CN118421617A - 用于纯化信使rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明尤其提供了基于常规流过滤来纯化mRNA以用于治疗用途的方法。

Description

用于纯化信使RNA的方法

相关申请的交叉引用

本申请是申请号为201980070381.1、申请日为2019年8月26日、发明名称为“用于纯化信使RNA的方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2019/048154的PCT专利申请的中国国家阶段申请，该PCT申请要求于2018年8月24日提交的美国序列号62/722,674的权益和优先权，将所述专利的内容整体并入本文。

背景技术

信使RNA(mRNA)治疗剂是有前途的新治疗剂；例如，mRNA疗法可以是传统的蛋白质替代疗法、抗体疗法、疫苗疗法和/或基因疗法的替代方案。在mRNA治疗剂中，将编码特定酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽的完整mRNA递送至靶细胞，并通过细胞自身的天然翻译机制翻译成完整的酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽。通常使用体外转录系统用酶诸如从模板质粒DNA转录mRNA的RNA聚合酶，随同或随后添加5'-帽和3'-聚腺苷酸化，合成用于此类治疗剂的mRNA。此类反应产生组合物，所述组合物同时包含全长mRNA和各种不希望的污染物(例如所述反应中使用的蛋白质、盐、缓冲液和非RNA核酸)，所述污染物必须除去以提供可用于mRNA替代治疗剂的纯净且均质的mRNA。

传统上，小规模的mRNA是通过可商购的基于硅胶的柱系统(诸如Qiagen试剂盒)，或者通过蛋白质萃取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀从体外转录反应中纯化而来。这些方法的规模有限，因为它们最多可以提供5至10mg的纯净且均质的mRNA；因此，它们不足以满足mRNA的临床和商业治疗用途的需求。

发明内容

本发明提供了一种部分基于使用常规流过滤(normal flow filtration)可以有效地将体外合成的mRNA纯化至适合于临床或商业治疗用途的纯度的惊人发现的用于大规模纯化体外合成的mRNA的改进方法。重要的是，本文所述的常规流过滤方法导致出乎意料高的产率的具有高纯度和完整性的mRNA。因此，本发明允许更有效和成本有效地制造用于治疗用途的高质量mRNA。

如本文所用，术语“常规流过滤”是指其中待纯化的材料沿相对于过滤器表面常规(即垂直)的方向流动的过滤过程。太大而无法通过过滤器的材料得以保留，然而较小的材料通过成为滤液。

在一个方面，本发明提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)沉淀在包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的组合物中的mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；(b)使包含沉淀的mRNA的悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mRNA被过滤器保留；(c)通过洗涤来自步骤(b)的包含保留的沉淀mRNA的过滤器来洗涤沉淀的mRNA；(d)溶解在步骤(c)中被过滤器保留的沉淀mRNA，从而使纯化的mRNA通过过滤器；以及(e)从步骤(d)中回收纯化的mRNA，其中步骤(b)、(c)和(d)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。

在一些实施方案中，制造mRNA包括体外转录(IVT)合成。在一些实施方案中，制造mRNA包括在合成后对所述mRNA进行5'-加帽的步骤。在一些实施方案中，制造mRNA不包括对所述mRNA进行5'-加帽的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mRNA进行加帽的步骤。

在一些实施方案中，制造mRNA包括对mRNA进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，制造mRNA不包括对mRNA进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后对纯化的mRNA进行3'加尾的步骤。

在一些实施方案中，制造mRNA不包括对mRNA进行5'-加帽的步骤，并且不包括对mRNA进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mRNA进行加帽和对纯化的mRNA进行3'加尾的步骤。

在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含酶。在一些实施方案中，所述酶是用于IVT合成mRNA的聚合酶。在一些实施方案中，所述酶是加帽酶。在一些实施方案中，所述酶是聚A聚合酶。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含盐。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含短的异常终止的转录物。

在一些实施方案中，适合用于常规流过滤的过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的孔径(例如孔直径)或分子量截止(MWCO)，使得当可溶性污染物流过时沉淀的mRNA可以保留在过滤器上。

在一些实施方案中，适合用于本发明的过滤器是膜过滤器。在一些实施方案中，膜过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的分子量截止(MWCO)。

在一些实施方案中，膜过滤器具有褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器的形式。在一些实施方案中，过滤器包含滤网。

在一些实施方案中，适合用于本发明的过滤器是深层过滤器。在一些实施方案中，所述深层过滤器具有实质上小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或污染物的孔径或孔直径。

在一些实施方案中，过滤器由惰性材料制成。在一些实施方案中，适合用于本发明的惰性材料是聚丙烯。在一些实施方案中，惰性材料是改性的聚醚砜(mPES)。在一些实施方案中，惰性材料是聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，惰性材料是聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，惰性材料是纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是硅藻土。在一些实施方案中，惰性材料是聚四氟乙烯(PTFE)。在一些实施方案中，惰性材料是硝化纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是聚乙烯。在一些实施方案中，惰性材料是聚丙烯腈。在一些实施方案中，惰性材料是聚碳酸酯。在一些实施方案中，惰性材料是尼龙。

在一些实施方案中，过滤器包含一种或多种三维基质。在一些实施方案中，所述一种或多种三维基质是毡基质。在一些实施方案中，所述毡的厚度为约1毫米(mm)至约1厘米(cm)(例如，约1-500mm、约1-400mm、约1-300mm、约1-200mm、约1-100mm、约1-50mm、约1-40mm、约1-30mm、约1-20mm、约1-10mm、或约1-5mm)。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1-10mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1-5mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度为小于1厘米、小于0.5cm、小于0.4cm、小于0.3cm、小于0.25cm、小于0.2cm、小于0.1cm、小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于25mm、小于20mm、小于15mm、小于10mm或小于5mm。在一些实施方案中，过滤器包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种三维基质。在一些实施方案中，过滤器包含堆叠的三维基质。

在一些实施方案中，过滤器具有有助于保留沉淀的mRNA的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有在0.001μm与500μm之间、在0.01μm与200μm之间、或在0.05μm与100μm之间的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有0.05μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有0.5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有10μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有20μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有25μm或更大的平均孔径。

在一些实施方案中，过滤器具有促进沉淀的mRNA的捕获和/或分布的总表面积。在特定的实施方案中，过滤器具有不为分布在过滤器上的mRNA的量提供凝胶层的总表面积。

在一些实施方案中，根据本发明的方法不需要将分散剂添加到含有沉淀的mRNA的悬浮液中。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括使用有机溶剂来沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括使用乙醇来沉淀mRNA。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤不包括有机溶剂。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且使用聚乙二醇(PEG)沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括使用PEG来沉淀mRNA。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且包括三乙二醇(TEG)来沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括使用TEG来沉淀mRNA。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且包括三乙二醇单甲醚(MTEG)来沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的步骤包括使用MTEG来沉淀mRNA。

在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括用一次或多次盐洗涤来洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括用有机溶剂的一次或多次洗涤。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次乙醇洗涤。

在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤不包括有机溶剂。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且包括聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含PEG的洗涤。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有90厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有80厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有70厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有60厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有50厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有40厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有30厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有20厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有10厘沲或更小的粘度。

在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且包括三乙二醇(TEG)。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含TEG的洗涤。

在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤不包括有机溶剂，并且包括三乙二醇单甲醚(MTEG)。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含MTEG的洗涤。

在一些实施方案中，常规流过滤包括以下中的一项或多项：恒定流；恒定压力；可变流；可变压力；通过芯吸的流；以及重力控制。

在一些实施方案中，常规流过滤包括用于一次使用的系统和/或过滤器。在一些实施方案中，常规流过滤包括用于多次使用的系统和/或过滤器。

在一些实施方案中，回收步骤包括以下中的一项或多项：

水/缓冲液的再循环；

水/缓冲液的单次通过冲洗；以及

水/缓冲液的反向冲洗。

可以将根据本发明的方法用于纯化编码蛋白质或肽的任何mRNA。在一些实施方案中，蛋白质是代谢蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是酶。在一些实施方案中，蛋白质或肽是受体蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质或肽是分泌的蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是非分泌的蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是胞质蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是核蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是线粒体蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是溶酶体蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是内质网蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是高尔基体蛋白质或肽。在一些实施方案中，蛋白质或肽是结构膜蛋白质或肽。

在一些实施方案中，蛋白质是抗体或抗体片段。在一些实施方案中，蛋白质是抗原。在一些实施方案中，蛋白质是癌症相关抗原。在一些实施方案中，蛋白质是疫苗。在一些实施方案中，蛋白质选自ABC7、ABCB3、ABCB7、ABCC7、ABCD1、AKT；AKT2、AKT3、ATF4、AKT2；AKT3；ALAS2、α半乳糖苷酶、α-1蛋白酶抑制剂、APA、APC；APOA1、APOE、抗胰蛋白酶α1、精氨酸琥珀酸合酶、ASAT；ATM；ATP7B、ATR；Atrophin-1；ATX3；Atxn10；ATXN2；Atxn7；ATXNl；Bax；Bcl2；Bcl2；BRCA1；BRCA2；氨甲酰磷酸合酶、CASP8、CBP(Creb-BP)；CDKN2a；CFTR、CREB1、CVAP、CYP1Bl、DBA、DMD、DMPK；EGFR、EIF2B1、EIF2BA、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B5、EIF2B4；ERBB2；ERBB3；ERBB4；促红细胞生成素、因子IX、因子V；因子VII、因子VII；因子VIII；因子VIIIa轻链、因子X；因子XI(F11)；因子XII缺陷型(F12、HAF)；因子XIIIA(F13Al、F13A)；因子XIIIB(F13B)；FBN1、FGF受体家族成员；FHL3；FKRP、FXN/X25；FXR1、G6PC、G6PT、GAA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、GLUT2、H1Fla；HBA1；HBB；HBA2、HBB、HBD、乙酰肝素N-硫酸酯酶、HIF；HIF3a；HLH3、HPLH2、HPLH3、亨廷丁(Huntingtin)、IDH2；IDH1、IGF受体；IGF；IGF1R、Igf2受体；Igf2；Igfl受体；Igfl；ITGB2、KIAA1596；Kras；LCRB、甲基丙二酰-CoA变位酶、MRP7、MUNC13-4、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、NOS3、NPC1、OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PAH、PKHD1、PKD1、PKD2、PKD4、PKLR、PKU1、PPARγ；PPARα；PRF1、PSEN2、PSF2、PTEN；RB、视网膜劈裂蛋白(Retinoschisin)；RING11、SBMA/SMAXl/AR；SEC63、SERPINA1、SERPINA2、SERPINA3、SERPINA5、SERPINA6、SFTPA1、SFTPB、SFTPC、SFTPD、SLC2A、SLC7A9、SMPD1、SPTB、TAP2、TAPBP、TPSN、UNC13D、VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c、VLDLR；以及WT1。

在一些实施方案中，蛋白质是CFTR蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是OTC蛋白质。

在一些实施方案中，本发明的方法导致总纯化的mRNA的高回收率。在一些实施方案中，以导致约85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高或者99％或更高的产率的量回收纯化的mRNA。在一些实施方案中，以导致至少约99％的产率的量回收总的纯化的mRNA。

在一些实施方案中，总的纯化的mRNA基本上不含蛋白质污染物。

在一些实施方案中，总的纯化的mRNA基本上不含短的异常终止的转录物污染物。

在一些实施方案中，总的纯化的mRNA具有大于95％的完整性。

在一些实施方案中，通过电泳确定纯化的mRNA的纯度。在一些实施方案中，通过毛细管电泳确定mRNA的纯度。在一些实施方案中，通过色谱法确定纯化的mRNA的纯度。在一些实施方案中，通过HPLC确定纯化的mRNA的纯度。

在一些实施方案中，纯化了至少约0.5克的RNA。在一些实施方案中，纯化了至少约1克的RNA。在一些实施方案中，纯化了至少约10克的RNA。在一些实施方案中，纯化了至少约50克的RNA。在一些实施方案中，纯化了至少约100克的RNA。在一些实施方案中，纯化了至少约1千克的RNA。

在特定实施方案中，本发明提供了一种纯化组合物的方法，所述组合物包含通过体外转录(IVT)合成制造的100gm或更多的mRNA，所述方法包括：沉淀包含来自IVT合成的一种或多种污染物的IVT转录的mRNA以产生悬浮液；使包含沉淀的mRNA和污染物的悬浮液进行通过过滤器的常规流过滤，其中沉淀的mRNA被过滤器保留；洗涤保留在过滤器上的mRNA；从过滤器以溶液回收mRNA，从而纯化mRNA，其中回收了至少85％的mRNA，并且所回收的mRNA具有90％或更高的完整性并且基本上不含蛋白质污染物。

