DE3689218T2

DE3689218T2 - Verfahren zur differenzierten Bestimmung weisser Blutkörperchen.

Info

Publication number: DE3689218T2
Application number: DE19863689218
Authority: DE
Inventors: John F Cremins; Young Ran Kim; Michael J Malin; Louis D Sclafani Iv
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1985-09-06
Filing date: 1986-09-03
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2006-09-04
Also published as: DK419286A; DK419286D0; DK169529B1; JPS6271857A; AU6201686A; EP0214613A3; CA1317533C; AU602129B2; DE3689218D1; EP0214613A2; ES2001424A6; JPH0511855B2; EP0214613B1

Description

Es existieren 5 Klassen von normalen weißen Blutkörperchen oder Leukozyten: neutrophile Granulozyten (Neutrophile), Lymphozyten, Monozyten, eosinophile Granulozyten, (Eonisophile) und basophile Granulozyten (Basophile). Es ist ein bekanntes medizinisches Diagnoseverfahren, einen getrockneten, gefärbten Blutausstrich auf einem Objektträger zu untersuchen und die relativen Anteile dieser fünf normalen Typen von weißen Blutzellen und auch die Konzentrationen von den anormalen Zellen zu bestimmen. Ein solches Verfahren wird als differenzierte Bestimmung weißer Blutkörperchen bezeichnet und ist in J.B. Miale, "Laboratory Medicine-Hematology", S. 822-830, 1126, 1127 und 1130, C.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri (1967), beschrieben.
In der letzten Zeit wurden automatische Verfahren und dafür geeignete automatische Apparaturen entwickelt, um die differenzierte Bestimmung der weißen Blutkörperchen zu erleichtern (vgl. etwa US-3 741 875 und 4 099 917). Hierbei werden zytochemische Verfahren zur spezifischen Identifizierung und Bezeichnung der einzelnen Zelltypen verwendet.
Ein Verfahren zur Herstellung der in solchen Systemen eingesetzten Zellsuspension umfaßt die Behandlung der nicht koagulierten Blutprobe mit einem oberflächenaktiven Mittel während etwa 1,5 Minuten als Vorbedingung für die Lysis von den roten Blutkörperchen. Danach wird zu den Zellen ein Fixativ während einer Minute unter Aufrechterhaltung eines neutralen pH-Werts zugegeben und die Mischung bei etwa 58ºC bis 60ºC inkubiert zur Lysis der roten Blutkörperchen und Fixierung der weißen Blutkörperchen (vgl. US-4 099 917). Es ist unerläßlich bei solchen Verfahren, daß alle roten Blutkörperchen lysiert werden, da die roten Blutkörperchen den weißen zahlenmäßig um etwa 700 : 1 überlegen sind. Demzufolge kann, selbst wenn nur 1 Prozent der roten Blutkörperchen nicht lysiert wird, die differenzierte Bestimmung der weißen Blutkörperchen nicht exakt durchgeführt werden.
Ein Hauptnachteil der bekannten Arbeitsweisen ist die relativ lange Zeit, die die Durchführung der Analyse erfordert, nämlich allein 5 Minuten für die Herstellung der Zellsuspension, wodurch diese Methoden unerwünscht sind für Notfall-Analysen oder für andere Situationen, bei denen rasche Ergebnisse erforderlich sind. Es besteht also das Bedürfnis nach einer Methode zur Durchführung der differenzierten Bestimmung der weißen Blutkörperchen, die im Vergleich zu den bekannten Arbeitsweisen relativ schnell ist. Eine solche Methode muß die roten Blutkörperchen in der Probe vollständig lysieren, und zwar ohne daß dabei die weißen Blutkörperchen beschädigt oder extrazelluläre Fällungen oder Verklumpungen der Zellen verursacht werden, da solche Fällungen oder Verklumpungen zu Mehrdeutigkeiten in der Zellenermittlung und Phasenerkennung des Verfahrens führen können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Verwendung als Reagenzlösung bei der differenzierten Bestimmung von weißen Blutkörperchen, das in einer wässerigen Mischung enthält:
