID (deficiencia combinada/inmunologica severa) (n = 12/grupo) durante 4 semanas con una inyeccion subcutanea semanal de anticuerpo de control (IgG1; 20 mg/kg/semana) o cantidades crecientes de un anticuerpo monoclonal humano contra ActRIIB (MOR08159; 2, 6 y 20 mg/kg/semana). Se midio la masa humeda del musculo gastrocnemio, el tejido adiposo marron interescapular (BAT) y el tejido adiposo blanco epididimal (WAT) y se expreso como un cambio porcentual respecto del promedio del grupo de control.

Figura 3: la inhibicion de ActRIIB aumenta la tolerancia al frio. La tolerancia al frio se evaluo colocando ratones C57BL6/J (n = 11/grupo) que habian sido tratados durante 3 semanas con una inyeccion subcutanea semanal de vehiculo o una variante de raton del anticuerpo monoclonal contra ActRIIB (anticuerpo quimerico que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 194 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 193, 20 mg/kg/semana) a 10°C durante 4 h y midiendo la temperatura corporal rectal cada hora.

Figura 4: la inhibicion de ActRIIB aumenta la respiracion celular de la grasa marron. Los adipocitos marrones primarios se diferenciaron y trataron como se describe en la figura 1 (n = 10-20 por condicion) y la tasa de consumo de oxigeno se midio en condiciones basales o en presencia de 2,5 pg/mL de oligomicina (desacoplada) o FCCP final 500 nM (carbonilcianuro-p-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona) (maxima).

Definiciones generales

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Para que la presente invencion se pueda entender mas facilmente, primero se definen ciertos terminos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.

El termino "que comprende" significa "que incluye", por ejemplo, una composicion que "comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

El termino "aproximadamente" en relacion con un valor numerico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

El termino "cambios hematologicos" se refiere a cambios en los parametros hematologicos como los niveles de globulos rojos (RBC: conteo absoluto de globulos rojos), ancho de distribucion de globulos rojos (RDW) o concentracion media de hemoglobina corpuscular (MCHC). En una realizacion preferida, el termino se refiere a un aumento de al menos uno de los parametros mencionados anteriormente. En otras palabras, los "cambios hematologicos" en el contexto de la ensenanza divulgada se refieren al hecho de que el tratamiento de un sujeto con las composiciones divulgadas no conduce a un aumento estadisticamente significativo en RBC, RDW y/o MCHC en dicho sujeto. Los valores de RBC, RDW y/o MCHC pueden determinarse usando metodos reconocidos en la tecnica. El experto en la materia conoce el recuento de globulos rojos fisiologicamente normales. Los niveles de RBC se pueden determinar contando los globulos rojos (usando el contador Coulter comercialmente disponible), mediante mediciones del nivel de hemoglobina o de hematocrito. El hematocrito (Hct) o volumen de celulas empaquetadas (PCV) se refiere a la relacion entre el volumen de globulos rojos y el volumen de sangre total. El hematocrito se puede determinar, por ejemplo, mediante centrifugacion de una muestra de sangre seguida de analisis de las capas producidas. Los intervalos fisiologicos normales de hematocrito para hombres y para mujeres son conocidos por los expertos en la materia.

Los niveles de hematocrito en el cuerpo del animal humano o mamifero son principalmente un porcentaje de los globulos rojos en una cierta cantidad de plasma. Por ejemplo, cuando se realiza una prueba de sangre, las lecturas se mostraran en el informe del analisis de sangre como niveles de HCT del 40%. Esto es indicativo del hecho de que por cada 100 mililitros de sangre en el cuerpo del paciente, aproximadamente 40 mililitros de este son principalmente globulos rojos. Los niveles de hemoglobina se pueden determinar mediante la lisis de los globulos rojos y la conversion de la hemoglobina en cianometahemoglobina y la medicion de la hemoglobina con un colorimetro. El experto en la materia conoce los niveles fisiologicamente normales de hemoglobina en hombres y mujeres adultos.

La frase "no aumento de los niveles de globulos rojos" o "sin aumento de los niveles de globulos rojos" en un sujeto se refiere a una afeccion en la que el nivel de globulos rojos (por ejemplo, RBC), hematocrito o hemoglobina no aumenta significativamente en comparacion con el nivel de globulos rojos, hematocritos o hemoglobina en dicho paciente antes de un tratamiento de dosis unica o multiple hasta tres meses despues del inicio del tratamiento. En consecuencia, un aumento en los niveles de globulos rojos daria lugar a cambios clinicamente inaceptables en el hematocrito u otro nivel de parametros sanguineos en un sujeto.

"No aumento de los niveles de globulos rojos" o "sin aumento de los niveles de globulos rojos" en un sujeto con niveles de globulos rojos aceptables o normales tambien se refiere a una condicion en la que los niveles de globulos rojos, hematocrito o hemoglobina no aumentan mas alla del intervalo aceptado o normal. Los niveles normales de hematocrito en ninos a la edad de aproximadamente 10 anos estaran entre aproximadamente 36 y aproximadamente 40%, mientras que las mujeres adultas mostraran lecturas de entre aproximadamente 36% y aproximadamente 46% con hombres adultos que reflejan las lecturas entre aproximadamente 41 y aproximadamente 54%. Cualquier lectura fuera de estos intervalos normales, siempre que los valores del individuo tratado antes del tratamiento no esten por encima de dichos intervalos, se considerara como una condicion en la que los niveles de globulos rojos se incrementan. El nivel de hemoglobina se expresa como la cantidad de hemoglobina en gramos (g) por decilitro (dL) de sangre entera, siendo un decilitro 100 mililitros. Los intervalos normales para la hemoglobina dependen de la edad y, a partir de la adolescencia, del sexo de la persona. Los intervalos normales son: ninos: alrededor de 11-13 g/dL, hombres adultos: alrededor de 14-18 g/dL, mujeres adultas: alrededor de 12-16 g/dL, hombres despues de la edad mediana: alrededor de 12,4-14,9 g/dL, mujeres despues de la mediana edad: alrededor de 11,7-13,8 g/dL. Cualquier nivel de hemoglobina fuera de estos intervalos normales, siempre que los valores del individuo tratado antes del tratamiento no esten por encima de dichos intervalos, se considerara como una condicion en la que los niveles de globulos rojos se incrementan. La frase "no aumento de los niveles de globulos rojos" o "sin aumento de los niveles de globulos rojos" en un sujeto se refiere a una condicion en la que se evita un aumento del hematocrito desde el intervalo normal hasta mas alla del intervalo aceptado de normalidad.

Lo siguiente ejemplifica un posible regimen de tratamiento preclinico para evaluar los posibles efectos de un tratamiento con un anticuerpo ActRIIB. El tratamiento se ejemplifica usando monos cynomolgus, pero los experimentos descritos no estan limitados a monos y el experto sabe como establecer experimentos adecuados o regimenes de dosificacion para otras especies, en particular para seres humanos: el anticuerpo ActRIIB se puede administrar una vez a la semana durante 3 meses a monos cynomolgus macho y hembra por inyeccion intravenosa. Se pueden asignar 32 monos cynomolgus (16/sexo) a uno de cuatro grupos de tratamiento (3 a 5 animales/sexo/grupo) y se pueden administrar inyecciones intravenosas de cualquiera de los vehiculos o del anticuerpo ActRIIB a razon de 10, 30 o 100 mg/kg una vez por semana durante 13 semanas (un total de 14 dosis; las dosis se seleccionaran en funcion de la actividad de hipertrofia muscular en el mono).

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La frase "aumento de la concentracion promedio de glucosa en plasma" se refiere a una situacion fisiologica en un paciente en el que se considerarfa la concentracion de glucosa en plasma (concentracion de azucar en sangre o nivel de glucosa en sangre o presencia de glucosa en la sangre de un ser humano o animal) por una persona capacitada como fuera del intervalo normal de un individuo sano. Los niveles de glucosa en sangre se miden en concentracion molar (milimoles por litro o milimolar, abreviado mM). El experto conoce los niveles normales de glucosa en sangre en los mamfferos, que estan estrechamente regulados como parte de la homeostasis metabolica. Sin embargo, los niveles de glucosa en sangre fluctuan a lo largo del dfa (mas bajos en la manana y aumentan despues de las comidas).

La hemoglobina glicada (hemoglobina glicosilada, hemoglobina A1c, HbA1c, A1C o Hb1c, a veces tambien HbA1c) es una forma de hemoglobina que se mide principalmente para identificar la concentracion promedio de glucosa en plasma durante periodos de tiempo prolongados. Se forma en una vfa de glicosilacion no enzimatica por la exposicion de la hemoglobina a la glucosa en plasma. Los niveles normales de glucosa producen una cantidad normal de hemoglobina glicada. A medida que aumenta la cantidad promedio de glucosa en plasma, la fraccion de hemoglobina glicada aumenta de manera predecible. Por lo tanto, la hemoglobina glicada sirve como un marcador para los niveles promedio de glucosa en sangre. Los metodos para determinar el nivel de hemoglobina glicada - como metodos confiables para evaluar el control glicemico - son bien conocidos en la tecnica (HB Chandalia y RR Krishnaswamy, Current Science, Vol. 83, No. 12, 25 de diciembre de 2002).

La frase "aumenta el tejido adiposo marron" o "aumento en el tejido adiposo marron (BAT)" se refiere a (i) un aumento en la masa humeda de tejido adiposo marron (BAT) interescapular medido y expresado como un cambio porcentual del promedio de un grupo de control definido, en el que el aumento es estadfsticamente significativo y esta influenciado por la cantidad de anticuerpo ActRIIB administrado y las composiciones que comprenden el mismo; o (ii) una mejora en la diferenciacion de los adipocitos marrones primarios como se refleja por un aumento en la expresion de genes termogenicos tales como UCP-1. Ademas, el tejido adiposo marron puede analizarse utilizando una tomograffa de emision de positrones y una tomograffa computarizada (Cypess et al., 2009, N Engl J Med 360: 1509-1517).

El termino "tejido adiposo marron" en el contexto de esta invencion se debe entender que tambien se refiere a los terminos "grasa marron", "adipocitos marron" y "adipocitos termogenicos", que se usan indistintamente.

El termino "trastorno metabolico" como se usa en el contexto de esta invencion se refiere a una enfermedad o condicion que se ve afectada por la presencia, nivel o actividad del tejido adiposo marron, concentracion de glucosa en plasma, nivel de insulina en plasma y/o contenido de grasa corporal. Un trastorno o afeccion metabolica tambien incluye, entre otros, sfndrome metabolico, tolerancia alterada a la glucosa, concentraciones elevadas de insulina en plasma y resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipertension, lipodistrofia, enfermedad cardiovascular, problemas o afecciones respiratorias. Los trastornos metabolicos de particular interes son la diabetes mellitus tipo 2 (tambien conocida como diabetes mellitus no insulinodependiente o diabetes de inicio en adultos), que se caracteriza por niveles elevados de glucosa en sangre en el contexto de resistencia a la insulina y deficiencia relativa de insulina, obesidad, enfermedad cardiovascular, accidente cerebrovascular, problemas respiratorios. La diabetes tipo 2, o diabetes insulinodependiente (es decir, diabetes mellitus no insulinodependiente), a menudo se produce frente a los niveles normales, o incluso elevados, de insulina y parece ser el resultado de la incapacidad de los tejidos para responder adecuadamente a la insulina. La mayorfa de los diabeticos tipo II tambien son obesos.

El termino "obesidad" se refiere a una condicion fisiologica de un individuo en el que hay un exceso de grasa corporal diagnosticado por un medico. La obesidad puede calcularse usando el fndice de masa corporal (IMC: peso corporal por altura en metros al cuadrado). Segun este sistema, la obesidad se define como un sujeto saludable que tiene un IMC mayor o igual a 30 kg/m2, o una condicion por la cual un sujeto con al menos una comorbilidad tiene un IMC mayor o igual a 27 kg/m2.

Los terminos "ActRIIA" y "ActRIIB" se refieren a receptores de Activina. Las activinas senalizan a traves de un complejo heterodfmero de receptores serina quinasas que incluyen al menos dos receptores de tipo I (I y IB) y dos de tipo II (II y IIB, tambien conocidos como ACVR2A y ACVR2B). Estos receptores son todos protefnas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de union a ligando con una region rica en cistefna, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmico con especificidad predicha de serina/treonina. Los receptores de tipo I son esenciales para la senalizacion, mientras que los receptores de tipo II son necesarios para unirse a ligandos y para la expresion/reclutamiento de receptores de tipo I. Los receptores de tipo I y II forman un complejo estable despues de la union del ligando que da como resultado la fosforilacion de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II. El receptor de activina II B (ActRIIB) es un receptor para la miostatina.

El termino "respuesta inmune" se refiere a la accion de, por ejemplo, linfocitos, celulas presentadoras de antfgeno, celulas fagocfticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el hfgado (por ejemplo, anticuerpos, citoquinas y complemento) que da como resultado un dano selectivo, destruccion o eliminacion del cuerpo humano de patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.

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Una "actividad de senalizacion" se refiere a una relacion causal bioquimica generalmente iniciada por una interaccion protein a-proteina tal como la union de un factor de crecimiento a un receptor, dando como resultado la transmision de una senal de una porcion de una celula a otra porcion de una celula. En general, la transmision implica la fosforilacion especifica de uno o mas residuos de tirosina, serina o treonina en una o mas proteinas en la serie de reacciones que provocan la transduccion de senales. Los penultimos procesos tipicamente incluyen eventos nucleares, lo que resulta en un cambio en la expresion genica.

El termino ActRIIB o receptor de Act IIB se refiere a ActRIIB humano como se define en la SEQ ID NO: 181 (AAC64515.1, GI: 3769443). Los anticuerpos anti-ActRIIB policlonales y monoclonales de calidad para investigacion son conocidos en la tecnica, tales como los fabricados por R & D Systems®, MN, EE.UU. Por supuesto, se podrian generar anticuerpos contra ActRIIB de otras especies y se podrian usar para tratar afecciones patologicas en esas especies.

El termino "anticuerpo" tal como se denomina en la presente memoria incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union a antigeno (es decir, "porcion de union a antigeno") o cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" natural es una glicoproteina que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada esta compuesta por una region variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada esta compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta por una region variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta compuesta por un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl se compone de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el terminal amino hasta el terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interactua con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huesped, que incluyen diversas celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clasico.

El termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porcion de antigeno"), como se usa en el presente documento, se refiere a la longitud completa o uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, una porcion de ActRIIB). Se ha demostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union abarcados dentro del termino "porcion de union a antigeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab, cada uno de los cuales se une al mismo antigeno, mediante un puente disulfuro en la region bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989. Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio Vh; y una region determinante de complementariedad (CDR) aislada.

Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite formarse como una sola cadena de proteina en la que las regiones Vl y Vh se aparean para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla tambien pretenden incluirse dentro de la expresion "region de union a antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a ActRIIB esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente a antigenos distintos de ActRIIB). Un anticuerpo aislado que se une especificamente a ActRIIB puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antigenos, tales como moleculas de ActRIIB de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos quimicos.

Los terminos "bloquear en forma cruzada", "bloqueado en forma cruzada" y "bloqueo cruzado" se usan indistintamente en este documento para significar la capacidad de un anticuerpo u otro agente aglutinante para interferir con la union de otros anticuerpos o agentes aglutinantes a ActRIIB, particularmente el dominio de union al ligando, en un ensayo de union competitivo estandar.

Los terminos "anticuerpo monoclonal" o "composicion de anticuerpo monoclonal" tal como se usan en la presente memoria se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular unica. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una unica especificidad de union y afinidad para un epitopo particular.

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El termino "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR se derivan de secuencias de origen humano. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien se deriva de tales secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de linea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de linea germinal humana o anticuerpo que contiene secuencias marco de consenso derivadas del analisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, como las descritas en Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57 - 86).

Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especifica del sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo). Sin embargo, el termino "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de la CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, se han injertado en secuencias marco humanas.

El termino "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una unica especificidad de union que tiene regiones variables en las que tanto la region marco como la region CDR se derivan de secuencias humanas. En una realizacion, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal transgenico no humano, por ejemplo un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera fusionado a una celula inmortalizada.

El termino "anticuerpo humano recombinante", como se usa en este documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos humanos y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique un empalme de todo o parte de secuencias genicas de inmunoglobulina humana, con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humanas, en mutagenesis somatica in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias de Vh y Vl de linea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la linea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG 1 o IgG2) que es proporcionada por los genes de la region constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antigeno" y "un anticuerpo especifico para un antigeno" se usan indistintamente en este documento con el termino "un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno".

Como se usa en este documento, un anticuerpo que "se une especificamente al polipeptido ActRIIB" se refiere a un anticuerpo que se une al polipeptido ActRIIB humano con una Kd de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos. Un anticuerpo que "reacciona de forma cruzada con un antigeno distinto de ActRIIB" se refiere a un anticuerpo que se une a ese antigeno con una Kd de 10 x 10-9 M o menos, 5 x 10-9 M o menos, o 2 x 10-9 M o menos. Un anticuerpo que "no reacciona de forma cruzada con un antigeno particular" se refiere a un anticuerpo que se une a ese antigeno, con una Kd de 1,5 x 10-8 M o mayor, o una Kd de 5-10 x 10-8 M, o 1 x 10-7 M o mayor. En ciertas realizaciones, dichos anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con el antigeno presentan una union esencialmente indetectable contra estas proteinas en ensayos de union estandar. Kd puede determinarse utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore® o una valoracion de equilibrio de la solucion.

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo antagonista" se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad de senalizacion inducida por ActRIIB en presencia de miostatina o de otros ligandos del ActRIIB tales como activinas o GDF-11. Los ejemplos de un ensayo para detectar esto incluyen la inhibicion de la senalizacion inducida por miostatina (por ejemplo mediante un ensayo del gen informador dependiente de Smad), la inhibicion de la fosforilacion de Smad inducida por miostatina (ELISA de P-Smad) y la inhibicion de la inhibicion inducida por miostatina de la diferenciacion de celulas del musculo esqueletico (por ejemplo, por un ensayo de creatina quinasa).

En algunas realizaciones, los anticuerpos inhiben la senalizacion inducida por miostatina medida en un ensayo del gen informador dependiente de Smad a una IC50 de 10 nM o menos, 1 nM o menos, o 100 pM o menos.

Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo con "actividad no agonista" se refiere a un anticuerpo que no aumenta significativamente la actividad de senalizacion mediada por ActRIIB en ausencia de miostatina en un ensayo basado en celulas, tal como la inhibicion de la senalizacion inducida por miostatina (por ejemplo, mediante un ensayo del gen informador dependiente de Smad), la inhibicion de la fosforilacion de Smad inducida por miostatina (ELISA de P-Smad) y la inhibicion de la inhibicion inducida por miostatina de la diferenciacion de celulas

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del musculo esqueletico (por ejemplo, mediante un ensayo de creatina quinasa). Tales ensayos se describen con mas detalles en los ejemplos a continuacion.

El termino "Kasoc" o "Ka", como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad de asociacion de una interaccion anticuerpo-antigeno particular, mientras que el termino "Kdis" o "Kd", como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad de disociacion de una interaccion particular anticuerpo-antigeno. El termino "Kd", como se usa en este documento, se refiere a la constante de disociacion, que se obtiene de la relacion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos se pueden determinar usando metodos bien establecidos en la tecnica. Un metodo para determinar la Kd de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmon superficial, tal como el sistema biosensor de Biacore®, o la valoracion de equilibrio de solucion (SET) (vease Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77 (2): 305 - 319, y Hanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339 (1): 182-184).

Como se usa en el presente documento, el termino "afinidad" se refiere a la fuerza de interaccion entre el anticuerpo y el antigeno en sitios antigenicos unicos. Dentro de cada sitio antigenico, la region variable del "brazo" del anticuerpo interactua a traves de fuerzas debiles no covalentes con el antigeno en numerosos sitios; cuantas mas interacciones, mas fuerte es la afinidad.

Como se usa en este documento, el termino "avidez" se refiere a una medida informativa de la estabilidad global o la fuerza del complejo anticuerpo-antigeno. Esta controlada por tres factores principales: afinidad del epitopo del anticuerpo; la valencia del antigeno y el anticuerpo; y la disposicion estructural de las partes que interactuan. En ultima instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epitopo de antigeno preciso.

Como se usa en el presente documento, el termino actividad de "ADCC" o de "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo" se refiere a la actividad de reduccion de celulas B humanas. La actividad de ADCC se puede medir mediante los ensayos de reduccion de celulas B humanas conocidas en la tecnica.

Para obtener una sonda de avidez mas alta, se puede construir un conjugado dimerico (dos moleculas de una proteina de anticuerpo acoplada a un marcador FACS), lo que hace que las interacciones de baja afinidad (como con el anticuerpo de linea germinal) se detecten mas facilmente por FACS. Ademas, otro medio para aumentar la avidez de la union al antigeno implica generar dimeros, trimeros o multimeros de cualquiera de los constructos descritos en la presente memoria de los anticuerpos anti-ActRIIB. Tales multimeros pueden generarse a traves de union covalente entre modulos individuales, por ejemplo, imitando la union del terminal C con el N naturales o imitando dimeros de anticuerpo que se mantienen juntos a traves de sus regiones constantes. Los enlaces modificados en la interfaz Fc/Fc pueden ser covalentes o no covalentes. Ademas, los companeros de dimerizacion o multimerizacion distintos de Fc pueden usarse en hibridos de ActRIIB para crear tales estructuras de orden superior. Por ejemplo, es posible usar dominios multimerizantes tales como el dominio trimerizante descrito en el documento WO2004/039841 o el dominio pentamerizante descrito en el documento WO98/18943.

Como se usa en este documento, el termino "selectividad" para un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que se une a un cierto polipeptido objetivo pero no a polipeptidos estrechamente relacionados.

Como se usa en este documento, el termino "alta afinidad" para un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 nM o menos para un antigeno objetivo. Como se usa en este documento, el termino "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano.

El termino "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamiferos y no mamiferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en este documento, el termino "optimizado" significa que una secuencia de nucleotidos se ha alterado para codificar una secuencia de aminoacidos usando codones que se prefieren en la celula u organismo de produccion, generalmente una celula eucariota, por ejemplo, una celula de Pichia, una celula de Triohoderma, una celula de ovario de hamster chino (CHO) o una celula humana. La secuencia de nucleotidos optimizada se modifica por ingenieria genetica para retener por completo o tanto como sea posible la secuencia de aminoacidos originalmente codificada por la secuencia de nucleotidos de partida, que tambien se conoce como secuencia "parental". Las secuencias optimizadas en este documento han sido modificadas para tener codones que son preferidos en celulas de mamifero CHO, sin embargo, tambien se preve aqui la expresion optimizada de estas secuencias en otras celulas eucariotas. Las secuencias de aminoacidos codificadas por secuencias de nucleotidos optimizadas tambien se conocen como optimizadas.