在各种实施方案中，合适的过滤器(例如聚丙烯毡过滤器)具有高达约264平方米或更大的总表面积。在各种实施方案中，合适的过滤器(例如聚丙烯毡过滤器)具有高达约528平方米或更大的总表面积。在各种实施方案中，合适的过滤器(例如聚丙烯毡过滤器)具有高达约1056平方米或更大的总表面积。

在各种实施方案中，使用基于本文所述的常规流过滤的方法的纯化的mRNA具有临床级纯度，而无需任何进一步纯化的步骤。如本文所用，术语“临床级”是指对于临床使用而言具有足够纯度的等级。在一些实施方案中，临床级是指满足或超过美国药典(USP)或国家处方集(NF)的要求或者由英国药典和欧洲药典所述的标准的纯度。在一些实施方案中，术语“药典级”与“临床级”可互换使用。

在一些实施方案中，无需进一步纯化步骤即可达到临床级纯度，所述进一步纯化步骤选自HPLC纯化、基于配体或结合的纯化、TFF纯化和/或离子交换色谱。

在各种实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含5％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含4％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含3％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含2％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，根据本文所述方法的纯化的mRNA被确定包含1％或更少的蛋白质污染物。

在各种实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含5％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含4％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含3％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含2％或更少的蛋白质污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含1％或更少的蛋白质污染物。

在各种实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的盐污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含5％或更少的盐污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含4％或更少的盐污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含3％或更少的盐污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含2％或更少的盐污染物。在某些实施方案中，通过HPLC确定根据本文所述方法的纯化的mRNA包含1％或更少的盐污染物。

在各种实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含5％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含4％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含3％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含2％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，通过毛细管电泳确定纯化的mRNA包含1％或更少的短的异常终止的RNA污染物。

在各种实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含5％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含4％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含3％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含2％或更少的短的异常终止的RNA污染物。在某些实施方案中，如通过HPLC所确定，纯化的mRNA被确定包含1％或更少的短的异常终止的RNA污染物。

在各种实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有95％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有96％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有97％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有98％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有98％或更高的完整性。在某些实施方案中，如通过毛细管电泳所确定，纯化的mRNA被确定具有99％或更高的完整性。

本发明尤其提供了一种包含使用本文所述的各种方法纯化的mRNA的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物，其包含本文所述的纯化的mRNA和至少一种药学上可接受的赋形剂。本发明还提供了用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。

本文援引的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均以引用的方式并入本文。本文引用的所有已公开的外国专利和专利申请均据此以引用的方式并入。本文引用的所有其他已公开的参考文献、文件、手稿和科学文献据此以引用的方式并入。

从附图以及下面的详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

附图说明

当结合附图时，根据下面的详细描述，将更清楚地理解上述以及另外的特征。然而，附图仅用于说明性目的，而不是限制。

图1示出了示例性深层过滤器设计。

图2展示了在使用深层过滤器的示例性mRNA纯化研究中过滤器阻力相对于加载到过滤器上的CFTR编码mRNA的量的变化。

图3显示了随着乙醇冲洗体积的增加过滤器电导率的变化，表明冲洗体积在从沉淀的mRNA去除盐方面的有效性。

图4展示了在再循环时间内体外转录的CFTR mRNA的mRNA回收百分比。

图5展示了在CFTR mRNA的第二次沉淀(沉淀2)之后过滤器阻力相对于加载到过滤器上的mRNA的量的变化。

图6显示了在使用深层过滤的示例性研究中来自mRNA加载和洗涤的滤液的照片(左图-第一次沉淀的(沉淀1)并且在溶解沉淀并收集滤液中溶解的mRNA之前由过滤器基质捕获的来自mRNA加帽和加尾反应(C/T)的滤液；右图-来自沉淀1中第二次沉淀的(沉淀2)、在溶解沉淀并收集滤液中溶解的mRNA之前由过滤器基质捕获的mRNA的滤液)。

图7显示了滤液电导率相对于沉淀1和沉淀2的80％乙醇冲洗体积的图。该图表明在C/T mRNA的示例性深层过滤期间随着乙醇冲洗体积增加滤液电导率降低。

图8A和图8B各自显示了在C/T之后沉淀1和沉淀2在再循环时间内的mRNA浓度的图。图8A显示了在再循环时间内所回收的mRNA的浓度(mg/ml)。图8B表示在再循环时间内所回收的mRNA百分比。

图9显示了通过深层过滤纯化的C/T mRNA的毛细管电泳。

图10显示了通过RNAse 1消化的纯化产物的凝胶电泳和银染所述凝胶以可视化残留蛋白质污染物获得的mRNA纯度。泳道1是阳性对照，并且泳道2是阴性对照。泳道3是纯化之前的相似地用RNase 1消化的C/T mRNA。泳道4-5是分别在来自沉淀1和沉淀2的mRNA的第一轮和第二轮过滤之后是纯化的mRNA产物。泳道6-10是从制备mRNA的过程的IVT和C/T反应中预期的污染物蛋白质的对照。

图11展示了过滤器阻力相对于用于IVT反应的加载到过滤器上、在制备CFTR mRNA的IVT和C/T反应之后的第一次沉淀反应(沉淀1)和第二次沉淀(沉淀2)的mRNA的量的变化。

图12表明来自深层过滤器中的三个过滤运行的滤液((1)IVT反应产物，(2)在C/T反应之后的沉淀1和(3)在沉淀1之后的沉淀2)不含任何沉淀。从左到右：(1)IVT，(2)C/T 1沉淀和(3)C/T 2沉淀。

图13显示了在CFTR mRNA的15g规模IVT批次制备的纯化中滤液电导率相对于80％乙醇冲洗体积(L/m2)的图。

图14A和图14B各自显示了在CFTR mRNA的15g规模IVT批次制备的纯化期间在洗脱步骤相对于再循环时间的mRNA回收率。图14A显示了在再循环时间内所回收的mRNA的浓度(mg/ml)。图14B表示在再循环时间内所回收的mRNA百分比。

图15A和图15B显示了通过毛细管电泳纯化过的15g IVT批次纯化的CFTR mRNA获得的电泳图。图15A–通过先前方法而没有使用常规流深层过滤纯化的对照CFTR mRNA。图15B-通过常规流深层过滤纯化的CFTR mRNA。

图16显示了评估mRNA纯度和在制造mRNA时使用的残留酶(包括加帽酶、聚合酶和RNase酶)的银染分析。在第一次沉淀和第二次沉淀之后在通过常规流过滤纯化的材料中未观察到残留的酶。

图17显示了相对于来自15g批次制造MUT mRNA的常规流过滤纯化步骤的80％v/v乙醇溶液的连续洗涤体积的残留盐(如通过滤液电导率所测量)的量度。

图18A和图18B显示了来自IVT制造的未加帽盖且未加尾的mRNA的常规流过滤纯化(图18A)、以及来自在对mRNA加盖和加尾(C/T)之后的常规流过滤纯化(图18B)的滤液中mRNA的回收率(以浓度表示)随再循环时间的变化。

图19显示了在根据本发明的mRNA的常规流过滤之后通过毛细管凝胶电泳(CGE)分析所评估的MUT mRNA的mRNA完整性。

图20显示了纯化过的MUT mRNA、以及对照和在制造mRNA中使用并通过本文所述的常规流过滤程序去除的参考酶的银染凝胶。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。以下术语和其他术语的其他定义阐述在整个说明书中。

除非上下文另有明确说明，否则在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。

除非特别声明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为是包含性的并且涵盖“或”与“和”两者。

如本文所用的术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而不意欲进行限制，并且不应解释为仅指代本说明书中明确列举的那些条目。

在整个说明书中，词语“包括”或者诸如“包含”或“含有”的变化形式将被理解为意味着包括所陈述的要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组。

除非特别声明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以理解为在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。除非根据上下原本清楚，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。

如本文所用，术语“批次”是指一次合成的(例如，在同一制造周期期间根据单个制造订单所生产的)mRNA的数量或量。批次可以是指在通过将酶的单个等分试样和/或DNA模板的单个等分试样用于在一组条件下连续合成而发生的一个反应中合成的mRNA的量。在一些实施方案中，批次将包括由其中随着反应进行并非补充和/或添加所有试剂和/或组分的反应生产的mRNA。术语“批次”将不表示在不同时间合成的被组合以达到所需量的mRNA。

如本文所用，术语“污染物”是指在限定量的液体、气体或固体内，与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。污染物也被称为杂质。污染物或杂质的实例包括缓冲液、蛋白质(例如酶)、核酸、盐、溶剂和/或洗涤溶液。

如本文所用，术语“分散剂”是指降低mRNA沉淀将形成水凝胶的可能性的固体颗粒。分散剂的实例包括并且不限于以下中的一种或多种：灰分、粘土、硅藻土、过滤剂、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚丙烯珠、聚苯乙烯珠、盐(例如纤维素盐)、沙子和糖。在实施方案中，分散剂是聚合物微球(例如，聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)微球)。

如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列生产mRNA模板(例如，通过转录)；(2)mRNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将mRNA翻译成多肽或蛋白质；以及/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。

如本文所用，“通量”是流速除以过滤面积。其允许在不同规模的过滤器之间进行比较。

如本文所用，“全长mRNA”是当使用特定的测定(例如凝胶电泳或使用UV和UV吸收光谱的检测)以及通过毛细管电泳分离时进行表征。编码全长多肽并且如在本文所述的任何纯化方法后获得的mRNA分子的长度是从靶DNA转录的全长mRNA分子的长度的至少50％，例如，从靶DNA转录并且在根据本文所述的任何方法纯化之前的全长mRNA分子的长度的至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.01％、99.05％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％。

如本文所用，“功能性”生物分子是其表现出表征其的性质和/或活性的形式的生物分子。

如本文所用，术语“水凝胶”是指亲水性聚合物链(例如，mRNA)的网状物，其形成其中水是分散介质的胶体凝胶。使用mRNA为实例，从水凝胶中比从干饼中提取或纯化mRNA更加困难。

如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与之相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。

如本文所用，术语“信使RNA”或“mRNA”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的mRNA二者。mRNA可以含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生以及任选地纯化，体外转录，或化学合成。

mRNA通常被认为是将信息从DNA传递到核糖体的RNA类型。mRNA的存在通常非常短暂，并且包括加工和翻译，然后是降解。通常，mRNA包括具有编码多肽的编码区、在编码区上游的5'非翻译区(5'UTR)、在编码区下游的3'非翻译区(3'UTR)、在5'末端的帽、在3'UTR的下游的聚A或聚腺苷酸化区域的核苷酸序列。通常，在真核生物体中，mRNA加工包括从DNA转录mRNA、以及在N(5')末端添加一个“帽”和在C(3')末端添加一个“尾巴”。典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其是通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的鸟苷。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。尾巴通常是聚腺苷酸化事件，由此聚腺苷酰基部分被添加到mRNA分子的3'末端。这种“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。信使RNA通常被核糖体翻译成组成蛋白质的一系列氨基酸。

在一些实施方案中，本发明的mRNA缺少帽和/或尾巴中的一者或两者。因此，mRNA可能具有帽而缺乏尾巴，mRNA可能具有尾巴而缺乏帽，并且mRNA可能缺乏帽且缺乏尾巴。

如本文所用，术语“mRNA完整性”一般是指mRNA的质量。在一些实施方案中，mRNA完整性是指在纯化过程(例如，本文所述的方法)之后未降解的mRNA的百分比。可以使用本文特别描述的方法(诸如TAE琼脂糖凝胶电泳或通过使用银染的SDS-PAGE)、或者通过本领域熟知的方法(例如通过RNA琼脂糖凝胶电泳)来确定mRNA完整性(例如Ausubel等人,JohnWiley&Sons,Inc.,1997,Current Protocols in Molecular Biology)。

如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理效益/风险比相称的物质。

“药学上可接受的赋形剂”意指适合用于制备一般是安全的、无毒的且在生物学上或其他方面都不合乎需要的药物组合物的赋形剂，并且包括对于兽医学用途以及人类药学用途可接受的赋形剂。如本说明书和权利要求书中所用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种或多于一种这样的赋形剂。

通常，合适的mRNA溶液还可以含有缓冲剂和/或盐。一般来讲，缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。

药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.PharmaceuticalSciences(1977)66:1-19中描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或有机酸(如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用所属领域中所用的其他方法(如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸酯、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N⁺(C^1-4烷基)₄盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括当适当时使用抗衡离子诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。其他药学上可接受的盐包括由胺的季铵化形成的盐，所述季铵化使用适当的亲电试剂例如卤代烷进行，以形成季铵化烷基化氨基盐。

如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。因此，基本上不含化合物‘x’的组合物应理解为包含小于5％的化合物‘x’、或小于1％、或小于0.1％或小于0.01％的化合物‘x’。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的以及在本申请所属领域中常用的含义相同的含义；此类技术以引用的方式以其整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。