a) eine oberflächenaktive Substanz;
b) Formaldehyd oder Paraformaldehyd;
c) einen Zucker oder Zuckeralkohol in einer Konzentration von etwa 9,0% bis etwa 13,5% (Gew./Vol); und
d) einen pH-Puffer zur Aufrechterhaltung des pH-Werts der Reagenzlösung zwischen etwa 6,6 und 7,6.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur raschen differenzierten Bestimmung von weißen Blutkörperchen in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, welches umfaßt:
a) die Herstellung oder Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 11 beschriebenen Reagenzlösung;
b) das rasche Mischen der Reagenzlösung mit der zu analysierenden Probe zur Bildung einer Reaktionsmischung innerhalb von etwa 5 Sekunden nach dem ersten Inberührungkommen von der Reagenzlösung und der Probe, die beide eine Ausgangstemperatur zwischen etwa 20ºC bis etwa 28ºC aufweisen und
c) das Erwärmen der Reaktionsmischung auf eine Temperatur zwischen etwa 62&sup0;C bis etwa 72ºC innerhalb von 30 Sekunden zum Auflösen der in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen und Fixieren der in der Probe enthaltenen weißen Blutkörperchen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet also eine Arbeitsweise zur raschen Durchführung einer differenzierten Bestimmung der weißen Blutkörperchen sowie eine dabei zu verwendende Lösung.
Aus der US-A-4 040 785 ist es bekannt, den Schutz von vollständigen Blutproben zu verbessern und die Logistik beim Transport der Proben zu erleichtern, indem man zu einer frischen Blutprobe eine filtrierte wässerige Mischung von einer Mono-, Di- oder Tri-Saccharidkomponente und Formaldehyd in solchen Mengen zusetzt, daß in der erhaltenen geschützten Blutprobe die Konzentration zwischen 0,05 bis 1 Gew.-% bzw. 0,1 bis 0,8 Gew.-% liegt. Indessen wird dadurch die beanspruchte Zusammensetzung der Reagenzlösung aus den vier bestimmten Komponenten nicht nahegelegt; dies gilt erst recht für die in den Patentansprüchen angeführten jeweiligen Parameter bzw. das beanspruchte Verfahren für eine rasche Herstellung einer Blutprobe zu (bzw. rasche Durchführung von) der differenzierten Bestimmung der weißen Blutkörperchen mittels dieser Reagenzlösung.
Formaldehyd oder Paraformaldehyd werden in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung als Fixierungsmittel für die weißen Blutkörperchen verwendet. Vorzugsweise wird Formaldehyd eingesetzt und liegt in der Lösung in einer Menge zwischen etwa 4,5% und etwa 6,6% vor. Insbesondere ist der Formaldehyd anwesend in einer Menge von etwa 5,3% bis etwa 5,9%.
Das in der Reagenzlösung gemäß der Erfindung vorhandene oberflächenaktive Mittel kann ein jedes sein, das die roten Blutkörperchen (red blood cells = RBCs) zu lysieren vermag. Das oberflächenaktive Mittel kann z. B. ein neutrales sein, wie Polyoxyethylen 20-Sorbitanmonolaurat, Polyoxyethylen 23-Monolaurylether oder Polyoxyethylen 20-Sorbitanmonooleat, die vom Fachmann leicht synthetisiert werden können; insbesondere ist es jedoch ein solches aus der Gruppe der Alkalimetallsalze von einem Alkylsulfat mit etwa 10 bis etwa 16 Kohlenstoffatomen. Als Alkalimetallkationen werden Natrium, Kalium und Lithium bevorzugt. Bei den bevorzugteren oberflächenaktiven Mitteln handelt es sich um Alkalimetalldodecylsulfate, von denen wiederum Natriumdodecylsulfat der Vorzug gegeben wird. Das oberflächenaktive Mittel soll in der Reagenzlösung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Menge von etwa 3,1 Millimol (mM) bis etwa 4,5 mM vorhanden sein. Im Falle des Natriumdodecylsulfats entspricht diese molare Konzentration etwa 0,9 g/L bis etwa 1,3 g/L.