Descripcion detallada de la invencion

Se ha descubierto que los anticuerpos dirigidos al receptor ActRIIB pueden evitar que la miostatina se una al receptor, influyendo asi en la homeostasis de la glucosa y/o el metabolismo de la grasa en un sujeto sin afectar negativamente a los parametros hematologicos en dicho sujeto.

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Esto conduce a efectos metabolicos o fisiologicos como un aumento en el tejido adiposo marron, homeostasis mejorada de la glucosa, normalizacion de los niveles de insulina, disminucion en la concentracion promedio de glucosa en plasma y/o disminucion de la hemoglobina glicosilada en un paciente/sujeto. Una ventaja adicional de la ensenanza divulgada reside en el hecho de que no es necesario controlar los parametros hematologicos antes, durante o despues de la administracion de las composiciones de la invencion. Ademas, en comparacion con los metodos de la tecnica anterior, no hay necesidad de restringir el tratamiento de las composiciones divulgadas a pacientes/sujetos que tienen parametros hematologicos apropiados. Por ejemplo, los pacientes/sujetos que tienen un nivel de globulos rojos, hemoglobina o hematocrito por encima de lo normal tambien pueden ser tratados. Por lo tanto, en un aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo antagonista que se une a ActRIIB para uso en el tratamiento de un trastorno metabolico en un sujeto, donde el anticuerpo anti-ActRIIB aumenta el tejido adiposo marron sin aumentar los niveles de globulos rojos en dicho sujeto y el anticuerpo anti- ActRIIB se une a un dominio de union que consiste en los aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181 (SEQ ID NO: 182); y donde el trastorno metabolico se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes tipo 2, sindrome metabolico, lipodistrofia, tolerancia alterada a la glucosa, concentracion elevada de insulina en plasma, resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertension, enfermedad cardiovascular y afecciones respiratorias.

En una realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada se unen a ActRIIB con una Kd de 100 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos. Preferiblemente, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada se unen a ActRIIB con una afinidad de 100 pM o menos (es decir, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM o menos). En una realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada se unen a ActRIIB con una afinidad de entre 10 y 20 pM.

En una realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada no reaccionan de forma cruzada con una proteina relacionada con ActRIIB, particularmente no reaccionan de forma cruzada con ActRIIA humana (NP_001607.1, GI: 4501897), mas particularmente, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada se unen a ActRIIB con una afinidad 5 veces mayor que cuando se une a ActRIIA, mas preferiblemente 10 veces, aun mas preferiblemente 50 veces, aun mas preferiblemente 100 veces.

En una realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada se unen a ActRIIA con una afinidad de 100 pM o mas (es decir, 250 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM o mas).

En una realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada son del isotipo IgG2.

En otra realizacion, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada son del isotipo IgG1. En una realizacion adicional, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada son del isotipo IgG1 y tienen una funcion efectora alterada a traves de la mutacion de la region Fc. Dicha funcion efectora alterada puede ser una actividad de ADCC y de CDC reducida. En una realizacion, dicha funcion efectora alterada es ADCC silenciada y actividad de CDC.

En otra realizacion relacionada, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada son anticuerpos IgG1 completamente humanos o humanizados sin actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o actividad de CDC y se unen a una region de ActRIIB que consiste en los aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181.

En otra realizacion relacionada, los anticuerpos comprendidos en la composicion divulgada son anticuerpos IgG1 totalmente humanos o humanizados con actividad de citotoxicidad celular reducida dependiente de anticuerpo (ADCC) o actividad de CDC y se unen a una region de ActRIIB que consiste en aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181.

La presente divulgacion se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos ActRIIB humanos o humanizados para uso en el tratamiento de un sujeto para aumentar el tejido adiposo marron mientras que no aumenta los niveles de globulos rojos.

La aplicacion de las composiciones divulgadas conduce a una reduccion de la concentracion promedio de glucosa en plasma, la normalizacion de la homeostasis de glucosa y/o las concentraciones de insulina en plasma mientras que no aumenta los niveles de globulos rojos en dicho sujeto. La concentracion promedio de glucosa en plasma puede medirse determinando el nivel de hemoglobina glicada (hemoglobina glicosilada, hemoglobina A1c, HbA1c, A1C, Hb1c o HbA1c, HB Chandalia y PR Krishnaswamy, Current Science, Vol. 83, No. 12, 25 de diciembre de 2002).

En una realizacion alternativa, la divulgacion se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo que se une a ActRIIB para su uso de acuerdo con las presentes reivindicaciones en el tratamiento de un sujeto para disminuir la concentracion promedio de glucosa en plasma en un sujeto, mientras que no aumenta los niveles de globulos rojos.

En otra realizacion, el paciente tratado con las composiciones divulgadas padece un trastorno metabolico o fisiologico y muscular. Hay muchas causas de trastornos musculares (por ejemplo, atrofia), que incluyen como resultado del tratamiento con un glucocorticoide como cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona o prednisolona. La atrofia muscular tambien puede ser el resultado de una denervacion debida a

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un traumatismo nervioso o un resultado de neuropatia degenerativa, metabolica o inflamatoria (por ejemplo, sindrome de Guillian-Barre, neuropatia periferica o exposicion a toxinas o farmacos ambientales).

Ademas, la atrofia muscular puede ser un resultado de miopatia, tal como la miotonia; una miopatia congenita, que incluye miopatia nemalinica, miopatia multi/minicore y miopatia miotubular (centronuclear); miopatia mitocondrial; paralisis periodica familiar; miopatia inflamatoria; miopatia metabolica, tal como la causada por una enfermedad de almacenamiento de glicogeno o lipido; dermatomiositisis; polimiositis; miositis por cuerpos de inclusion; miositis osificante; rabdomiolisis y mioglobinurias. Ademas, el termino atrofia muscular tambien se relaciona con la sarcopenia asociada a la obesidad, la sarcopenia o la atrofia muscular asociada a la diabetes.

La miopatia puede ser causada por un sindrome de distrofia muscular, como Duchenne, Becker, miotonica, fascioescapulohumeral, Emery-Dreifuss, oculofaringea, escapulohumeral, de cinturas, Fukuyama, una distrofia muscular congenita o miopatia distal hereditaria. La enfermedad musculoesqueletica tambien puede ser osteoporosis, una fractura osea, baja estatura o enanismo.

Ademas, la atrofia muscular puede ser el resultado de una enfermedad neuronal motora adulta, atrofia muscular espinal infantil, esclerosis lateral amiotrofica, atrofia muscular espinal juvenil, neuropatia motora autoinmune con bloqueo conductor multifocal, paralisis por accidente cerebrovascular o lesion de la medula espinal, inmovilizacion esqueletica debido a trauma, reposo prolongado en cama, inactividad voluntaria, inactividad involuntaria, estres metabolico o insuficiencia nutricional, cancer, SIDA, ayuno, trastorno de la glandula tiroides, hipotonia congenita benigna, enfermedad del nucleo central, quemaduras, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfermedades hepaticas (ejemplos tales como fibrosis, cirrosis), sepsis, insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca congestiva, envejecimiento, viajes espaciales o tiempo pasado en un entorno de gravedad cero.

Algunos ejemplos de afecciones relacionadas con la edad que pueden tratarse incluyen sarcopenia, atrofia cutanea o perdida de masa muscular.

El tratamiento puede conducir a la ausencia total de un trastorno metabolico. En este contexto, el termino "ausencia total" se refiere a las condiciones fisiologicas o el estado de una persona que, sobre la base de la medicion del parametro fisiologico/metabolico pertinente, seria considerado por un experto como saludable (todos los parametros estan dentro del intervalo normal). El experto es consciente del parametro fisiologico/metabolico relevante y de como determinarlos. Dichos parametros seran seleccionados por una persona experta (por ejemplo, un medico) sobre la base de la condicion relacionada con la edad o el trastorno metabolico investigado. Los resultados del tratamiento tambien pueden ser parciales, de modo que la peculiaridad del trastorno metabolico en un sujeto es significativamente menos pronunciada que si el sujeto no hubiera recibido una composicion de la presente invencion. Los resultados parciales del tratamiento pueden ser una disminucion en la gravedad de los sintomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duracion de los periodos libres de sintomas de la enfermedad, o una prevencion del deterioro o la discapacidad debido a la enfermedad. En este contexto, el termino "trastorno metabolico significativamente menos pronunciado" se refiere a las condiciones fisiologicas o el estado de una persona que, sobre la base de la medicion del parametro fisiologico/metabolico relevante, despues del tratamiento con las composiciones de la invencion, no sera considerado por una persona experta como completamente sana (los parametros pueden estar todavia fuera del intervalo normal), pero donde se ha observado una mejora significativa (que podria ser un aumento o disminucion de un cierto parametro) del parametro fisiologico/metabolico relevante. Se puede identificar una mejora o disminucion significativa, por ejemplo, mediante la comparacion de los resultados del tratamiento de pacientes individuales en comparacion con los individuos de un grupo control o placebo.

Varios aspectos de la invencion se describen con mas detalle en las siguientes subsecciones. En la tecnica se conocen ensayos estandar para evaluar la capacidad de union de los anticuerpos frente a ActRIIB de diversas especies, que incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western y RIA. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. La afinidad de union de los anticuerpos tambien puede evaluarse mediante ensayos estandar conocidos en la tecnica, tales como analisis Biacore o valoracion de equilibrio de solucion. Las tecnicas basadas en resonancia de plasmon superficial tales como Biacore pueden determinar la cinetica de union que permite el calculo de la afinidad de union. Ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de ActRIIB (por ejemplo, union al receptor, prevencion o induccion de la proliferacion de celulas B humanas o produccion de IgG) se describen con mas detalle en los Ejemplos.

Por consiguiente, se entendera que un anticuerpo que "inhibe" una o mas de estas propiedades funcionales de ActRIIB (por ejemplo, actividades bioquimicas, inmunoquimicas, celulares, fisiologicas u otras actividades biologicas) como determinadas de acuerdo con las metodologias conocidas en la tecnica y descritas en la presente memoria, se relaciona con una disminucion estadisticamente significativa en la actividad particular con respecto a la observada en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando esta presente un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de ActRIIB produce tal disminucion estadisticamente significativa en al menos 10% del parametro medido, en al menos 50%, 80% o 90%, y en ciertas realizaciones un anticuerpo de la invencion puede inhibir mas de 95%, 98% o 99% de la actividad funcional de ActRIIB.

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La capacidad o el grado en el que un anticuerpo u otro agente de union puede interferir con la union de otro anticuerpo o molecula de union a ActRIIB y, por lo tanto, si puede decirse que bloquea en forma cruzada de acuerdo con la descripcion, puede determinarse usando ensayos de union de competicion estandar. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnologia Biacore (por ejemplo, usando un instrumento BIAcore (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnologia de resonancia de plasmon superficial. Otro ensayo para medir el bloqueo cruzado utiliza un enfoque basado en ELISA. Un ensayo adicional usa analisis de FACS, en el que se prueba la competencia de diversos anticuerpos para unirse a celulas que expresan ActRIIB (tal como se describe en los Ejemplos).

De acuerdo con la descripcion, un anticuerpo de bloqueo cruzado u otro agente de union de acuerdo con la divulgacion se une a ActRIIB en el ensayo de bloqueo cruzado BIAcore descrito de modo que la union registrada de la combinacion (mezcla) de los anticuerpos o agentes de union esta entre 80% y 0,1% (por ejemplo, 80% a 4%) de la union teorica maxima, especificamente entre 75% y 0,1% (por ejemplo, 75% a 4%) de la union teorica maxima, y mas especificamente entre 70% y 0,1% (por ejemplo, 70 % a 4%), y mas especificamente entre 65% y 0,1% (por ejemplo, 65% a 4%) de union teorica maxima (como se definio anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de union en combinacion.

Un anticuerpo se define como bloqueo cruzado de un anticuerpo anti-ActRIIB de la divulgacion en un ensayo ELISA, si el anticuerpo de prueba puede causar una reduccion de la union del anticuerpo anti-ActRIIB a ActRIIB de entre 60% y 100%, especificamente entre 70 % y 100%, y mas especificamente entre 80% y 100%, en comparacion con los pozos de control positivo (es decir, el mismo anticuerpo anti-ActRIIB y ActRIIB, pero ningun anticuerpo de bloqueo cruzado de "prueba"). Los ejemplos de anticuerpos de bloqueo cruzado como se citan en la presente memoria son MOR08159 y MOR08213. Por lo tanto, la invencion proporciona composiciones que comprenden anticuerpos que bloquean en forma cruzada MOR08159 o MOR08213 para la union a ActRIIB.

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen los anticuerpos recombinantes humanos, aislados y estructuralmente caracterizados, como se describe en los Ejemplos. Las secuencias de aminoacidos de Vh de los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se muestran en las SEQ ID NOs: 99-112. Las secuencias de aminoacidos de Vl de los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se muestran en las SEQ ID NOs: 85-98, respectivamente. Ejemplos de secuencias preferidas de aminoacidos de la cadena pesada de longitud completa de anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se muestran en las SEQ ID NOs: 146-150 y 156-160. Los ejemplos de secuencias preferidas de aminoacidos de la cadena ligera de longitud completa de anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se muestran en las SEQ ID NOs: 141-145 y 151-155, respectivamente. Otros anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen aminoacidos que han sido mutados por eliminacion, insercion o sustitucion de aminoacidos, pero tienen al menos 60, 70, 80, 90, 95, 97 o 99 por ciento de identidad en las regiones CDR con las regiones CDR representadas en las secuencias descritas anteriormente. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoacidos mutantes en las que no se han mutado mas de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos por eliminacion, insercion o sustitucion de aminoacidos en las regiones CDR en comparacion con las regiones CDR representadas en la secuencia descrita mas arriba.

Ademas, las secuencias de nucleotidos parentales de la cadena pesada variable se muestran en las SEQ ID NOs: 127-140. Las secuencias de nucleotidos parentales de la cadena ligera variable se muestran en las SEQ ID NOs: 113-126. Las secuencias de nucleotidos de la cadena ligera de longitud completa optimizadas para la expresion en una celula de mamifero se muestran en las SEQ ID NOs: 161-165 y 171-175. Las secuencias de nucleotidos de la cadena pesada de longitud completa optimizadas para la expresion en una celula de mamifero se muestran en las SEQ ID NOs: 166-170 y 176-180. Otros anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen aminoacidos o estan codificados por acidos nucleicos que han sido mutados, pero tienen al menos 60 o mas (es decir, 80, 90, 95, 97, 99 o mas) por ciento de identidad con las secuencias descritas anteriormente. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoacidos mutantes en las que no se han mutado mas de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos por eliminacion, insercion o sustitucion de aminoacidos en las regiones variables en comparacion con las regiones variables representadas en la secuencia divulgada mas arriba.

Ya que cada uno de estos anticuerpos se une al mismo epitopo y son progenies del mismo anticuerpo parental, las secuencias de Vh, Vl, de la cadena ligera de longitud completa y de la cadena pesada de longitud completa (secuencias de nucleotidos y secuencias de aminoacidos) pueden "mezclarse y emparejarse" para crear otras moleculas de union anti-ActRIIB de la invencion. La union de ActRIIB de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede analizar usando los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia de Vh de un emparejamiento Vh/Vl particular debe reemplazarse con una secuencia de Vh estructuralmente similar. Del mismo modo, una

secuencia de la cadena pesada de longitud completa de un emparejamiento particular de la cadena pesada de

longitud completa/cadena ligera de longitud completa deberia reemplazarse por una secuencia de la cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Del mismo modo, una secuencia de Vl de un emparejamiento de Vh/Vl particular debe reemplazarse con una secuencia de Vl estructuralmente similar. Del mismo modo, una

secuencia de la cadena ligera de longitud completa de un emparejamiento particular de la cadena pesada de

longitud completa/cadena ligera de longitud completa deberia reemplazarse con una secuencia de la cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. Por consiguiente, en un aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante o una region de union a antigeno del mismo que tiene: una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos 5 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 99-112; y una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 85-98.

En otro aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden:

(i) un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 99-112; y una

10 cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 85-98, o

(ii) una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno de la misma.

En otro aspecto, la invencion proporciona composiciones que comprenden:

(i) un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado que tiene una cadena pesada de longitud completa codificada 15 por una secuencia de nucleotidos que se ha optimizado para la expresion en la celula de un mamifero seleccionado

del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 127-140, y una cadena ligera de longitud completa codificada por una secuencia de nucleotidos que se ha optimizado para la expresion en la celula de un mamifero seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 113-126, o

20 Los ejemplos de secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vh de los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se muestran en las SEQ ID NOs: 1-14. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vh de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 15-28. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de Vh de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 29-42. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vl de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 43-56. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vl de 25 los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 57-70. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de Vl de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 71-84. Las regiones CDR se delinean usando el sistema de Kabat (Kabat, E.A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicacion NIH No. 91-3242). Un metodo alternativo para determinar las regiones CDR usa el metodo ideado por Chothia (Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-883). La definicion de 30 Chothia se basa en la ubicacion de las regiones de bucle estructural. Sin embargo, debido a los cambios en el sistema de numeracion utilizado por Chothia (vease, por ejemplo,
http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/GeneralInfo.htmL y
http://www.bioinf.org.uk/abs/), este sistema ahora se utiliza con menos frecuencia. Existen otros sistemas para definir CDR y tambien se mencionan en estos dos sitios web.

35 Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a ActRIIB y que la especificidad de union a antigeno es proporcionada principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de la CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias de la CDR1, 2 y 3 de Vl pueden ser "mezcladas y emparejadas" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y emparejarse, conteniendo cada anticuerpo una CDR1,2 y 3 de Vh y una CDR1,2 y 3 de Vl crean otras moleculas de union anti-ActRIIB de la invencion. La union de ActRIIB de tales anticuerpos 40 "mezclados y emparejados" pueden probarse usando los ensayos de union descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Cuando las secuencias de la CDR de Vh se mezclan y emparejan, la secuencia de la CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vh particular debe reemplazarse por una secuencia o secuencias de la CDR estructuralmente similar. De la misma manera, cuando las secuencias de la CDR de Vl se mezclan y emparejan, la secuencia de la CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia particular de Vl debe reemplazarse con una 45 secuencia o secuencias de la CDR estructuralmente similar. Sera evidente para un experto en la tecnica que las secuencias novedosas de Vh y Vl pueden crearse sustituyendo una o mas secuencias de la region CDR de Vh y/o Vl con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de la CDR mostradas aqui para anticuerpos monoclonales.

El anticuerpo anti-ActRIIB comprendido en las composiciones de la invencion, o la region de union a antigeno del 50 mismo tiene: una CDR1 de region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-14; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-28; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende 55 una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 43-56; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 57-70; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 71-84.

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En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 15; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 29; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 43; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 57; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 71.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 2; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 16; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 30; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 44; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 58; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 31; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 45; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 59; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 73.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 32; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 46; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 60; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 74.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 5; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 19; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 33; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 61; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 75.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 6; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 20; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 48; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 76.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 21; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 35; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 49; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 63; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 77.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 22; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 36; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 50 una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 64; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 78.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 79.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 10; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 24; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 38; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 66; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 80.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 11; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 25; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 39; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 53; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 67; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 81.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 12; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ

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ID NO: 26; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 40; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 54; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 68; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 82.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 13; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 27; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 41; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 55; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 69; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 83.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion comprende: una CDR1 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 28; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 42; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 56; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 70; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 84.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que comprende: (a) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 85 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 99; (b) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 86 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 100; (c) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 87 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101; (d) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 88 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 102; (e) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 89 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 103; (f) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 90 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 104; (g) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 91 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 105; (h) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 92 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 106; (i) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 107; (j) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 94 y la secuencia de la cadena ligera variable de la sEq ID NO: 108; (k) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 95 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 109; (l) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 96 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 110; (m) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 97 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111; o (n) la secuencia de la cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 98 y la secuencia de la cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 112.

En una realizacion, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que comprende: (a) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 146 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 141; (b) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 147 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 142; (c) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 148 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 143; (d) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 149 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 144; (e) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 150 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 145; (f) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 156 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 151; (g) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 157 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 152; (h) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 158 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 153; (i) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 159 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 154; o (j) la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 160 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 155.

Como se usa en este documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera o cadenas pesada o ligera de longitud completa que son "el producto de" o "derivado de" una secuencia de linea germinal particular si las regiones variables o cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Dichos sistemas incluyen la inmunizacion de un raton transgenico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antigeno de interes o el cribado de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentada en fagos con el antigeno de interes. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoacidos de las inmunoglobulinas de linea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana que esta mas proxima en secuencia (es decir, el % de identidad mas elevado) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de la linea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somaticas naturales o introduccion intencional de la mutacion dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado tipicamente es al menos 90% identico en secuencia de aminoacidos a una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de linea germinal humana y contiene residuos de aminoacidos que identifican al anticuerpo humano como humano en comparacion con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina de linea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias germinales de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 80%, 90% o al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% identico en secuencia de aminoacidos

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a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea germinal. Tipicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de linea germinal humana particular mostrara no mas de 10 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede mostrar no mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de linea germinal.

En una realizacion, el anticuerpo comprendido en las composiciones de la invencion es el codificado por pBW522 o pBW524 (depositado en DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania el 18 de agosto de 2009 bajo los numeros de deposito DSM22873 y DSM22874, respectivamente).

Anticuerpos homologos

En aun otra realizacion, un anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion tiene secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y ligera de longitud completa; secuencias de nucleotidos de la cadena pesada y ligera de longitud completa, secuencias de nucleotidos de la cadena pesada y ligera de region variable, o secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y ligera de region variable que son homologas a las secuencias de aminoacidos y nucleotidos de los anticuerpos descritos en la presente memoria, y en donde los anticuerpos retienen propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-ActRIIB de la invencion.

Por ejemplo, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo) que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en la que: la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 99-112; la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 85-98; alternativamente, las composiciones comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo) que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en la que: la region variable de la cadena pesada comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 aminoacidos o no mas de 1 aminoacido que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 99-112; la region variable de la cadena ligera comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 o no mas de 1 aminoacidos que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 85-98 y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) inhibe la union de miostatina in vitro o in vivo, (ii) disminuye la inhibicion de la diferenciacion muscular a traves de la ruta dependiente de Smad y/o (iii) no induce cambios hematologicos, en particular, ningun cambio en RBC. En este contexto, el termino "cambio" se refiere a inserciones, eliminaciones y/o sustituciones.