具体实施方式

本发明涉及基于常规流过滤制备可规模数量的纯的和高质量mRNA的方法。体外合成的mRNA包含在合成过程期间产生或从合成过程携带的污染物。本发明的方法涉及沉淀体外合成的mRNA并使mRNA制备物经历常规流过滤，使得沉淀的mRNA保留在过滤器基质或系统之中或之上同时允许来自合成过程的污染物流过过滤器或过滤器系统成为滤液，从而纯化沉淀的mRNA。然后通过溶解mRNA沉淀将捕获的mRNA转化为滤液，从而使mRNA通过过滤器或过滤器系统，在此处其可以以适合用于临床或治疗应用的纯度被收集而无需纯化mRNA的进一步的步骤(例如，无需进一步的HPLC纯化、或TFF、离子交换色谱或亲和结合色谱)。值得注意的是，此方法提供了显著的mRNA回收率。如本文所述的方法允许有效地以适合用于治疗用途的令人惊讶的高纯度和完整性制造大量mRNA。

信使RNA

本文所述的纯化方法适合用于任何mRNA的纯化。本发明可以用于纯化编码各种蛋白质(例如多肽)或肽的mRNA。

根据各种实施方案，本发明可以用于纯化各种长度的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mRNA。例如，典型的mRNA的长度可以为约1kb至约5kb。更典型地，mRNA将具有约1kb至约3kb的长度。然而，在一些实施方案中，本发明的组合物中的mRNA长得多(大于约20kb)。

在某些实施方案中，mRNA核苷酸被修饰以提供“经修饰的mRNA”。因此，根据本发明的经修饰的mRNA可包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，编码抗体的mRNA(例如，编码重链和轻链的mRNA)可以由以下天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成：包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，如例如1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基辫苷、怀丁氧苷和焦磷酰胺、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。

在一些实施方案中，本发明可以用于纯化未经修饰的体外合成的mRNA。

在一些实施方案中，mRNA包括5'和/或3'非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mRNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。

示例性的3’UTR序列和/或5’UTR序列可以源自稳定的mRNA分子(例如，球蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白和柠檬酸循环酶)，以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可以包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以提高核酸酶抗性和/或提高多核苷酸的半衰期。还考虑了在多核苷酸(例如，mRNA)的3’末端或非翻译区包含编码人类生长激素(hGH)或其片段的序列，以进一步稳定该多核苷酸。一般来讲，这些特征相对于没有此类特征的相同多核苷酸改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如使得改善了此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性的特征。

在一些实施方案中，mRNA编码细胞内蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码胞质蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与肌动蛋白细胞骨架相关的蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与质膜相关的蛋白质。在一些具体实施方案中，mRNA编码跨膜蛋白。在一些具体实施方案中，mRNA编码离子通道蛋白。在一些实施方案中，mRNA编码核周蛋白。在一些实施方案中，mRNA编码核蛋白。在一些具体实施方案中，mRNA编码转录因子。在一些实施方案中，mRNA编码伴侣蛋白。在一些实施方案中，mRNA编码细胞内酶(例如，编码与尿素循环或溶酶体贮积代谢障碍相关的酶的mRNA)。在一些实施方案中，mRNA编码参与细胞代谢、DNA修复、转录和/或翻译的蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码细胞外蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码与细胞外基质相关的蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码分泌的蛋白质。在具体实施方案中，本发明的组合物和方法中使用的mRNA可以用于表达被一种或多种靶细胞排泄或分泌到周围的细胞外液中的功能性蛋白质或酶(例如，编码激素和/或神经递质的mRNA)。在一些实施方案中，mRNA编码用于疫苗目的的免疫原性蛋白质。在一些实施方案中，mRNA编码抗体或其片段。在一些实施方案中，mRNA编码代谢蛋白。在一些实施方案中，mRNA编码酶。在一些实施方案中，mRNA编码受体蛋白。在一些实施方案中，mRNA编码抗原。在一些实施方案中，mRNA编码癌症相关抗原。在一些实施方案中，mRNA编码疫苗。

作为非限制性实例，mRNA编码蛋白质，诸如ABC7、ABCB3、ABCB7、ABCC7、ABCD1、AKT；AKT2、AKT3、ATF4、AKT2；AKT3；ALAS2、α半乳糖苷酶、α-1蛋白酶抑制剂、APA、APC；APOA1、APOE、抗胰蛋白酶α1、精氨酸琥珀酸合酶、ASAT；ATM；ATP7B、ATR；Atrophin-1；ATX3；Atxn10；ATXN2；Atxn7；ATXNl；Bax；Bcl2；Bcl2；BRCA1；BRCA2；氨甲酰磷酸合酶、CASP8、CBP(Creb-BP)；CDKN2a；CFTR、CREB1、CVAP、CYP1Bl、DBA、DMD、DMPK；EGFR、EIF2B1、EIF2BA、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B5、EIF2B4；ERBB2；ERBB3；ERBB4；促红细胞生成素、因子IX、因子V；因子VII、因子VII；因子VIII；因子VIIIa轻链、因子X；因子XI(F11)；因子XII缺陷型(F12、HAF)；因子XIIIA(F13Al、F13A)；因子XIIIB(F13B)；FBN1、FGF受体家族成员；FHL3；FKRP、FXN/X25；FXR1、G6PC、G6PT、GAA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、GLUT2、H1Fla；HBA1；HBB；HBA2、HBB、HBD、乙酰肝素N-硫酸酯酶、HIF；HIF3a；HLH3、HPLH2、HPLH3、亨廷丁(Huntingtin)、IDH2；IDH1、IGF受体；IGF；IGF1R、Igf2受体；Igf2；Igfl受体；Igfl；ITGB2、KIAA1596；Kras；LCRB、甲基丙二酰-CoA变位酶、MRP7、MUNC13-4、N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、NOS3、NPC1、OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)、PAH、PKHD1、PKD1、PKD2、PKD4、PKLR、PKU1、PPARγ；PPARα；PRF1、PSEN2、PSF2、PTEN；RB、视网膜劈裂蛋白(Retinoschisin)；RING11、SBMA/SMAXl/AR；SEC63、SERPINA1、SERPINA2、SERPINA3、SERPINA5、SERPINA6、SFTPA1、SFTPB、SFTPC、SFTPD、SLC2A、SLC7A9、SMPD1、SPTB、TAP2、TAPBP、TPSN、UNC13D、VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c、VLDLR；以及WT1。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于治疗受试者的肺部、或肺细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码在受试者中可能缺乏或无功能的内源蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于受试者的治疗性mRNA疫苗中的多肽。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肺部、或肺细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码囊性纤维化跨膜电导调节剂CFTR。可以将纯化过的CFTR mRNA递送至需要用于治疗囊性纤维化的治疗组合物的受试者的肺部。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肝脏、或肝细胞的肽或多肽。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，用纯化的mRNA递送至或治疗肝脏或肝细胞提供治疗有益效果。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与尿素循环障碍相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码精氨酸琥珀酸合成酶1蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码氨基甲酰磷酸合成酶I蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码精氨琥珀酸裂解酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码精氨酸酶蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与溶酶体贮积症相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码α半乳糖苷酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码葡萄糖脑苷脂酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码艾杜糖醛酸酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码β-半乳糖苷酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码溶酶体脂肪酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码转录因子EB(TFEB)蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与糖原贮积症相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码酸性α-葡糖苷酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码肝糖原磷酸化酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码肌肉磷酸甘油酸变位酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码糖原解支化酶蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与氨基酸代谢相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码苯丙氨酸羟化酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码戊二酰-CoA脱氢酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码丙酰-CoA羧化酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与脂质代谢或纤维化障碍相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码mTOR抑制剂蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码ATP酶磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化编码一种或多种NF-κB抑制剂的mRNA的方法，所述抑制剂诸如I-κBα、干扰素相关的发育调节剂1(IFRD1)和Sirtuin 1(SIRT1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码PPAR-γ蛋白或活性变体。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码甲基丙二酰-CoA变位酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码甲基丙二酰CoA差向异构酶蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，对于所述mRNA，递送至或治疗肝脏可以提供治疗有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码ATP7B蛋白(也被称为Wilson病蛋白)。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码胆色素原脱氨酶。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码一种或多种凝结酶，诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码因子IX。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码人血色素沉着病(HFE)蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的心血管系统、或心血管细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码血管内皮生长因子A蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码松弛素蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码骨形态发生蛋白9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码骨形态发生蛋白2受体蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肌肉、或肌肉细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码肌营养不良蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码人源线粒体蛋白(frataxin)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的心肌、或心肌细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码调节肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Kv7.1通道的蛋白质。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Nav1.5通道的蛋白质。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的神经系统、或神经系统细胞的肽或多肽。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种纯化mRNA的方法，所述mRNA编码存活运动神经元1蛋白。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种纯化mRNA的方法，所述mRNA编码存活运动神经元2蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码人源线粒体蛋白(frataxin)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码CLN3蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码β球蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码布鲁顿酪氨酸激酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码一种或多种凝结酶，诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的肾脏、或肾细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码IV型胶原α5链(COL4A5)蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送至或治疗受试者的眼睛、或眼细胞的肽或多肽。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码视网膜劈裂蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码视网膜色素上皮特异性65kDa(RPE65)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码290kDa的中心体蛋白(CEP290)。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于递送用于受试者或受试者细胞的疫苗或用疫苗治疗的肽或多肽。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自诸如病毒等感染因子的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自流感病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自呼吸道合胞病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自狂犬病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自巨细胞病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自轮状病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自肝炎病毒(诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自人乳头瘤病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自单纯疱疹病毒(诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2)的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自人免疫缺陷病毒(诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型)的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自人间质肺炎病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化编码来自人副流感病毒的抗原的mRNA的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自疟疾病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自寨卡病毒的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码来自基孔肯雅病毒的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码从突变型KRAS基因表达的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码抗体。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码针对OX40的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码针对VEGF的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码针对组织坏死因子α的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码针对CD3的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码针对CD19的抗体。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码免疫调节剂。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码白介素12。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码白介素23。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码白介素36γ。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码一种或多种干扰素基因(STING)蛋白刺激物的组成型活性变体。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码核酸内切酶。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白，诸如Cas 9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码大范围核酸酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码转录激活因子样效应子核酸酶蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码锌指核酸酶蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述mRNA编码用于治疗眼疾病的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法用于纯化编码视网膜劈裂蛋白的mRNA。

mRNA合成

可以根据多种已知方法中的任一种合成mRNA。例如，可以通过体外转录(IVT)合成mRNA。尽管本发明对于纯化通过体外转录反应合成的mRNA特别有用。在一些实施方案中，预期来自其他来源的mRNA在本发明的范围内，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。

简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNase抑制剂。确切条件将根据特定应用而变化。根据若干实施方案，这些试剂的存在于最终产品中是不希望的，因此可以被称为杂质或污染物，并且含有这些杂质或污染物中的一种或多种的制剂可以被称为不纯的制剂。在一些实施方案中，体外转录以单批次发生。在一些实施方案中，IVT反应包括加帽和加尾反应(C/T)。在一些实施方案中，加帽和加尾反应与IVT反应分开进行。在一些实施方案中，从IVT反应中回收mRNA，随后通过本申请中所描述的方法首先沉淀和纯化mRNA；然后将回收的纯化的mRNA加帽并加尾，并进行第二次沉淀和纯化。

在一些实施方案中，本发明可以用于纯化含有至少200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1000kg或更多mRNA的组合物或批次。在一些实施方案中，mRNA分子的长度大于600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10,000或更多个核苷酸；在本发明中还包括具有介于两者之间的任何长度的mRNA。

IVT反应

IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNase抑制剂。确切条件将根据特定应用而变化。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，随后是所需mRNA的所需核苷酸序列和终止信号。

其他IVT方法在本领域中是可用的，并且可以用于实施本发明。

加帽和加尾(C/T)反应

通常，在真核生物体中，mRNA加工包括在N(5')末端添加一个“帽”，和在C(3')末端添加一个“尾巴”。典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其是通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的鸟苷。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。尾巴通常是聚腺苷酸化事件，由此聚腺苷酰基部分被添加到mRNA分子的3'末端。这种“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。信使RNA被核糖体翻译成组成蛋白质的一系列氨基酸。

如Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures byviral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249所描述，通过使用鸟苷酸转移酶添加5'N⁷-甲基鸟苷酸Cap 0结构并使用2'O-甲基转移酶在倒数第二个核苷酸的2'O位置处添加甲基基团产生Cap 1结构来酶促修饰体外转录的mRNA。在添加Cap 1结构后，使用聚A聚合酶酶促地将聚腺苷酸尾巴添加到体外转录的mRNA的3'末端。简而言之，将纯化过的IVT mRNA与GTP、S-腺苷甲硫氨酸、RNase抑制剂、2'-O甲基转移酶、鸟苷酰转移酶、包含Tris-HCl、MgCl₂和无RNase的H₂O的反应缓冲液混合；然后在37℃下孵育。孵育后，通过添加包含Tris-HCl、NaCl、MgCl₂、ATP、聚A聚合酶和无RNase的H₂O的加尾缓冲液来启动加尾反应。通过添加EDTA将反应淬灭。