Der Zucker oder Zuckeralkohol ist in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung in der beanspruchten Menge anwesend, um das Signal-Störbild-Verhältnis (Rauschverhältnis, signal-to-noise ratio) bei Lymphozyten zu erhöhen (d. h., deren Eignung, durch elektrooptische Detektoren "gelesen" werden zu können, zu verbessern). Geeignete Zucker oder Zuckeralkohole sind Sucrose, Fructose, Dextrose, Sorbit und Mannit. Die Wahl zwischen einem Zucker und Zuckeralkohol soll und kann der Fachmann routinemäßig in Abhängigkeit von der besonderen Situation treffen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß im Falle der Verwendung eines Zuckeralkohols in der Reagenzlösung diese unter erschwerten Bedingungen länger stabil ist als bei Verwendung eines reduzierenden Zuckers, wie Glukose.
Der Grund für die größere Stabilität der Reagenzlösung im Falle der Verwendung eines Zuckeralkohols gegenüber der von einem reduzierenden Zucker scheint darin zu liegen, daß ein reduzierender Zucker, wie Glukose im Verlaufe der Zeit durch Luft unter Bildung von Gluconsäure oxydiert werden kann (vgl. z. B. Tamura W. Nishikido jr. und Y. Fuknoda, Jap. Kokai Tokyo Koho 80 40, 606, Chem. Abstr. 93 : 22120d (1950). Wenn Gluconsäure vorhanden ist, wird der pH-Wert der Lösung herabgesetzt. Sobald der pH-Wert aus dem Bereich gemäß der Erfindung fällt, wird die Arbeitsweise nach der Erfindung wegen der geringeren Lysierung der roten Blutkörperchen weniger genau. Ein Zuckeralkohol kann nicht durch die Luft oxydiert werden. Darüber hinaus kann sich ein Zuckeralkohol chemisch mit Formaldehyd binden unter Bildung eines Polyacetals, wodurch die Oxydation von Formaldehyd zu Ameisensäure verhindert wird, welche - sofern sie entstehen würde - ebenfalls den pH-Wert der Formulierung herabsetzen würde.
Der in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung vorzugsweise verwendete Zucker ist Dextrose (ein reduzierender Zucker) und der bevorzugte Zuckeralkohol ist Sorbit, wobei jedoch - wie angemerkt - ein Zuckeralkohol überhaupt von Vorteil ist. Im Idealfall liegen Dextrose oder Sorbit in der Reagenzlösung gemäß der Erfindung in einer Menge zwischen etwa 11,0% bis etwa 12% (Gew./Vol.) vor. Sofern ein anderer Zucker als Dextrose oder ein anderer Zuckeralkohol als Sorbit eingesetzt ist, so soll die Menge des alternativ vorhandenen Zuckers oder Zuckeralkohols in etwa äquimolar mit der von Dextrose oder Sorbit sein.
Gewünschtenfalls kann die Reagenzlösung auch noch ein Salz enthalten. Als für die gemäß der Erfindung zu verwendenden Salze sind die Alkalimetallchloridsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Lithiumchlorid zu nennen. Das bevorzugte Salz ist NaCl. Dieses Salz kann wahlweise vorhanden sein, da es die Unterscheidung zwischen den Neutrophilen und den Eosinophilen durch Hervorrufung einer Differenz bei der Peroxydase-Färbungsintensität unter Verwendung von optischen Lichtstreu/Absorptions-Geräten unterstützen kann. Andere Halogensalze (d. h. Fluoride, Bromide und Jodide) inhibieren die Peroxydaseaktivität der Neutrophilen zu viel und verhindern dadurch die Unterscheidung der Neutrophilen von den anderen ungefärbten weißen Blutkörperchen (WBCs). Sofern ein Salz verwendet wird, soll es in einer Menge zwischen etwa 68 mM bis etwa 103 mM vorhanden sein. Im Falle der Verwendung von NaCl ist dessen Konzentration in der Reagenzlösung zwischen etwa 0,4% bis etwa 0,6% (Gew./Vol.).
