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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Reagens für
die Retikulozytenzählung mit Hilfe der Fließzytometrie.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf
ein Reagens für die Retikulozytenzählung mit Hilfe von
Fließzytometrie, welches aus zwei Lösungen besteht,
nämlich einer Stammlösung zum Färben und einer
Pufferlösung.
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Unentwickelte Erythrozyten im Blut werden Retikulozyten
genannt und machen 0,7 bis 2,2% der Gesamtzahl der
Erythrozyten aus. Die Bestimmung der Retikulozytenzahl
hilft bei der Bestätigung der Diagnose derartiger
Krankheiten, wie beispielsweise akute innere Blutung,
hämolytische Anämie, aplastische Anämie, etc., und hilft
auch bei der Überwachung des Fortschritts des körperlichen
Befindens des Patienten nach Arzneimittelverabreichung.
Somit wird sie im Bereich von Labortests als sehr wichtig
angesehen.
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Ein Verfahren, welches für das Zählen dieser Retikulozyten
verwendet worden ist, wird folgendermaßen durchgeführt:
Ein Blutausstrich einer mit einem Grundfarbstoff, wie
beispielsweise neuem Methylenblau, Brillantkresylblau,
etc. gefärbten Blutprobe wird beobachtet, und der
Prozentsatz der Anzahl gefärbter Retikulozyten wird im
Hinblick auf die Gesamterythrozytenzahl bestimmt.
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Dieses Verfahren benötigt eine Menge an Zeit und umfaßt
eine beträchtliche Arbeitsbelastung für die Vorbehandlung
von Blutproben, beispielsweise Färben etc., wie auch für
das visuelle Zählen nach dem Färben, und ist ungeeignet,
wenn die Anzahl der Proben groß ist.
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Deshalb sind viele Verfahren vorgeschlagen worden, bei
denen das Retikulozytenzählen durch Verwendung von
Fließzytometrie automatisiert ist. Beispielsweise sind in
der DE-A-35 44 867 und der japanischen
Patentveröffentlichung Nr. 34058/1987 Verfahren
beschrieben, bei denen ein Fluorchromreagens, welches
Auramin O enthält, zum Zählen von Retikulozyten mit Hilfe
von Fließzytometrie verwendet wird.
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W.c. Holmes et al erklären, daß das zuvor genannte
Auramin O einer Hydrolysereaktion, wie im nachfolgenden
dargestellt, unterliegt, welche durch eine Säure oder ein
Alkali katalysiert wird, und daß, je höher die
Reaktionstemperatur ist, desto größer die
Geschwindigkeitskonstante ist (Journal of The American
Chemical Society, 46, 2343 bis 2348 (1924)).
Michlers Keton
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Die Zeit, die erforderlich ist, damit 5% Auramin O unter
den in dem genannten Artikel beschriebenen Bedingungen
hydrolysiert wird, berechnet auf der Grundlage der in dem
Artikel beschriebenen Daten, ist in Tabelle 1 dargestellt.
In der Tabelle bedeutet K die Geschwindigkeitskonstante.
TABELLE 1 Zeit, die benötigt wird, um 5% Auramin O zu hydrolysieren
pH Temperatur K*¹ Zeit, die für die Hydrolyse von 5% benötigt wird
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* 1 umgewandelt aus Literaturwerten (h&supmin;¹)
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* 2 theoretische Werte
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Weil jedoch die Tabelle 1 nicht alle Bedingungen umfassen
kann, unter denen Auramin O für das Zählen von
Retikulozyten verwendet wird, wurde Experiment 1
durchgeführt, um detailliert die Zeit festzulegen, die für
die Hydrolyse von 5% Auramin O unter den tatsächlichen
Färbungsbedingungen erforderlich ist. Dieses Experiment
ist im nachfolgenden dargestellt.
EXPERIMENT 1
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Es wurden Färbelösungen mit vier verschiedenen
Zusammensetzungen, die in der Tabelle 2 dargestellt sind,
hergestellt und in Bädern gelagert, deren Temperaturen auf
5,4ºC, 22,3ºC und 39,0ºC kontrolliert wurden, und die
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verbleibende Menge Auramin O in jeder Lösung wurde bis zum
12. Tag mit Hilfe von HPLC untersucht.
TABELLE 2 Zusammensetzung der Färbelösung*
Probe Nr. pH Auramin O-Konzentration
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* 20 mM HEPES-Pufferlösung, 160 mM- (NaCl)
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Fig. 1 zeigt ein Beispiel der Ergebnisse bei 37ºC. Aus
dieser Figur ist deutlich ersichtlich, daß die
Hydrolysereaktion-von Auramin O erster Ordnung ist. Die
Hydrolysereaktionsgeschwindigkeitskonstanten jeder
Färbelösung bei den entsprechenden Temperaturen sind in
Tabelle 3 dargestellt.