其他加帽和/或加尾方法在本领域中是可用的，并且可以用于实施本发明。

体外合成的mRNA中的污染物

例如，来自如上所述合成过程的mRNA产物可能含有各种污染物(也被称为杂质)，包括残留的模板DNA、异常终止的产物、酶(包括聚合酶(例如SP6或T7聚合酶))、加帽酶(例如，鸟苷酰转移酶或甲基鸟苷酰转移酶)、加尾酶(诸如聚A聚合酶)、DNase 1、各种盐、以及过早终止的mRNA寡核苷酸，它们是mRNA合成反应的副产物。

mRNA纯化

根据本发明的纯化过程可以在合成期间或之后进行。例如，可以在将帽和/或尾巴添加至mRNA之前如本文所述纯化mRNA。在一些实施方案中，在将帽和/或尾巴添加至mRNA之后纯化mRNA。在一些实施方案中，在添加帽之后纯化mRNA。在一些实施方案中，在将帽和/或尾巴添加至mRNA之前和之后均纯化mRNA。一般来讲，如本文所述的纯化步骤可以在mRNA合成的每个步骤之后进行，任选地与其他纯化过程诸如透析一起进行。

mRNA的沉淀

根据本发明，可以使用本领域已知的各种沉淀方法在不纯的制剂诸如体外合成反应混合物中沉淀mRNA。如本文所用，术语“沉淀”(或其任何语法等同物)是指溶液中不溶性物质(例如固体)的形成。当与mRNA结合使用时，术语“沉淀”是指在液体中mRNA的不溶或固体形式的形成。

适合用于沉淀mRNA的任何和所有方法都可以用于实施本发明。通常，mRNA沉淀涉及变性条件。如本文所用，术语“变性条件”是指可以导致对mRNA的天然构象的破坏的任何化学或物理条件。由于分子的天然构象通常是最水溶性的，因此破坏分子的二级和三级结构可能导致溶解度发生变化并且可能导致mRNA从溶液中沉淀出来。

例如，从不纯的制剂中沉淀mRNA的合适方法涉及用变性剂处理不纯的制剂，使得mRNA沉淀。适合用于本发明的示例性变性试剂包括但不限于氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸铵及其组合。合适的试剂可以以固体形式或以溶液形式提供。

作为非限制性实例，硫氰酸胍(GSCN)可以用于沉淀mRNA。通常，可以在溶液中以约1M或更高、约2M或更高、约3M或更高、约4M或更高、约5M或更高、约6M或更高、约7M或更高、约8M或更高、约9M或更高、或约10M或更高的浓度提供硫氰酸胍。在一些实施方案中，适合用于mRNA沉淀的溶液含有浓度为约4M或约5M或约6M的硫氰酸胍。

除了变性试剂之外，用于mRNA沉淀的合适溶液可以包括另外的盐、表面活性剂和/或缓冲剂。例如，合适的溶液还可以包括月桂酰肌氨酸钠和/或柠檬酸钠。作为非限制性实例，适合用于mRNA沉淀的溶液可以含有4M硫氰酸胍。在某些实施方案中，适合用于mRNA沉淀的溶液可以含有约5M硫氰酸胍。

通常，希望将不纯的制剂与本文所述的一种或多种变性试剂在允许大量mRNA沉淀的所需温度下孵育一段时间。例如，可以将不纯的制剂和变性剂的混合物在室温或环境温度下孵育一段时间。通常，合适的孵育时间是等于或大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60分钟的时段。在一些实施方案中，合适的孵育时间是等于或小于约60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6或5分钟的时段。在一些实施方案中，将混合物在室温下孵育约5分钟。通常，“室温”或“环境温度”是指范围为约20-25℃，例如约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的温度。在一些实施方案中，也可以将不纯的制剂和变性剂的混合物在高于室温(例如，在约30-37℃，或者特别是在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃)下或在低于室温(例如，约15-20℃，或者特别是在约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃)下孵育。可以基于孵育温度来调节孵育时间。通常，较高的孵育温度需要较短的孵育时间。

替代地或另外地，可以使用溶剂来促进mRNA沉淀。合适的示例性溶剂包括但不限于异丙醇、丙酮、甲基乙酮、甲基异丁酮、乙醇、甲醇、地那铵(denatonium)及其组合。例如，可以将溶剂(例如，无水乙醇)与变性试剂一起或者在添加变性试剂和如本文所述的孵育之后添加到不纯的制剂中，以进一步增强和/或加速mRNA沉淀。

在一些实施方案中，沉淀mRNA可以包括使用有机溶剂诸如乙醇来沉淀mRNA。

但是，在没有使用有机溶剂的情况下可以实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG-6000沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG-400沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇(TEG)沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用叔丁基-TEG-O-丙酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二乙烯基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单丁基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-甲基醚甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单癸基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二苯甲酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。这些基于PEG或TEG的试剂中的任何一种均可以与硫氰酸胍组合使用来沉淀mRNA。在下面表A中显示了这些试剂中的每一种试剂的结构。

表A：用于纯化mRNA(沉淀和/或洗涤mRNA)的非有机溶剂试剂

通常，在添加合适的溶剂(例如，无水乙醇)之后，可以将混合物在室温下再孵育一个时间段。通常，合适的孵育时间段为或大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50或60分钟。在一些实施方案中，合适的孵育期为等于或小于约60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6或5分钟的时段。通常，将混合物在室温下再孵育约5分钟。在适当调节孵育时间的情况下可以使用高于或低于室温的温度。替代地，孵育可以在4℃或-20℃下发生以进行沉淀。

通常，本文所述的方法导致从不纯的制剂中沉淀出大量的mRNA。在一些实施方案中，本文所述的方法导致从不纯的制剂中沉淀出总mRNA的至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，本文所述的方法导致从不纯的制剂中沉淀出基本上100％的总mRNA。

通常，由于沉淀的结果，形成了含有沉淀的mRNA和本文所述的各种污染物的悬浮液，并将所述悬浮液进行常规流过滤。

常规流过滤

常规流过滤是其中待纯化的全部材料或产物都沿相对于过滤器表面常规(即垂直)的方向流动的一种过滤过程。太大而无法通过过滤器的材料得以保留，然而较小的材料通过成为滤液。

通常，本文所述的常规流过滤过程包括加载、洗涤和回收mRNA的步骤。加载步骤涉及将进料(例如，含有沉淀的mRNA的不纯的制剂)加载到过滤器系统上。进料可以在各种条件下加载，所述各种条件包括但不限于恒定流、恒定压力、可变流、可变压力、通过芯吸的流和/或重力控制。

可以在添加或不添加分散剂到负载(例如悬浮液)中的情况下进行常规流过滤。在一些实施方案中，将包含沉淀的mRNA的悬浮液在没有分散剂的情况下进行常规流过滤。

可以使用本领域中已知的各种常规流过滤处理系统和方法，或者将其应用于实施本发明。各种过滤器可以用于常规流过滤系统中，包括但不限于各种膜过滤器、深层过滤器(其中过滤器包含一种或多种三维基质)。可以使用一种或多种具有各种分子量截止(MWCO)、孔径、表面积或形式的过滤器。在一些实施方案中，可以堆叠多个过滤器。在一些实施方案中，使用一个或多个滤网。选择过滤器以促进捕获或保留沉淀的mRNA并允许污染物通过。通常，选择小于沉淀的mRNA且大于可溶性mRNA或其他污染物的合适的MWCO或孔径。选择合适的表面积以促进捕获足够大量的沉淀的mRNA并允许捕获到的mRNA的分布而不会阻塞或形成凝胶层。在下面更详细地描述示例性过滤器。

过滤器

用于本发明的合适的过滤器包括多种形式，例如褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器。在一些实施方案中，合适的过滤器是深层过滤器。在一些实施方案中，合适的过滤器是膜过滤器。在一些实施方案中，合适的过滤器包含滤网。悬浮液中的目标颗粒(即沉淀的mRNA)保留在过滤器上或过滤器中，然而具有可溶污染物的悬浮液或具有较小尺寸的污染物颗粒则流过过滤器，这通常被称为滤液。

通常，选择具有合适孔径的过滤器，以使得膜的分子量截止(MWCO)值通常小于沉淀的mRNA的最小分子量，但大于溶解的污染物的分子量。在一些实施方案中，使用孔径比沉淀的mRNA的MWCO小了二至六倍(例如2、3、4、5或6倍)的膜。对于mRNA纯化，膜过滤器通常具有在1千道尔顿(kDa)与10,000千道尔顿(kDa)之间的范围内(例如，10kDa–9,000kDa、50kDa–8,000kDa、100kDa–9,000kDa、100kDa–8,000kDa、100kDa–7,000kDa、100kDa–6,000kDa、100kDa–5,000kDa、100kDa–4,000kDa、100kDa–3,000kDa、100kDa–2,000kDa、或100kDa–1,000kDa)的MWCO。示例性的合适的膜过滤器可以具有为或大于1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa或100kDa的MWCO值。在一些实施方案中，合适的膜过滤器可以具有为或大于110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、150kDa、160kDa、170kDa、180kDa、190kDa、200kDa、210kDa、220kDa、230kDa、240kDa、250kDa、260kDa、270kDa、280kDa、290kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa或1000kDa的MWCO值。在一些实施方案中，用于本发明的合适的膜过滤器可以具有为或小于约100kDa、300kDa、500kDa、1,000kDa、1,500kDa、2,000kDa、2,500kDa、3,000kDa、3,500kDa、4,000kDa、4,500kDa、5,000kDa、5,500kDa、6,000kDa、6,500kDa、7,000kDa、7,500kDa、8,000kDa、8,500kDa、9,000kDa、9,500kDa或10,000kDa的MWCO值。

在一些实施方案中，还以平均孔直径测量过滤器的孔径。例如，合适的过滤器具有在0.001与500μm之间、在0.01μm与400μm之间、在0.01μm与300μm之间、在0.01μm与200μm之间、在0.01μm与100μm之间、在0.05μm与500μm之间、在0.05μm与400μm之间、在0.05μm与300μm之间、在0.05μm与200μm之间、或在0.05μm与100μm之间的范围内的平均孔径。在一些实施方案中，合适的过滤器具有0.001μm或更大、0.01μm或更大、0.05μm或更大、0.01μm或更大、0.1μm或更大、0.2μm或更大、0.3μm或更大、0.4μm或更大、0.5μm或更大、1μm或更大、5μm或更大、10μm或更大、15μm或更大、20μm或更大、25μm或更大、30μm或更大、35μm或更大、40μm或更大、45μm或更大、或50μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有0.5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有10μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有20μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有25μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，合适的膜具有为或大于约0.10μm、0.20μm、0.22μm、0.24μm、0.26μm、0.28μm、0.30μm、0.40μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、或1.0μm的平均孔径。

用于本发明的合适的过滤器可以由任何材料制成。示例性材料包括但不限于聚醚砜(PES)(未改性)、聚醚砜(mPES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸纤维素、硝化纤维素、MCE(混合纤维素酯)、超高分子量聚乙烯(UPE)、聚氟四乙烯(PTFE)、尼龙、聚砜、聚丙烯腈、聚丙烯、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃过滤器及其组合。

用于本发明的合适的过滤器可以具有各种表面积。通常，合适的过滤器具有足够大的表面积以促进mRNA的大规模生产。特别地，合适的过滤器具有允许捕获大量沉淀的mRNA而不会阻塞或形成凝胶层的表面积。例如，合适的过滤器可以具有为或大于约1,000cm²、1,500cm²、2,000cm²、2,500cm²、3,000cm²、3,500cm²、3,500cm²、4,000cm²、5,000cm²、7,500cm²、10,000cm²、1m²、5m²、10m²、50m²、100m²、150m²、200m²、300m²、400m²、500m²、600m²、700m²、800m²、900m²、1000m²的表面积。在一些实施方案中，合适的过滤器可以具有为或大于264m²的表面积。在一些实施方案中，合适的过滤器可以具有为或大于528m²的表面积。在一些实施方案中，合适的过滤器可以具有为或大于1056m²的表面积。在一些实施方案中，合适的过滤器可以具有为或大于2112m²的表面积。可以使用单层或多层过滤层。实例包括硅藻土基质、纤维素基质或聚丙烯毡基质。在一些实施方案中，合适的过滤器系统包括可以由多层单一基质类型或多层不同的基质构成的深层过滤器。包含沉淀的mRNA的悬浮液通过常规流流过深层过滤器，其中沉淀的mRNA被保留在具有合适孔径的一个或多个过滤器中。深层阵列过滤器的示例性阵列可以包括2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或10个或更多个过滤器层。在一些实施方案中，每个层具有比在流动方向上之前的层的孔径减小了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的孔径(例如，通过MWCO或平均直径所测量)。作为非限制性实例，合适的深层过滤器依次具有以下孔径：200μm、100μm、50μm和5μm；或者500μm、300μm、200μm、100μm和20μm；或者100μm、50μm、20μm或5μm。示例性深层过滤器设计如图1所示。