Der Puffer oder die Puffermischung gemäß der vorliegenden Erfindung soll derart sein, daß damit ein pH-Wert der Reagenzlösung zwischen etwa 6,6 bis etwa 7,6, vorzugsweise zwischen etwa 6,9 bis etwa 7,3 aufrechterhalten werden kann. Geeignete Puffer umfassen Natrium- oder Kaliumphosphate, Dimethylmalonat, 3-(N-Morpholin)propansulfonsäure (MOPS), N-2-Acetamido-2-aminoethansulfonsäure (ACES) und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES). Bevorzugt wird eine Mischung aus Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4;. Wie ausgeführt, sollen die Puffer in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung in einer solchen Menge vorhanden sein, daß damit der pH-Wert der Lösung in einem etwa neutralen Bereich gehalten wird. Wenn z. B. eine Mischung aus Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4; verwendet wird, soll die Mischung ein molares Verhältnis von Na&sub2;HPO&sub4; zu NaH&sub2;PO&sub4; aufweisen, das zwischen etwa 2,04 : 1 bis etwa 0,81 : 1 liegt und eine Reihe von Lösungen mit einem pH-Bereich zwischen etwa 6,9 und 7,3 hergestellt werden kann. Die Konzentration dieser Mischung in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung beträgt etwa 0,075 Mol (M)bis etwa 0,125 M.
Die für die Praxis anwendbare Reagenzlösung gemäß der Erfindung ist eine wässerige Lösung, bei der vorzugsweise deionisiertes Wasser eingesetzt wird. Die Lösung wird hergestellt durch Zusammengeben der abgemischten Bestandteile in Wasser. Eine enge Überwachung des pH-Werts von der Lösung soll sicherstellen, daß dieser im gewünschten Bereich bleibt. Der Fachmann kann ggf. weitere Additive der Reagenzlösung zusetzen. So kann z. B. Ethylendiamintetraessigsäuse (EDTA) als Metallchelatbildner eingebracht werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Reagenzlösung rasch mit der zu analysierenden Probe unter Bildung der Reaktionsmischung vermischt. Eine gleichförmige Mischung soll innerhalb von 5 Sekunden ab dem Inberührungskommen von Reagenzlösung und Blutprobe erfolgen. Wenn die beiden nicht schnell innig vermischt werden, tritt eine Fixierung der RBCs ein, die die vollständige Lysierung der RBCs verhindert und so die bei der Durchführung der Erfindung erzielbare Genauigkeit der differenzierten WBC-Bestimmung beeinträchtigt.
Bei dem Mischen sollen die Reagenzlösung und die Blutprobe im wesentlichen Raumtemperatur (etwa 20ºC bis 28ºC) haben, um sicherzustellen, daß das kritische Wärmeprofil aufrechterhalten bleibt. Die Reaktionsmischung wird dann rasch auf eine Temperatur zwischen etwa 62ºC und etwa 72ºC erwärmt, insbesondere auf etwa 64ºC und 68ºC, vorzugsweise durch Injektion in ein automatisches hämatologisches Analysegerät, das bei der geeigneten erhöhten Temperatur gehalten wird. Kinetische Messungen zeigen, daß die Temperatur der Reaktionsmischung im wesentlichen unmittelbar nach der Injektion auf 35ºC bis etwa 42ºC gebracht wird. Der anschließende Temperaturanstieg beginnt ab diesem Punkt. Das Erwärmen der Rekktionsmischung soll innerhalb von 30 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 20 Sekunden erfolgen, anderenfalls eine RBC-Fixierung erfolgt, die die Lysis verhindert und dadurch die Genauigkeit der differenzierten WBC-Bestimmung beeinträchtigt.
