CN117624382B - 一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用。将根据绵羊β防御素2基因CDS设计的重组绵羊β防御素2基因整合到巴斯德毕赤酵母GS115基因组上，从而实现目的基因在毕赤酵母上的分泌表达。本发明通过毕赤酵母真核表达的重组绵羊β防御素2蛋白具有较强的抑菌效果，在开发新型替抗产品以及羊饲用抗菌肽中具有广泛应用前景。

Description

一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及羊重组抗菌肽，具体涉及重组绵羊β防御素2蛋白在毕赤酵母中的表达和抗菌活性验证。

背景技术

随着对抗生素的研究越来越广泛，已有60多种抗生素应用于畜牧业，在动物疫病的预防和治疗、提高饲料利用效率、促进畜禽快速生长等方面均发挥了重要作用。然而随着抗生素长期亚治疗剂量的添加和滥用，耐药菌产生、菌群失调、不良反应、药物残留等已严重影响了动物性食品的安全，危害了环境及人的健康，寻求绿色、高效的抗生素替代品成为了研究的重点。抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是自然界中广泛存在的多肽物质，作为机体先天免疫的关键组成部分，具有抗细菌、真菌、肿瘤、病毒等生物学功能。AMPs因不易产生耐药性、无残留等优点，成为抗生素替代品研究的热点之一。

对于反刍动物而言，瘤胃是营养发酵的重要器官，能够产生如短链脂肪酸和微生物蛋白质，为个体提供能量和蛋白质。研究发现，饲粮中添加AMPs(例如，PBD-m1和LUC-n)可以有效改善瘤胃发酵功能，使乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的浓度得到提高，同时通过改善瘤胃微生物群结构，使瘤胃发酵参数发生改变，提高了饲料利用率。此外，《SBD2对湖羊抗F17大肠杆菌感染的作用及其调控机制研究》的结果表明，β防御素2是反刍动物消化道(主要是肠道)抗感染的重要内源性成分。

目前蛋白表达一般选用原核表达系统，其优点在于表达周期短、表达量高，但也存在一些缺点：表达的蛋白没有经过修饰，无法保证具有天然蛋白的活性，所表达蛋白可用于抗体制备或检测，较少用来表达具有生物学活性的蛋白；无法对表达时间及表达水平进行调控，有些目的基因过量表达会导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难。而利用毕赤酵母这一真核宿主可以实现目的蛋白的可溶性表达并最大程度保留其生物活性，且只需简单除菌、冻干即可应用于生产。

尽管羊抗菌肽在大肠杆菌原核表达系统以及毕赤酵母真核表达系统中的表达有诸多研究，但是目前未见到绵羊β防御素2(SBD2)外源性表达的相关报道。中国专利CN101538582A中提出了鸭β-防御素2重组蛋白的表达方法，但受到反刍动物消化道生理环境、菌群影响，鸭β-防御素2重组蛋白并不能在投喂羊等反刍动物后发挥其抗菌活性。

另外，中国专利CN1699416A中提出了富含甘氨酸的重组蛋白(包括在天然抗菌肽序列末端添加1～5个AA的肽段)，但这类抗菌重组蛋白仅验证了在温和生理条件下的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白及其应用，经毕赤酵母表达的重组绵羊β防御素2蛋白具有在羊等反刍动物的消化道生理环境下发挥较强的抑菌效果的潜力。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种羊源耐酸重组抗菌肽，该耐酸重组抗菌肽包括重组绵羊β防御素2蛋白。

优选的，所述耐酸重组抗菌肽还包括与重组绵羊β防御素2蛋白融合表达的柔性接头肽段。

优选的，所述重组绵羊β防御素2蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列大小为64AA。

优选的，所述柔性接头肽段连接在重组绵羊β防御素2蛋白羧基端，柔性接头肽段的氨基酸序列为GGGGS。

优选的，所述耐酸重组抗菌肽还包括融合表达的His标签(例如，6×His)，His标签通过柔性接头肽段连接在重组绵羊β防御素2蛋白的羧基端(也就是说，与重组绵羊β防御素2蛋白融合表达的柔性接头肽段及His标签的氨基酸序列可以为GGGGSHHHHHH)。

上述羊源耐酸重组抗菌肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

采用基于毕赤酵母构建的表达系统，将所述耐酸重组抗菌肽进行真核表达。

优选的，所述制备方法具体包括以下步骤：

1)根据绵羊β防御素2基因获得对应的CDS，根据绵羊β防御素2基因的CDS与柔性接头肽段及His标签对应的核苷酸序列构建含有目的基因(即上述重组绵羊β防御素2蛋白的氨基酸序列所对应的核苷酸序列)的重组载体，利用该重组载体构建用于表达所述耐酸重组抗菌肽的毕赤酵母表达菌株，即所述耐酸重组抗菌肽可以采用如SEQ.ID.NO.3所示的氨基酸序列，氨基酸序列大小为75AA(为含有目的蛋白与His标签的氨基酸序列的融合序列)；