深层过滤器由多家制造商商业制造，例如：Millipore Sigma(Clarisolve60HXfilters,Millistak filters)、Pall Corporation、Sartorius Biotech等等。过滤器由惰性材料(例如毡制聚丙烯或硅藻土)制成。过滤器外壳和适配器配件包括玻璃填充的聚丙烯。在一些实施方案中，惰性材料是改性的聚醚砜(mPES)。用于过滤器的惰性材料的其他实例包括聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)和纤维素。过滤器可以具有变化的厚度。过滤器的厚度可以是1cm或更大。深层过滤器具有容易的可扩展性，例如，可以添加过滤器以增加过滤面积。具有表面积和相应的预测mRNA纯化能力的示例性过滤器包括如下：23cm²过滤器可以具有纯化约290mg mRNA的能力；135cm²过滤器可以具有纯化约1.7gm mRNA的能力；270cm²过滤器具有纯化约3.4gm mRNA的能力；0.11-1.65m²过滤器可以具有纯化约14gm-200gm mRNA的能力；11.5m²过滤器可以具有纯化约1.4Kg mRNA的能力。在一些实施方案中，过滤器包含至多约264平方米或更多、或至多约528平方米或更多或者至多约1056平方米或更大的总表面积。

加载

通常，加载步骤涉及将进料(诸如含有沉淀的mRNA的悬浮液)加载到本文所述的过滤系统上。进料可以在各种条件下加载，所述各种条件包括但不限于恒定流、恒定压力、可变流、可变压力、以及通过芯吸的流和/或重力控制。在一些实施方案中，将含有来自IVT反应的沉淀的mRNA的悬浮液以合适的流速加载到一个或多个过滤器上。含有沉淀的mRNA的悬浮液的示例性合适的浓度可以在从约0.01mg/ml至约100mg/ml、或从约0.1mg/ml至约50mg/ml、或从约0.1mg/ml至约25mg/ml、或从约0.1mg/ml至约10mg/ml、或从约0.5mg/ml至约50mg/ml、或从约0.5mg/ml至约25mg/ml、或从约0.5mg/ml至约10mg/ml、或从约0.5mg/ml至约5mg/ml、或从约1mg/ml至约5mg/ml的范围内。在一些实施方案中，合适的流速可以为至少约1mg/ml、或1.2mg/ml、或1.3mg/ml、或1.4mg/ml、或1.5g/ml、或1.6mg/ml、或1.7mg/ml、或1.8mg/ml或1.9mg/ml或2mg/ml、以及介于两者之间的任何浓度。在一些实施方案中，归一化至膜面积的悬浮液流速可以在10至10000升/m²/hr(LMH)的范围内。示例性的合适流速为10LMH、50LMH、100LMH、200LMH、300LMH、400LMH、500LMH、600LMH、700LMH、800LMH、900LMH、1,000LMH、1,100LMH、1,200LMH、1,300LMH、1,400LMH、1,500LMH、1,600LMH、1,700LMH、1,800LMH、1,900LMH、2,000LMH、2,100LMH、2,200LMH、2,300LMH、2,400LMH、2,500LMH、2,600LMH、2,700LMH、2,800LMH、2,900LMH、3,000LMH、3,100LMH、3,200LMH、3,300LMH、3,400LMH、3,500LMH、3,600LMH、3,700LMH、3,800LMH、3,900LMH、4,000LMH、4,100LMH、4,200LMH、4,300LMH、4,400LMH、4,500LMH、4,600LMH、4,700LMH、4,800LMH、4,700LMH、4,800LMH、4,900LMH或5,000LMH。在一些实施方案中，合适的流速包括5,500LMH、6,000LMH、6,500LMH、7,000LMH、7,500LMH、8,000LMH、8,500LMH、9,000LMH、9,500LMH或10,000LMH。

一般来讲，流速在加载期间可能会变化。在一些实施方案中，调节压力以随着负载的增加维持流速。在本说明书中所提供的工作实施例中都提供了示例性的负载流动时间和速率。

mRNA的洗涤和回收

在洗脱之前，可以洗涤所捕获或保留的不溶性的沉淀的mRNA，以去除保留在一个或多个过滤器上的杂质。在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用一种或多种洗涤溶液的单次漂洗或多次漂洗循环。例如，可以使用胍缓冲液(GSCN)和乙醇、随后用70-80％的乙醇(例如，约70％、75％或80％的乙醇)通过多次漂洗循环来进行洗涤步骤。在某些实施方案中，多次漂洗循环包括多于2、多于3、多于4、多于5、多于6、多于7、多于8、多于9、或多于10次循环。

可以使用各种洗涤缓冲液。例如，可以对捕获的mRNA进行一次或多次盐洗涤和/或一次或多次乙醇洗涤。可以使用水性溶剂或有机溶剂进行洗涤。在美国专利9,957,499和9,850,269、以及美国专利申请15/907,086和15/906,864中进一步描述了示例性洗涤缓冲液。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA可以用一次或多次盐洗涤来实现。在一些实施方案中，可以用有机溶剂来洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以用乙醇洗涤来洗涤沉淀的mRNA。

洗涤沉淀的mRNA可以包括使用有机溶剂，诸如乙醇。但是，在不使用有机溶剂的情况下可以实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG-6000来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG-400来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA包括一次或多次包含粘度为90厘沲或更小的PEG的洗涤。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有80厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有70厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有60厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有50厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有40厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有30厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有20厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有10厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇(TEG)来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用叔丁基-TEG-O-丙酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二乙烯基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单丁基来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-甲基醚甲基丙烯酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单癸基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二苯甲酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在上面表A中显示了这些试剂中的每一种试剂的结构。

通常，可以通过将沉淀的mRNA重新溶解到溶液中来洗脱所捕获或保留的mRNA。例如，可以用无RNase的水来洗脱捕获的mRNA。在某些实施方案中，洗脱捕获的mRNA涉及再循环无RNase的水。例如，可以将无RNase的水循环约5-100分钟(例如，约5-90分钟、约5-80分钟、约5-70分钟、约5-60分钟或约5-30分钟)。在特定实施方案中，将无RNase的水再循环约5-10分钟(例如，约5、6、7、8、9或10分钟)。

在一些实施方案中，可以将重新溶解的mRNA以期望的浓度透析到期望的配制品中。可以将各种配制品用于透析。在一些实施方案中，将纯化的mRNA溶液用1mM柠檬酸钠透析。在一些实施方案中，将纯化的mRNA溶液用乙酸钠、碳酸铵、碳酸氢铵、乙酸吡啶鎓、甲酸吡啶鎓、乙酸铵、尿素、氯化钾等透析。根据感兴趣的mRNA的大小，可以使用具有适当分子量截止(MWCO)的透析膜。例如，合适的透析膜可以具有约50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa或500kDa的MWCO。

对纯化的mRNA的表征

可以使用本领域可用的任何方法来表征和定量纯化的mRNA。在一些实施方案中，使用印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染、光谱、紫外线(UV)或UPLC或其组合来表征纯化的mRNA分子。本领域中已知的其他方法也包括在本发明中。在一些实施方案中，使用UV吸收光谱和通过毛细管电泳的分离来检测纯化的mRNA分子。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前，首先通过乙二醛染料使mRNA变性。

在一些实施方案中，除了通过本文所述和本领域已知的各种检测方法(例如，毛细管电泳、凝胶电泳、HPLC或UPLC)确定的全长mRNA以外，通过本文公开的方法纯化的mRNA包含小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％的杂质。杂质包括IVT污染物，例如蛋白质、酶、游离核苷酸和/或短聚体(shortmer)。如本文所用，术语“短聚体”或“异常终止转录物”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短聚体”或“异常终止转录物”为小于100个核苷酸的长度，小于90个、小于80个、小于70个、小于60个、小于50个、小于40个、小于30个、小于20个或小于10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，在添加5'-帽和/或3'-聚A尾巴之后，检测或定量短聚体。

本文所述的纯化方法尤其可以用于制造用于治疗用途的mRNA。通过本文所述的各种表征技术确定的纯化的mRNA的纯度和/或完整性可以用作批次释放标准。在一些实施方案中，在制造过程中批次生产mRNA的释放标准包括以下中的一种或多种的毛细管电泳确定：纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含蛋白质污染物；纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含短的异常终止RNA污染物；纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含盐污染物；纯化的mRNA包含95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的完整性。

在一些实施方案中，在制造过程中批次生产mRNA的释放标准包括以下中的一种或多种的HPLC确定：纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含蛋白质污染物；纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含短的异常终止RNA污染物；纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少、或基本上不含盐污染物；纯化的mRNA包含95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的完整性。

另外地，根据本发明纯化的mRNA导致高的产率。例如，以导致至少约70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的产率的量回收总的纯化的mRNA。

根据本发明，可以大规模地纯化mRNA。例如，可以在单一批次中纯化至少0.5克、1克、5克、10克、15克、20克、35克、40克、45克、50克、60克、70克、80克、90克、100克、200克、300克、400克、500克、1千克、10千克、50千克、100千克的mRNA。

治疗的组合物和方法

根据本发明纯化的mRNA可以作为裸mRNA(未包装)或通过递送媒介物来递送。如本文中所用，术语“递送媒介物”、“转运媒介物”、“纳米颗粒”或语法等同物可互换使用。

递送媒介物可以与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合配制，或者在药物组合物中配制，在所述药物组合物中所述递送媒介物与合适的赋形剂混合。用于配制和施用药物的技术可在"Remington'sPharmaceutical Sciences,"MackPublishing Co.,Easton,Pa.，最新版本中找到。特定的递送媒介物根据其促进将核酸转染至靶细胞的能力来选择。

根据各种实施方案，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体，诸如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒(LNP)和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成来源的外泌体、天然、合成和半合成的板层体、纳米颗粒、磷硅酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶体颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、基于淀粉的传递系统、胶束、乳剂、类脂质体、多域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉调配物、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其他载体标签。

脂质体递送媒介物

在一些实施方案中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒(LNP)或脂质体。在一些实施方案中，脂质体可包含一种或多种阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含不超过四种不同的脂质组分。在一些实施方案中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。

如本文所用，术语“阳离子脂质”是指在选定pH(诸如生理pH)下具有净正电荷的许多脂质和类脂质物类中的任一者。文献中已经描述了若干阳离子脂质，其中许多是可商购获得的。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产包含纯化的mRNA的治疗组合物的方法，所述纯化的mRNA编码在受试者中可能是缺陷的或无功能的内源蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产包含纯化的mRNA的治疗组合物的方法，所述纯化的mRNA编码在受试者中可能是缺陷的或无功能的内源蛋白。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明可用于制造编码囊性纤维化跨膜电导调节剂CFTR的mRNA的方法中。将CFTR mRNA递送至需要用于治疗囊性纤维化的治疗组合物的受试者的肺部。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，以富集的全长mRNA递送至或治疗肝脏或肝细胞提供治疗有益效果。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与尿素循环障碍相关的蛋白质的纯化的mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨琥珀酸合成酶1蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码氨基甲酰磷酸合成酶I蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨琥珀酸裂合酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨酸酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与溶酶体贮积症相关的蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码α半乳糖苷酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码葡萄糖脑苷脂酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码异氰酸酯-2-硫酸酯酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码艾杜糖苷酸酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码N-乙酰基-α-D-葡糖胺苷酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码β-半乳糖苷酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码溶酶体脂肪酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述纯化mRNA编码芳基硫酸酯酶B(N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码转录因子EB(TFEB)的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与糖原贮积症相关的蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码酸性α-葡糖苷酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肝糖原磷酸化酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肌肉磷酸甘油酸突变酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码糖原解支化酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与氨基酸代谢相关的蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码苯丙氨酸羟化酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码戊二酰-CoA脱氢酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码丙酰基-CoA羧化酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与脂质代谢或纤维化疾病相关的蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码mTOR抑制剂的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码ATPase磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种NF-κB抑制剂的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述抑制剂诸如I-κBα、干扰素相关的发育调节剂1(IFRD1)和Sirtuin 1(SIRT1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码PPAR-γ蛋白或活性变体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的纯化mRNA的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码甲基丙二酰辅酶A突变酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码甲基丙二酰辅酶A差向异构酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，对于该治疗组合物，递送至或治疗肝脏可以提供治疗有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码ATP7B蛋白(也被称为Wilson病蛋白)的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码胆色素原脱氨酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种凝结酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人血色素沉着病(HFE)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心血管系统或心血管细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码血管内皮生长因子A蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码松弛素蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码骨形态发生蛋白9蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码骨形态发生蛋白2受体蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肌肉或肌肉细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肌营养不良蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人源线粒体蛋白(frataxin)的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心肌或心肌细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Kv7.1通道的蛋白质的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中Nav1.5通道的蛋白质的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的神经系统或神经系统细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码存活运动神经元1蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码存活运动神经元2蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人源线粒体蛋白(frataxin)的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码ATP结合盒亚家族D成员1(ABCD1)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码CLN3蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码β球蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码布鲁顿酪氨酸激酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种凝结酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肾脏或肾脏细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码IV型胶原α5链(COL4A5)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的眼或眼细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码ATP结合盒亚家族A成员4(ABCA4)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码视黄醛壳素蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码视网膜色素上皮特异性65kDa(RPE65)蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码290kDa的中心体蛋白(CEP290)的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mRNA的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于向受试者或受试者的细胞递送疫苗或用疫苗治疗。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自诸如病毒之类的传染源的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自流感病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自呼吸道合胞病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自狂犬病病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自巨细胞病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了生产具有编码来自轮状病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自肝炎病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述肝炎病毒诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人乳头瘤病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自单纯疱疹病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述单纯疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人免疫缺陷病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述人免疫缺陷病毒诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人间质肺炎病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人副流感病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自疟疾病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自寨卡病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自基孔肯雅病毒的抗原的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码从突变KRAS基因表达的抗原。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对OX40的抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对VEGF的抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对组织坏死因子α的抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对CD3的抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对CD19的抗体的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码免疫调节剂的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素12的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素23的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素36γ的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码一种或多种干扰素基因(STING)蛋白刺激物的组成型活性变体。