En un ejemplo adicional, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo) que comprende una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en la que: la cadena pesada de longitud completa comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 146-150 y 156 -160; la cadena ligera de longitud completa comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 141 -145 y 151-155; alternativamente, las composiciones comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo) que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en la que: la region variable de la cadena pesada comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 o no mas de 1 aminoacidos que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 146-150 y 156 -160; la region variable de la cadena ligera comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 o no mas de 1 aminoacidos que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 141-145 y 151-155 y el anticuerpo presenta al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) inhibe la union de miostatina in vitro o in vivo, (ii) disminuye la inhibicion de la diferenciacion muscular a traves de la ruta dependiente de Smad y/o (iii) no induce cambios hematologicos, en particular, no cambios en RBC. Preferiblemente, dicho anticuerpo se une al dominio de union a ligando de ActRIIB. En este contexto, el termino "cambio" se refiere a inserciones, eliminaciones y/o sustituciones.

En otro ejemplo, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo), que comprende una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en la que: la cadena pesada de longitud completa esta codificada por una secuencia de nucleotidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que

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consiste en las SEQ ID NOs: 166-170 y 176-180; la cadena ligera de longitud completa esta codificada por una secuencia de nucleotidos que es al menos 80%, o al menos 90% (preferiblemente al menos 95, 97 o 99%) identica a una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 161 -165 y 171-175; alternativamente, las composiciones comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante (o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo) que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en la que: la region variable de la cadena pesada comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 o no mas de 1 aminoacidos que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 166-170 y 176 -180; la region variable de la cadena ligera comprende no mas de 5 aminoacidos, o no mas de 4 aminoacidos, o no mas de 3 aminoacidos, o no mas de 2 o no mas de 1 aminoacidos que cambian en comparacion con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 161-165 y 171-175 y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) inhibe la union de miostatina in vitro o in vivo, (ii) disminuye la inhibicion de la diferenciacion muscular a traves de la ruta dependiente de Smad y/o (iii) no induce cambios hematologicos, en particular, no cambios en RBC. Preferiblemente, dicho anticuerpo se une al dominio de union a ligando de ActRIIB. En este contexto, el termino "cambio" se refiere a inserciones, eliminaciones y/o sustituciones.

En diversas realizaciones, el anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion puede exhibir una o mas, dos o mas, o tres de las propiedades funcionales discutidas anteriormente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1 completamente humano.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoacido de VH y/o VL pueden ser 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identicas a las secuencias indicadas anteriormente. En otras realizaciones, las secuencias de aminoacidos de VH y/o VL pueden ser identicas, excepto una sustitucion de aminoacidos en no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoacidos. Un anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen una identidad elevada (es decir, 80% o superior) con las regiones VH y VL de las SEQ ID NO 99-112 y las SEQ ID NO: 85-98, respectivamente, puede obtenerse mediante mutagenesis (por ejemplo, dirigida al sitio o mediada por PCR mutagenesis) de las moleculas de acido nucleico SEQ ID NOs: 127-140 y 113-126 respectivamente, seguidas de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la funcion retenida (es decir, las funciones indicadas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en este documento.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada y/o de la cadena ligera de longitud completa pueden ser 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identicas a las secuencias indicadas anteriormente o pueden ser identicas, excepto un cambio de aminoacido en no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoacidos. Un anticuerpo que tiene una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa que tiene una identidad alta (es decir, 80% o mayor) con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquiera de la SEQ ID NOs: 146-150 y 156-160 y cadenas ligeras de longitud completa de cualquier de las SEQ ID NOs: 141-145 y 151155, respectivamente, pueden obtenerse por mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moleculas de acido nucleico de las SEQ ID NOs: 166-170 y 176-180 y SEQ ID NOs: 161-165 y 171-175, respectivamente, seguido de pruebas del anticuerpo alterado codificado para la funcion retenida (es decir, las funciones indicadas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en este documento.

En otras realizaciones, las secuencias de nucleotidos de la cadena pesada y/o cadena ligera de longitud completa pueden ser 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identicas a las secuencias establecidas anteriormente.

En otras realizaciones, las regiones variables de secuencias de nucleotidos de la cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identicas a las secuencias indicadas anteriormente o pueden ser identicas excepto un cambio de aminoacido en no mas de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoacidos.

Como se usa en este documento, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, el % de identidad = # de posiciones identicas/# total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de espacios, y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matematico, como se describe a continuacion.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17, 1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (version 2.0) , usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion por longitud de espacio de 12 y una penalizacion por espacio de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444 -453, 1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso por espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras

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En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion tiene una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o mas de estas secuencias de la CDR han especificado secuencias de aminoacidos basadas en los anticuerpos descritos en la presente memoria o secuencias variantes de los mismos que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos o modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti- ActRIIB de la invencion. Por consiguiente, la invencion proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB recombinante aislado, o una proteina funcional que comprende una porcion de union a antigeno del mismo, que consiste en una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3, en las que: las secuencias de aminoacidos de la CDR1 de la region variable de la cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-14 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1,2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoacidos de la CDR2 de la region variable de la cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-28 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1,2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoacidos de la CDR3 de la region variable de la cadena pesada se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoacidos de la CDR1 de las regiones variables de la cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4356 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoacidos de la CDR2 de las regiones variables de la cadena ligera se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 57-70 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; las regiones variables de la cadena ligera de las secuencias de aminoacidos de la CDR3 se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 71-84 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos y modificaciones conservadoras de las mismas. Preferiblemente, el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) inhibe la union de miostatina in vitro o in vivo, (ii) disminuye la inhibicion de la diferenciacion muscular a traves de la ruta dependiente de Smad y/o (iii) no induce cambios hematologicos, en particular, no hay cambios en RBC.

En diversas realizaciones, el anticuerpo puede exhibir una o ambas de las propiedades funcionales enumeradas anteriormente. Tales anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos.

En otras realizaciones, un anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion optimizada para expresion en una celula de mamifero tiene una secuencia de la cadena pesada de longitud completa y una secuencia de la cadena ligera de longitud completa, en donde una o mas de estas secuencias tienen secuencias de aminoacidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en la presente memoria o modificaciones conservadoras de las mismas, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-ActRIIB de la invencion. Por consiguiente, la invencion proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo monoclonal anti-ActRIIB aislado optimizado para expresion en una celula de mamifero que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa en la que: la cadena pesada de longitud completa tiene secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo de la SEQ ID NOs: 146-150 y 156-160 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene secuencias de aminoacidos seleccionadas del grupo de las SEQ ID NOs: 141-145 y 151-155 o secuencias variantes de las mismas que comprenden 1, 2, 3, 4 o 5 cambios de aminoacidos, y modificaciones conservadoras de las mismas; y el anticuerpo exhibe al menos una de las siguientes propiedades funcionales: (i) inhibe la union de miostatina in vitro o in vivo, (ii) disminuye la inhibicion de la diferenciacion muscular a traves de la ruta dependiente de Smad y/o (iii) no induce cambios hematologicos, en particular, no cambios en RBC.

Como se usa en este documento, la expresion "modificaciones conservadoras de secuencia" se refiere a modificaciones de aminoacidos que no afectan o alteran significativamente las caracteristicas de union del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de aminoacidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la invencion mediante tecnicas estandar conocidas en el arte, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR.

Las sustituciones conservadoras de aminoacidos son aquellas en las que el residuo de aminoacido se reemplaza por un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,

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tirosina, cisteina, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por lo tanto, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invencion pueden reemplazarse con otros residuos de aminoacidos de la misma familia de cadenas laterales, y el anticuerpo alterado puede analizarse por la funcion retenida usando los ensayos funcionales descritos en este documento.

Anticuerpos que se unen al mismo epitopo que los anticuerpos anti-ActRIIB comprendidos en la composicion de la invencion.

En otra realizacion, la invencion proporciona composiciones que comprenden anticuerpos que se unen al mismo epitopo que los diversos anticuerpos anti-ActRIIB especificos descritos en la presente memoria. Todos los anticuerpos descritos en los ejemplos que son capaces de bloquear la union de miostatina a ActRIIB se unen a uno de los epitopos en ActRIIB con alta afinidad, estando comprendido dicho epitopo entre los aminoacidos 19-134 de la SEQ ID NO: 181.

Por lo tanto, se pueden identificar anticuerpos adicionales basandose en su capacidad para competir de forma cruzada (por ejemplo, inhibir competitivamente la union, de una manera estadisticamente significativa) con otros anticuerpos de la divulgacion en ensayos de union estandar de ActRIIB. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la union de anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion a ActRIIB humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con dicho anticuerpo para unirse a ActRIIB humano; dicho anticuerpo puede, de acuerdo con la teoria no limitante, unirse al epitopo igual o relacionado (por ejemplo, estructuralmente similar o espacialmente proximal) en ActRIIB humano como el anticuerpo con el que compite. En una determinada realizacion, el anticuerpo que se une al mismo epitopo en ActRIIB humano como los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion es un anticuerpo recombinante humano. Dichos anticuerpos recombinantes humanos se pueden preparar y aislar como se describe en los ejemplos.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por y/o que compite por la union con un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 85, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 99.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 86, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 100.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 87, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 101.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 88, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 102.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 89, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 103.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 90, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 104.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 91, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 105.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 92, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 106.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 93, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 107.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 94, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 108.

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Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 95, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 109.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 96, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 110.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 97, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 111.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo reconocido por un anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada variable indicada en la SEQ ID NO: 98, y la secuencia de la cadena ligera variable indicada en la SEQ ID NO: 112.

Despues de experimentos mas detallados de mapeo de epitopos, las regiones de union de los anticuerpos preferidos de las composiciones de la invencion se han definido mas claramente.

Por lo tanto, la invencion proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende los aminoacidos 78-83 de la SEQ iD NO: 181 (WLDDFN - SEQ ID NO: 188).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende los aminoacidos 76-84 de la SEQ ID NO: 181 (GcWlDDFNC - SEQ ID NO: 186).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende los aminoacidos 75-85 de la SEQ ID NO: 181 (KGCWLDDFNCY - SEQ ID No: 190).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende los aminoacidos 52-56 de la SEQ ID NO: 181 (EQDKR - SEQ ID NO: 189).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende los aminoacidos 49-63 de la SEQ ID NO: 181 (CEGEQDKRLHCYASW - sEq ID NO: 187).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende o consiste en los aminoacidos 29-41 de la SEQ ID NO: 181 (CIYYNANWELERT-SEQ ID NO: 191).

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende o consiste en los aminoacidos 100-110 de la SEQ ID NO: 181 (YFCCCEGNFCN - SEQ ID NO: 192); o

La invencion tambien proporciona una composicion que comprende anticuerpos que se unen a epitopos que consisten en estas secuencias o epitopos que comprenden combinaciones de estas regiones epitopicas.

Por lo tanto, la invencion tambien proporciona una composicion que comprende un anticuerpo que se une a un epitopo que comprende o consiste en los aminoacidos 78-83 de la SEQ ID NO: 181 (WLDDFN) y aminoacidos 52-56 de la SEQ ID NO: 181 (EQDKR).

Anticuerpos disenados y modificados

Un anticuerpo comprendido en las composiciones de la invencion adicionalmente puede prepararse usando un anticuerpo que tiene una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl mostradas aqui como material de partida para disenar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas a partir del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede disenarse modificando uno o mas residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo dentro de una o mas regiones CDR y/o dentro de una o mas regiones marco. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede disenarse modificando residuos dentro de la region o regiones constantes, por ejemplo para alterar la funcion o funciones efectoras del anticuerpo.

Un tipo de modificacion de region variable que se puede realizar es el injerto de la CDR. Los anticuerpos interactuan con antigenos objetivo predominantemente a traves de residuos de aminoacidos que estan localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada y ligera. Por esta razon, las secuencias de aminoacidos dentro de las CDR son mas diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de la CDR son responsables de la mayoria de las interacciones anticuerpo- antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos naturales especificos construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias de la CDR del anticuerpo natural especifico injertado en secuencias marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332: 323 - 327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321: 522 - 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 10029-10033; la patente de los Estados Unidos N° 5.225.539 de Winter, y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).

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De acuerdo con esto, otra realizacion de la invencion se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo monoclonal anti-ActRIIB, o una protefna funcional que comprende una porcion de union a antfgeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias de la CDR1 que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1-14; secuencias de la CDR2 que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-28; secuencias de la CDR3 que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42, respectivamente; y una region variable de la cadena ligera que tiene secuencias de la CDR1 que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 43-56; secuencias de la CDR2 que tienen una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5770; y secuencias de la CDR3 que consisten en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 71-84, respectivamente. Por lo tanto, tales anticuerpos contienen las secuencias de la CDR de Vh y Vl de anticuerpos monoclonales, aunque pueden contener diferentes secuencias marco de estos anticuerpos.

Tales secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN publicas o referencias publicadas que incluyen secuencias genicas de anticuerpos de lfnea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la lfnea germinal para genes de la region variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias germinales humanas "VBase" (disponible en Internet en
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), asf como en Kabat, EA, et al., [citado mas arriba]; TomLinson, IM, et al., 1992 J. fol. Biol. 227: 776 - 798; y Cox, JPL et al., 1994 Eur. J Immunol. 24: 827-836. Un ejemplo de secuencias marco para su uso en los anticuerpos de la invencion son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias estructurales utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invencion, por ejemplo, secuencias de consenso y/o secuencias marco usadas por los anticuerpos monoclonales de la invencion. Las secuencias de la CDR1, 2 y 3 de Vh, y las secuencias de la CDR1,2 y 3 de Vl, pueden injertarse en regiones estructurales que tienen una secuencia identica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la lfnea germinal del que deriva la secuencia estructural, o pueden injertarse las secuencias de la CDR en regiones marco que contienen una o mas mutaciones en comparacion con las secuencias de la lfnea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones marco para mantener o mejorar la capacidad de union del antfgeno del anticuerpo (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al).

Otro tipo de modificacion de region variable es mutar los residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl para mejorar de ese modo una o mas propiedades de union (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interes, conocido como "maduracion de afinidad". La mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la o las mutaciones y el efecto sobre la union del anticuerpo u otras propiedades funcionales de interes puede evaluarse en ensayos in vitro o in vivo como se describe aquf y se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discutio anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoacidos. Ademas, tfpicamente no se alteran mas de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una region CDR.

Por consiguiente, en otra realizacion, la invencion proporciona anticuerpos monoclonales anti-ActRIIB aislados, o una protefna funcional que comprende una porcion de union a antfgeno del mismo, que consiste en una region variable de la cadena pesada que tiene: una region CDR1 de Vh que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que tiene SEQ ID NOs: 1-14 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 1-14; una region CDR2 de Vh que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-28, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEQ ID NOs: 15-28; una region CDR3 de Vh que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 29-42; una region CDR1 de Vl que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 43-56, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 43-56; una region CDR2 de Vl que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 52-70, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 52-70; y una region CDR3 de Vl que tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las sEq ID NOs: 71-84, o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con las SEQ ID NOs: 71-84.

Injertar dominios de union a antfgeno en estructuras o andamios alternativos

Se puede emplear una amplia variedad de estructuras/andamios de anticuerpo/inmunoglobulina siempre que el polipeptido resultante incluya al menos una region de union que se una especfficamente a ActRIIB. Dichos marcos o andamios incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de los mismos (tales como los descritos en otra parte de este documento), e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, que preferiblemente tienen aspectos humanizados. Los anticuerpos de la cadena pesada sencilla, como los identificados en los camelidos, son de particular interes a este respecto. Nuevos marcos, andamios y fragmentos continuan siendo descubiertos y desarrollados por los expertos en la materia.

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En un aspecto, las composiciones de la invencion pueden comprender anticuerpos no basados en inmunoglobulinas usando andamios que no son de inmunoglobulina sobre los que pueden injertarse CDR de los anticuerpos divulgados. Se pueden emplear marcos y andamios que no son de inmunoglobulina conocidos o por conocer, siempre que comprendan una region de union especifica para la proteina objetivo de la SEQ ID NO: 181 (preferiblemente, el dominio de union a ligando del mismo como se muestra en la SEQ ID NO: 182). Tales compuestos se conocen en la presente memoria como "polipeptidos que comprenden una region de union especifica del objetivo".

Modificacion del marco o de Fc

Los anticuerpos modificados comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en residuos de marco dentro de Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Tipicamente, tales modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "mutar nuevamente" uno o mas residuos del marco a la secuencia correspondiente de la linea germinal. Mas especificamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutacion somatica puede contener residuos de marco que difieren de la secuencia de la linea germinal a partir de la cual se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias del marco del anticuerpo con las secuencias de la linea germinal a partir de las cuales se deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la region marco a su configuracion de la linea germinal, las mutaciones somaticas pueden "mutarse nuevamente" a la secuencia de la linea germinal mediante, por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis mediada por PCR. Tales anticuerpos "mutados nuevamente" tambien pueden estar comprendidos en las composiciones de la invencion.

Otro tipo de modificacion del marco implica la mutacion de uno o mas residuos dentro de la region marco, o incluso dentro de una o mas regiones CDR, para eliminar epitopos de celulas T para reducir asi la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque tambien se denomina "desinmunizacion" y se describe con mas detalle en el documento US2003/0153043.

Ademas o alternativamente a las modificaciones hechas dentro de las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la invencion pueden modificarse para incluir modificaciones dentro de la region Fc, tipicamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, fijacion del complemento, union al receptor Fc y/o citotoxicidad celular dependiente del antigeno. Ademas, un anticuerpo comprendido en las composiciones de la invencion puede modificarse quimicamente (por ejemplo, uno o mas residuos quimicos se pueden unir al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilacion, nuevamente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mas detalle a continuacion. La numeracion de residuos en la region Fc es la del indice EU de Kabat.

En una realizacion, la region bisagra de CH1 se modifica de modo que el numero de residuos de cisteina en la region bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos No. 5.677.425. El numero de residuos de cisteina en la region bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realizacion, la region bisagra de Fc de un anticuerpo esta mutada para disminuir la semivida biologica del anticuerpo. Mas especificamente, se introducen una o mas mutaciones de aminoacidos en la region de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra de Fc de manera que el anticuerpo tiene una union deteriorada de la proteina A estafilococica (SpA) con respecto a la union de SpA del dominio de bisagra nativo de Fc. Este enfoque se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos No. 6.165.745. En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biologica. Varios enfoques son posibles. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6.277.375. Alternativamente, para aumentar la semivida biologica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la region CH1 o CL para contener un epitopo de union al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 5,869,046 y la patente de Estados Unidos No. 6,121,022.

En otras realizaciones mas, la region Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoacido con un residuo de aminoacido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos pueden reemplazarse con un residuo de aminoacido diferente de manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de union al antigeno del anticuerpo parental. El ligando efector al que se le altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 de complemento. Este enfoque se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos No. 5.624.821 y la patente de Estados Unidos No. 5.648.260, ambos de Winter et al. En particular, los residuos 234 y 235 pueden estar mutados. En particular, estas mutaciones pueden ser por alanina. Por lo tanto, en una realizacion, el anticuerpo comprendido en las composiciones de la invencion tiene una mutacion en la region Fc en uno o ambos aminoacidos 234 y 235. En otra realizacion, uno o ambos aminoacidos 234 y 235 pueden estar sustituidos por alanina. La sustitucion de ambos aminoacidos 234 y 235 por alanina da como resultado una actividad de ADCC reducida.

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En otra realizacion, uno o mas aminoacidos seleccionados entre los residuos de aminoacidos de los anticuerpos descritos pueden reemplazarse con un residuo de aminoacido diferente de manera que el anticuerpo ha alterado la union a C1q y/o reducido o suprimido la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos No. 6.194.551.

En otra realizacion, uno o mas residuos de aminoacidos de los anticuerpos descritos se alteran para alterar asi la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en el documento WO94/29351.

En otra realizacion mas, la region Fc de los anticuerpos descritos se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o mas aminoacidos. Este enfoque se describe adicionalmente en el documento WO00/42072. Ademas, los sitios de union en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con union mejorada (vease Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276: 65916604).

En otra realizacion mas, la glicosilacion de un anticuerpo comprendido en las composiciones de la invencion se modifica. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antigeno. Tales modificaciones de carbohidratos pueden realizarse, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o mas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado la eliminacion de uno o mas sitios de glicosilacion del marco de la region variable para eliminar de ese modo la glicosilacion en ese sitio. Tal glicosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antigeno. Tal enfoque se describe con mas detalle en las patentes de Estados Unidos numeros 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.

Adicional o alternativamente, puede usarse un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilacion alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos pueden realizarse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula huesped con maquinaria de glicosilacion alterada. Las celulas con maquinaria de glicosilacion alterada se han descrito en la tecnica y se pueden usar como celulas huesped en las cuales expresar los anticuerpos recombinantes descritos para producir de este modo un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al., describe una linea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha linea celular exhiben hipofucosilacion. Por lo tanto, en una realizacion, los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se producen por expresion recombinante en una linea celular que exhibe un patron de hipofucosilacion, por ejemplo, una linea celular de mamifero con expresion deficiente del gen FUT8 que codifica la fucosiltransferasa. El documento WO03/035835 describe una linea celular CHO variante, celulas Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados a Asn (297), que tambien da como resultado la hipofucosilacion de anticuerpos expresados en esa celula huesped (vease tambien Shields, RL et al., 2002 J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). El documento WO99/54342 describe lineas celulares disenadas para expresar glicosiltrasferasas que modifican glucoproteinas (por ejemplo, beta (1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las lineas celulares modificadas exhiben estructuras de GlcNac bisectantes aumentadas que da como resultado una actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (vease tambien Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180). Alternativamente, los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion pueden producirse en una levadura o un hongo filamentoso disenado para un patron de glicosilacion de tipo mamifero, y capaz de producir anticuerpos que carecen de fucosa como patron de glicosilacion (vease, por ejemplo, el documento EP1297172B1).

Otra modificacion de los anticuerpos de la presente invencion contemplada por la invencion es la pegilacion. Un anticuerpo se puede pegilar para, por ejemplo, aumentar la semivida biologica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, tipicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o derivado de aldehido de PEG, en condiciones en las que uno o mas grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilacion puede llevarse a cabo mediante una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula PEG reactiva (o un polimero soluble en agua reactivo analogo). Como se usa en el presente documento, el termino "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para formar derivados de otras proteinas, tales como mono (C1- C10) alcoxi o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo usado para pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los metodos para pegilar proteinas son conocidos en la tecnica y se pueden aplicar a los anticuerpos divulgados (vease, por ejemplo, los documentos EP0154316 y EP0401384).