TABELLE 3 Hydrolysegeschwindigkeit von Auramin O bei jedem pH-Wert
und Temperatur (Sek&supmin;¹)
Probe Nr. pH
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Die Beziehung zwischen der Hydrolysegeschwindigkeit und
Temperatur jeder Färbelösung (Arrhenius Plot) ist in Fig.
2 dargestellt. Wie in der Figur dargestellt ist, bilden
die Meßpunkte eine beinahe gerade Linie. Somit können die
Hydrolysegeschwindigkeitskonstanten bei Temperaturen, die
nicht tatsächlich bei dem Experiment verwendet worden
sind, leicht erhalten werden. Aus den zuvor angegebenen
experimentellen Ergebnissen wurde die Zeit, die
erforderlich ist, damit 5% Auramin O unter den für das
Färben von Retikulozyten tatsächlich verwendeten
Bedingungen hydrolysiert wird, wie in Tabelle 4 geschätzt.
TABELLE 4 Geschätzte Zeit, die für die Hydrolyse von 5% Auramin O unter den Bedingngen des Auramin O-Färbens benötigt wird (Std.)
Temperatur pH
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Eine Färbelösung, deren Restfarbstoffmenge mit Hilfe von
HPLC bestimmt worden ist, wurde filtriert, um mögliche
ungünstige Effekte durch Verwenden von gefälltem Michler's
Keton zu vermeiden. Zu 2 ml des Filtrats wurden 10 ul von
mit EDTA antikoaguliertem frischen Blut hinzugefügt. Nach
1-minütiger Inkubation wurde die Probe einem
Fließzytometer ausgesetzt, wobei ein Argon-Ionenlaser von
488 nm (10 mW) als Lichtquelle verwendet wurde, und es
wurden die Vorwärtsstreuung und Fluoreszenz von
Blutkorpuskeln bestimmt.
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Die HPLC-Ergebnisse sind in Tabelle 5 für die in Tabelle 2
dargestellte Färbelösung (pH 8,5) angegeben. Die bei drei
Temperaturniveaus (5,4ºC, 22,3ºC und 39,0ºC) gelagerten
Proben wurden während einer Zeitspanne zwischen dem Tag
der Zubereitung und dem 12. Tag einer fünfmaligen Messung
ausgesetzt; das bedeutet, es wurden insgesamt 60 Messungen
durchgeführt. In Tabelle 5 sind jedoch nur die Ergebnisse
bei einem pH-Wert von 8,5 dargestellt, weil bei diesem
pH-Wert die Wirkungen der Temperatur, bei der die
Färbelösung gelagert wurde, maximal sind.
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Wie in den Fig. 3 I-a bis 3 III-c dargestellt ist,
verringert sich die mit Hilfe von Fließzytometrie
gemessene Färbeintensität mit der Abnahme der mit Hilfe
von HPLC bestimmten Restmenge des Farbstoffs.
TABELLE 5 Restmenge des Farbstoffs (%)
Temperatur Zeit nach der Herstellung Stunden Tage
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Wie zuvor dargestellt ist, zeigten die Ergebnisse des
Experiments 1, daß Auramin O selbst unter den üblichen,
in der DE-A-35 44 867 beanspruchten Färbebedingungen
hydrolysiert wird. Die Löslichkeit von Michler's Keton in
Wasser, welches zur Zeit der Hydrolyse gebildet wird, ist
extrem gering. Es wird nur in einer Menge gelöst, die
äquivalent zu nicht mehr als 10 mg/ml Auramin O ist.
Beispielsweise fällt in einer Färbelösung, deren pH-Wert
8,0 und deren Auramin O-Konzentration 400 ug/ml beträgt,
Michler's Keton in 5 Tagen aus, wenn es bei einer
Temperatur von 4ºC gelagert wird, und in etwa einem halben
Tag aus, wenn es bei Raumtemperatur gelagert wird. Deshalb
wird die Retikulozytenzählung bei Verwendung dieser
Färbelösung ungünstig beeinflußt werden.