在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码核酸内切酶的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mRNA的治疗组合物的方法，该mRNA编码RNA指导的DNA核酸内切酶蛋白，诸如Cas 9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码大范围核酸酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码转录激活因子样效应子核酸酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种制备包含编码锌指核酸酶蛋白的纯化mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种生产包含纯化的mRNA的治疗组合物的方法，所述纯化的mRNA编码用于治疗眼疾病的蛋白质。在一些实施方案中，所述方法用于生产包含纯化的mRNA的治疗组合物，所述纯化的mRNA编码视网膜劈裂蛋白。

本发明的另一个方面是通过上述方面或实施方案制备的纯化的mRNA组合物。

本发明的又另一个方面是药物组合物，其包含上述方面的纯化的mRNA组合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明的一个方面是一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述方面的药物组合物的步骤。

本发明的另一个方面是包含通过上述方面或实施方案制备的纯化的mRNA的溶液。

在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含含有上述描述的纯化的mRNA和至少一种药学上可接受的赋形剂的溶液。

本发明的一个方面是一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述方面的药物组合物的步骤。

本发明还包括组合物，其包含通过上述方面和/或实施方案生产的纯化的mRNA沉淀。

本发明还包括药物组合物，其包含通过上述方面和/或实施方案生产的纯化的mRNA沉淀和至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明还包括一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用上述方面和/或实施方案的药物组合物。

可以将本文所述的任何方面或实施方案与如本文所公开的任何其他方面或实施方案组合。尽管已经结合本公开的具体实施方式描述了本公开，但是以上描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

在以下中的一个或多个中描述了与本发明有关的附加教导：WO 2010/053572、WO2011/068810、WO 2012/075040、WO 2012/170889、WO 2012/170930、WO 2013/063468、WO2013/149140、WO 2013/149141、WO2013/185067、WO 2013/185069、WO 2014/089486、WO2014/152513、WO 2014/152659、WO 2014/152673、WO 2014/152774、WO 2014/152966、WO2014/153052、WO 2015/061461、WO 2015/061467、WO 2015/061491、WO 2015/061500、WO2015/148247、WO 2015/164773、WO 2015/184256、WO 2015/200465、WO 2016/004318、WO2016/149508、WO/2014/152940、PCT/US16/57044、US 62/320,073、US 62/349,331、US 62/420,413、US 62/420,421、US 62/420,428、US 62/420,435、US 62/421,007、US 62/421,021以及申请人于2017年2月27日提交的标题为“LARGE SCALE SYNTHESIS OF MESSENGER RNA”(US 62/464,043)、“METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA”(US 62/463,998)和“NOVEL CODON-OPTIMIZED CFTR MRNA”(US 62/464,215)的相关申请，其每一个均以引用的方式整体并入。

实施方案1：一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)从包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的溶液中沉淀mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；

(b)使包含所述沉淀的mRNA的所述悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mRNA被所述过滤器保留；

(c)溶解步骤(b)中被所述过滤器保留的所述沉淀的mRNA，从而允许纯化的mRNA通过所述过滤器；以及

(d)从步骤(c)中回收所述纯化的mRNA；

其中步骤(b)和(c)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。

实施方案2：根据实施方案1所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。

实施方案3：根据实施方案1或2所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的5’-加帽的步骤。

实施方案4：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的3'-加尾的步骤。

实施方案5：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含酶。

实施方案6：根据实施方案5所述的方法，其中所述酶是聚合酶。

实施方案7：根据实施方案5所述的方法，其中所述酶是加帽酶。

实施方案8：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含盐。

实施方案9：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含短的异常终止的转录物。

实施方案10：根据前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括洗涤来自步骤(b)的保留在所述过滤器上的所述沉淀的mRNA的步骤。

实施方案11：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器是膜过滤器或深层过滤器。

实施方案12：根据实施方案11所述的方法，其中所述过滤器是深层过滤器。

实施方案13：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器的形式。

实施方案14：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含滤网。

实施方案15：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器由惰性材料制成。

实施方案16：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚丙烯。

实施方案17：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是改性的聚醚砜(mPES)。

实施方案18：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚醚砜(PES)。

实施方案19：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚偏二氟乙烯(PVDF)。

实施方案20：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是纤维素。

实施方案21：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是硅藻土。

实施方案22：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚四氟乙烯(PTFE)。

实施方案23：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是硝化纤维素。

实施方案24：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚乙烯。

实施方案25：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚丙烯腈。

实施方案26：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是聚碳酸酯。

实施方案27：根据实施方案15所述的方法，其中所述惰性材料是尼龙。

实施方案28：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含一种或多种三维基质。

实施方案29：根据实施方案28所述的方法，其中所述一种或多种三维基质是毡基质。

实施方案30：根据实施方案29所述的方法，其中所述毡的厚度在1-10mm的范围内。

实施方案31：根据实施方案29所述的方法，其中所述毡的厚度在1-5mm的范围内。

实施方案32：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含至少两种三维基质。

实施方案33：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器包含堆叠的三维基质。

实施方案34：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有促进保留所述沉淀的mRNA同时允许溶解的污染物通过的平均孔径。

实施方案35：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径在0.001μm与500μm之间、在0.01μm与200μm之间、或在0.05μm与100μm之间。

实施方案36：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为0.05μm或更大。

实施方案37：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为0.5μm或更大。

实施方案38：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为5μm或更大。

实施方案39：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为10μm或更大。

实施方案40：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为20μm或更大。

实施方案41：根据实施方案34所述的方法，其中所述平均孔径为25μm或更大。

实施方案42：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有不为分布在所述过滤器上的mRNA的量提供凝胶层的总表面积。

实施方案43：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法不需要向所述悬浮液中添加分散剂。

实施方案44：根据实施方案10-43中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括用一次或多次盐洗涤来洗涤所述沉淀的mRNA。

实施方案45：根据实施方案10-44中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括使用有机溶剂进行的一次或多次洗涤。

实施方案46：根据实施方案45所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含乙醇的洗涤。

实施方案47：根据实施方案10-44中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤不包括包含有机溶剂的洗涤。

实施方案48：根据实施方案10-47中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含聚乙二醇(PEG)的洗涤。

实施方案49：根据实施方案48所述的方法，其中所述一次或多次包含聚乙二醇(PEG)的洗涤各自具有50厘沲或更小的粘度。

实施方案50：根据实施方案10-49中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含三乙二醇(TEG)的洗涤。

实施方案51：根据实施方案10-49中任一项所述的方法，其中洗涤所述沉淀的mRNA的步骤包括一次或多次包含三乙二醇单甲醚(MTEG)的洗涤。

实施方案52：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包括以下中的一项或多项：

恒定流；

恒定压力；

可变流；

可变压力；

通过芯吸的流；以及

重力控制。

实施方案53：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包含一次使用的系统和/或过滤器。

实施方案54：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述常规流过滤包含多次使用的系统和/或过滤器。

实施方案55：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述回收步骤包括以下中的一项或多项：

水/缓冲液的再循环；

水/缓冲液的单次通过冲洗；以及

水/缓冲液的反向冲洗。

实施方案56：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述mRNA编码蛋白质或肽。

实施方案57：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是代谢蛋白质或肽。

实施方案58：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是酶。

实施方案59：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是受体蛋白质或肽。

实施方案60：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是分泌的蛋白质或肽。

实施方案61：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是非分泌的蛋白质或肽。

实施方案62：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是胞质蛋白质或肽。

实施方案63：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是核蛋白质或肽。

实施方案64：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是线粒体蛋白质或肽。

实施方案65：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是溶酶体蛋白质或肽。

实施方案66：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是内质网蛋白质或肽。

实施方案67：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是高尔基体蛋白质或肽。

实施方案68：：根据实施方案61所述的方法，其中所述蛋白质或肽是结构膜蛋白质或肽。

实施方案69：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或多肽是抗体或抗体片段。

实施方案70：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质或肽是抗原。

实施方案71：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质是CFTR蛋白质。

实施方案72：根据实施方案56所述的方法，其中所述蛋白质是OTC蛋白质。

实施方案73：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中以导致至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的产率的量回收从所述方法中回收的总的纯化mRNA。

实施方案74：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中以导致至少约90％的产率的量回收总的纯化mRNA。

实施方案75：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA具有临床级纯度，无需进一步纯化。

实施方案76：根据实施方案75所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少或者基本上不含如通过毛细管电泳确定的蛋白质污染物。

实施方案77：根据实施方案75或76所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、或者基本上不含通过HPLC确定的盐污染物。

实施方案78：根据实施方案75-77中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少或者基本上不含通过HPLC确定的短的异常终止的转录物污染物。

实施方案79：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中如通过毛细管电泳确定，所述纯化的mRNA具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的完整性。

实施方案80：根据实施方案75-79中任一项所述的方法，其中无需选自HPLC纯化、基于配体或结合的纯化、TFF纯化和/或离子交换色谱的进一步纯化即达到所述临床级纯度。

实施方案81：一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

(a)从包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的溶液中沉淀mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；

(b)通过使包含所述沉淀的mRNA的所述悬浮液经历基本上由常规流过滤的一个或多个步骤组成的纯化系统来纯化所述mRNA；并且

其中所述纯化的mRNA具有临床级纯度，无需进一步纯化。

实施方案82：根据实施方案81所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少或者基本上不含如通过毛细管电泳确定的蛋白质污染物。

实施方案83：根据实施方案81或82所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、或者基本上不含通过HPLC确定的盐污染物。

实施方案84：根据实施方案81-83中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少或者基本上不含通过HPLC确定的短的异常终止的转录物污染物。

实施方案85：根据实施方案80-83中任一项所述的方法，其中如通过毛细管电泳确定，所述纯化的mRNA具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的完整性。

实施方案86：根据实施方案81-85中任一项所述的方法，其中无需选自HPLC纯化、基于配体或结合的纯化、TFF纯化和/或离子交换色谱的进一步纯化即达到所述临床级纯度。

实施方案87：一种纯化包含通过体外转录(IVT)合成制造的100gm或更多mRNA的组合物的方法，所述方法包括：

沉淀包含来自所述IVT合成的一种或多种污染物的IVT转录的mRNA以产生悬浮液；

使包含所述沉淀的mRNA和污染物的所述悬浮液经历通过过滤器进行的常规流过滤，其中所述沉淀的mRNA被所述过滤器保留；

从所述过滤器以溶液回收所述mRNA，从而纯化所述mRNA，

其中回收至少85％的所述mRNA，并且所回收的mRNA具有90％或更高的完整性并且基本上不含蛋白质污染物。

实施方案88：根据实施方案87所述的方法，其中所述蛋白质污染物是聚合酶。

实施方案89：根据实施方案87所述的方法，其中所述蛋白质污染物是加帽酶。

实施方案90：根据实施方案87-89中任一项所述的方法，所述方法还包括洗涤来自步骤(b)的包含所保留的沉淀mRNA的所述过滤器的步骤。

实施方案91：根据实施方案87-90中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA基本上不含短的异常终止的转录物污染物。

实施方案92：根据实施方案87-91中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有高达约264平方米或更大的总表面积。

实施方案93：根据实施方案87-92中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有高达约528平方米或更大的总表面积。

实施方案94：根据实施方案87-93中任一项所述的方法，其中所述过滤器具有高达约1056平方米或更大的总表面积。

实施方案95：一种组合物，所述组合物包含使用前述实施方案中任一项所述的方法纯化的mRNA。

实施方案96：根据实施方案95所述的组合物，所述组合物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但下面对合适的方法和材料进行描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用的方式整体并入本文。本文引用的参考文献不被视为所要求保护的发明的现有技术。另外，所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并且不旨在进行限制。