Otra modificacion de los anticuerpos contemplada por la invencion es una conjugacion o fusion proteica de al menos la region de union a antigeno del anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion a proteina serica, tal como albumina serica humana o un fragmento de la misma para aumentar la semivida de la molecula resultante (vease, por ejemplo, el documento EP0322094). Otra posibilidad es una fusion de al menos la region de union a antigeno del anticuerpo comprendido en la composicion de la invencion a proteinas capaces de unirse a proteinas

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sericas, tales como albumina de suero humano para aumentar la semivida de la molecula resultante (vease, por ejemplo, el documento EP0486525).

Metodos de modificacion de anticuerpos alterados

Como se discutio anteriormente, los anticuerpos anti-ActRIIB que tienen secuencias de la CDR, secuencias de Vh y Vl o secuencias de la cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas aqui se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti-ActRIIB modificando las secuencias de la CDR de las secuencias de cadena pesada y/o de cadena ligera de longitud completa, secuencias de Vh y/o Vl, o la region o regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto de la invencion, las caracteristicas estructurales de un anticuerpo anti-ActRIIB comprendido en las composiciones de la invencion se usan para crear anticuerpos anti-ActRIIB estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion, tal como la union a ActRIIB humano, pero tambien inhibe una o mas propiedades funcionales de ActRIIB (por ejemplo, la inhibicion de la activacion de Smad).

Por ejemplo, una o mas regiones CDR de los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la presente invencion, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos adicionales anti-ActRIIB modificados en forma recombinante comprendidos en las composiciones de la invencion, como se discutio anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la seccion anterior. El material de partida para el metodo de modificacion es una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl proporcionadas en este documento, o una o mas regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo modificado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como proteina) un anticuerpo que tiene una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl proporcionadas en este documento, o una o mas regiones CDR de las mismas. Por el contrario, la informacion contenida en la secuencia o secuencias se utiliza como material de partida para crear una secuencia o secuencias de "segunda generacion" derivadas de la secuencia o secuencias originales y luego se prepara la secuencia o secuencias de "segunda generacion" y se expresan como una proteina.

La secuencia de anticuerpo alterada tambien puede prepararse seleccionando bibliotecas de anticuerpos que tienen secuencias de la CDR3 fijadas seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-42 y las SEQ ID NOs: 71-84 o determinantes de union esenciales minimos como se describe en el documento US2005/0255552 y diversidad en secuencias de la CDR1 y CDR2. El cribado puede realizarse de acuerdo con cualquier tecnologia de cribado apropiada para el cribado de anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos, tal como la tecnologia de presentacion en fagos.

Las tecnicas de biologia molecular estandar pueden usarse para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpos alterados es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-ActRIIB descritos en el presente documento, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no estan limitadas a, unirse especificamente a ActRIIB humano y la inhibicion de la activacion de Smad.

El anticuerpo alterado puede exhibir una o mas, dos o mas, o tres o mas de las propiedades funcionales discutidas anteriormente.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar usando ensayos estandar disponibles en la tecnica y/o descritos en la presente memoria, tales como los expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA).

Las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente o selectivamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-ActRIIB y los anticuerpos anti-ActRIIB modificados resultantes pueden cribarse para la actividad de union y/u otras propiedades funcionales como se describe en este documento. Los metodos mutacionales se han descrito en la tecnica. Por ejemplo, el documento WO02/092780 describe metodos para crear y seleccionar mutaciones de anticuerpos usando mutagenesis de saturacion, ensamblaje de ligacion sintetica o una combinacion de los mismos. Alternativamente, el documento WO03/074679 describe metodos para usar metodos de cribado computacional para optimizar las propiedades fisicoquimicas de los anticuerpos.

Moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion

Se muestran ejemplos de secuencias de nucleotidos de la cadena ligera de longitud completa optimizadas para la expresion en una celula de mamifero en las SEQ ID NOs: 161-165 y 171-175. Ejemplos de secuencias de nucleotidos de la cadena pesada de longitud completa optimizadas para la expresion en una celula de mamifero se muestran en las SEQ ID NOs: 166-170 y 176-180.

Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular, o pueden ser acidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta "aislado" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o proteinas celulares, mediante tecnicas estandar, incluido el tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografia en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., Ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York. Los acidos nucleicos pueden obtenerse usando tecnicas estandar de biologia molecular.

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Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgenicos que portan genes de inmunoglobulina humana como se describe mas adelante a continuacion), los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo preparado por el hibridoma se pueden obtener por amplificacion por PCR estandar o tecnicas de clonacion de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando tecnicas de presentacion en fagos), el acido nucleico que codifica el anticuerpo puede recuperarse de varios clones de fagos que son miembros de la biblioteca. Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos de Vh y Vl, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante tecnicas de ADN recombinante estandar, por ejemplo para convertir los genes de la region variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vl o Vh se une operativamente a otra molecula de ADN, o a un fragmento que codifica otra proteina, tal como una region constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El termino "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de una manera funcional, por ejemplo, de manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco, o de modo que la proteina se expresa bajo el control de un promotor deseado.

El ADN aislado que codifica la region Vh puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica Vh a otra molecula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la region constante de la cadena pesada humana son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., [citado mas arriba]) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificacion PCR estandar. La region constante de la cadena pesada puede ser una region constante IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. La region constante de la cadena pesada se puede seleccionar entre isotipos de IgG1. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica Vh se puede unir operativamente a otra molecula de ADN que codifica solo la region constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region VL se puede convertir a un gen de la cadena ligera completa (asi como a un gen de la cadena ligera Fab) ligando operativamente el ADN que codifica Vl a otra molecula de ADN que codifica la region constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la region constante de la cadena ligera humana se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., [citado mas arriba]) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificacion PCR estandar. La region constante de la cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican Vh y Vl se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de Vh y Vl se pueden expresar como una proteina de cadena sencilla contigua, con las regiones Vl y Vh unidas por el enlazador flexible (vease por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; Huston et al., 1988 Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 85: 5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348: 552- 554).

Generacion de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales (mAb) se pueden producir mediante una variedad de tecnicas, que incluyen la metodologia convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la tecnica de hibridacion de celulas somaticas estandar de Kohler y Milstein (1975 Nature 256: 495). Muchas tecnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo, transformacion viral u oncogenica de linfocitos B.

Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La produccion de hibridoma en el raton es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y tecnicas de inmunizacion para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusion son conocidos en la tecnica. Los companeros de fusion (por ejemplo, las celulas de mieloma de murino) y los procedimientos de fusion tambien son conocidos.

Los anticuerpos quimericos o humanizados comprendidos en las composiciones de la presente invencion se pueden preparar en base a la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describio anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera puede obtenerse a partir del hibridoma murino de interes y modificado para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) usando tecnicas de biologia molecular convencionales. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, las regiones variables murinas se pueden unir a regiones constantes humanas usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 4.816.567). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino pueden insertarse en un marco humano usando metodos conocidos en la tecnica (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370).

En una determinada realizacion, los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra ActRIIB pueden generarse utilizando ratones transgenicos o transcromosomicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema del raton. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen ratones a los que se hace referencia en esta memoria como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en este documento como "ratones Ig humanos".

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El raton HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene un miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (g y y) y de cadena ligera k humana no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endogenos de la cadena g y k (vease por ejemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas introducidos experimentan cambio de clase y mutacion somatica para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad. (Lonberg, N. et al., 1994 [citada mas arriba]; revisada Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparacion y el uso de ratones HuMAn, y las modificaciones del genoma llevadas a cabo por tales ratones, se describen con mas detalle en Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. Veanse ademas las patentes de Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429; y 5.545.807; asi como los documentos WO92/103918, WO93/12227, WO94/25585, WO97/113852, WO98/24884; WO99/45962; y

WO01/14424.

En otra realizacion, los anticuerpos humanos comprendidos en las composiciones de la invencion se pueden generar utilizando un raton que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas tales como un raton que porta un transgen de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en la presente memoria "ratones KM", se describen en detalle en el documento WO02/43478.

Aun mas, los sistemas de animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y pueden usarse para generar anticuerpos anti-ActRIIB de la invencion. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgenico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963.

Ademas, los sistemas animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana estan disponibles en la tecnica y pueden usarse para generar anticuerpos anti-ActRIIB de la invencion. Por ejemplo, pueden usarse ratones que portan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 722-727. Ademas, las vacas que portan transcromosomas de la cadena pesada y ligera humana se han descrito en la tecnica (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20: 889-894) y pueden usarse para generar anticuerpos anti-ActRIIB.

Los anticuerpos recombinantes humanos comprendidos en las composiciones de la invencion tambien se pueden preparar usando metodos de presentacion en fagos para explorar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Dichos metodos de presentacion en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la tecnica o se describen en los ejemplos a continuacion. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081.

Los anticuerpos monoclonales humanos comprendidos en las composiciones de la invencion tambien se pueden preparar usando ratones SCID en los que las celulas inmunes humanas se han reconstituido de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunizacion. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.476.996 y 5.698.767.

Generacion de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos comprendidos en las composiciones de la invencion, los esplenocitos y/o celulas de ganglios linfaticos de ratones inmunizados se pueden aislar y fusionar a una linea celular inmortalizada apropiada, tal como una linea celular de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes pueden cribarse para la produccion de anticuerpos especificos de antigeno. Por ejemplo, las suspensiones de celulas individuales de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados se pueden fusionar a un sexto del numero de celulas de mieloma de raton no secretoras de P3X63-Ag8.653 (ATCC, cRl 1580) con 50% de PEG. Las celulas se siembran en placa a aproximadamente 2 x 145 en placas de microtitulacion de fondo plano, seguido de una incubacion de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de suero de clonacion fetal, 18% de medios condicionados “653”, 5% de origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, Piruvato sodico 1 mM, HEPES 5 mM, 2- mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina y HAT 1X (Sigma; el HAT se agrega 24 horas despues de la fusion). Despues de aproximadamente dos semanas, las celulas pueden cultivarse en un medio en el que el HAT se reemplaza por HT. Los pozos individuales pueden luego cribarse mediante ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se produce un crecimiento extenso del hibridoma, se puede observar el medio por lo general despues de 10-14 dias. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden se pueden sembrar en placa nuevamente, cribar de nuevo, y si

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todavia son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces mediante dilucion limitante. Los subclones estables pueden luego cultivarse in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo tisular para su caracterizacion.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, se pueden hacer crecer hibridomas seleccionados en frascos giratorios de dos litros para la purificacion de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografia de afinidad con proteina A-sefarosa (Pharmacia). La IgG eluida puede controlarse mediante electroforesis en gel y cromatografia liquida de alta resolucion para garantizar la pureza. La solucion reguladora puede intercambiarse en PBS y la concentracion puede determinarse mediante DO280 utilizando un coeficiente de extincion de 1,43. Se pueden tomar alicuotas de anticuerpos monoclonales y almacenar a -80°C.

Generacion de transfectomas productores de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion tambien pueden producirse en un transfectoma de celula huesped usando, por ejemplo, una combinacion de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfeccion genica como es bien conocido en la tecnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, se pueden obtener ADN que codifican cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, mediante tecnicas estandar de biologia molecular (por ejemplo, amplificacion de PCR o clonacion de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interes) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresion de manera que los genes se unan operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, el termino "unido operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control de transcripcion y traduccion dentro del vector cumplan su funcion prevista de regular la transcripcion y traduccion del gen de anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eligen para que sean compatibles con la celula huesped de expresion utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, mas tipicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion por metodos estandar (por ejemplo, ligacion de sitios de restriccion complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligamiento del extremo romo si no estan presentes sitios de restriccion). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos aqui pueden usarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertandolos en vectores de expresion que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y constante de la cadena ligera del isotipo deseado de modo que el segmento Vh esta operativamente enlazado al segmento o segmentos CH dentro del vector y el segmento Vl esta operativamente enlazado al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido senal que facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo desde una celula huesped. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el peptido senal se une en el marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoglobulina o un peptido senal heterologo (es decir, un peptido senal de una proteina no inmunoglobulinica).

Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes de la invencion portan secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula huesped. El termino "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de la cadena del anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca 1990). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluida la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de la proteina deseada, etc. Las secuencias reguladoras para la expresion de celulas huesped de mamifero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de proteinas en celulas de mamiferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de simio (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Alternativamente, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de P-globina. Aun ademas, elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repeticion terminal larga del virus de la leucemia de celulas T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al., 1988). Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).

Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas huesped (por ejemplo, origenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas huesped en las que se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, tipicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas huesped dhfr con seleccion/amplificacion de metotrexato) y el gen neo (para la seleccion de G418). Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, el vector o vectores de expresion que

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codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una celula huesped mediante tecnicas estandar. Las diversas formas del termino "transfeccion" pretenden abarcar una amplia variedad de tecnicas utilizadas comunmente para la introduccion de ADN exogeno en una celula huesped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y similares. Teoricamente es posible expresar los anticuerpos de la invencion en celulas huesped procariotas o eucariotas. La expresion de anticuerpos en celulas eucariotas, en particular celulas huesped de mamifero, se discute porque tales celulas eucariotas, y en particular celulas de mamifero, son mas propensas que las celulas procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo inmunologicamente activo y plegado adecuadamente. Se ha informado que la expresion procariota de genes de anticuerpos es ineficaz para la produccion de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M.A. y Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6: 12-13).

Las celulas huesped de mamifero para expresar los anticuerpos recombinantes comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (que incluyen celulas dhfr-CHO, descritas por Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 4216-4220 usado con un marcador seleccionable DH FR, por ejemplo como se describe en RJ Kaufman y PA Sharp, 1982 Mol. Biol. 159: 601-621), celulas de mieloma NSO, celulas COS y celulas SP2. En una realizacion, las celulas huesped son celulas CHO K1PD. En particular, para el uso con celulas de mieloma NSO, otro sistema de expresion es el sistema de expresion del gen GS mostrado en los documentos WO87/04462, WO89/01036 y EP 338.841. Las celulas huesped de mamifero para expresar los anticuerpos recombinantes comprendidos en las composiciones de la invencion incluyen lineas celulares de mamifero deficientes para la expresion del gen FUT8, por ejemplo como se describe en la patente de Estados Unidos No. 6.946.292 B2. Cuando los vectores de expresion recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en celulas huesped de mamifero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas huesped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped o la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el que las celulas huesped crecen. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando metodos estandar de purificacion de proteinas.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invencion presenta composiciones que comprenden un anticuerpo anti-ActRIIB, o un fragmento del mismo, conjugado con un residuo terapeutico, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan aqui "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las celulas (por ejemplo, las mata).

Las citotoxinas se pueden conjugar con anticuerpos de la invencion usando tecnologia de enlazador disponible en la tecnica. Los ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen peptidos. Puede elegirse un enlazador que es, por ejemplo, susceptible de escision por pH bajo dentro del compartimento lisosomico o susceptible de escision por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).

Para una discusion adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y metodos para conjugar agentes terapeuticos con anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al., Adv. 2003. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52: 328 - 337; Payne, G. 2003 Cancer Cell 3: 207 - 212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2: 750 - 763; Pastan, I. y Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Los anticuerpos comprendidos en las composiciones de la presente invencion tambien se pueden conjugar con un isotopo radiactivo para generar productos radiofarmaceuticos citotoxicos, tambien denominados radioinmunoconjugados. Los ejemplos de isotopos radiactivos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso diagnostico o terapeutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Los metodos para preparar radioinmunoconjugados se establecen en la tecnica. Los ejemplos de radioinmunoconjugados estan disponibles en el mercado, incluidos ZevalinMR (DEC Pharmaceuticals) y BexxarMR (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden usar metodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.

Los conjugados de anticuerpos comprendidos en las composiciones de la invencion se pueden usar para modificar una respuesta biologica dada, y el residuo de farmaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapeuticos quimicos clasicos. Por ejemplo, el residuo de farmaco puede ser una proteina o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales proteinas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteina tal como factor de necrosis tumoral o interferon-Y; o modificadores de la respuesta biologica, tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina 1 ("IL-1"), interleuquina 2 ("IL-2"), interleuquina 6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

Las tecnicas para conjugar dicho residuo terapeutico con anticuerpos son bien conocidas, vease, por ejemplo, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer

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Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), paginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), paginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), paginas 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Composiciones farmaceuticas

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene uno o una combinacion de los anticuerpos/anticuerpos monoclonales descritos anteriormente, o una porcion o porciones de union a antigeno de los mismos, formulados junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinacion de (por ejemplo, dos o mas diferentes) los anticuerpos descritos, o inmunoconjugados o moleculas biespecificas. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la invencion puede comprender una combinacion de anticuerpos que se unen a diferentes epitopos en el antigeno objetivo o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion tambien se pueden administrar en terapia de combinacion, es decir combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo anti-ActRIIB de la presente invencion combinado con al menos otro agente que aumenta la masa muscular/fuerza, por ejemplo, IGF-1, IGF-2 o variantes de IGF-1 o IGF-2, un anticuerpo antimiostatina, un propeptido de miostatina, una proteina senuelo de miostatina que se une a ActRIIB pero no lo activa, un agonista beta 2, un agonista de Ghrelin, un SARM, agonistas/mimeticos de GH o folistatina. Los ejemplos de agentes terapeuticos que pueden usarse en terapia de combinacion se describen con mayor detalle a continuacion en la seccion sobre usos de los anticuerpos de la invencion.

Como se usa en el presente documento, "vehiculo farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes retardadores de la absorcion e isotonicos, y similares que son fisiologicamente compatibles. El vehiculo debe ser adecuado para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, mediante inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molecula biespecifica, se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la accion de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. Una "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto precursor y no imparte ningun efecto toxicologico no deseado (vease, por ejemplo, Berge, SM, et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acidos y sales de adicion de bases. Las sales de adicion de acido incluyen las derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tales como clorhidrico, nitrico, fosforico, sulfurico, bromhidrico, yodhidrico, fosforoso y similares, asi como de acidos organicos no toxicos tales como acidos alifaticos mono y dicarboxilicos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos y similares. Las sales de adicion de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares.

Una composicion farmaceutica de la invencion tambien puede incluir un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como acido citrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.

Los ejemplos de vehiculos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmaceuticas de la invencion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilizacion, citados mas arriba, como mediante la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenolsorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio y similares en las

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composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusion de agentes que retrasan la absorcion, tales como el monoestearato de aluminio y la gelatina.

Los vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Compuestos activos suplementarios tambien se pueden incorporar en las composiciones.

Las composiciones terapeuticas tipicamente deben ser esteriles y estables bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El vehiculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede realizar incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de agentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por microfiltracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros agentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion son secado al vacio y secado por congelacion (liofilizacion) que producen un polvo del agente activo mas cualquier agente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada del mismo.

La cantidad de agente activo que puede combinarse con un material portador para producir una unica forma de dosificacion variara dependiendo del sujeto que se esta tratando, y del modo particular de administracion. La cantidad de agente activo que se puede combinar con un material portador para producir una unica forma de dosificacion generalmente sera la cantidad de la composicion que produce un efecto terapeutico. Generalmente, de cien por ciento, esta cantidad variara de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de agente activo, de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, o de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de agente activo. en combinacion con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Los regimenes de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un unico bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun lo indicado por las exigencias de la situacion terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La forma de unidad de dosificacion como se usa en el presente documento se refiere a unidades fisicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehiculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de unidad de dosificacion de la invencion esta dictada y depende directamente de las caracteristicas unicas del compuesto activo y del efecto terapeutico particular que debe lograrse, y las limitaciones inherentes en la tecnica de composicion de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administracion la composicion que comprende el anticuerpo, la dosificacion del anticuerpo varia de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas habitualmente de 0,01 a 30 mg/kg, del peso corporal del huesped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de aproximadamente 0,3 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal o aproximadamente 30 mg/kg peso corporal dentro de los intervalos de aproximadamente 1-10 mg/kg o aproximadamente 3-7 mg/kg. Un ejemplo de un regimen de tratamiento implica administracion una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a seis meses. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse aproximadamente una vez al ano o una sola vez. Dicha administracion puede llevarse a cabo por via intravenosa o subcutanea. Los regimenes de dosificacion para un anticuerpo anti-ActRIIB de la invencion incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por administracion intravenosa, administrandose el anticuerpo usando uno de los siguientes esquemas de dosificacion: cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; cada tres semanas; 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

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La dosificacion deberia ser una que provoque un aumento del BAT sin aumentar los niveles de globulos rojos en un sujeto. En algunos metodos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de union estan comprendidos en las composiciones de la invencion y, por lo tanto, se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo generalmente se administra en multiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones unicas pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Los intervalos tambien pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles sanguineos de anticuerpos contra el antigeno objetivo en el paciente. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para alcanzar una concentracion de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1.000 pg/mL y en algunos metodos aproximadamente 25-300 pg/mL. Por ejemplo, un anticuerpo ActRIIB de la invencion podria administrarse conjuntamente con un anticuerpo antimiostatina.

Alternativamente, la composicion puede ser una formulacion de liberacion sostenida, en cuyo caso se requiere una administracion menos frecuente. La dosis y la frecuencia varian dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida mas larga, seguidos por anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosificacion y la frecuencia de administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, se administra una dosificacion relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo periodo de tiempo. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, a veces se requiere una dosificacion relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresion de la enfermedad se reduce o finaliza o hasta que el paciente muestra una mejoria parcial o completa de los sintomas de la enfermedad. A partir de entonces, al paciente se le puede administrar un regimen profilactico.

Los niveles de dosificacion reales de los agentes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden variar para obtener una cantidad del agente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente particular, composicion y modo de administracion, sin ser toxica para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de una variedad de factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion empleadas, o el ester, sal o amida de los mismos, la via de administracion, el tiempo de administracion, la tasa de excrecion del compuesto particular que se emplea, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combinacion con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado, la salud general y el historial medico previo del paciente tratado, y factores bien conocidos en las artes medicas.

La administracion de una "dosificacion terapeuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-ActRIIB comprendido en las composiciones de la invencion puede dar como resultado una disminucion en la gravedad de los sintomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duracion de los periodos sin sintomas de la enfermedad, o una prevencion del deterioro o la discapacidad debido a la afliccion de la enfermedad, es decir, un aumento en la masa muscular y/o la fuerza.