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Ein Verfahren zum Lösen dieses Problems würde darin
bestehen, Michler's Keton durch Zugabe eines
Lösungsmittels löslich zu machen. Jedoch ist dieses
Verfahren nur auf eine Verminderung der Störung, die durch
Fällung von Michler's Keton beim Retikulozytenzählen
verursacht wird, gerichtet und kompensiert nicht die
Verschlechterung der Reagenseigenschaft aufgrund der
Abnahme an Auramin O-Gehalt.
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Fig. 1 zeigt die Änderung des restlichen
Auramin O-Gehalts im Laufe der Zeit bis zum
12. Tag nach der Zubereitung und Lagerung
von Färbelösungen von vier
Zusammensetzungen, die in Tabelle 2
dargestellt sind, in einem auf 39,0ºC
gehaltenen Luftbad;
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Fig. 2 ist ein Arrhenius Plot, welcher die
Beziehung zwischen der
Hydrolysegeschwindikgeit und Temperatur für
jede der zuvor genannten Färbelösungen
darstellt; und die
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Fig. 3 I-a, 3 I-b, 3 I-c, 3 II-a, 3 II-b, 3 II-c,
3 III-a, 3 III-b und 3 III-c zeigen die
Messergebnisse des vorwärts gestreuten
Lichtes und der Fluoreszenz von
Blutkorpuskeln bei Verwendung einer
Färbelösung bei einem pH-Wert von 8,5 unter
den in Tabelle 5 dargestellten Zeit- und
Temperaturbedingungen. Hier entspricht die
Konfiguration dieser Figuren dem Eintrag in
Tabelle 5.
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In den zuvor genannten Figuren zeigt A den Bereich, der
den reifen Erythrozyten entspricht, B Retikulozyten und C
Thrombozyten.
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Die vorliegende Erfindung liefert ein stabiles Reagens für
die Retikulozytenzählung, welches frei von
Verschlechterung, d. h. einer Abnahme des Farbstoffgehalts
ist, wobei zum Zwecke der Verhinderung der Abnahme der
Menge des Fluorochroms Auramin O aufgrund von Hydrolyse
das Reagens in zwei Lösungen, nämlich eine
Farbstofflösung, in der das Fluorochrom in einem
wasserfreien Lösungsmittel gelöst ist, und eine wäßrige
Pufferlösung, die den optimalen Färbebedingungen genügt,
geteilt ist; und diese beiden Lösungen werden unmittelbar
vor Verwendung gemischt.
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In anderen Worten ausgedrückt heißt das, die vorliegende
Erfindung liefert ein Reagens für die Fließzytometrie
gemäß dem ersten Teil des Anspruchs 1. Ein derartiges
Reagens, welches aus zwei Lösungen, nämlich einer
Stammlösung zum Färben, in der ein Farbstoff (Thiazol-
Orange) in einem nicht-wäßrigen Lösungsmittel (Methanol)
gelöst ist, und einer Pufferlösung besteht, ist in
EP-A-0 226 272 offenbart.
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Die erfindungsgemäße Stammlösung zum Färben umfaßt
Auramin O als Farbstoff und als nicht-wäßriges
Lösungsmittel Ethylenglykol oder Triethylenglykol oder
Diethylenglykol. Das nicht-wäßrige Lösungsmittel sollte
den nachfolgenden Bedingungen genügen:
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(1) Es sollte polar genug sein, um Auramin O zu
lösen, und die Löslichkeit von Auramin O darin sollte
nicht geringer als einige Prozent sein.
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(2) Es sollte nicht mit den Blutkorpuskeln in
Wechselwirkung treten. Zumindest sollte es nicht die
Zählergebnisse mittels Fließzytometrie verzerren.
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(3) Es sollte nicht in ungünstiger Weise das
Fließsystem der Vorrichtung für die Fließzytometrie
beeinflussen.
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(4) Es sollte wenig Flüchtigkeit aufweisen und kaum
eine Neigung besitzen, sich über lange Perioden der
Lagerung zu verschlechtern oder zu verringern.
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Im Hinblick auf diese Anforderungen umfassen Alkohole
bevorzugte Lösungsmittel, und zehn alkoholische
Lösungsmittel wurden detailliert unter Berücksichtigung
dieser Bedingungen untersucht.