实施例

实施例1:mRNA的常规流过滤纯化

在本实验中，评价了使用深层过滤(Clarisolve 60HX)纯化信使RNA(mRNA)的常规流过滤的可行性。所述方法步骤包括(1)沉淀mRNA，(2)通过过滤器捕获沉淀的mRNA到过滤器内和/或过滤器上，(3)洗涤捕获的沉淀的mRNA，(4)溶解沉淀的mRNA以将其转化为过滤器渗透物，以及(5)回收溶解的物质。特别地，在本实验中，改变沉淀条件和洗涤缓冲液，并且评估mRNA的产率和纯度。在纯化的各个点评估了这种常规流过滤的可行性：(i)如通过目视检查滤液所指示，沉淀的mRNA保留在深层过滤器内；(ii)如滤液的电导率所指示，沉淀的mRNA洗涤的有效性；(iii)如通过分光光度法所指示，从纯化中回收mRNA。

IVT反应

对于本文所述的此实施例和所有实施例，一般来讲，通过标准方法体外转录(IVT)mRNA。简而言之，对于每克转录的mRNA，用无RNase的水制备反应，所述反应含有线性化的双链DNA质粒和RNA聚合酶特异性启动子、RNA聚合酶(例如，SP6聚合酶或T7聚合酶)、RNase抑制剂、焦磷酸酶、NTP、DTT和反应缓冲液，然后在37℃下孵育指定的时间。然后通过添加DNase I和DNase I缓冲液以促进用于纯化的制剂中双链DNA模板的消化来淬灭反应。

RNA沉淀和过滤

材料：进料mRNA：体外合成的编码CFTR的mRNA；GSCN缓冲液：硫氰酸胍、柠檬酸钠、N-月桂酰肌氨酸的混合物；深层过滤器：Clarisolve60HX，目录号：CS60HX01L3，有效面积为23cm²。GSCN洗涤缓冲液：GSCN缓冲液、乙醇、水。

A.沉淀

通过首先将mRNA与硫氰酸胍(GSCN)缓冲液混合并混合至使mRNA变性，从而沉淀出体外合成的编码CFTR的mRNA(进料mRNA)。将100％乙醇(EtOH)添加到混合物中并混合以沉淀mRNA。

B.过滤

以恒定进料通量将沉淀的混合物加载到深层过滤器上。选择初始进料通量以达到3-4小时的处理时间。在实验期间调节通量。在加载完成之后，将捕获的沉淀的mRNA用GSCN/乙醇洗涤缓冲液、随后用80％乙醇漂洗(洗涤)，直到实现0.0mS/cm的滤液电导率。在加载和洗涤步骤期间监测滤液质量、进料压力和滤液电导率。通过将漂洗液从80％乙醇改变为水，将洗涤后的沉淀的mRNA溶解并转化为滤液。在这种情况下，水通过深层过滤器和过滤器系统再循环。然后收集具有溶解的mRNA的水，并且通过在260nm处的吸光度测量mRNA回收率。

mRNA分析：在本文所述的此实施例和其他实施例中，随着负载的增加记录在mRNA加载到过滤器期间的阻力变化，并以进料压力除以进料通量进行测量。指示此参数而不是指示压力以归一化由流速变化引起的压力变化。使用CE Fragment Analyzer^TM使用总mRNA负载为300ng的标准敏感性mRNA分析试剂盒(Advanced Analytical Tech.)分析了mRNA完整性(其可以包括加帽和加尾的(C/T)mRNA，其中完整性包括对聚A尾巴长度的评估)。通过在NuPAGE样品加载和还原缓冲液中制备20μg RNase I消化的mRNA来分析残留的过程酶，并在200V下在NuPage 10％bis-tris凝胶上分离样品35分钟(Invitrogen)。然后，使用SilverQuest^TM银染试剂盒(Invitrogen)可视化残留的蛋白质。基于如通过用于制备mRNA的IVT和/或加帽/加尾反应中的初始试剂量所确定的理论上预期的产物量来计算待纯化的mRNA的起始质量。产率百分比计算为所得产物与理论上预期的产物量的比率。

在加载步骤期间，随着mRNA负载的增加，没有观察到阻力的增加。阻力相对于mRNA加载的趋势显示在图2中。阻力计算为进料压力除以进料通量。

检查来自加载和洗涤步骤的滤液中是否存在沉淀来作为沉淀的mRNA的一些部分通过过滤器的指示。在滤液中未观察到沉淀。

如上所述，用GSCN/乙醇洗涤缓冲液、随后用80％乙醇洗涤过滤器中沉淀的mRNA。通过测量电导率并将其相对于EtOH洗涤缓冲液体积的增加绘图展示了此过滤器系统去除制造中的盐污染物的有效性，并且示于图3中。随着冲洗体积的增加由污染物盐赋予的电导率降低到零，从而指示盐的去除，并且表明80％的乙醇有效地从过滤器和沉淀的mRNA中去除了盐污染物。特别地，在冲洗体积为每克mRNA大约2.0L后，观察到0.0mS/cm的滤液电导率。

从此纯化方法回收的mRNA总结于表1中。图4显示了在再循环时间内体外转录的CFTR mRNA的mRNA回收百分比。在使水通过系统再循环40分钟以溶解沉淀的mRNA之后，收集滤液，并通过在A260处的吸光度测量mRNA。令人惊讶地，从此纯化中回收了94％的mRNA。从所得的电导率测量值为零得出的此惊人的高回收百分比表明(a)在深层过滤器介质内成功地捕获/保留了沉淀的mRNA，(b)有效地洗涤掉了在深层过滤器介质中捕获的沉淀mRNA的盐污染物，并且(c)有效地回收了在深层过滤器介质中捕获的沉淀的mRNA。

表1：产物回收汇总

起始质量	373mg
		回收质量：	352mg
回收％：	94％

如表1中所示，使用本文所述的常规流过滤过程获得了高回收率。

实施例2.在加帽和加尾反应之后对mRNA进行常规流过滤器纯化。

在本实验中，在加帽和加尾(C/T)反应之后，对IVT制造的mRNA使用深层过滤器进行常规流过滤器纯化。使用以下标准评价对加帽和加尾的mRNA的纯化：(i)如通过目视检查滤液和产物回收所指示，在C/T反应后的沉淀的mRNA保留在深层过滤器(Clarisolve 60HX)内；(ii)如滤液电导率和产物回收所指示，洗涤沉淀的mRNA以去除污染物并保留mRNA的有效性；(iii)如通过分光光度法所指示，对mRNA的回收(在溶解其沉淀形式后，从而将在过滤器之中和/或之上捕获的mRNA转化为过滤器滤液)；(iv)如通过毛细管电泳(CE)所指示的mRNA完整性；以及(v)如通过银染凝胶分析所指示的mRNA纯度。

加帽和加尾(C/T)反应

在如上所述通过体外转录合成mRNA后，如Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249所描述，通过使用鸟苷酸转移酶添加5'N⁷-甲基鸟苷酸Cap 0结构并使用2'O-甲基转移酶在倒数第二个核苷酸的2'O位置处添加甲基基团产生Cap 1结构来酶促修饰体外转录的mRNA。在添加Cap 1结构后，使用聚A聚合酶酶促地将聚腺苷酸尾巴添加到体外转录的mRNA的3'末端。

进行C/T反应之后立即进行沉淀和深层过滤器测试。

A.沉淀

C/T材料无需稀释即可沉淀(沉淀1)。通过首先将mRNA进料材料与GSCN缓冲液混合(并且混合14分钟以使mRNA变性)来进行沉淀。将100％乙醇添加到混合物中并混合6分钟以沉淀mRNA。

B.过滤

将包含沉淀的mRNA的所得溶液以大约1600LMH的恒定进料通量(基于先前的测试和处理时间考虑)加载到深层过滤器上。在加载完成之后，将捕获的沉淀用GSCN/乙醇洗涤缓冲液(如上所述)漂洗(洗涤)、随后用80％乙醇洗涤，直到实现0.0mS/cm的滤液电导率。在加载和洗涤步骤期间监测滤液质量、进料压力和滤液电导率。通过使水通过深层过滤器再循环而使深层过滤器中洗涤的沉淀mRNA溶解，从而将捕获的mRNA转化为滤液。然后将溶解的mRNA作为滤液回收，并通过260nm处的吸光度随时间测量回收率。

还对从深层过滤器洗脱的mRNA进行了第二次沉淀(沉淀2)。使用与第一次沉淀所用的相同程序进行第二次沉淀。按照上述相同程序，对由过滤器捕获的沉淀的mRNA进行第二轮洗涤，随后溶解并收集为滤液。

C/T沉淀1和2的阻力相对于mRNA加载的趋势分别显示在图4和图5中。在加载步骤中观察到最小的(如果有的话)阻力增加。检查来自加载和洗涤步骤的滤液中是否存在沉淀。如图6所示，在两种情况下在滤液中均未观察到沉淀。

图7显示了80％乙醇冲洗去除残留盐的有效性。80％乙醇有效地从过滤器中去除了残留的盐并沉淀出mRNA。在mRNA溶解和回收之前，用每克mRNA大约9L的80％乙醇冲洗通过每个过滤器。

C/T反应后沉淀的mRNA成功地从深层过滤器中溶解并回收，进一步表明沉淀的mRNA保留在深层过滤器介质中，并且80％乙醇冲洗有效地保持沉淀状态的mRNA捕获在过滤器之上和/或之内并有效地去除盐污染物。再循环期间的产物回收率显示在图8A-B中，并总结在表2中，汇总了回收质量和百分比。

表2：产物回收汇总

	C/T沉淀1	C/T沉淀2
			起始质量	289mg*	270mg
回收质量：	274mg	269mg
			回收％：	95％	100％

*基于预期的尾巴长度，起始质量假设从C/T反应浓度增加10％。

通过使用毛细管电泳检查回收的纯化mRNA的等分试样，对mRNA完整性进行评估。结果表明高度的纯度和完整性，如图9所示。观察到单个没有明显肩峰的峰。这表明深层过滤器过程成功地去除了污染物(例如，短聚体)，并且同时没有不利地影响mRNA的质量和完整性，而是其产生了具有高水平的mRNA完整性的高度纯化的mRNA。

通过用RNase I消化mRNA产物并通过在凝胶上电泳消化的产物并用银染进行可视化来可视化剩余的污染物而进一步评估mRNA纯度的分析。银染对组合物中的少量蛋白质敏感，并且因此可以检测到甚至少量的残留的加帽酶或加尾酶。如图10所示，泳道4和5，沉淀和过滤的mRNA产物不含蛋白质，类似于泳道2(其是高纯度mRNA的阴性对照)。没有观察到与泳道6-10中的酶相对应的残留酶。这表明使用如本文所述的常规流过滤可有效去除mRNA制造中所使用的盐和酶以产生高纯度的mRNA产物。

实施例3.用于大规模纯化mRNA的常规流过滤的评估

在本实验中，使用深层过滤器进行常规流过滤，以纯化15克IVT合成的CFTR mRNA。表3中描述了过程步骤的概要。

表3：15g CFTR mRNA批次制造过程

为了常规流过滤纯化15克mRNA，使用0.11m²的过程规模模块(CS60HX01F1-X)的Clarisolve 60HX深层过滤器，特别是用于捕获和洗涤沉淀的mRNA。以约130g/m²进行mRNA加载。

图11显示了所有三种沉淀的阻力相对于mRNA加载的趋势。由于所有沉淀都以相同的通量加载，因此趋势中也包括了压力下降。

沉淀15克的CFTR mRNA，将其加载到过滤器系统中，捕获在过滤器之上和/或过滤器中，用GSCN/乙醇缓冲液、随后用80％乙醇缓冲液洗涤，并且然后如上所述溶解于滤液中。检查来自加载和洗涤步骤的滤液(其中沉淀的mRNA保留在过滤器中)中是否存在沉淀。来自负载的滤液的照片显示在图12中。在滤液中未观察到沉淀。对于所有三个沉淀步骤，图13显示了80％乙醇冲洗以去除残留盐的有效性。在每克mRNA大约3L 80％乙醇之后，实现了0.0mS/cm的滤液电导率。在再循环之前，冲洗了总共5L/g的80％乙醇。达到0.0mS/cm所需的乙醇冲洗体积与小规模运行相当。如图13所指示，80％乙醇冲洗有效地从过滤器中去除了残留的盐并沉淀出mRNA。

接下来，如上所述，通过切换至水冲洗使mRNA溶解，将其再循环。再循环期间重新溶解的mRNA的回收率显示在图14A-B中。图14A显示了随时间回收的mRNA浓度。图14B指示了mRNA随时间的回收％。再循环30-60分钟之后，mRNA浓度稳定，此后将mRNA作为滤液回收。每次沉淀之后，沉淀的mRNA成功地重新溶解并从深层过滤器中回收，进一步表明在80％乙醇冲洗期间产物已成功捕获在深层过滤器介质中。