Unmittelbar danach wird eine Färbelösung aus Wasserstoffperoxid und einem geeigneten Chromogen, wie 4-Chlor-1-naphthol mit der Reaktionsmischung vermischt. Die Ausgangstemperatur der Färbelösung kann Raumtemperatur sein; bevorzugt, aber nicht unbedingt notwendig, wird die Temperatur nach dem Mischen der Färbelösung mit der Reaktionsmischung auf etwa 62ºC bis etwa 72ºC, insbesondere 63&sup0;C bis etwa 69ºC innerhalb einer Zeitspanne von etwa 30 Sekunden, vorzugsweise zwischen 8 und 15 Sekunden erhöht, um die peroxydaseaktiven Neutrophilen und Eosinophilen zu färben.
In der Praxis kann der Vorgang wie folgt ablaufen:
Der Reaktionsraum von einem automatischen hämatologischen Analysiergerät wird bei einer Temperatur von etwa 72ºC gehalten. 12,0 ul Gesamtblut und 250 ul der hier offenbarten Reaktionslösung auf Raumtemperatur werden gleichzeitig in das System injiziert, dabei rasch unter Bildung der Reaktionsmischung vermischt, die dann bis innerhalb von 30 Sekunden inkubiert wird unter Anstieg der Temperatur der Mischung auf etwa 62ºC bis etwa 72ºC. Am Ende von dieser Inkubationsperiode sind die RBCs völlig lysiert und die WBCs fixiert.
Im unmittelbarem Anschluß werden 125 ul einer Chromogen-Mischung (z. B. 0,8% 4-Chlor-1-naphthol in Oxydiethanol) gleichzeitig mit 250 ul einer Wassersuperoxidlösung mit 0,3% an Wasserstoffsuperoxid injiziert. Beide Reagentien haben zunächst Raumtemperatur, indessen steigt die Temperatur der Färbemischung aufgrund der Temperatur von dem Reaktionsraum auf etwa 63ºC bis etwa 69ºC innerhalb von etwa 30 Sekunden, wonach die Peroxydase-Färbung der Neutrophilen und Eosinophilen beendet ist.
Fig. 1 zeigt ein Zytogramm, das erhalten wurde mittels einer elektrisch-optischen Bestimmungsapparatur von einem automatischen hämatologischen Analysator. Diese Figur zeigt die vier WBC-Typen, wie sie gemäß der erfindungsgemäßen Methode differenziert bestimmt wurden: 1. die Lymphozyten, 2. die Monozyten, 3. die Neutrophilen und 4. die Eosinophilen. Das Zytogramm zeigt ferner das Signal 5, das von Blutplättchen und roten Schattenzellen stammt.
Ein anderer wesentlicher Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die hohe Konzentration an Gelöstem in der Reagenzlösung. Die relativ hohen Gehalte an Formaldehyd oder Paraformaldehyd und Zucker oder Zuckeralkohol ergeben eine Gesamtmolarität der Reagenzlösung von mehr als etwa 2,0 M/Liter. Die Wirkung dieser hypertonischen Lösung auf Blutzellen verursacht deren Kerbung (Schrumpfung aufgrund einer osmotischbedingten Dehydratation). Es ist bekannt, daß die Einkerbung der Lymphozyten deren Signal-Erkennung erhöht und dadurch die Genauigkeit der differenzierten WBC-Bestimmung verbessert.
Der Ablauf des Verfahrens gemäß der Erfindung wird zwar an Hand einer automatischen Anordnung erläutert, indessen ist für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß dieses auch bei manuellen Methoden anwendbar ist. Darüberhinaus wurde das Verfahren gemäß der Erfindung erläutert unter Verwendung einer Gesamtblutprobe zwecks der dadurch gegebenen differenzierten WBC-Bestimmung. Für den Fachmann ist ohne weiteres erkennbar, daß die Erfindung auch anwendbar ist für Vorratskalibriergeräte, Kontroll- und andere Lösungen von Blutzellen, die zur Eichung und Aufrechterhaltung der Genauigkeit von der Apparatur eigens hergestellt werden. Der hier verwendete Ausdruck "Probe" wird ausdrücklich ausgewählt, um sowohl Gesamtblut als auch andere Lösungen mit einem Gehalt an Blutzellen zu umfassen. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Nachdem sie aber nur zur weiteren Erleichterung des Verstehens der Erfindung gegeben werden, sind sie in keiner Weise zur Einschränkung der Erfindung auslegbar.