Una composicion de la presente invencion se puede administrar mediante una o mas vias de administracion usando uno o mas de una variedad de metodos conocidos en la tecnica. Como apreciara el experto en la materia, la ruta y/o el modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administracion para anticuerpos de la invencion incluyen vias de administracion intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, espinal u otras vias parenterales, por ejemplo mediante inyeccion o infusion. La frase "administracion parenteral" como se usa en este documento significa modos de administracion distintos de la administracion enteral y topica, habitualmente mediante inyeccion, e incluye, sin limitacion inyeccion e infusion, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. En una realizacion, la composicion que comprende el anticuerpo se administra por via intravenosa. En otra realizacion, el anticuerpo se administra por via subcutanea. Alternativamente, un anticuerpo que comprende la composicion de la invencion puede administrarse por una ruta no parenteral, tal como una ruta de administracion topica, epidermica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o topica.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehiculos que protegeran el compuesto contra la liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes, parches transdermicos y sistemas de administracion microencapsulados. Se pueden usar polimeros biodegradables y biocompatibles, como acetato de vinil etileno, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son conocidos en general por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapeuticas se pueden administrar con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una realizacion, una composicion terapeutica de la invencion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermica sin aguja, tal como los dispositivos mostrados en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 o 4.596.556. Ejemplos de implantes bien conocidos y modulos utiles en la presente invencion incluyen: la patente de los Estados Unidos No. 4.487.603, que muestra una bomba de microinfusion implantable para dispensar medicamentos a una velocidad controlada; la patente de los Estados Unidos No. 4.486.194, que muestra un dispositivo terapeutico para administrar

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medicamentos a traves de la piel; la patente de los Estados Unidos No. 4.447.233, que muestra una bomba de infusion de medicamentos para administrar la medicacion a una velocidad de infusion precisa; la patente de los Estados Unidos No. 4.447.224, que muestra un aparato de infusion implantable de flujo variable para la administracion continua de farmacos; la patente de los Estados Unidos No. 4.439.196, que muestra un sistema osmotico de administracion de farmacos que tiene compartimentos de multiples camaras; y la patente de los Estados Unidos No. 4.475.196, que muestra un sistema osmotico de suministro de farmaco. Muchos otros implantes, sistemas de suministro y modulos de este tipo son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen los fabricados por MicroCHIPSMR (Bedford, MA).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos que comprenden la composicion de la invencion se pueden formular para asegurar la distribucion apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para asegurar que los compuestos terapeuticos de la invencion cruzan la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los metodos de fabricacion de liposomas, veanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o mas residuos que se transportan selectivamente a celulas u organos especificos, mejorando asi la administracion dirigida del farmaco (vease, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol., 29: 685). Los ejemplos de residuos de direccionamiento incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.416.016); manosidasa (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother., 39: 180); un receptor de proteina A surfactante (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269: 9090); vease tambien K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imnunomethods 4: 273.

Usos y metodos de la invencion

La invencion tambien se refiere al uso de un anticuerpo anti-ActRIIB como se define en las presentes reivindicaciones en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno metabolico, particularmente obesidad, diabetes tipo 2, sindrome metabolico, lipodistrofia, tolerancia alterada a la glucosa, concentraciones elevadas de insulina en plasma, resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertension, enfermedad cardiovascular o problemas respiratorios o para disminuir la concentracion promedio de glucosa en plasma, controlar la homeostasis de la glucosa o la sensibilidad a la insulina.

Los metodos son particularmente adecuados para tratar, prevenir o mejorar trastornos metabolicos.

La divulgacion tambien se refiere a los metodos para tratar a un sujeto que padece un trastorno metabolico y una enfermedad o trastorno musculoesqueletico, tal como atrofia muscular. La atrofia muscular puede ser sarcopenia asociada a la obesidad, sarcopenia o atrofia muscular asociada a la diabetes.

Existen muchas causas de atrofia muscular, incluso como resultado del tratamiento con un glucocorticoide como cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona o prednisolona. La atrofia muscular tambien puede ser el resultado de una denervacion debida a un traumatismo nervioso o un resultado de neuropatia degenerativa, metabolica o inflamatoria (por ejemplo, sindrome de Guillian-Barre, neuropatia periferica o exposicion a toxinas o farmacos ambientales). Ademas, la atrofia muscular puede ser un resultado de miopatia, tal como la miotonia; una miopatia congenita, que incluye miopatia nemalinica, miopatia multi/minicore y miopatia miotubular (centronuclear); miopatia mitocondrial; paralisis periodica familiar; miopatia inflamatoria; miopatia metabolica, tal como la causada por una enfermedad de almacenamiento de glucogeno o lipidos; dermatomiositisis; polimiositis; miositis por cuerpos de inclusion; miositis osificante; rabdomiolisis y mioglobinurias. Otras afecciones que conducen a enfermedades musculoesqueleticas o atrofia muscular se describieron en detalle anteriormente. Los resultados del tratamiento pueden ser completos, por ejemplo, la ausencia total de un trastorno metabolico. Los resultados tambien pueden ser parciales, de manera que la peculiaridad del trastorno metabolico en un sujeto es estadisticamente significativamente menos pronunciada que si el sujeto no hubiera recibido una composicion de la presente invencion. Los resultados parciales del tratamiento pueden ser una disminucion en la gravedad de los sintomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duracion de los periodos libres de sintomas de la enfermedad, o una prevencion del deterioro o la discapacidad debido a la enfermedad. Una afeccion relacionada con la edad como se menciona en este documento puede comenzar a la edad de 50 anos o mas (es decir, 60, 70, 80 o mas).

En una realizacion, un paciente puede tratarse previamente con un anticuerpo anti-ActRIIB o una composicion de acuerdo con las presentes reivindicaciones antes de un periodo anticipado de descanso/inactividad forzada. Tal periodo puede ocurrir cuando un paciente ingresa en un hospital, por ejemplo para una cirugia en la cadera o la pierna. La inactividad puede estar localizada, por ejemplo, al enyesar una extremidad o articulacion rota, o por la administracion de un agente paralizante.

En una realizacion adicional, el paciente puede ser uno que no ha respondido a tratamientos previos. Por ejemplo, el paciente puede no haber respondido al tratamiento con IGF-1, IGF-2 o variantes de IGF-1 o IGF-2, un anticuerpo antimiostatina, un propeptido de miostatina, una proteina senuelo de miostatina que se une a ActRIIB pero no lo activa, un agonista beta 2, un agonista de Ghrelin, un SARM, agonistas/mimeticos de GH o folistatina. Una manera

simple de medir la respuesta de un paciente al tratamiento puede ser cronometrar el tiempo que le toma a un paciente subir una altura conocida de las escaleras y comparar los resultados antes y despues del tratamiento.

Los anticuerpos ActRIIB se pueden administrar como el unico agente activo o junto con, por ejemplo, un adyuvante para, o en combinacion con, otros medicamentos, por ejemplo, IGF-1, IGF-2 o variantes de IGF-1 o IGF-2, un 5 anticuerpo antimiostatina, un propeptido de miostatina, una proteina senuelo de miostatina que se une a ActRIIB pero no lo activa, un agonista beta 2, un agonista de Ghrelin, un SARM, agonistas/mimeticos de GH o folistatina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invencion pueden usarse en combinacion con un mimetico de IGF-1 como se divulga en el documento WO2007/146689.

De acuerdo con lo anterior, la presente invencion proporciona un aspecto incluso adicional:

10 Un metodo o uso como se definio anteriormente que comprende la administracion conjunta, por ejemplo de forma concomitante o en secuencia, de una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo ActRIIB y al menos una segunda sustancia farmacologica, siendo dicha segunda sustancia farmacologica IGF-1, IGF-2 o variantes de IGF-1 o IGF-2, un anticuerpo antimiostatina, un propeptido de miostatina, una proteina senuelo de miostatina que se une a ActRIIB pero no lo activa, un agonista de beta 2, un agonista de Ghrelin, un SARM, agonistas/mimeticos de GH o 15 folistatina.

Secuencias

Tabla 1: listado de secuencias

SEQ ID NO: Region de Ab Secuencia

SEQ ID NO 1: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 2: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 3: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 4: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 5: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 6: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 7: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 8: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 9: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO 10: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO11: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO12: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO13: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO14: HCDR1 GYTFTSSYIN

SEQ ID NO15: HCDR2 TINPVSGNTSYAQKFQG

SEQ ID NO16: HCDR2 TINPVSGNTSYAQKFQG

SEQ ID NO17: HCDR2 TINPVSGNTSYAQKFQG

SEQ ID NO18: HCDR2 TINPVSGNTSYAQKFQG

SEQ ID NO19: HCDR2 MINAPIGTTRYAQKFQG

SEQ ID NO20: HCDR2 QINAASGMTRYAQKFQG

SEQ ID NO21: HCDR2 MINAPIGTTRYAQKFQG

SEQ ID NO22: HCDR2 TINPVSGNTRYAQKFQG

SEQ ID NO23: HCDR2 TINPVSGSTSYAQKFQG

SEQ ID NO24: HCDR2 QINAASGMTRYAQKFQG

SEQ ID NO25: HCDR2 NINAAAGITLYAQKFQG

SEQ ID NO26: HCDR2 TINPPTGGTYYAQKFQG

SEQ ID NO27: HCDR2 GINPPAGTTSYAQKFQG

SEQ ID NO28: HCDR2 NINPATGHADYAQKFQG

SEQ ID NO29: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO30: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO31: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO32: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO33: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO34: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO35: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO36: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO37: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO38: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO39: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO40: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO41: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO42: HCDR3 GGWFDY

SEQ ID NO43: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO44: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO45: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO46: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO47: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO48: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO49: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO50: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO51: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO52: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO53: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO54: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO55: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO56: LCDR1 TGTSSDVGSYNYVN

SEQ ID NO57: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO58: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO59: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO60: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO61: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO62: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO63: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO64: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO65: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO66: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO67: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO68: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO69: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO70: LDCR2 LMIYGVSKRPS

SEQ ID NO71: LCDR3 QAWTSKMAG

SEQ ID NO72: LCDR3 SSYTRMGHP

SEQ ID NO73: LCDR3 ATYGKGVTPP

SEQ ID NO74: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO75: LCDR3 QAWTSKMAG

SEQ ID NO76: LCDR3 QAWTSKMAG

SEQ ID NO77: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO78: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 79: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 80: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 81: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 82: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 83: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 84: LCDR3 GTFAGGSYYG

SEQ ID NO 85: VL Dl ALTQPASVSaSPGOaTI OCTGTSSDVGSY NYV NWYQQH PGKAPK LMIYGV5KFLPSGV SNR FSGSKSG NTASLTI S<3 LQAED EADYYCQAWTSKMAGVFGGGTKLTV LGQ

EQ ID NO 86: VL DIALTQ PASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNYVNWYQQH PG KAPKLMIYGVSKRPSGV SNR FSGS KSGNTASLT1SG LQAE PEA DYYC SSYTRMGHRVFGGGT KLTVLGQ

SEQ ID NO 87: VL DIALTQ PASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNYVNWYQQH PG KAPKLMI YGVSKRPSGV SMR FSGS KSGNTASLT1SG LQAE PEA DYYCATYG KGVT PPV FGG GTKLTVL GQ

SEQ ID NO 88: VL DIALTQ PASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNYVNWYQQH pq KAPKLMI YG VSKRPSGV SMR FSGS KSGNTASLT1SG LQAE PEA DYYC GTFAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQ

SEQ ID NO 89: VL DIALTQP ASVSGS PGQSITIISCTGTSSDVGSYNYV WWYQQHPGKAP K LMIYGVSK RRSGV SNRFSGSKGG WTAS LTISGLQAED EA D YYCQAWTSKMAGVFGGGTKLTVLGQ

SEQ ID NO 90: VL Dl A LTQPASVSGSPGQSITI SCTGTSSDVGSYN YVNWYQQPl PG KAPKLMI YGVSK RPSGV SN RFSGS KS GNTAS LTISGLQA EDEADYYCQAWTSKMA GVFGGGTKLTVLGQ

SEQ ID NO 91: VL DIALTQP ASVSGSPGQSITIISCTGTSSDVGSYNYV WWYQQHPGKAP K LMI YGVSK RPSGV SN R FSGSKSG WTAS1 TISGLQAEP EA DYYC GTFAGGSYYGVFGGGTKL.TVLGQ

SEQ ID NO 92: VL DIALTQ P AS VSG5PGQ5ITI5CT GTSSD VGSYN YVNW YQQH PG KAPKLMI YGVSK RPSGV SMR FSGSKSGNTASLT1SG LQAE PEA PYYC GTFAGGSYYGVFGGGTKLTVLGQ

SEQ ID NO 93: VL DIALTQ PASVSGSPGQSITI5CTGTSSDVGSYNYVNW YQQH PGKAPKLMIYGVSKRPSGV SN RFSGSKSGMTASLTI5GI-QAE0 EA PYYCGTFAGGSYYGVFGGGTK LTV LGQ

SEQ ID NO 94: VL DIALTQP ASVSGSPGQSI TIISCTGTSSDVGSYNYV WWYQQHPGKAP K LMI YGVSK RPSGV SN R FSGSKSG WTAS 1 TISGLQAEP EA DYYC GTFAGGSYYGVFGGGTKL .TV LGQ

SEQ ID NO 95: VL DIALTQP ASVSGSPGQSI TIISCTGTSSDVGSYNYV WWYQQHPGKAP K LMI YGVSK RPSGV SN R FSGSKSG WTAS 1 TISGLQAEP EA DYYC GTFAGGSYYGVFGGGTKL .TV LGQ

SEQ ID NO 96: VL LMALTQPAS VStiSFCiQSlTl EC TQTSSDVGEYN Y V NWYOOH POKAPKLMI YG VSKfiPSQV SNR FSGS KSGNTASLTi SG LQAE PEA DYYCGTFAGGSYYSVFGGGTK LTVLGQ

SEQ ID NO 97: VL Dl ALTQPAS VSGSPGQSITI5CTGTSSD VGSYN YVNW YQQH PGKAPKLMIYGVSKRPSGV SN RFSGS KS GNTAS ITISGLQAEDFADYYCGTFAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQ

SEQ ID NO 98: VL DIALTQ PASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYNYVNWYQQH PG KAPKLMI YG VSKRPSGV SNR FSGS KSGNTASLT1SG LQAE DEA DYYC GTFAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQ

SEQ ID NO 99: VH QVQL VQSGAEVKKPGAS VKVSCKASG YTFTSSYINWVRQAPGQGL EWMGTINPVSGNT SYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 100: VH QVQL VQSGAEVKKPGAS VKVSCKASG YTFTSSY INWVRQAPGQGL EWMGTI NPVSGNT SYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 101: VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSYINIWVRQAPGQGLEWMGTI NPVSGNT SYAQ K FQG RVTMTRDTSIST AYME LSSLRSE DTAVYYCA RGGWF DYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 102: VH QVQL VQSGAEVKKPGAS VKVSCKASG YTFTSSY INWVRQAPGQGL EWMGTI NPVSGNT SYAQKFQGRVTWRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 103: VH QVQLVQSGAE V KK P GA SVKVSCKASGYTFTSSYINWVRQAPGQGLEWMGM1WAPIGTTR YAQK FQGHVTMTR DTSIST AYM ELSSLRS E DTAVYYCARGGW FDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 104: VH QVQL VQSGAEV K K PGASVKVSCKASGYTFTSSYIN WVRQAP GQGL EW MGQ1NAASGMT RYAQKFQGRVTTjITRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAF G6W FDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 105: VH QVQ L VQSGAEV K KFGASVKVSCKASGYTFTSSYINWVRQAPGQGL EWMGMINAPIGTTR YAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 106: VH QVQLVQSGAEVKKPGA SVKVSCKASGYTFTSSYINW VHQAPGQGLEWMGTTNPVSG NT RY AQKFQGRVTMTR D_SLSTAYMELSS L RSE DTAVYYCARGGW FDYWGQGTLVTVS S

SEQ ID NO 107: VH QVQLYQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSEYINWVRQAPGQGLEWMGTINPVSGST SYAQKFQGRVTW RDTSI ETA YMELSS LRSE DTAVYYCAR GK3W FDYWG QGTLV TVS 5

SEQ ID NO 108: VH QVQLVQSGAEV K KPGAE VKVSC KASGYTFTSSYINW VRQAPGQGLEW M GQINAASGMT RYAQK FQGRVTMTRDTSI STA YMELSS LRSF DTAVYYCARGGW FDYWGQGTI ,VTVSS

SEQ ID NO 109: VH QVQLVQEGAEVKKPGASVKVECKASGYTFTSEYINWVRQAPGQGLEWMGNINAAAGITL YAQK FQG RVTMTP DTSISTAYW E L SSL RSEGTAVYYCA RGGW FDYWGGGTLVTVSS

SEQ ID NO 110: VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSYINWVRQAPQQGLEWMGTINPFTGGT YYAGK FQG RVTMTR0TS1ST AYME LSSLRSE DT AVYYCA RGGWF DYWGiQGTLVTVSS

SEQ ID NO 111: VH OVQLVQSGA EV KKPGASVKVSCKASGYTFTSSYINWVRQ APGQGL EW MGGINPPAGTT SYAQKFGGRVTMTRDTEISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO 112: VH QVQLVQSGAEV KKFG A SVKVS CKASG YTFTSSYINWVRQAFGQGL EWMG MIN PATGHA DYAQK FQGRVTMTHDTSISTA YMELSSLRSE DTAVYYC A RGGYV FDYWGQGTLVTYSS

SEQ ID NO 113: ADN VL GATATCGCACTGACCCAGCCAaCT TCAGTGAGCGGC TCACCAGGTCAGAGCATTACC ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTGTTATAATTATGTGAAT-GGTACC agcagcatcccgggaaggcgccgaaacttatgatttatggtgtttctaagcgtccct CAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGACC attagcggcctgcaagcggaagacgaagcggattattattgccaggcttggacttct AAGATGGCTGGTGTGTTTGGCGGCGGCAC-GAAGTTAACCGTTQTTGGCCAG

SEQ ID NO 114: ADN VL gat atcgcagtgacccaggc agg ttcag tgag cggctcaccaggtcaga g cattacc ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCTTATAATTATOTGAATTGGTAQC agcagcatcccgggaaggcgccgaaacttatgatttatggtgtt-ctaagcgtccgt caggggtgagcaaccgttttagcggatccaaaaggggcaacaccgcgagcctgacc AT 'AGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATT AT TGCTCTT CTTATACTCGTA TGGGTCATCCTGTGr_rGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 115: ADN VL GATATCGCACT GACCCAGCCAGCT TCAG TGAGCGGCTCACCAGG TCAGAGCATTAGC ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATCTTCCTTC^ATAATTA-GTGAATTGGTACC AGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGT-TCTAAGCG-CCCT GAGGCGTGAG GAACCGTTTTAGC G GATCCAAAAGGGGCAACACCGCGAGCCTGACC ATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGCTACTTATGGTAAG GGTGTTACTGGTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACGGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 116: ADN VL gata r CGCACT GACCCAGCCAGCT TCAGTGAGCGGCTCACC AGGTCAGAGCATT ACC atctggtgtacgggtagtagcagcgatgttggttgttataattatgtgaattggtacc AGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCCT CAGGCGTGAGGAACCGTTTTAGGGGATCCAAAAGGGGCAACACGGCGAGCCTGACC ATTAQCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGAUATTATTGCGGTACTTTTGCTGGT ggttcttattatggtgtgtttggcggcggcacqaagttaaccqttcttgggcag

SEQ ID NO 117: ADN VL GATATCGCACTGACCCAGCCAGCTTCAGTGAGCGGCTCACCAGGTCAGAGCATTACC ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCTTATAAT ATGTGAATTGGTA CC AGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACT"ATGATTTA_GGTGTTTCTAAGCGTCCCT CAGGCGTGAPCAAGCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGAGC ATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGAGGCTTGGACTTCT AAGATGGCTGGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAAC-CGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 118: ADN VL GATATCGCACT GACCGAGCCAGCT TCAGTGAGCGGGTCAGCAGGTCAGAGCATTACC atctcgtgtacgggtactagcagcgatgttggttcttatmttatgtgaattggtacc AGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCCT CAGGCGTGAGGAACCGTTTTAGGGGATCCAAAAGGGGCAACACGGCGAGCCTGACC ATTAGCGGCCTG CAAGCGGAAGACGAAGCGGATT ATTATT GCCAGGGTT GGACTTCT aagatggc-ggtgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgttcttggccag

SEQ ID NO 119: ADN VL GAT atcgcact gacgcagccagcttcag tgagcggctcacc agg tcagagcattac c ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCTTATAATTATGTGAATTGGTACC AGGAQCATGCCGGGAAGGGGGGGA AAGTT ATG ATTTATGGTGTTTCT AAGGGTCGCT CAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGACC ATTAGCGGC CTQCAAGCGG AAGAC GAAGC □ GATT ATT ATTGCGGTAGTTTTGCTG GT GGTTCTTATTATGGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 120: ADN VL GATATCGC act gacccagccag ct tcagtgag cggct gag caggtcagagcattag c atctcgtgtacgggtactagcagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtacc agcagcatcccgggaaggcggggaaacttatgatttatggtgtttctaagcgtcgct caggggtgagcaaccgttttagc gg atccaaaag CGGCAACACCGCGAGCCTGACC attagcggcgtgcaagcggaagacgaagcggattattattgcggtacttttgctggt GGTTCTT ATTAT GGTGTGTTTGGCG GCGGCAC GAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 121: ADN VL GATATCGC ACT GACCCAGCCAG CT TCAGTGAG CGGCT CAC CAGGTCAGA GCATTAG C ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCTTATAATTATGTGAATIGGTACC AGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCCT CAGGGGTGAGCAACCGTTTTAGC GG ATCCAAAAG CGGCAACACCGCGAGCCTGACC ATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTTTTGCTGGT ggttcttattatggtgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgttcttggccag

SEQ ID NO 122: ADN VL gat atcgcactgacccaggcagct tcag tgagc GGCTCACCAG G TCAGAGCATT ACC a-ctcgtgtacgggtactagcagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtacc agcagcatcccgggaaggcgccgaaacttatgat^tatggtgtttctaagcgtccct caggggtgagcaaccgttttagcggatccaaaagcggcaacaccgggagcctgacc attagcggcctgcaagcggaagacgaagcggattattattgcggtacttttgctggt ggttcttattatggtgtgtttggcggcggcacgaagttaaccgttcttggccag