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Zuerst wurden die Wirkungen der Lösungsmittelzugabe auf
die zuvor unter Punkt (2) beschriebene
Retikulozytenzählung in dem nachfolgenden Experiment 2
untersucht. Bei der tatsächlichen Fließzytometrieanalyse
wird Auramin O in einem Lösungsmittel gelöst, und diese
Auramin O-Stammlösung und eine Pufferlösung werden unter
Herstellung einer endgültigen Färbelösung für die
Retikulozytenzählung gemischt. Bei diesem Experiment wurde
jedoch ein Lösungsmittel alleine zu einer Färbelösung
gegeben, welche schon Auramin O enthielt, und die
Wirkungen der Lösungsmittelzugabe auf die
Retikulozytenzahlbestimmung wurden untersucht.
EXPERIMENT 2
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Auramin O 400 mg/l
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Phosphorsäure 20 mM/l
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Natriumchlorid 150 mM/l
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Es wurden Färbelösungen mit einem pH-Wert von 8,0 mit der
zuvor dargestellten Zusammensetzung unmittelbar vor der
Messung so hergestellt, daß sie verschiedene
Lösungsmittel in Konzentrationen von 0,40%, 0,63%,
1,00%, 1,6%, 2,5%, 4,0%, 6,25%, 10,0%, 16,0% und
25,0% enthielten (alle Prozentangaben beziehen sich auf
das Volumen).
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Zu 2 ml jeder Färbelösung wurden 10&supmin;¹ von mit EDTA-
antikoaguliertem Frischblut hinzugegeben. Die
Blutkorpuskeln wurden 30 Sekunden bei 25ºC gefärbt, und
die Vorwärtsstreuung und Fluoreszenz wurden mit Hilfe von
Fließzytometrie gemessen.
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Die Konzentration, bei der Erythrozytolyse auftritt,
unterscheidet sich in bezug auf die Art des
Lösungsmittels. Bei Fällen von Lösungsmitteln, die
Erythrozytolyse selbst bei einem Lösungsmittelgehalt in
der Färbelösung von über 10% verursachen, wurden
geringere oder keine Wirkungen bei der Messung des
vorwärts gestreuten Lichts bis zu einem
Lösungsmittelgehalt von etwa 10% beobachtet; im Falle von
Lösungsmitteln, welche Erythrozytolyse bei einem
Lösungsmittelgehalt von weniger als etwa 10% verursachen,
galt das Gleiche bis unmittelbar vor Auftreten des
Zytolysephänomens.
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Andererseits verringert sich die Intensität des
Fluorochromfärbens mit der Zunahme der Menge des
hinzugegebenen Lösungsmittels. In derartigen Fällen ist
die Retikulozytenzählung frei von Wirkungen der
Lösungsmittelzugabe bis zu einer bestimmten kritischen
Menge, wodurch die Empfindlichkeit der Fließzytometrie
vergrößert wird. Die kritische Zugabemenge ist im
Hinblick auf die Art des Lösungsmittels unterschiedlich.
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Der Gehalt an Lösungsmittel, bei dem Erythrozytolyse
auftritt, und der maximal mögliche Lösungsmittelgehalt,
der Retikulozytenzählung mittels Fließzytometrie
ermöglicht, sind in Relation zur Zugabe verschiedener
Lösungsmittel in Tabelle 6 dargestellt.
TABELLE 6 Lösungsmittelgehalt, welcher die Retikulozytenzählung mit
Hilfe des Fließzytometers ermöglicht (V/V-%)
Lösungsmittel Gehalt, bei dem Erythrozytolyse auftritt Maximal möglicher Gehalt, welcher die Retikulozytenzählung mittels Fließzytometrie ermöglicht Methanol Ethanol n-Propanol Ethylenglykol Diethylenglykol Triethylenglykol Ethylenglykolmonomkethylether Ethylenglykolmonoethylether Ethylenglykolmono-(n-butyl)ether Diethylenglykolmonoethylether
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Aus Tabelle 6 ist ersichtlich, daß die maximale
Lösungsmittelmenge, die hinzugefügt werden kann, durch den
Bereich bestimmt wird, in dem Fließzytometrie möglich
ist. Weil es jedoch wünschenswert ist, daß die Abnahme
der Fluoreszenzintensität auf ein Minimum gebracht wird,
ist es vorzuziehen, daß die Menge des hinzuzugebenden
Lösungsmittels auch auf ein Minimum gebracht wird.