Beispiel 1

Lösungen mit der nachfolgenden Zusammensetzung wurden angesetzt:
Natriumdodecylsulfat 0, 105 g/L
NaCl 5,0 g/L
Formaldehyd 55,0 g/L
Dextrose 112,0 g/L
Phosphat-Puffer* 0,079 M**
Dinatriumsalz von EDTA 0,75 g/L
Wasser aufgefüllt auf Volumen
* Mischung aus NaH&sub2;PO&sub4; und Na&sub2;HPO&sub4;
** NaOH und/oder HCl werden jeweils zugesetzt, um die Lösung auf den angeführten pH-Wert einzustellen.
Drei Lösungen mit einem pH-Wert von 6,5, 7,2 und 7,5 wurden hergestellt. 250 ul von einer jeden Lösung wurden rasch (innerhalb von 2 Sekunden) mit 12 ul Gesamtblut vermischt und 20 Sekunden inkubiert, wobei während dieser Zeit die Temperatur auf etwa 70ºC angehoben wurde. 250 ul von einer Lösung mit 0,3% Wasserstoffsuperoxid und 125 ul von einer Lösung mit 0,8% 4-Chlor-1-naphthol in Oxydiethanol wurden mit den Reaktionsmischungen vereinigt und für 20 Sekunden inkubiert, wobei während dieser Zeit die Temperatur auf 67ºC gebracht wurde.
Die erhaltenen Lösungen wurden danach durch ein elektro-optisches Meßsystem geleitet und ein Zytogramm hergestellt. Fig. 2 zeigt das Zytogramm, das mit der Lösung vom pH-Wert 6,5 erhalten wurde. Dieses Zytogramm zeigt nur die Signatur der roten Blutkörperchen, was erläutert, das beim pH-Wert von 6,5 die RBCs nicht lysiert werden.
Fig. 3 zeigt ein Zytogramm, das mit einer Lösung vom pH-Wert 7,2 erhalten wurde. Dieses Zytogramm zeigt eine sehr genaue Bestimmung der weißen Blutkörperchen und erläutert, daß bei einem pH-Wert von 7,2 die RBCs lysiert und die weißen Blutkörperchen gut fixiert werden.
Fig. 4 zeigt ein Zytogramm, das mit einer Lösung vom pH-Wert 7,5 erhalten wurde. Dieses Zytogramm läßt eine Abnahme in der Signatur der Lymphozyten und Monozyten erkennen, was anzeigt, daß beim pH-Wert von 7,5 die RBCs nicht völlig lysiert wurden.

Beispiel 2

Lösungen mit dem nachstehenden Aufbau wurden hergestellt:
Natriumdodecylsulfat 0, 105 g/l
NaCl 5,0 g/L
Phosphat-Puffer* 0,079 M
Formaldehyd 55,0 g/L
Dextrose 112,0 g/L
Dinatriumsalz der EDTA 0,75 g/L
Wasser aufgefüllt auf Volumen
* Mischung aus Na&sub2;HPO&sub4; und NH&sub2;PO&sub4; (pH-Wert etwa 7,0)
Die Lösung wurde in vier Teile geteilt, von denen ein jeder mit einer Gesamtblut-Probe entsprechend Beispiel 1 vermischt wurde, jedoch die Temperatur, auf die die Reaktionsmischung gebracht wurde, variierte.
Fig. 5 zeigt ein Zytogramm, das im Falle einer Temperaturerhöhung auf 57ºC erhalten wurde. Dieses Zytogramm zeigt, daß die RBCs nicht völlig lysiert wurden, denn die Schatten von teilweise lysierten RBCs maskieren die Trennung des Signals der Lymphozyten vom Störbild (Rauschen, noise).
Fig. 6 zeigt ein Zytogramm, das bei einem Anstieg der Temperatur auf 60ºC erhalten wurde. Ausweislich von diesem Zytogramm sind noch einige unvollständig lysierte RBCs vorhanden, die den Spalt zwischen Lymphozyten und Störbild füllen und die Lymphozyten-Unterscheidung vom Störbild beeinflussen.
Fig. 7 zeigt ein Zytogramm, das bei einer auf 65ºC angehobenen Temperatur erhalten wurde. Dieses Zytogramm läßt erkennen, daß die RBCs vollständig lysiert wurden und somit die Separation der Lymphozyten vom Störbild eindeutig ist.
Fig. 8 zeigt ein Zytogramm, das bei einem Temperaturanstieg auf 72ºC erhalten wurde. Ausweislich von diesem Zytogramm liegt dies an der oberen Grenze der Temperatur. Eine geringe Inhibierung der Peroxydaseaktivität von den Neutrophilen und Eosinophilen ist feststellbar.
Fig. 9 zeigt ein bei einem Temperaturanstieg auf 74ºC erhaltenes Zytogramm. Es zeigt, daß eine Proteinfällung und Peroxydasedenaturierung eingetreten sind. Die Fällung erhöht den Störpegel und beeinträchtigt die eindeutige Trennung der Lymphozyten vom Störbild.
Fig. 10 zeigt ein bei einem Temperaturanstieg auf 75ºC erhaltenes Zytogramm. Es zeigt, daß eine Proteinfällung und Peroxydasedenaturierung eingetreten sind, was daran erkennbar ist, daß die Fällungen ein die Trennung der Lymphozyten beeinflussendes Störbild erzeugen und die Signaturen der Neutrophilen und Monozyten nach links verschoben sind.