SEQ ID NO 123: ADN VL GAT ATCGCACTGACCCAGCCAGCT TCAG TGAGCGGCTCACCAG G TCAGAGCATT AC C A^CTCGTGTAtGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCTTATMTTATGTGAATTGGTACC AGCAGCATCCCGGGAAGGGGCCGAAACTTATGAT~TATGGTGTTTGTAAGCGTCCCT caggggtgagcaaccgttttagcggatccaaaagcggcaacaccgcgagcctgacc ATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTTTTGCTGGT GGTTCTTATTATCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCaTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 124: ADN VL gatatcgcactgacgcagccagcttcagtgagcggctcaccaggtcagagcattacc ATCTCGTGT ACTGGTACTAGCAGC GAT GTTGGTTCTTATAA TT ATGTGAATTGGTACCA GCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTrTCTAAGCGTCCCTC aggcgtgagcaacggtttt agcg gatcgaaaagcggcaa caccgcgagcctgaccat TAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTTTTGCTGGTGG TTCTTATTATGGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 125: ADN VL GATATCGC ACT GACCCAGCCAG CT TCAGTGAG cggct caccaggtcagagcattac c ATCTGGTGTACGGGT AGTAGCAGCGATGTTGGTTGTT ATAATT ATGTGAATTGGTACC agcagcatgccgggaaggcggcgaaacttatgatttatggtgtttctaagcgtcgct CAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGC GG ATCCAAAAG CGGCAACACCGCGAGCCTGACC ATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTTTTGCTGGT GGTTCTT ATTAT GGTGTGTTTGGCG GCGGCAC GAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 126: ADN VL GAT atcgcact gacgcagccagcttc ag tgagcggctcacc agg tcagagcattac c ATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGTTGGTTCnTATAATTATGTGAATTGGTACC AGGAGCATGGCGGGAAGGGGGGGA AAGTT ATG ATTTATGGTGTTTCT AAGGGTCGCT CAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCC AAAAGC GGGAACACCGC GAGCCTGACC ATTAGCGGC CtOGAAGCGG AAGAC GAAGC □ GATT ATT ATTGCGGTAGTTTTGCTG GT GGTTCTTATTATGGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG

SEQ ID NO 127: ADN VH CAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA A A ACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGCTGCAAAGCCTGCGGATATACCTTTAGTTCTTCTTATATTAATTGGGTCCGCC AAQCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCACTATCAATCCGGTTTCTGGCAATA CGTCTTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA gcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattatt GCGCGCGTGGTGGTTGGTI-GATTATTGG6GCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCT CA

SEQ ID NO 128: ADN VH GAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA AA ACCGGGCGC GAGCGI'GAA ACT GAGCT GGAAAGCCT CCGGATAT ACCTTT ACTTCTTCTT ATATT AATT GGGTCCGCG AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCACTATCAATCCGGTTTCTGGCAATA CGTCTTAC G C S CAGAAGTTT GAGGGrC CG G QTGAG GATGl A CC CGTGATAC C AG CA TT A GCACCGGGTATAT GGAAC-T GAGCAGCCTGCGTAG CGAAGAT ACGGCCGTGTATTATT gcgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccctgotgacggttagct CA

SEQ ID NO 129: ADN VH GAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA A A ACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGC TGCAAAGCCTCCGGATATACCT TTACTTCT TCTTATATTAATTGGGTCCGCC AAQCCCCTGGGGAGGGTCTCGAGTGGATGGGCACTATCAATCCGGTTTCTGGCAATA CGTCTTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA ggaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattatt gcgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccotggtgacggttagct CA

SEQ ID NO 130: ADN VH GAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA A A ACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTTCTTCTTATATTAATTGGGTCCGCC aaqcgcctgggcagggtctcgagtggatgggcactatcaatccggtttctggcaata CGTCTTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA gcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattatt GCGCGCGTGGTGGTTGGTI-GATTATTGG6GCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCT CA

SEQ ID NO 131: ADN VH GAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCGGAAGTG AAA AA ACCGGGCGC GAGCG I'GAA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCQGATATACCTTTACTTCTTCITATATTAATTG0GTCCGCC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATGATTAATGCTCCTATTGGTACTA CTCGTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATGACCC6TGATACCAGCATTA GCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATT gcgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccctggtgacggttagct CA

SEQ ID NO 132: ADN VH CAGGTGCAATTGG TTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCGCiATAT AOCTTT ACTTCTTCTTATATTAATT GGGTCCGCG AAGCCCCT GGGCAGG GT CTCGAGT GGAT GG GCGAG ATT AATGCTGCTTCTGGT ATGA CTCGTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGAGCATGACCCGTGATACCAGCATTA gcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattatt GCGCGCGTGGTGGTTGGTTTGATTATTGGG GCCAAGGCAGGCTGGTGA cggtt agct CA

SEQ ID NO 133: ADN VH CAGG-GCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTTCTTCTTATATTAATTGGGTCCGCC aagccgctgggcagggtctcgagtggatgggcatgattaatgctcctattggtacta CTCGTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA GCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCGGTGTATTATT GCGCGCGTGGTGGTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCT CA

SEQ ID NO 134: ADN VH CAGGTGCAATTGGTT cagagcggcgcggaagt g aaaaaaccgggc gcgagcgtgaa agtgagctgcaaagcctccggatatacctttacttcttcttatattaattgggtccgcc AA GCCGCTGG GGAGGGTC TCGAGTG GATG GGCACTATCAATGCGGTTTCTGGCAATA CGCGTTACGCGCAGMGTTTCAGGGCCGGGTGACCATGAGCCGTGATACCAGCATTA GCACGGCGTATATGGAACTGAGCAGGCTGCGTAGCGAAGATACGGGCGTGTArTATT GGGC GGGTGGTGGTTGGTTTGATTATTG GGGGCAAGGCAGCCTGGTG AC GGTTAGGT CA

SEQ ID NO 135: ADN VH CAGGTGCAATTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA A A ACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGCTGCAAAGCGTCCGGATAT ACCTTT AGTTGTTCTT ATATT AATTGGGTCC GCC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCACTATCAATCCGG-TTCTGGCTCTA GGTGTTACGGGCAGAA GTTTGAGGGCCGGGTG ACCATG ACGCG T G ATACGAGC ATT A GCAGCGCGTATATGGAACTG AGG AGCCTGCGTAG CGAAGATACGGCCG TGTATTATT gggggcgtggtggttggtttgattattggggcgaaggcaccctggtgagggttaggt CA

SEQ ID NO 136: ADN VH CAGGrGCAArTGGT TCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAA A A ACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGC TGCAAAGCCT C CGGATATACCT TTACTTCT TCTTATATTAATTGGGTCCGCC AAQCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCCAGATTAATGCTGCTTCTGGTATGA CTCGTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTA gcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgtagcgaagatacggccgtgtattatt GCGCG CGTGGTGG TTG GTTTGATTA TT □ GG GCC AAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCT CA

SEQ ID NO 137: ADN VH CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCG GAAGTGAAAAAACCGGGCGC GAGCGTGAA AGTGAGC TGCAAAGCCTGCGGATATACCTTTACTTGTTCTTATATTAATTGGGTGCGCC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAG7GGATGGGCAATATTAATGCTGCTGCTGGTATTA CTCTTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAG GACCGCGTATATGGAACTGAGGAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTG CGCGCGTGGTGGTTGGTTTGATTATTGJjGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTC A

SEQ ID NO 138: ADN VH CAGGTG CAATTGGT TCAGAGCGGCGC G GAAGTGAAAAA ACC GG GCGCGAGCGTGAA AGTGAGC TGCAAAG CCTCCGGATATACCTTTACTTCT TCTTATA''TAATTGGGTCCGCC AAGCCCGTGGGGAGGGTCTCGAGTGGATG GGCACTATTA ATCCTCGTACTGGAG GTA CTTATTATGCTCAGAAGTT-CAGGGTCGGGTGACCATGACCCGTGATACGAGCATTAG CAGCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTG CGCGGGTGGTGGTTGGTTTGATTATT gggggo a aggcagcgtgqtg acggtt agct g A

SEQ ID NO 139: ADN VH CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGCAAGTGaAAaaACCOGGCGCGAGGGTGAA AGTGAGCT GGAAAGCGTGC GGATATAGCTTTACTTCTTGTT ATATTA ATTGGGTCGGC G AAGGCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATTAATCCTCCTGCTGGTACTA CTTCTTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACCAGCATTAG CACGGCGTATATGGAACTGAGCAGGCTGCGTAGCGAAGATAGGGGCGTGTATTATTG GGGGCGTGGTGGTTGGTTTGATTATTGGGGGGAAGGGACCGTGGTGAGGGTTAGCTC A

SEQ ID NO 140: ADN VH CAGGTQCAATTCsGTTCAGAGCGGCGCCsGAAGTGA aaaaa ccgggcgcga gcgtg AA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATA^ACCTTTACTTCTTCTTATATTAATTGGGTCCGCC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCAATATTAATCGTGCTACTGGTCATG CTGATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATGACCCGTGATACGAGCATTA GCAGCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGGGTAGCGAAGATAGGGCCGTGTATTATT GGGCGCGTGGTGGTTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCT CA

SEQ ID NO 141: Cadena ligera qsaltq p asvsgspgqsitisctgtssdvgsy nyvnwyqq hpgkapk lmi ygvskrpsg VSN RFSGSK BGNT ABUTISGLQAE DEADVYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQPKAAP SVTLFPPSS E E LOAN KATLVC L ISDFY PGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQS NN KYA ASSYLS LTPEQW kshheyscqvth egstve ktvaptecs

SEQ ID NO 142: Cadena ligera QSALTQ P ASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSY NYVNWYQQ HPGKAPK LMI YGVSKRPSG VSN RFSGSK BGNT ABLTISGLQAE DEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQPKAAP SVTLFPPSS E E LOAN KATLVC L ISDFY FGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQS NN KYA ASSYLS LTPEQW KEHREYSCQVTH EGSTVE KTV APTECS

SEQ ID NO 143: Cadena ligera QSALTQ P ASVEGEPGQSITISCTGTSEDVGEY NYVNWYQQ HPGKAPK LMI YGVSKRPSG VSN RFSGSK BGNT ASLTISGLjQAE DEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQPKAAP SVTLFPPSS E E LOAN KATLVC L ISDFY PGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQS NN KYA ASSYLS LTPEQW KSHHSYSCQVTH EGSTVE KTV APTECS

SEQ ID NO 144: Cadena ligera QSALTQPASVSGS PGQSITISCTGTSSDVGSYNYVNWYQQ HPG KAPK LMIYGVSKRPSG VSNRFSGSKSGNTASLTTSGLQAEDEADYYCGTFAGGSYYGVFGGGTKLTVLGQPKAAP


: SVTLF PPSS EELQ ANKATLV C LISDF Y PGAVTVAW KADSS PVKAGVETTTPSKQSNN KYA AESYLSLTPEQW KSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO 145: Cadena ligera QSALTQ P AEVSGEPGQSITISCTGTSSDVGSY NYVNWYQQ HPGKAPK LMI YGVSKRPSG VSN RFSGSK BGNT ABLTISGLjQAE DEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQPKAAP SVTLFPPSS E E LQAN KATLVC L ISDFY PGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQS NN KYA ASSYLS LTPEQW KSHHSYSCQVTH EGSTVE KTV APTECS

SEQ ID NO 146: Cadena pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS ckasg ytftssyi nwv rqapgqg l ewmgti npvsgst SYAGKFQG RVTMTR DTSiSTAYM EL3RLR3 DDT AVY YCARGGW FDYW GQGTLVTVSSA STKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDVFPE PVTV8WNSGAL~SGV HTFPA VLOSS GLYS LSSW TVPSSSLGTOTYlC NVN HK PSNT KV DKRV EPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGG P3V FLFPPK PKDTLMI SR l'PbVTCVVVDVSHE DPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTVRWG VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPCIV VTLPPSRE EMTK NQ VS LTC L VKG F YPSD1A VE WES NGQPE NN YKTTP PVL PSQGSF FLYSK LT VD KSR WOQGNVFSCSWIHEALH NHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO 147: Cadena pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSYINWV RQAPGQG LEWMGQ5NAASGMT RYA QKFQ G RVTMTR DTSISTAYMELSRLHS DCTAVYYGAfi GGWFDYW GQGTLVTVSSA STKGPSYFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL-SGVHTFPAVLOSS GLYS LSSVVTVPSSGLGTQTYIC NVN HK PSNT KVDKRV EPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGG PSV FLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDV SHE DPEVKF NWYVD GVEVH NAKTTK PREEOY NSTY RWSVLTV LFIODW LMGKE YKCKVSN KA LEAP 1EKTI SKAKGqPREPQVYTLPPS RE EMTKNQVS LTC LVKG FYPSDIAVE W £S NGQPENNYK TTP PV LDSDGSF FLYSKLTVD KSR WOQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO 148: Cadena pesada QVQLVQSGAEV KK P GA SVKVSCKA5GYTFTSSYIN WV RQAPGQGLEW MG NrNAAAGITL YAQKFQGRVTfrfrHDTSlSTAYMEL3RLRSDDTAVYYGARGGWFDYWGQGTLVTVS3A3 TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHrFPAVLQSSGL ys lsswtv psss lgtqtyi c nvnhkpsntkvdkrve PKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPS vflfppk PKDTLMlSRTPEVTC m dvsh e dpevkf nwyv dgvevh naktk preeqynst YRVVSVl TVL HQDWLNGKFYKCKV&WKAl PAPIEKTIS-KAKGQPRE PQV YTI FP3REEWT K NQV5LTC LV KG FYP5DIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVD KS FiWq QG N VFSCS VMHE ALH NH YTQKSLSLS PG K

SEQ ID NO 149: Cadena pesada QVQLVQSGA EVKKPGAS VKVSCKASGYTFTSSYINWVRQAFGQQLEWMQGINPPAGTT SYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGWFDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVK DYFPE PVTVS W NSGALTSG VHTFPAV LOGS GLYGLGS WTV PSSSLGTQTYICNYN HKPSNTK V DK RVEPKSCD KTHTC PPCPA P E A AGG PSVFLFF PK PKDTL MISRTF EVTCV VVDVSHE DPEVK FNWYV DGVEV HNAKTK PREEQY NSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAP1 EKTl SKAKGQPR EPGVYT LPPS RE EMTKMaVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENMYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQOGNVFSCSYMH EA LHN HYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO 150: Cadena pesada qvqlvqsqaevkkpgasvkvsckasgytftssyinwv rqapgqg lewmgninpatgha DYA QKFQ Q RVTMTR DTSISTAYMELSRLHS DCTAVYYGAR QGWFDYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAP6SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL_SGVHTFPAVLOSS GLYS LSSVVTVPSSGLGTQTYIC NVN HK PSNT KVDKRV EPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGG PSV FLFPPK PKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPRE COY NSTY R V VS VLTVLHq DW LNGKE YKCK V5N KALPAP 1 EKTl SKAKGQPREPQ V YTLPPS RE EMTKNQVS LTC LVKG PYPSDIAVE W £S NGQPENNYK TTP PV LDSDGSF PLYSKLTVD K3R WOQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO 151: Cadena ligera QSALTQ P ASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSY nyvnwyqq hpgka pk lmi ygvskrpsg VSN RFSGSKSGNT ASLTlSG LGAEDEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTV LGOPKAAP SV TLFPPSS EELQAN KATLVC LlSDFY PGAVTVAW KADSSPVKAGV ETTTPSKQS NN KYA ASSYLS LTPEQW KSHRSYSCQVTH EGSTV E KTV APTECS

SEQ ID NO 152: Cadena ligera QSALTQ PA SV SGS PQQ S ITl SC TGTSS DVGSY NYVtfAfYQQ H PGKAPK LMIYGVSKRPSG VSN R P5GSKSGNTASLTI 5G LQAE DEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTVLGQPKAAP SVTUFPPSSEELQANKAUVCUSDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTFSKQSMVIKYA ASSVLSLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO 153: Cadena ligera QSA LTQPASVSGSPGQSITISCTGTSS DVGS YNYVNW YQQH PG KA PK LMIYGVSKRPSG VS NRFSGSKSGNTASLTISGLQAE DEAQYYGGTF AGG3YYGVF GGGTKLTY LGQ P KAA P SVTLFPPSSEE LQANKATL VCLISDFvPGAVTVA W KADSSPVKA GVETTTPSKQSN NKYA ASS YLSLT P EQ W KSHRS YSCQVTH EGSTVEKTYAPTECS

SEQ ID NO 154: Cadena ligera OSALTQP ASVS GSPGQSIT1SCTGTSSGVGS YNY VNWYQQHPG KAPK LMIYGVSK RPSG VSN RFSGSKSGNTASLTI £G LQAEDEADYYCGTFAGGSYYGVF &GGTK LTV LGQPKAAP 3V TLFPPSS EELQANKATLV C LI SD FYPGAVTVAW KADSS PVKAGV ETTTPSKOS NNKYA ASSYLS LTPEqWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA PTECS

SEQ ID NO 155: Cadena ligera OSALTQ P ASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSY NYV NWYQQ HPGKAPK LMIYGVSKRPSG VSN RFSGSKSGNT ASLTlSG LOAEDEADYYCGT FAGGSYYGVFGGGTK LTV LGQPKAAP SVTLFPPSS EELGAN KATLVC LlSDFY FGAVTVAW KADSSPVKAGV ETTTPSKOG NN KYA ASSYLS LTPEQW KSHRSYSCQVTH EGSTV E KTV APTECS

SEQ ID NO 156: Cadena ligera QVOLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKASGYTFTSSYINWVRQA P GQGLEWMGT1N PVSGST SYAOKFQG RVTWRDTSI STAYMELSR L RSD DTAVYYCAlRGGYV FDYWGQGTLVT VSSA STKGPSVFRLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSW NSGALTSGV HT FPAVLQS&G LYS LSSWTVPSSN FGTGTYTCNVDI-IK PSNTKV DKTVERKCCV ECPPCPAPPV AGPSV FL FPPKPKDTLM IS RT FEVTCWV DVSH E DPEVQ FNWY V DGVEVH NA KTKPR C EGFN STF R VVSVLTVVHOD WLNG K EY KCKVSNKG LPAPl EKTISKTKGQPR E ROVYTLPPSREEWTKN GVSlTClV KGFYPSDIAV EW ES NGQ PE NnY KTT P PMLbS t)GSF FLYSKLTV DKSRWQQG NVFSCSVMH EAL HNHYTQKSLSLSPG K

SEQ ID NO 157: Cadena pesada QVQLVQSGAEVKK PGASVKVS CKASGYTFTSSYINW VRQAPGQG L EWMGQINAASGMT RYAQKFQQRVTMTHDTSlSTAYMELSRLRSDDTAVYYCAHQQWFDYWQQGTLVrVSSA STKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSG LYSLGS WTVPSSNFGTQTYTGNV DH K PSNTKV DKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGP&VFL FPPKPKDTU.1lSRTPEVTCWVDYSl IEDPEVQFNWYVDGVEVI INAKTKPREEOFNSTFft V VS V LT W HQDWLNGKE YKCK VSNKGLPAPlEKTlSKTKGGPRE PQVYTLPPSREEMTKN OVS LTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGGPE NNfY KTTPPMLDSDGSFF LYSK LTVDKSRWOQG NVFSCSVMHEALFIHHYTQKSLSLS PG K

SEQ ID NO 158: Cadena pesada QVOLVQSGAEVKKPG ASVKVSCKASGYTFTSSYIHW VRQAPGOGLEWMG NrNA AA GITL YAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELSR L RSD DTAVYYGARQSWFDYWQQGTLVTVSSAS TKGPSVF P LA PCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPE PVTV5WNS GALTSGV HTFPAVLQSSGL Y3 LSSVVTVPSSNF GTQTYTCNV DH KPSNTKVDKTV ERKGCV ECPPCPAPPVAGPSVFLF PPK PKDT LMI SRTPEVTCVWDVS HED PEVQFNW YVDGV CV HNAKTKPR EEOFNSTF RV VS V LTW HQDWLNG K EYKCKVSN K GLPAPI EKTl 5KTKGOPR EPQVYTLPPSREEMT K NQ VS L7CLVKGF YPSD IAVEIA/ESnGOPEN N'YKtTPfMLDSDgSF FLYS KLTvDKS RWOQGhl vfscsvmhealhnhytqkslslspgk

SEQ ID NO 159: Cadena pesada QVQLVQSGAEVKK PGASVKVS CKASGYTFTSSYIW VRQAPGQG L EWMGGINPPAGTT SYAOKFQaRVTMrRDTSlSTAYWELSRLHSDDTAVYYOARGGlWFDYVYGOGTLVTVSSA STKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSG LYSLSSWTVPSSNFQTCJTYTCNV DH K PSNTKV DKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGP&VFL FPPKPKDTU.1iSRTPEVTGWVDYSt IEDPEVQFNWYVDGVEVI INAKTKPREEOFNSTFR V VS V LT W HQDWLNGKE YKCK VSNKG LP API EKTlSKTKGGPRE pqvytlppsreemtkn OVS LTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGOPE NNfY KTTPPMLDSDGSFF LYSK LTVDKSRWOQG NVFSC5VMHEALHNHYTQKSLSLS PC K

SEQ ID NO 160: Cadena pesada OVQLVaSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSSYINWVRGAPGOGLEWMGNINPATGHA DYAQK FQGRVTMTRDTSfSTAYMELSR L RSDP_AVYYCARGGVY FPYW GQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSHSTSESTAALGCLVKDYFP6PVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSG LYSLSSVVTVPSSN FGTQTYTCNVDP KPSNTKVD KT VERKCCVECPPC PA PPVAG PSVFL FPPKPKDTLM IS RT PEV TG WVDVSHEDPEVOF NWYVD GVEVHJMAKTKP REEQ F N3TFR v vs vlt whop w lfjgke ykck vsnkglf a p i ekti skt kgopfi e po v y tlppsr eemtkn OVSLTCLV K GFYPS PIAVEW E ENGQPE M NYKTTPPML PSDGS FFLYSKLTV DKSRWQQG NVFSC5VMHEAI.HMHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO 161: Cadena ligera de ADN CAGAGC GCCCTGACCCAGCC CGCCAG CGTQTCCGG CAGCCCAGGCCAGTCTATCAG AATC AGCTGCACCGGGACCT C OAGCGACGTGGGCAGGTACAAGT ACGTGAACTGGT A TCAGGAGCACCCC GGCAA GG CCCCC AAGCTGATGATCTACGGCGTGAGCAAGAGGC CCAGCGGCGTGTCCAACAGGTTCAGCG gcagcaagagcggc aacac cgccagoctg AGAAT CAGTGGGCTGCAGGCTGAGGACGAGGCC GACTACTACTGCGGCACCTTT GC CGGCG GATGATACTAC GGCGTGTTCG GCGGAG GGACGAAGGTGAGCGTGCTGGGCC AGCCTAAGGCTGC CCCCAGC GTGACCCTGTT CCCGCCCAGCAGCGAGGAGGTGCAG GCGAACAAGGCGACGCT GGTGTGCGTGATCAGC GAGTTGT ACCCAG GGGGCGT GAG CGTOGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACC GCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGGCGCGAGCAGCTACGTGAGCCTGACCCC CGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCA ccgtggaaaagac cgtggccccaac cgagtgcag c