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Damit die Retikulozytenzählung möglich ist, sollte die
endgültige Färbelösung eine gewünschte
Farbstoffkonzentration aufweisen. Zu diesem Zweck sollte
die gewünschte Farbstoffmenge in einer Stammlösung zum
Färben gelöst werden. Andererseits sollte, wie zuvor
erklärt worden ist, die Menge der in der Stammlösung zum
Färben enthaltenen Lösungsmittel in der endgültigen
Färbelösung so gering wie möglich sein. Deshalb ist ein
Lösungsmittel, in dem Auramin O eine große Löslichkeit
besitzt, bevorzugt. Wenn ein derartiges Lösungsmittel
ausgewählt wird, kann die gewünschte Konzentration der
endgültigen Färbelösung durch Zugabe einer kleineren Menge
einer Stammlösung zum Färben (und deshalb einer kleineren
Menge Lösungsmittel) erhalten werden. Dies entspricht dem
zuvor genannten Punkt (1) als Bedingung für ein geeignetes
nicht-wäßriges Lösungsmittel.
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Natürlich kann ein Lösungsmittel, in dem Auramin O eine so
geringe Löslichkeit besitzt, daß die gewünschte
Konzentration in der endgültigen Färbelösung nicht
erhalten werden kann, wenn das Lösungsmittel nicht in
einer Menge hinzugegeben wird, die die maximal erlaubte
Menge, wie in Tabelle 6 dargestellt, übersteigt, nicht als
Stammlösung zum Färben verwendet werden.
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Beispielsweise erfordert die Herstellung einer Färbelösung
mit einer endgültigen Farbstoffkonzentration, wie in
Tabelle 2 dargestellt, daß die Löslichkeit von Auramin O
in dem Lösungsmittel so ist, wie in Tabelle 7 für jeden
Lösungsmittelgehalt in der endgültigen Färbelösung
dargestellt ist. Tabelle 7 kann folgendermaßen
interpretiert werden: Um eine Farbstoffkonzentration von
1000 ug/ml in der endgültigen Färbelösung bei einem
Lösungsmittelgehalt von 1 V/V-% zu haben, sollte die
Löslichkeit von Auramin O in dem Lösungsmittel
10,0 g/100 ml betragen.
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Die eigentliche Löslichkeit in jedem Lösungsmittel beträgt
in den Fällen von Methanol, Ethanol und n-Propanol 2 bis
3 g/100 ml. Die maximale Menge an Ethanol und Methanol,
die hinzugegeben werden kann, beträgt 6,25 V/V-%, wie in
Tabelle 6 dargestellt ist, und um eine
Farbstoffkonzentration von 1000 ug/ml in der endgültigen
Färbelösung zu haben, ist eine Löslichkeit von
1,6 g/100 ml, wie in Tabelle 7 dargestellt, erforderlich.
Methanol und Ethanol können deshalb im Hinblick auf die
Löslichkeit verwendet werden. Andererseits beträgt die
maximale Menge von n-Propanol, die hinzugegeben werden
kann, 2,5 V/V-%. Tabelle 7 zeigt, daß dieser
Löslichkeitsgrad zu gering ist, um eine
Farbstoffkonzentration von 1000 ug/ml in der endgültigen
Färbelösung zu liefern, da die maximale
Farbstoffkonzentration in der endgültigen Färbelösung
höchstens zwischen 500 und 750 ug/ml liegen könnte.
TABELLE 7 Erforderliche Löslichkeit für die Herstellung der
endgültigen Färbelösung (g/100 ml)
Lösungsmittelgehalt Farbstoffkonzentration in der endgültigen Färbelösung
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In den Fällen von Ethylenglykol, Diethylenglykol und
Triethylenglykol beträgt die Löslichkeit von Auramin O in
diesen Lösungsmitteln 6 bis 8%; deshalb kann die
Färbelösung der in Tabelle 2 dargestellten
Farbstoffkonzentrationen leicht innerhalb des Bereichs der
maximal möglichen Menge der Lösungsmittelzugabe, wie in
Tabelle 6 dargestellt, hergestellt werden.
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Von den in Tabelle 1 aufgeführten Lösungsmitteln beträgt
die Löslichkeit von Auramin O in den verbleibenden vier
Lösungsmitteln 2 bis 3%, welches zu gering ist, um eine
Färbelösung von 1000 ug/ml ohne Beeinträchtigung der
Retikulozytenzählung herzustellen, und die maximale
Konzentration des Farbstoffs in der Färbelösung, die mit
diesem Lösungsmittel hergestellt werden kann, beträgt
750 ug/ml. Daneben eignen sich diese vier Lösungsmittel im
Hinblick auf den zuvor genannten Punkt (3) nicht.