Beispiel 3

Eine Lösung mit dem nachfolgenden Aufbau wurde hergestellt:
Natriumdodecylsulfat 0, 105 g/L
NaCl 5,0 g/L
Phosphat-Puffer* 0,079 M
Formaldehyd 55,0 g/L
Dextrose **
Dinatriumsalz von EDTA 0,75 g/L
Wasser aufgefüllt auf Volumen
* Mischung aus NaH&sub2;PO&sub4; und Na&sub2;HPO&sub4; (pH-Wert etwa 7,0)
** wechselnd, wie beschrieben.
Vier einzelne Lösungen mit unterschiedlichen Dextrose-Konzentrationen wurden hergestellt, von denen eine jede entsprechend Beispiel 1 mit Gesamtblut zur Reaktion gebracht wurde.
Fig. 11 zeigt ein mit einer Dextrose-Konzentration von 7,0% erhaltenes Zytogramm. Es läßt erkennen, daß die Lymphozyten-Scattersignale noch zu niedrig sind, um klar von dem Störbild getrennt werden zu können.
Fig. 12 zeigt ein Zytogramm, das mit einer Dextrose-Konzentration von 11,5% erhalten wurde. Wie daraus ersichtlich, sind die Lymphozyten-Scattersignale für die Trennung vom Störbild hinreichend hoch.
Fig. 13 zeigt ein mit der Dextrose-Konzentration von 16,0% erhaltenes Zytogramm. Es weist aus, daß Fällungen eingetreten sind und daß eine Beeinflussung der völligen RBC- Lysis besteht.

Beispiel 4

Eine Lösung mit der nachfolgenden Zusammensetzung wurde hergestellt:
Natriumdodecylsulfat 0, 105 g/L
NaCl 5,0 g/L
Phosphat-Puffer* 0,079 M**
Formaldehyd 55,0 g/L
Sorbit 112,0 g/L
Dinatriumsalz von EDTA 0,75 g/L
Wasser aufgefüllt bis zum Volumen
* Mischung aus Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4;
** NaOH und/oder HCl wurden zugegeben, um die aufgeteilte Lösung auf den angeführten pH-Wert einzustellen.
Die Lösung wurde in zwei Portionen geteilt, von denen eine jede mit Gesamtblut entsprechend Beispiel 1 zur Reaktion gebracht wurde, jedoch der pH-Wert einer jeden geändert wurde.
Fig. 14 zeigt das Zytogramm, das mit einem pH-Wert von 6,8 erhalten wurde, Fig. 15 das mit einem pH-Wert von 7,2 erhaltene Zytogramm. Ein jedes dieser Zytogramme belegt, daß in der erfindungsgemäßen Reagenzlösung ohne Wirkungsverlust ein Zuckeralkohol anstelle eines Zuckers vorliegen kann.