SEQ ID NO 162: Cadena ligera de ADN CAGAGC GCCCf GACGCAGCC CGCC AG CGrGTCCGG CAGCCCAGGCCAGT CTA“CAC AATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCAGCTACAACTACGTGAACTGGTA TCAGGAGCACCCC GGCAA GG CCCCCAAGCTGATGATCTACGGCGTG AGC AAGAGGC ccagcggcgt gtccaacagg ttcagcg gcagcaag agcggc aagac cgccagcgtg AGAAT GAGT GGGCTGCAGGCTGAGGAGGAGGCC GACTACTACTGCGGCACCTTT GC CGGCG GATGATACTAC GGCGTGTTCG GCGGAG GGACGAAGCTGACGGTGCTGGGCC AGCCTAAGGCTGC CCCCAGC GTGACCCTGTTCCCCGCCAGCAGCGAGGAGCTGCAG GCCAACAAGGCGACCCT GGTGTGCGTGATCAGC GACTTCT ACCCAG GCGCCGTG AC CGTGCCCTGGAAGQCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGCAGACCACCACC CCCAGCAA GCAGAGGAACAA CAAGTACGGCGCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACCCC CGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCA ccgtggaaaagaccgtggccccaaccgagtgcacc

SEQ ID NO 163: Cadena ligera de ADN gagagcgcactgacccagcc agcttcagtgag cgg ctcaccag gtcagagcattac GATCTCG7GTACGGGTACTAGGAGCGATG_TGGnrCTTATAATTATGTGAATT<jGTAC CAGCAGCATCCCGGG/WjGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCG_CCC TCAGGCGTGAGCAAC CGTTTTAGCGGATC CAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGAC CATTAGCGGCCTGCAA GCG GAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTT TTGCTGG TGGTTC I'TATTA TGGT G1G l'TTGGCGGC GGCACGAAGTT AACCGT CC TAG GTCAGCC CAAGGCTGCCCCCTC GGTCACTCTGTTCCCGC CCTCCTCTGAGGA GCTTCAAGCCAA CAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGC CTG GAAGGCAGATAG GAG CCCCGTCAAGGCGGGAGTG GAGACCACCAC ACCCTCCA AACAAAGCAAGAACAAGTAGGCGGCCAGCAGGTATCTGA&CCTGACGCGTGAGCAGT GG AAGTCCCAGAGAAGC TAGAGCTGCCA GGTGACGCATGAAGGGAGCA CCGTGGAG aa gacagtggcccctacag aatgttga

SEQ ID NO 164: Cadena ligera de ADN CAGAGCGC ACTGACCCAGCCAGC TTCAGTGAGCGGCTCACGAGGTCAGAGCATT AC CATCTCGTGTACGGGTACTAGCAGCGATGT-GGTTCTTATAATTATGTGAATTGGTAC CAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCC T CAGGCGTGAGCAACCG'TTTT AGCGGAT CCAAAAGCGGCAACAGCG CGAGGCTGAC GATTAGCGGGCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATrATTATTGCGGTAGTTTTGGTGG tggttctt att atggtgtgtttggcggcggcaggaagtt aaccgtcct aggt caggc


: GAAGGCTGGCCCCTCGGTCACTCTG TTCCCG CCGTCCTCTGAGGAG CTTGAAGGCAA GAAGGCCACACtGGTGTGTGTCATAAGTGACTTGTACCGGGGAGGCGTGACAGTGGG ctggaaggcagatagcagccccgtcmggcgggagtggagaccaccacaccgtcca AACAAAGCAAGAACAAGT ACGGGGCCAGCAG CTAT GTGAGCCT GACGCCT GAG CAGT ggaagtcccacagaagctacagctgccaggtgacggatgaagggagcaccgtggag AAGACAGTGGCC cctac AG AATGTTGA

SEQ ID NO 165: Cadena ligera de ADN cagagcgcactgacccagccagcttcagtgagcggctcaccaggtcagagcattac catctcgtgtaggggtactagcagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtac CAGCAGCA-CCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCC TCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCGAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGAC CATTAGCGGCCTGCAAGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTAGTTTTGCTGG TGGT TC TTA TTATGGTGTGT TTGG CGG CGGCACGAAGTTAACCGTCCT A GGTCAGCC CAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCGCTCCTCTGAGeAGCTTCAAGCCAA CAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGOAOCCGTGACAGTGGC CT GGAAGGCAGAT AGCAGCCCCGTCAAGGGGGGAGT GGAGAGC ACCACAGCCT GCA AACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTA~CTGAGCCTGACGCCTGAGCAGT GGAAGTCCGACAGAAGCTACAGCTGCGAGGTGACGCATGAAGGGAGCAGGGTGGAG AAGACAGTGGCCCCTACAG AATGTTGA

SEQ ID NO 166: Cadena pesada de ADN CAGGTGGAGctggtgcagag cggagctgaggtgaagaagccag gcg ccagcgtcaa G GTGTCCTG CAAGGCCAGCG GCTACACC TTCACCAG C AGO I'ACATCAAC TGGG TCCG ccaggctcctgggcagggactggagtggatgggcaccatcaaccccgtgtccggca GCACCAGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCAGCATGACCAGGGACACCAGC ATCAGCACCGCCTACATGGAGCTOTCCAGGCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTA ctactgcgccaggggcggctggttcgactactggggccagggcaccctggtgaccg tgtgctcagctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggcccccagcagcaag ag cacctccggcggcacag ccgccctggg CTGCCTGGTG A AGG ACTACTTCCCCGA GCCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CCGCCGTGCTGC A GAGC AG CGGCCTGTAC AGCCTGTCC AGCGTGGTG AC AGTGCCC AG cagcaggctgggcacccagacct acatctg caacgtgaacgacaagccca gcaac accaaggtg gacaagagagtg gagcccaagagctgcgagaagaccgacacctgccc cgcct gcccagcgcccgaagctgcaggcg gcccttcc gtgttcctgttccccccc a AGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GA CGTGAGGCACGAGGACGCAGA GGTGAAGTTGAACTGGT ACGTGG ACGGCG“GGA GGTGCAGAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCAGCTACAGGG TGGTGT CCGT GGT GACGGTGGTGCACC AG GACT GGCTG A ACGGCAAAG A ATA CAAGT G CAAGGTCT OCAACAAGGGCCTGCCT GCCCGCAT CGAAAAGACCAT CAGCAAGGCCA AGGGCCaGCCACGGGAGCCCCaGG TGTACACCCTGCCCCC TT CITCGGGAGGaGaTG ACCAAGAACCAGG~GTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCC AGTGCT GGACAGCGAC GGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCA GGGCA ACGTGTTC agctgc agcgtgatgcacgaggccctgcaca ACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCACCCGGCAAG

SEQ ID NO 167: Cadena pesada de ADN caggtgcagc tg gtgcagag cggagctg aggtgaagaagcgagggggcagc gtcaa GGTGTCCTGCAAGGCCAGGGGCTACACCTTCACCAGCAGCTACATCAACTGGGTGCG ccaggctccagggcagggactggagtggatgggccagatcaacgccgccagcggc ATGAC CAQATAC QC CC AGAAGTTCCA G GGCAGA 3TC ACAATGAGCA GGGACACCTCT atcagcaccgcctacatggagctgtccaggct GAG AAGCGACGACACCG CCGT GTA CTACTGC GCCAGG GGCGGCTG GTTCG ACTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACCG TGTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTC CCCCTGGC CCCCAGCAGCA AG AGCACCTCCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGA GCGCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CCG CCGTGCTGCAGAGCAG CG GCCTG T ACAGCCTGTCCAGCGT GGTGACAGTG CCC AGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTCAACCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCC CCCCT GCCCAGCCC CCGAAG CT GCAGGCGGCCCTT CCGTGTTCCT GTTCCCCCCCA AGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GA CGTGAGCC AC GAGGACC CAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGA GGTGCAC AACGC CAAGACCAAGCCCAGA GAGGAGCAGTACA ACAGCA CCTACAGGG TGGTGTCCGTGCT GACCGT GCTG CA CCAGGACTGGGT GAACGGCAAAGAAT ACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCA AGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCTCGGGAGGAGATG ACC A AGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTG aagggcttctac cccagcgacatc GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCC AGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACA accactagacccagaagagcctgagcctgtcacccggcaag

SEQ ID NO 168: Cadena pesada de ADN CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGAA AG TGAGCT GCAAAG CCTCG GGATATAGCT TTACTTCTTCT TATATTAATTG GGTCGGGC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATCGGCAATA-rAATGCTGCTGCTGGTATTA CTCTTTATGCTCAGAAGTTTCAGG gtcggg tca ccatga CCCGTGATACCAGCATTAG CACCGCGTATATGGAACTGAGCGGCCTGCGTAGCGATGATACGGCCGTGTATTATTG cgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcacgctggtgacggttagctg AGCCTCCACCAAGGGTCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACaGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGaACC ggt ga CGGTGTGGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGGGGGGTGGAGACGTTCCCGGGTGTG GTAGAGTCGTC AGGAGTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGAC CGTGCCCTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAGAAGCCCAGGAACACGAAGGTG GAG A AG A GAGTTG AGCGC A A ATCTTGTG AG A AAACTC A C AC ATGCCC ACC GTGCCCA GCACCTGAAGCAGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAGATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT'G cgaagacaaaggggcgggag gagcagtacaagagcaggtagcgggtggtgagc gtg CTCACCGTC CTGCA CCAGGACTGGCTGAATQGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTC_CC AA CAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAA ACCAT CTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA GGTCAGGCT GACCTGCGTGGTGAAAGG CTT GTATCGCAGCG AC ATCGCGGTGGAGTG ggagagcaatgggcaggcgga-gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggact ccgacg gctcct TC TTCCTCTAGAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG-GGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATCCTCCGTGATGCATGAGCCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGOCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO 169: Cadena pesada de ADN CAGG-GCAATTGGTTCAGAGCGGCGCG gaagtgaaaaaaccgggcgc GAGCGTG AA AG TGAGCT GCAAAGC CTCCGGATATACCTTTACTTCTTC TTATATTAATTGGGTCCGCC AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATOGGCGGTATTAATCCTCCTeCTGGTACTA cttcttatgctcagaagtttcagggtcgggtcaccatgacccgtgataccagcattag caccgcgtatatggaactgagccgcctgcgtagcgatgatacggccgtgtattattg cgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccctggtgacggttagctc AGCCTCCACCAAGGGTCC A TCG GTC TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTC TGGGGGCACAGCG GCCCTGGGGTGCCTGGTCAAGGACTACTTC CCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC TTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTCAATCACAA GCC CAGCAACACCAA G GT Cl GACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAAGCAGCGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCGAAAACCCAAGGA CACCCTCATGATC-CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC ACGAAGACGCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGAGGGCGTGGAGGTGCATAATG ccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacaggacgtaccgggtggtcagcgtc CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC AA C AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGC CAAA GGGCA GCCC CGAGAACCACAGGTGTAGACCCTGCCCCGATGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA G GTGAGCGTGA CCT GGCT GGTCAAAGGCTT CT ATCCCAGCGACAT CGCCGTGGAGTG GGAGAGC AATGGG CAGCCG GAGAAC AACTACAAGaCCACGCCTCCCG TGC TGgAcT CCGACGG CTCC TTCT TCCTCTACAGCAAGC TCACCGTG GACAAGAGCAGG TGGCAGC AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC agaagagcctctccctgtctccgggtaaa

SEQ ID NO 170: Cadena pesada de ADN GAGG_GCAATTGGTTCAGAGCGGGGCGGAAGTGAAAAAACCGGGGGCGAGGGTGAA agtgagctgcaaaggctccggatatacctttacttcttcttatattaattgggtcggcc AA GCC GCTGGGCAGGGTCTC GAGTGGATGGGCAATATTAATCCTGCTACTGGTCATG CTGATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA gcagcgcgtatatggaactgaciCcggctgcgtagcgatgatacggccgtgtattatt gcgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccctggtgacggttagct CAGCCTCCACCAAGGGTCC ATCGGTCT TCCC CCTGGCACCGTC CTCGAAGAGGACCT CTGGGGGGACAGGGGCCCTGG GCTGGCTGGTCaAGGACTACTT CCCCGaAGCGGTG AGGGTGTCGTGGAACTGAGGCGCCCTGAGCAGCGGCGTGCAOACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCGCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG CTTGGGCACCCAGACCT ACAT CT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAA CAGC AAGGT G GACA AGAGA GTTGAGCCC AAAT CTTGT GAGAAAACTCACACATGCCC A CCGTGCCC AG CACCTGAAGCAG CGGGGGGAGCGTCA GTCTTCGT CTTCCGCCGAA AACGC A AG GA CACCCT CAT GATCTCCCGGACCCGT GAG GT CACAT GCGT GGT GGTG GACGT GAGCC ACGAAGACCCTGAGGTGAAGTrCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG CCA AGACAAAGCCG CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGGGTGGTGAGC G TC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC AA C AAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAA AACCA“CTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCA G GTGA'GCCTGA CGTGGCTGGTCAAAGG CTTGT ATGCCAGGGACAT CGCGGTGGAGT G GGAGAGC AATGGG CAGCCG GAGAAC AACTACAAGACCACGC CTCC CG-GCTGGACT CCGACGG CTCC TTCT TCCT CTACAGCAAGCTCA CCGTGG ACAAGAGCAGGTGGCAG C AGCGGAACCTCTTCTCATGCTCCCTGATqCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO 171: Cadena ligera de ADN GAGAGCGCCCTGACCCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGGAGCCCAGGCCAGTCTATCAC AATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGT'GGGCAGCTACAACTACGTGAACTGGTA TC AGCAGCAC CCCG GCAAGGCCCCCAAGCTGATGATCTACGGCGTGAGCAA GAGGC CCA GCG GGGTGTGCAAGA QGTTCAGCGGCAGCAAGAGCGGC AACACC GCCAGC CTG ACA ATCAGTGGGCT G CAGGCTGAGGACGAGGCCGA CTACT ACTGCGGCACCTTT GC CGGCGGATCATACTACGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTGCTGGGCC AGCCTAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAG GCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTAGCCAGGCGCCGTGAC CGT GGCCTG GAAGGCC GACAGCAGCCCCGTGAAG GCCGGCGTG GAGACC ACCACC cccagcaagcagagcaacaacaagtaggcggccagcagctacctgaggctgacccc CGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCA CCGTGGAAAAGACCGTGGCCCCAACCGAGTGCAGC

SEQ ID NO 172: Cadena ligera de ADN CAGAGC GCCCTGACCCAGCC CGCCAG CGTGTCCGG CAGCCCAGGCCAGT CTATC AC AATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCAGCTACAACTACGTGAACTGGTA TCAGCAGCACCCC GGCAA GGCCCCGAAGCT GATGATCT ACGGCG TGAGCAAGAGGC CCAGCGGCGTGTCCAACAGG TTC AGCG GCAGCAAGAGCGGCAACAC CGCCAGCCTG ACAATCAGTGGGCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGAGTACTACTGCGGCACCTTTGC CGGCGGATCATACTACGGCGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTGCTGGGCC AGCCT AAGGCTGC GCGCAGC GTGACGCTGTTCGCCCCCAGCAGCGAGGAGGTGCAG GCC A AC A AGGCC ACCCT G GTGTGCCTG ATCAGC GACTTCT ACCC AG GCGCCGTGAC CGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACC CCCAGCAA GCAGAGCAACAACA AGTACGCCGCGAGCAGCT ACCTGAGCCT GACGCC CGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCA ccgtggaaaagacggtggccccaaccgagtgcagc

SEQ ID NO 173: Cadena ligera de ADN CAGAGCGCACTGACCCAGCCAGCT tcagtgag cgg ctcaccag gtcagagcattac catctcg_gtacgggtactagcagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtac CAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCC TCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGAC CATTAGCGGCCTGCAA GCG GAAGACG AAGCGGATTATTATTGCGGTACTT TTGCTGG TGGTTC I'TATTA TGGT G1G l'TTGGC GGC GGCACGAAG'I 1 AACCGT CCT AG GTCAGCC caaggctoccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaa caaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggc CTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCA AAC AAAGCAACAAC AAGT ACGCGGCCAGCAGCT ATCTGAGCCTGACGCCT GAGCAGT GGAAGTCCCAGAGAAGC TAGAGCTGCCA GGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAG aa gagagtggcccctacag aatgttca

SEQ ID NO 174: Cadena ligera de ADN gagagcgcactgac ccagccagcttcagtgag cgg ctcaccag gtcagagcattac gatctcg_gtacgggtagtaggagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtac CAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGATTTATGGTGTTTCTAAGCGTCCC TCAGGCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATGCAAAAGCGGCAACACCGCGAGCCTGAC CATTAGCGGCCTGCAA GCG GAAGACGAAGCGGATTATTATTGCGGTACTT TTGCTGG TGGTTCTTATTA TGGT G1G l'TTGGC GGC GGCACGAAG'I 1 AACCGT CCT AG GTCAGCC CAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAA CAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGC CT G GAAGGCAGATAG CAG CCCCGTCAAGGCGGGAGT G GAGACC ACCACACCGT CCA AAC AAAGCAACAAC AAGT ACGCGGCCAGCAGCT ATCTGAGCCTGACGCCT GAGCAGT GGAAGTCCCAGAGAAGC T AGAGCTGCCA GGTGACGGATGAAGGGAGCAGCGTGGAG AA GAGAGTGGCCCCTACAG AATGTTCA

SEQ ID NO 175: Cadena ligera de ADN gagagcgcactgacccagccagcttcagtgagcggctcaccaggtcagagcattac catctggtgtacgggtactagcagcgatgttggttcttataattatgtgaattggtac CAGCAGCATCCCGGGAAGGCGCCGAAACTTATGA_TTATG<yTGTTTCTAAGCGTCCC tcaggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaaagcggcaacaccgcgagcctgac cattagcggcctgcaagcggaagacgaagcggattattattgcggtacttttgctgg tggttcttattatg gtgtgt ttg gcggc ggcac GAAGTTAACCG tcc tagg tcagcc CAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCA agc c a a CAAGGCCACAC“GGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAG_GGC CTGGAAGGCAGATAGGAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCA aacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagt GG A AGTCCG AC AG AAGGT AC AGCTGCC a GGTC AC GC ATG AAGGG AGC ACCGTGG AG AAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA

SEQ ID NO 176: Cadena pesada de ADN CAGG-fiCAGCT ggtgcagagcgqagctgag gtgaagaaggcaggc gccagcgtcaa g gtgtcctgcaaqgccagcggctacacct tgaccagcag ctacatcaactggg TCCG CCAGGCTCCTGGGCAGGGACTGGAGTGGATGGGCACCATCAACCCCGTGTCCGGCA GCACCAGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACCAGC ATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGAAGCGACGAGACCGCCGTGTA CT ACT G CGCCAGGGGCGGCTGGTT GGAC^ACTGGGGCC AGGGCACGCTGGTGACCG TGTCC TCAG CTAGC ACCAAGGGCCCCAGCGTG T~ CCCCCTGGCCCCCTG CAGCAGA AGCaCCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGA GCGAGTGACC GTGTGCTGG AAGAGCGGAGCC CTGACCAGC GGCGTGCAGACGTTCC CCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTIGCAGCGTGGTGACCGTGCCC AGCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAAC ACCAA GOTGGA CAAGACCGTGGAGAGGAAGTG CTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCC AGCCCGCCCAGTGGCCGGACGCTCCGTGTTCGTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACA CCGT GAT GATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCAC GA GGAGCCAGAGGT GCAGTT CAACTGGT ACGTG GAG GGCGTGGAGGTGCACAACGC GAAGACCAA GGCCAGAGAG GAACAGTTTAACAGCAGCrTCAG GGTGGT GTCCGTGCT GACC GTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCA ACA AGGGCCTGCCAGCCCC CATCGAGAAAACCAT CAGCAA GA CC A AGGGCCAGCCA CGGGAGCGCCAGGTGT ACACGCTGCCGCCC AGCGGGG AG GAAAT G ACC A AGA ACCA G GTGT CCCT GACCTGT CT GGTGAAGGGGTTCTACCGCAGCGAC AT CGCGGTG GAGT G GGAGAGCAACGGCCAGC CCGAGAACAA CTACAAGACCACCCCCCCCATGCTG GAG AG cgacggcagctt cttggtgtacagca agct gacagt ggac aagagcaggtggca G CAGGGCA AC GTGTTCAGCTGCA GCGTGATGCACC AGGCCCTCCACAACCACTACA CCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAAe

SEQ ID NO 177: Cadena pesada de ADN caggtgcagc tggtgcagagcggag ctgag gtgaagaagccaggggccag cgtcaa GGTGT CCTGCAAG GCCAGCGGCTACACCT TC AGCAGC AGCT ACAT CAACT GGGTGGG CCAGGCTCCAGGGCAGGGACTGGAGTGGATGGGCCAGATCAACGCCGCCAGCGGC atgaccagatacgcccagaagticcagggcagagtcacaatgaccagggacacctgt ATCAGGAGCGCCTACATGGAGCTGTCCAGGCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTA ctactgcggcaggggcggctggttcgac_actgggggcagggcagcgtggtgagcg TGTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCGCTGCAGCAGA AGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGA G CC AGTG ACCGTGTC CTQGAACAGCGGAGCCCTGACCA GCGGCGTGC AC ACCTTGC CCGCGGTGCTGCAGAGCAG CGGCCTGT AG AGCGTGTCG AGGGT GGTGACGGTGCGC AGCAGCAA CTTCGGCACCCAGACCT AC ACCTGCAACGTGGAC CACA AGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAGCGTGGAGAG GAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCC AGCCCCCCCAGTGGCCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACA CCCTGATGATCAGC AG GACC CCCGAGGTGAC GTGCGTGGTGGTQGAC GTGAGCCAC


: gaggagccagaggtgcagttc aactggt acgtggacggcgt qgaggtggacaacgc caagaccaagcccagagaggaacagtttaacagcaccttcagggtggtgtccgtgct gaccgtggtgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctcca ACA AGGG CCTGCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATC AGCAAGACCAAG GGCCAGCCA cgggagcccg aggtgtacaccctgc cccccagccgggaggaaatgac caagaacca GGTGTCCGTGACGTGTCTGGTGAAGGGCTTGTAGCCGAGCGACATCGCGGTGGAGT GGGAGAGCA AC GGC CAGCCCGAGAACAA CTACAAGACCAG CCCC CCCATGCTGGAC AGCGACGGCAGCTTGTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGAGAAGAGCAGGTGGCA GCAGGGCAACGTCTTCA GCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACT ACA CCCAGAA GAGC CTGAGC CTGTCCCCCGGCAA G