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Im Hinblick auf Punkt (4) besitzen Methanol, Ethanol und
n-Propanol eine hohe Flüchtigkeit und sind somit nicht
geeignet.
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Deshalb sind die Lösungsmittel, die für die Ziele der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können,
vorzugsweise Ethylenglykol, Diethylenglykol und
Triethylenglykol; Wenn derartige charakteristische
Merkmale wie die Wirkungen auf die Erythrozyten und die
Viskosität zusätzlich in Betracht gezogen werden, ist
Ethylenglykol das am meisten bevorzugte.
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Eine Pufferlösung enthält ein Pufferagens und ein den
osmotischen Druck kompensierendes Mittel. Ein Pufferagens
wird für die Beibehaltung des pH-Werts der Färbelösung
hinzugegeben, und ein akzeptabler Gehalt ist einer, bei
dem eine Fluoreszenzintensitätsänderung nicht mit der
pH-Fluktuation der Färbelösung auftritt. Ein den
osmotischen Druck kompensierendes Mittel wird
hinzugegeben, um eine extreme Deformation der
Blutkorpuskeln zu vermeiden.
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Die Gehalte dieser Agenzien sind wie in der DE-A-35 44 867
beschrieben; die endgültige Färbelösung wird so
hergestellt, daß die Konzentration eines den osmotischen
Druck kompensierenden Agenses 5 bis 20 mg/ml beträgt, und
der pH-Wert wird auf 6,0 bis 9,5 eingestellt.
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Das erfindungsgemäße Reagens umfaßt zwei Lösungen,
nämlich eine Stammlösung zum Färben und eine Pufferlösung.
Bei diesem Reagens wird der Farbstoff Auramin O in einem
nicht-wäßrigen Lösungsmittel bis unmittelbar vor der
Messung gehalten, so daß Michler's Keton, welches die
Retikulozytenzählung ungünstig beeinflußt, nicht gefällt
wird, und eine Verringerung der Auramin O-Menge während
der Lagerung auch verhindert werden kann. Durch
Vereinigung dieser beiden Lösungen unmittelbar vor der
Messung kann eine stabile endgültige Färbelösung für die
Retikulozytenzählung immer erhalten werden.
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Im nachfolgenden wird die vorliegende Erfindung weiterhin
detailliert durch das Beispiel beschrieben.
BEISPIEL
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Zuerst wurden eine Lösung 1 und eine Lösung 2, deren
Zusammensetzungen wie im nachfolgenden dargestellt sind,
hergestellt:
Lösung 1
Bestandteil: Konzentration
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HEPES 20 mM
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NaCl 160 mM
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8,5 pH
Lösung 2
Bestandteil: Konzentration:
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Auramin O 1,25 G/V-%
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Ethylenglykol Rest
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2 ml einer Färbelösung wurden hergestellt, indem 1960 ul
der Lösung 1 und 40 ul der Lösung 2 gemischt wurden, so
daß
die Auramin O-Konzentration 250 ug/ml wurde. Zu
dieser Lösung wurden 10 ul von mit EDTA-antikoaguliertem
Frischblut unter Herstellung einer Probe hinzugegeben.
Nachdem das Färben 30 Sekunden bei Raumtemperatur
durchgeführt worden war, wurde die Probe dem zuvor
erwähnten Fließzytometer unter Messung des vorwärts
gestreuten Lichts und der Fluoreszenz ausgesetzt.
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Wie zuvor beschrieben, ermöglicht die Zwei-Lösungs-
Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung die
Messung unmittelbar, nachdem die Färbelösung hergestellt
worden ist. Deshalb wird eine Verringerung der Restmenge
an Farbstoff im Laufe der Zeit nach Herstellung einer
Färbelösung, wie in der zuvor genannten Tabelle 5 des
Experiments 2 und Fig. 3 II-a bis Fig. 3 III-c beobachtet,
überhaupt nicht beobachtet. In anderen Worten ausgedrückt
heißt das, daß durch Vereinigung der Lösung 1 und Lösung
2 unmittelbar vor Gebrauch immer Ergebnisse erhalten
werden können, die die gleichen sind wie diejenigen, die
in Tabelle 5 (die Spalte, die "2 Stunden nach Herstellung
der Färbelösung" bedeutet), Fig. 3 I-a, Fig. 3 I-b und
Fig. 3 I-c dargestellt sind.