Beispiel 5

Die pH-Wert-Stabilität der Komponenten in der Reagenzlösung wurde untersucht, und zwar unter Belassung der Komponenten in einem Phosphat-Puffer (Mischung aus Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4;) während einer Zeit von mehreren Tagen bei erhöhter Temperatur. Die Ergebnisse sind in der Tabelle I zusammengestellt. TABELLE I Konzentration des Puffers 0,1 M Gelöster Stoff Tage Temp. (ºC) Ausgangs-pH-Wert End-pH-Wert Diff. der pH-Wert Glukose b Galaktose b Sorbit b Mannit b Formaldehyd c Glukose b Formaldehyd c Sorbit b Formaldehyd c Mannit b Formaldehyd c Kontrolle d b Konzentration : 0,7 M. c Konzentration : 1,8 M. d Puffer allein
Es ist leicht zu erkennen, daß die gemäß der Erfindung offenbarten und beanspruchten Komponenten, Konzentrationen und Verfahrensparameter von kritischer Bedeutung für die erfolgreiche differenzierte WBC-Bestimmung sind, die wesentlich schneller durchgeführt werden kann als bekannte Methoden. Auch ist ersichtlich, daß unter erschwerten Bedingungen Zuckeralkohol eine größere pH-Wert-Stabilität als ein reduzierender Zucker gewährleistet.

Claims

1. Mittel zur Verwendung als Reagenzlösung zur differenzierten Bestimmung von weißen Blutkörperchen, enthaltend in wässeriger Lösung eine Mischung von:

a) einer oberflächenaktiven Substanz,

b) Formaldehyd oder Paraformaldehyd,

c) einem Zucker oder Zuckeralkohol in einer Konzentration voll etwa 9,0% bis etwa 13,5% (Gew./Vol) und

d) einem pH-Puffer zur Aufrechterhaltung des pH-Werts der Reagenzlösung zwischen etwa 6,8 und 7,6.

2. Mittel gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert zwischen etwa 6,9 bis etwa 7,3 liegt.

3. Mittel gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Puffer aus einer Mischung von Na&sub2;HPO&sub4; und NaH&sub2;PO&sub4; besteht.

4. Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die oberflächenaktive Substanz ein Alkalimetallsalz von einem Alkylsulfat mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen ist.

5. Mittel gemäß Anspruch 4, wobei die oberflächenaktive Substanz Natriumdodecylsulfat ist.

6. Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Zucker oder Zuckeralkohol Sucrose, Fructose, Dextrose, Sorbit oder Mannit ist.

7. Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei c) Dextrose oder Sorbit ist.

8. Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend zusätzlich ein Alkalimetallchloridsalz.

9. Mittel gemäß Anspruch 8, wobei das Alkalimetallchloridsalz NaCl, KCl oder LiCl ist.

10. Mittel gemäß Anspruch 9, wobei das Salz in einer Menge von etwa 68 mM bis etwa 103 mM vorliegt.

11. Mittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die oberflächenaktive Substanz in einer Menge von etwa 3,1 bis etwa 4,5 mM sind der Formaldehyd in einer Menge von etwa 4,5 bis etwa 6,6% vorliegen.

12. Verfahren zur raschen Gewinnung einer Blutprobe zur differenzierten Bestimmung von weißen Blutkörperchen, umfassend:

a) die Herstellung oder Verwendung der in einem der Ansprüche 1 bis 11 beschriebenen Reagenzlösung

b) das rasche Mischen der Reagenzlösung mit der zu analysierenden Probe zur Bildung einer Reaktionsmischung innerhalb von etwa 5 Sekunden nach dem ersten Inberührungkommen von der Reagenzlösung und der Probe, die beide eine Ausgangstemperatur zwischen etwa 20ºC bis etwa 28ºC aufweisen und

c) das Erwärmen der Reaktionsmischung auf eine Temperatur zwischen etwa 62ºC bis etwa 72ºC innerhalb von 30 Sekunden zum Auflösen der in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen und Fixieren der in der Probe enthaltenen weißen Blutkörperchen.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, umfassend die zusätzliche Stufe des Anfärbens der peroxydaseaktiven weißen Blutkörperchen.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Anfärbestufe das rasche Mischen der Reaktionslösung mit Wasserstoffsuperoxid und einem Chromogen umfaßt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Chromogen 4-Chlor-1-naphthol ist.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, umfassend das differenzierte Zählen der in der Probe enthaltenen weißen Blutkörperchen.