SEQ ID NO 178: Cadena pesada de ADN caggtgcaattggttcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcgcgagcgtgaa AGT GAGCTGCAAAGCCTC-CGGATAT ACCT TT ACTTCTT CTT AT ATTAATT GGGT CCGCC a agcccctggggagggtctcg agtgg atgg gc a atatt a atg ctgctgctg gt atta CTCTT TATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCAT gacgcgtgataccagcattag gagggcgtatatggaactgaggcgggtgggtagcqatgatagggccgtgtattattg CGCGCGTGGTGG1 1GG1 1 \ GAT r Al 1 GGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGC 1G agcttggaccaagggcggcagcgtgttccccctggccccgtgcaggagaagcacca gcgagagcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttcgccgagcccgtg accgtg agctgg a ac agcgg agcc ctgacc agc ggcgtgc ac accttcccc gccgt ggtgcagagcagcggcgtgtagaggctgaggagcgtggtgaccgtgcccagcagca ACTTCGGCACGCAGACCT ACACCTGCAA CGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGG tggacaagaccgtggaggggaagTgCTgcgtggagtggcgcgcCTgccctgcgcct GCTGTGGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACGCTGATG ATGAGCCG GACCCCCGAGGT GACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCC cgaggtgcagtticaagtggt acgtgg acggc gtggaggtggacaagggcaagac c A AGCCCC GGGAGGAAGAGTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGT GTCCGT GGTG ACCGT G gtgcacca ggactggctgaacggcaaagaatac AAGTGCAAGGTGTC CAACAAGGG GCTGGCTGGGGGGATGGAGAAAACGATGAGGAAGACAAAGGGGGAGCCCAGGGAAC CCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGA AATGAC CAAGAACCAGGTGTCC gtgaggtgtctggtgaaggggttgtaccccagggagatggcggtggagtgggagag CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACG GCAGCTTCTTCCTeTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG AGCCTGAGCCTGTCCCCC GGCAAA

SEQ ID NO 179: Cadena pesada de ADN CAGG-GCAATTGGTTCAGAGCGGC GCGGAAGTGAAAAAACCGGGC GCGAGCG TG AA AGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCT1 rACTTCTTCTTATATTAATTGGGTCCGCC AA GCCCCTGGGCAGGGTCTC GAGTGGAT GGGCGGT ATT AATCCTCCTGCTGGTACT A CTtCTTATGCtCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCATGACCCGTGATACGAGGATTAG CACCGCGTATATGGAACTGAGCCGCCTGCGTAGCGATGATACGGCCGTGTATTATTG cgcgcgtggtggttggtttgattattggggccaaggcaccctggtgacggttagctc agcttccaccaagggccccagcgtgttccccctggccccctgcagcagaagcacca G CGAGAG C ACAGCCGCCCTGG GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CGCGTG ACCGTGAGCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGGACACCTTCCCCGCCGT GCTGCAGAGGAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCGCAGCAGCA ACTTCG gcacccagacgtacac ctgcaacgtggaccacaagcocag caacaccaagg tggagaagaccgtg gagcg gaagtg ctgcgtggag tgccccgcctg ccctgcgcct CCrGTGGCCGGACCCTCCGTGmCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATG ATCAG CCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAGGAGGC CGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTOCACAACGCCAAGACCA AGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG


: G-GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGrGTCCAACAAGGG CCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACAAAGGGCCAGCCCAGGGAAC CCC AGGTGTAC ACCCTGCCCCCC AGCCGGG AG GA AATGACCAAGAACCAG GTGTCC CTGACCTGTCTGGTGAAGG.GCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAGAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACG GCAGCTT CTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGG GC AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGGACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAG agcctgagcctgtcccccggcaaa

SEQ ID NO 180: Cadena pesada de ADN gaggtgcaattggttcagagcggcg cggaagtgaaaaaac cgggcgcgag cgtgaa agtgagctgcaaagcctgggqatatacctttacttc'ttgttatattaattgggtccgcc AAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCAATATTAATCCTGCTACTGGTCATG CTGATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTGACCATGACCCGTGATACCAGCATTA GC ACCG CGTATATGG A ACTG AG CCGCCTGCGTAGCG ATG ATACGG CGGTGT ATT ATT GCGCGCGTGGTGGTTGGTTTG ATTATTGGGGCC A AG GCACCCTGGTGACGGTTA GOT CAGCTTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGT TCCC CCTG GCCCCCTGCAGCAGAAG cacc AG CGAGAGCACAGCC GCCC TGGGCTGCCTGGTGAAGG AGTaC TT CCCCGAGCCCGT GACCGTGAGGTGGAACAGCGGAGGCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCGCCGGCG TGCTGCAG AGC AGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTG GTGACCGT GCCC AGC AGC AACTTCGG CAGCCAGACGTACAC CTGCAAC GTGG ACCACAAG OCCA GCAACACCAAG GTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCTGCCCC TCCTGTGGCCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGAGACCCTGAT GAT CAGCCGGACCCCC GAGGTGAGCTGCGT GGT GGT GGACGTGAGCCAGGAGGA C CCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTAGGTGGACGGCGTGGAGGTGCAGAACGCCAAGAC GAAGCGCCGGGAGGAAGAGTTCAACAGCACCTTGGGGGTGGTGTCCGTGCTGACCG TGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGG GCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACAAAGGGCCAGCCCAGGGAA CCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAG GAAATG ACCAAGA ACC AGGTGTC CGTGACCTGTGTGGTGAAGGGCTTGTACGGCAGCGACATCGCGGTGGAGTGGGAGA gcaacgggcagcccgagaacaactacaagaccagcccccccatgctggacagcgac GGGAGCTT CTTCC TGTACAGCAAG CTGACAGTGGACAAGAGCGGG_GGCAGCAGGG CAACGTGTTCAGGTGGAGCGTGATGCAGGAGGCCCTeCACAACCACTAGACCCAGAA GAGCCTGAGCCTGTCCCCCOOCA A A

SEQ ID NO 181: ActRIIB MTA PWVALA L LWGS LCAGSGRGE AFTREC IVY NARVY F1 F RTNQSG LERCEGE QDK RLH cyaswhnssgtielvkkgcwldpfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthl PE A GGPEVTYE P P PTAPTLLTV LAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYR HH KPPYGHVDIH EDPG PP P PSPLVG LKPLOLL EIK A RGR FGCVWKAQLM ND F VAVKIFPLGDKOS WOS EREIFGTR GMKHEMJJQFIAAEKRGSNLE VEL WLITAFIIDKQSLTDYLKGNIITWJEUGIIVAETMSRGL SY LI IE OV PWCRGEGH KPGIAI1 RDF KSKNV LLKS DLTAVLAD rGLAVRF CPG KP PGDTIHG QV GTRRYMAPEVLEG AJNFQRDAFLR1DMYAMGLVLVY ELVS PC KAADG PVDEYMLFFEE ElGQH PS LE E LQEVVV HKKMR PTIKD HWLKH P GLAQLCVTIEACWDHDAEAR LSAGCVEE RYS L| RR3VNGTTSDCLVSLVTSVTNVDL PPK ESSI

SEQ ID NO 182: Dominio de union al ligando de ActRIIB (aa19-134) SG RGEAET FtEClYYNANWELERTNQS GLE RCEG EODKR LHC YASW RNSSGTl ELV KKG C W LD DF NCY DHQE CVATE E NPQ VYFCC CEGNFC NER FT HLPEA GGPEVTYEPPPTAPT

SEQ ID NO 183: Region de union al anticuerpo IELVKKGSWLDDFNS

SEQ ID NO 184: Region de union al anticuerpo VKKGSWLDDFNSYDR

SEQ ID NO 185: Region de union al anticuerpo GSWLDDFNSYDRQES

SEQ ID NO 186: Region de union al anticuerpo GCWLDDFNC

SEQ ID NO 187: Region de union al anticuerpo CEGEQDKRLHCYASW

SEQ ID NO 188: Region de union al anticuerpo WLDDFN

SEQ ID NO 189: Region de union al anticuerpo EQDKR

SEQ ID NO 190: Region de union al anticuerpo KGCWLDDFNCY

SEQ ID NO 191: Region de union a anticuerpo CIYYNANWELERT

SEQ ID NO 192: Region de union a anticuerpo YFCCCEGNFCN

SEQ ID NO 193: Cadena h/mLgG2 aLALA-ligera DIALTGPASVSGS PGQSITISCTGTSS DVG5YNYVNWYQQ HPGKAP K LMIYGV5K RPSGV 9 H RFSGS KSG NTAS LTISGLQAEDEADYYCGTFAGGSYYGVFGGGTKLTVLGOPKSTPTL Tv FPPGSE ELKENKATLVCLISNFSPSGVTVAWKANGTPITQGVDTS NPTKEGH KFMASS FIHLTSDQWREH HSFTCQVTH ElODTYEKSLSPAECL

SEQ ID NO 194: Cadena h/mlgG2 aLALA-pesada QVQLVQSGAEVKKPGASVKV5CKASGYTFT SSYINWVH'QAPGQGLEWM GTINPVSGSTSYAQ KFOGRVTMTFiDTSl ST AYMEL3S LR3EDTAV YYCARGGWF DYWGQ GTLVTV5SAKTTAPS WFLAPV CGDTTG55VTLGCLYKG YFFEFYTLTWNSG 5LSSGV HT FP AV LOS DLYTLSSSVTVTSSTWPSQSl TCNVA1IPASSTKVDK KIEPRG PTIKPC PPG K CP AP N AAGGPSVFIFPPKIKD V LMI3LSPIVTCV WDVS EC DP DVOISWF VNN V EVHTAOTGT HREO^YNSTL RV VSALP IGHQDWM&GKEFKCKV N1S KDLP API E RTIS KPKGSVRAPQVYV L P PP EEEMT KKQYTLTCMVTD FM13 E DIYVEWTN MGKTELNY K NTEPVLDSOGSYFMYS KL RVF KKNWVF RN5Y3GSW HFGL HNHH TKSFSFfTPGK

La invencion que se ha descrito completamente se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que son ilustrativos y no pretenden ser limitantes adicionales.

Ejemplos

5 Metodologia general

Anticuerpos ActRIIB, su caracterizacion y metodos relacionados con los mismos como (i) Ensayos funcionales, (ii) ensayos de genes informadores (RGA), (iii) Cultivo de lineas celulares HEK293T/17, (iv) Ensayos de genes reporteros de luciferasa inducidos por miostatina, (v) ELISA de especificidad, (vi) ELISA de interaccion de la union a ActRIIB/Fc-miostatina, (vii) valoracion para FACS en celulas que expresan hActRIIB y hActRIIA, (viii) Union a celulas 10 primarias de musculo esqueletico humano, (ix) determinacion de afinidad de Fab del ActRIIB antihumano utilizando resonancia de plasmon superficial (Biacore), (x) ensayo CK, (xi) modelos animales, (xii) protocolos de tratamiento, (xiii) analisis Estadistico, (xiv) paneos, (xv) identificacion y caracterizacion de anticuerpos, (xvi) optimizacion de anticuerpos derivados de la primera maduracion de afinidad, (xvii) conversion de IgG2 de Fab madurados por afinidad (1ra maduracion), (xviii) segunda maduracion de afinidad, (xix) conversion de IgG2 y caracterizacion de 15 IgG2 (2da maduracion), (xx) Caracterizacion de anticuerpos anti-ActRIIB en estudios murinos in vivo, (xxi) confirmacion de afinidad por SET, (xxii) estudios de bloqueo cruzado y (xxiii) los detalles y las tecnologias de mapeo de epitopos se han divulgado en el documento WO 2010/125003.

Ejemplos de trabajo: biologia molecular

Diferenciacion de adipocito marron. Se aislaron preadipocitos marron primarios a partir de tejido adiposo marron 20 interescapular de ratones C57BL6/J macho de 5 semanas de edad usando disociacion con colagenasa como se describio previamente (Feige, et al., 2008). Las celulas se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino al 10% (Sigma), insulina 3 nM (Sigma) y un coctel de antibioticos (Invitrogen). Despues de alcanzar la confluencia, se diferenciaron los preadipocitos marron en placas de 12 pozos durante 9 dias con insulina 20 nM y triyodo-tironina 1 nM (T3; Sigma) para el protocolo completo y IBMX 25 0,5 mM (Sigma), dexametasona 0,5 pM (Sigma) y indometacina 0,125 mM (Sigma) durante los primeros dos dias. El

medio y los tratamientos fueron reemplazados cada 2 dias.

Experimentos con animales. Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la ordenanza suiza sobre experimentacion con animales despues de la aprobacion por parte de las autoridades veterinarias cantonales. Ratones macho C57BI6/J de diez semanas de edad (Laboratorios Janvier, Francia) o ratones hembra CB17/ICR-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Prkddsdd/Crl (ratones Scid, Charles River, Alemania) se mantuvieron a 22°C en un ciclo de luz- oscuridad de 12 horas con acceso irrestricto a dieta y al agua regulares. Los animales se trataron con los anticuerpos durante cuatro semanas mediante inyeccion subcutanea semanal con un volumen de 5 mL/kg y una dosis de 20 mg/kg, a menos que se indique lo contrario. La tolerancia al frio se evaluo colocando animales durante 4 horas a 10°C en jaulas individuales y midiendo la temperatura corporal cada hora con un termometro rectal (Bioseb). Todos los animales se sacrificaron con CO2 y los animales expuestos a frio se sacrificaron inmediatamente despues de la exposicion al frio durante 24 h.

Perfilado de expresion genica. El ARN se extrae usando reactivo Trizol (Invitrogen). La transcripcion inversa se realizo con hexameros aleatorios en 1 qg de ARN total usando un kit de transcripcion inversa de alta capacidad (Applied Biosystems) y la reaccion se diluyo 100 veces para amplificacion. Las reacciones de PCR se realizaron por duplicado en placas de 384 pozos en un ciclador CFX384 (BioRad) usando sondas TaqMan especificas (Applied Biosystems). Los datos se normalizaron con uno o dos genes de mantenimiento usando el metodo AACt.

Perfilado hematologico en primates no humanos. Se administro MOR08159 una vez a la semana durante 3 meses a monos cynomolgus macho y hembra mediante inyeccion intravenosa. Se asignaron 32 monos cynomolgus (16/sexo) a uno de cuatro grupos de tratamiento (3 a 5 animales/sexo/grupo) y se les administraron inyecciones intravenosas de cada vehiculo o MOR08159 a razon de 10, 30 o 100 mg/kg una vez por semana durante 13 semanas (total de 14 dosis). Los parametros evaluados incluyeron patologia clinica general (hematologia, quimica clinica y coagulacion). MOR08159 no causo cambios hematologicos significativos a lo largo del estudio en globulos rojos, ancho de distribucion de globulos rojos, concentracion media de hemoglobina corpuscular en monos machos y hembras (vease Tabla 2 para datos de machos).

Perfilado hematologico en voluntarios sanos. Se administro MOR08159 como una infusion intravenosa unica de 0 (placebo), 0,1; 0,3; 1, 3, 10 o 30 mg/kg a voluntarios sanos machos y hembras. Las hembras se confirmaron como posmenopausicas o quirurgicamente esteriles antes de la infusion. Los parametros hematologicos que incluyen los recuentos de globulos rojos se evaluaron antes de la dosificacion como linea base y a las 4 y 8 semanas despues de la dosificacion. MOR08159 no produjo cambios significativos en los parametros de los globulos rojos en comparacion con el placebo durante todo el periodo de estudio (vease Tabla 3).

Resultados:

Efecto sobre el tejido adiposo marron y los parametros hematologicos.

La inhibicion de la ruta de senalizacion de ActRIIB por un anticuerpo ActRIIB (Ab) mejora drasticamente la diferenciacion de adipocitos marron primarios como se refleja por un aumento en genes termogenicos tales como UCP-1. Por el contrario, la miostatina, un ligando de ActRIIB, es capaz de inhibir la diferenciacion de los adipocitos marron primarios, un efecto que puede prevenirse mediante la administracion de un inhibidor de la ruta de ActRIIB, tal como Ab ActRIIB (Figura 1).

La inhibicion de la administracion de la via de senalizacion de ActRIIB de un Ab ActRIIB durante 4 semanas a ratones no modificados aumento significativamente no solo la masa del musculo esqueletico sino tambien la grasa marron interescapular mientras que no se detectaron cambios significativos en la grasa blanca (Figura 2).

La influencia de la inhibicion de ActRIIB sobre la funcionalidad del tejido adiposo marron se evaluo in vivo desafiando a los ratones a traves de la exposicion al frio. Los ratones tratados con el anticuerpo ActRIIB durante cuatro semanas se protegieron significativamente de la hipotermia tras la exposicion al frio en comparacion con los ratones tratados con vehiculo (Figura 3). Esto demostro que la inhibicion de ActRIIB mejora la termogenesis adaptativa.

Esta proteccion funcional podria, al menos en parte, ser explicada por un aumento en la respiracion celular en adipocitos marron primarios tratados con Ab ActRIIB (Figura 3). De manera importante, la inhibicion farmacologica de la senalizacion de ActRIIB usando un anticuerpo ActRIIB dio como resultado una cantidad incrementada de grasa parda en animales adultos, y se tradujo en mayor gasto de energia y termogenesis (Figuras 2 y 3).

La inhibicion de ActRIIB provocada por la administracion semanal de un anticuerpo ActRIIB durante 13 semanas (total de 14 dosis) en monos cynomolgus no causo ningun cambio hematologico significativo a lo largo del estudio en globulos rojos, ancho de distribucion de globulos rojos y concentracion media de hemoglobina corpuscular (vease Tabla 2). De forma similar, la administracion intravenosa unica de Ab ActRIIB en voluntarios sanos humanos hasta 30 mg/kg no indujo ningun cambio significativo en los globulos rojos/parametros hematologicos hasta 10 semanas despues de la dosificacion (vease Tabla 3).

Tabla 2: Parametros hematologicos despues de 13 semanas de aplicacion de MOR08159 en monos cynomolgus

(E3= 103 y E6 = 106)


: Dosis (mg/kg) i.v.

0 (n = 5): 10 (n = 3) 30 (n = 3) 100 (n = 5)

RBC (E6/gL): Dosificacion previa 5,97 ± 0,388 5,98 ± 0,255 5,70 ± 0,353 5,74 ± 0,161

RBC (E6/ gL): Dia 92 5,97 ± 0,536 5,77 ± 0,206 5,27 ± 0,215 5,55 ± 0,151

MCHC (g/dL): Dosificacion previa 30,2 ± 1,65 30,1 ± 0,55 29,9 ± 1,46 31,4 ± 1,34

MCHC (g/dL): Dia 92 28,8 ± 1,59 30,1 ± 0,40 29,4 ± 0,40 30,4 ± 1,07

RDW (%): Dosificacion previa 12,6 ± 0,79 11,9 ± 0,78 12,1 ± 1,27 11,9 ± 0,59

RDW (%): Dia 92 12,8 ± 0,53 11,6 ± 0,67 12,0 ± 1,06 12,1 ± 0,43

Tabla 3: recuento de globulos rojos despues de inyeccion unica de MOR08159 en voluntarios sanos humanos (E6 =

106)

: RBC (E6/gL)

Dosificacion previa (Bas): semana 4 (d 29) Semana 8 (d 57)

Placebo (n = 12): 4,87 ± 0,45 4,85 ± 0,51 4,81 ± 0,35

1 mg/kg (n = 6): 5,05 ± 0,24 4,88 ± 0,36 5,03 ± 0,26

3 mg/kg (n = 6): 5,22 ± 0,41 5,12 ± 0,22 5,40 ± 0,24

10 mg/kg (n = 6): 5,12 ± 0,38 5,07 ± 0,51 5,05 ± 0,44

30 mg/kg (n = 6): 5,12 ± 0,29 5,12 ± 0,27 5,17 ± 0,31

5

Efecto sobre los parametros metabolicos y adipocitos marron en ratones alimentados con una dieta alta en grasas.

El efecto de la inhibicion de la ruta de senalizacion de ActRIIB por un anticuerpo ActRIIB en ratones alimentados con una dieta rica en grasas puede investigarse en una modalidad terapeutica. Los ratones que muestran alguna disfuncion metabolica que consumen una dieta alta en grasas durante varias semanas se tratan con un anticuerpo 10 ActRIIB o vehiculo compatible para examinar el beneficio metabolico en los parametros sanguineos, niveles de glucosa e insulina, distribucion tisular, tejido adiposo marron termogenico en particular, y firma genica especifica del tejido

Lista de referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende un anticuerpo antagonista que se une a ActRIIB para uso en el tratamiento de un trastorno metabolico en un sujeto, en la que el anticuerpo anti-ActRIIB aumenta el tejido adiposo marron sin aumentar los niveles de globulos rojos en dicho sujeto y en el que el anticuerpo anti-ActRIIB comprende una CDR1

5 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; una CDR2 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; una CDR3 de la region variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 37; una CDR1 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; una CDR2 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 79 en la que el trastorno metabolico se selecciona del grupo que consiste en obesidad, diabetes tipo 2, sindrome metabolico, lipodistrofia, 10 tolerancia alterada a la glucosa, concentracion elevada de insulina en plasma, resistencia a la insulina, dislipidemia, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipertension, enfermedad cardiovascular.
2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el trastorno metabolico resulta o esta provocado por una concentracion promedio mayor de glucosa en plasma, homeostasis de glucosa anormal y/o concentracion elevada de insulina en plasma.

15 3. Una composicion de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en la que el sujeto padece un trastorno metabolico y

un trastorno muscular.
4. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que el trastorno muscular es una atrofia muscular seleccionada del grupo que consiste en sarcopenia asociada a obesidad, sarcopenia y atrofia muscular asociada a diabetes.

20 5. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el anticuerpo se une a ActRIIB con

una afinidad 10 veces o mayor con la que se une a ActRIIA.
6. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el anticuerpo anti-ActRIIB comprende la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 146 y la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 141.
7. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el anticuerpo anti-ActRIIB 25 comprendido en dicha composicion tiene una funcion efectora alterada a traves de la mutacion de la region Fc.
8. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en la que el anticuerpo anti-ActRIIB comprendido en dicha composicion esta codificado por pBW522 como DSM22873 o pBW524 como DSM22874, depositada en DSMZ el 18.08.2009.