表4总结了每个过滤步骤的mRNA产率。基于预期的尾巴长度，起始质量假设从C/T反应浓度增加10％。从15g IVT生产了总共15.4g mRNA。这种回收率是令人惊讶和出乎意料的；并且比本领域中使用的典型过程好得多，对于为15g mRNA的起始质量，预计将产生大约8-10g mRNA。

表4：产率汇总

*产率计算假设由添加尾巴导致质量增加10％。

通过毛细管电泳评估纯化的mRNA的质量。评估mRNA完整性和尾巴长度的电泳图显示在图15A和15B中。高完整性对照样品的实例，其中CFTR mRNA产物较早地通过不使用深层过滤的方法进行了纯化，如图15A所示。图15B显示了在后两次C/T沉淀之后深层过滤器洗脱的mRNA的电泳图，并且结果优于高完整性对照样品。没有观察到明显的肩峰。深层过滤器过程不会对mRNA的质量和完整性产生不利影响。

涂片分析结果显示于表5中。深层过滤器批次的涂片分析表明，通过其他方法，mRNA质量与先前制造的mRNA批次相当。

表5：CE涂片分析

此外，对纯化的mRNA样品的尾巴长度分析和加帽效率进行了评估。尾巴长度分析总结在表6中。构建体大小和尾巴长度与预期一致，表明深层过滤器纯化不会对加帽反应产生不利影响。加帽测定的结果显示在表7中。帽百分比与预期一致，表明深层过滤器纯化不会对加尾反应产生不利影响。

表6：mRNA尾巴长度分析

表7：mRNA加帽分析

未加帽	5
		Cap 0	0
Cap G	0
		Cap 1	95

评估mRNA纯度和残留酶的银染分析显示在图16中。在第一次C/T沉淀以及第二次C/T沉淀(药物物质)之后评估mRNA纯度，分别显示在泳道6和7中。在第一次沉淀和第二次沉淀之后对于通过深层过滤纯化的材料未观察到残留酶条带。银染表明，C/T沉淀1后的样品不含残留的酶。

总而言之，这些结果表明深层过滤器在IVT和C/T反应中的每一个反应之后都有效地捕获、洗涤和回收大规模量的mRNA。两次C/T常规流过滤中的每一次过滤的步骤产率均超过90％。使用本文所述的常规流过滤纯化过程制造的mRNA的完整性与预期和参考标准品质量一致，表明深层过滤器纯化对完整性没有不利影响。此外，它表明基于深层过滤器的纯化过程对加帽和加尾反应没有不利影响。帽百分比和尾巴长度与参考值一致。最终，在沉淀1或沉淀2之后未检测到残留的加帽或加尾酶条带，这表明深层过滤器可有效促进这些酶以及盐和短的异常终止RNA种类的去除。

总之，本实施例表明，使用本文所述的常规流过滤过程纯化的大规模量的mRNA(例如CFTR mRNA)具有高纯度和完整性，并且可以以适合于临床使用的大规模生产。

实施例4.用于100g批次mRNA纯化的常规流过滤的评估

在本实验中，使用深层过滤器进行常规流过滤，以纯化100克的IVT合成的并加帽和加尾(C/T)的CFTR mRNA。在表8中描述了总体处理步骤的概要，并且在每个纯化步骤(即，表8中的IVT纯化和C/T纯化步骤)中进行了常规流过滤纯化。

表8：100g CFTR mRNA批次制造过程

在每个纯化步骤(即，IVT纯化和C/T纯化)开始时，通过添加5MGSCN缓冲液、随后添加乙醇，将mRNA沉淀成悬浮液中的细小沉淀。然后将沉淀的mRNA转移至常规流过滤系统中进行纯化。对于每个纯化步骤，使用0.66m²的Clarisolve 60HX深层过滤器(2x 0.33m²，过程规模模块CS60HX03F1-X)实现100克mRNA的纯化，过滤器上的mRNA负载为大约150g/m²。

对于每个纯化步骤，将100克CFTR mRNA(1)沉淀出来，(2)加载到过滤器系统中，在过滤器系统中沉淀的mRNA被过滤器捕获，(3)使用80％乙醇缓冲液在过滤器上洗涤，并且然后(4)溶解在滤液中，其包括mRNA通过过滤器系统的再循环。80％乙醇洗涤去除了mRNA中的所有残留盐，如通过滤液电导率为0.0mS/cm所证实，每克mRNA用大约3L 80％乙醇洗涤。

通过切换至水冲洗将mRNA溶解在滤液中，将其再循环大约60分钟以最大化回收率，此后以滤液形式回收mRNA。

对于使用上述常规流过滤纯化的100g批次CFTR mRNA，回收了97.9g纯化的mRNA的最终量(例如，在表8中的所有步骤中)。尤其是在这些高质量的量的所处理mRNA下，纯化的mRNA的这一97.9％的回收率是令人惊讶且出乎意料的。

通过多种度量评估纯化的mRNA的质量，所述多种度量包括通过银染凝胶测量残留的酶和蛋白质含量，通过毛细管凝胶电泳测量mRNA完整性，以及通过已知技术测量加帽百分比和聚A尾巴长度。那些结果显示在下面的表9中。

表9：纯化的100g CFTR mRNA的质量

总而言之，这些结果表明深层过滤器有效地捕获、洗涤和回收了100g批次的mRNA。mRNA的产率超过95％。使用本文所述的常规流过滤纯化过程制造的mRNA的完整性与预期和参考标准品质量一致，表明深层过滤器纯化对完整性没有不利影响。此外，它表明基于深层过滤器的纯化过程对加帽和加尾反应没有不利影响。帽百分比和尾巴长度与参考值一致。最终，在纯化的mRNA中未检测到残留的加帽或加尾酶条带，这表明深层过滤器可有效促进这些酶以及盐和短的异常终止RNA种类从100克批次的mRNA中去除。总之，本实施例表明，可以使用如本文所述的常规流过滤过程将100克批次的mRNA(例如CFTR mRNA)纯化至适合于临床使用的高纯度和完整性水平。

实施例5:MUT mRNA的常规流过滤纯化的评估

在本实验中，评估了使用深层过滤纯化编码甲基丙二酰-CoA变位酶蛋白(MUT)的信使RNA(mRNA)的常规流过滤。使用下面表10中所述的步骤制造15克MUT mRNA，其中使用Clarisolve 60HX深层过滤器进行两个常规流过滤步骤。将纯化的MUT mRNA的关键质量属性用于评估过程性能和最终药物物质概况。

表10：15g MUT mRNA批次制造过程

对于IVT纯化和C/T纯化步骤中的每一个步骤，mRNA加载过滤器描述于下面表11中。

表11：纯化步骤期间的mRNA加载

在每个纯化步骤中使用深层过滤器纯化mRNA涉及mRNA沉淀后的三个过程：(1)加载沉淀的mRNA，(2)洗涤捕获的mRNA和(3)从膜上洗脱mRNA。在下面进一步描述每个单独过程的结果。

(1)沉淀的mRNA的加载

首先将制造的mRNA(未加帽的和加帽的)以限定的比率在连续混合条件下持续所需量的时间而在GSCN/乙醇溶液中变性并沉淀，随后将沉淀的溶液泵送通过预处理的Clarisolve 60HX深层过滤器装置，以在过滤器膜上捕获沉淀的mRNA。以频繁的间隔收集滤液样品，并且未观察到沉淀的mRNA的损失。

(2)用80％乙醇洗涤以去除缓冲液和盐

对于IVT纯化和C/T纯化步骤中的每一个步骤，在加载沉淀的mRNA后，将过滤器系统用80％v/v乙醇溶液漂洗，以去除缓冲盐和其他过程残留酶。图17提供了如用80％v/v乙醇溶液的连续洗涤体积通过滤液电导率测量的残留盐的量度。在两个纯化步骤中去除残留盐的趋势是一致的。在大约2.5L/g的80％乙醇之后实现了0.0mS/cm的滤液电导率。在再循环之前，冲洗总共1.5L/g的80％乙醇。达到0.0mS/cm所需的乙醇冲洗体积与先前的小规模运行相当。这表明，这种80％乙醇的冲洗有效地去除了过滤器中的残留盐并沉淀出mRNA。

(3)mRNA的回收

对于IVT纯化和C/T纯化步骤中的每一个步骤，通过在37℃下再循环无RNase的水来进行从深层过滤器中回收mRNA，其中频繁测量滤液池的mRNA浓度以确定饱和点。在达到饱和水平后，将滤液池替换为新鲜的无RNase的水以洗脱剩余的mRNA。进行此步骤直至滤液池中的mRNA浓度可忽略不计。图18A和图18B显示了滤液中mRNA的回收率(以浓度表示)随着再循环时间的变化。

如图所示，再循环25分钟后，滤液mRNA浓度稳定。这表明在每次沉淀之后，沉淀的mRNA已成功地从深层过滤器中重新溶解并回收，进一步指示产物保留在深层过滤器介质中以及80％乙醇冲洗的有效性。

mRNA产率

如表10中所述的所有制造过程步骤中mRNA的总产率超过了95％，这是基于来自15g mRNA的IVT反应的mRNA的起始目标质量并且假设由于添加帽和3’尾巴在C/T反应之后的质量增加了10％。

分析结果通过多种度量评估纯化的mRNA的质量，所述多种度量包括通过毛细管凝胶电泳(CGE)测量mRNA完整性，通过已知技术测量加帽百分比和聚A尾巴长度。在包括如表10中所述的两个常规流过滤步骤的制造后评估MUT mRNA完整性和尾巴长度的电泳图显示在图19中。在两次沉淀(IVT和C/T)之后，深层过滤器材料的电泳图与预期一致。没有观察到明显的肩峰，从而表明深层过滤器过程不会对mRNA质量和完整性产生不利影响。涂片分析的结果显示在下面表12中。

表12：纯化的MUT mRNA药物物质的涂片分析

尾巴长度分析总结于表13中。构建体大小和尾巴长度与预期一致。

表13：MUT mRNA药物物质的尾巴长度分析

加帽测定的结果显示在表14中。帽百分比与预期一致。

表14：MUT mRNA药物物质的加帽效率

帽种类	百分比(％)
		未加帽	5
Cap 0	0
		Cap G	0
Cap 1	95

评估mRNA纯度和残留酶的银染分析显示在图20中。对于在1mg/mL和2mg/mL浓度下在C/T沉淀之后通过深层过滤纯化的材料(泳道3-6)未观察到残留酶条带，从而表明深层过滤器过程在去除残留酶方面的效率。

总的来说，在IVT和C/T反应之后深层过滤器有效地捕获、洗涤和回收mRNA，以产生高纯度的mRNA药物物质。这些纯化步骤的总体过程产率超过了95％。

通过基于深层过滤器的纯化过程制造的mRNA的完整性与预期和参考标准品一致，这表明深层过滤器纯化对完整性没有不利影响。另外，基于深层过滤器的纯化过程对加帽和加尾反应没有不利影响。帽百分比和尾巴长度在预期和分析规格范围内。此外，在沉淀步骤之后检测到残留酶条带，表明深层过滤器可有效促进对残留过程酶的去除，从而提高了mRNA的纯度。

等效物

本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。

Claims (10)

1.一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)从包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的溶液中沉淀mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；

(b)使包含所述沉淀的mRNA的所述悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mRNA被所述过滤器保留；

(c)溶解步骤(b)中被所述过滤器保留的所述沉淀的mRNA，从而允许纯化的mRNA通过所述过滤器；以及

(d)从步骤(c)中回收所述纯化的mRNA；

其中步骤(b)和(c)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的5’-加帽的步骤。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的3'-加尾的步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是聚合酶。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是加帽酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含盐。

9.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

(a)从包含来自制造所述mRNA的一种或多种污染物的溶液中沉淀mRNA，以提供包含沉淀的mRNA的悬浮液；

(b)通过使包含所述沉淀的mRNA的所述悬浮液经历基本上由常规流过滤的一个或多个步骤组成的纯化系统来纯化所述mRNA；并且

其中所述纯化的mRNA具有临床级纯度，无需进一步纯化。

10.一种纯化包含通过体外转录(IVT)合成制造的100gm或更多mRNA的组合物的方法，所述方法包括：

沉淀包含来自所述IVT合成的一种或多种污染物的IVT转录的mRNA以产生悬浮液；

使包含所述沉淀的mRNA和污染物的所述悬浮液经历通过过滤器进行的常规流过滤，其中所述沉淀的mRNA被所述过滤器保留；

从所述过滤器以溶液回收所述mRNA，从而纯化所述mRNA，

其中回收至少85％的所述mRNA，并且所回收的mRNA具有90％或更高的完整性并且基本上不含蛋白质污染物。