2)对所述毕赤酵母表达菌株连续发酵培养后分离去除菌体(即除菌)，得到含有所述耐酸重组抗菌肽的发酵液上清。

优选的，所述毕赤酵母表达菌株的构建中采用巴斯德毕赤酵母菌GS115株作为所述重组载体的真核宿主。

优选的，所述重组载体是通过将含有目的基因的核苷酸序列(例如，SEQ.ID.NO.2所示的与所述耐酸重组抗菌肽对应的基因序列)与诱导分泌型毕赤酵母表达载体(例如，pPIC9K)骨架连接所得。

优选的，所述毕赤酵母表达菌株是通过对含有所述重组载体的毕赤酵母转化子进行抗性压力筛选(例如，采用高浓度抗生素G418)所得。

一种抗菌添加剂，该添加剂含有上述羊源耐酸重组抗菌肽，所述添加剂的具体形式可以为上述毕赤酵母表达菌株的发酵液上清。

一种羊饲料，该饲料含有上述羊源耐酸重组抗菌肽，所述饲料可以通过将上述抗菌添加剂加入羊(例如，山羊、绵羊)日常饲粮或其他种类饲粮中制成。

上述羊源耐酸重组抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

优选的，所述耐酸重组抗菌肽对致病性大肠杆菌具有抑制作用。

优选的，所述耐酸重组抗菌肽的生物学活性验证包括对羊源致病菌进行牛津杯抑菌实验，即采用牛津杯法测定抑菌圈的大小，从而判定所述耐酸重组抗菌肽(或目的蛋白)的抑菌活性。

优选的，在进行牛津杯抑菌实验前，利用体外模拟羊皱胃胃酸环境(羊皱胃胃酸pH在1.05～1.32之间)处理所述耐酸重组抗菌肽。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据绵羊β防御素2进行抗菌重组蛋白表达设计，经毕赤酵母真核表达后通过活性检测发现，抗菌重组蛋白(实际指重组绵羊β防御素2蛋白)具有较强的抑菌效果，并且制备操作简单，方便进行制剂应用(例如，只需对发酵液上清除菌即可分离出高活性蛋白)。本发明获得的重组绵羊β防御素2蛋白在开发新型替抗产品以及羊饲用抗菌肽中具有广泛应用前景。

进一步的，本发明通过在重组绵羊β防御素2蛋白羧基端设计用于连接His标签的柔性接头肽段，不仅可以使得重组绵羊β防御素2蛋白更易被检测鉴定及后期纯化，而且经酸化处理条件下的抑菌实验结果证实，利用毕赤酵母表达系统(具体指上述毕赤酵母表达菌株)可以获得具备优异耐酸性能的重组绵羊β防御素2蛋白融合表达产物，从而可以作为一种外源性的耐酸抑菌制剂(例如，上述毕赤酵母表达菌株的发酵液上清)在反刍动物(例如，羊)饲料添加剂中应用。

附图说明

图1为含抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)基因的毕赤酵母真核表达质粒pPIC9K-SBD2双酶切鉴定图；泳道M：DL 10000DNA marker；泳道1：毕赤酵母真核表达质粒空载pPIC9K EcoR I和Not I双酶切鉴定结果；泳道2至4：毕赤酵母真核表达质粒pPIC9K-SBD2 EcoR I和Not I双酶切鉴定结果。

图2为高浓度抗生素(10mg/mL G418)YPD平板筛选高拷贝重组毕赤酵母GS115菌株；图左为转化真核表达质粒空载pPIC9K的毕赤酵母GS115抗性筛选结果；图右为转化真核表达质粒pPIC9K-SBD2的毕赤酵母GS115抗性筛选结果。

图3为10mg/mL G418压力筛选条件下整合有抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)基因的重组毕赤酵母菌株菌液PCR鉴定图谱；泳道M：DL 1000DNA marker；泳道1：阴性对照；泳道2：转入pPIC9K空载菌株对照。

图4为不同条件下重组毕赤酵母表达所得抗菌重组蛋白Western Blot鉴定图谱；A为重组毕赤酵母菌株不同诱导时间表达抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)结果；B为重组毕赤酵母菌株不同甲醇诱导浓度表达抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：空载对照；泳道2：未诱导对照上清；泳道3：2％甲醇浓度诱导24h上清；泳道4：2％甲醇浓度诱导48h上清；泳道5：2％甲醇浓度诱导72h上清；泳道6：2％甲醇浓度诱导96h上清；泳道7：0.5％甲醇浓度诱导96h上清；泳道8：1％甲醇浓度诱导96h上清；泳道9：2％甲醇浓度诱导96h上清；泳道10：3％甲醇浓度诱导96h上清。

图5为表达抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)的重组毕赤酵母经诱导后上清抑菌圈测定结果(发酵液上清，100μL/孔)；①：2％甲醇浓度诱导96h空载对照上清；②：96h未诱导对照上清；③：2％甲醇浓度诱导48h上清；④：2％甲醇浓度诱导96h上清。

图6为体外37℃、pH＝1.0酸化处理后验证表达抗菌重组蛋白(重组SBD2抗菌肽与His标签的融合蛋白)的重组毕赤酵母经诱导后上清抑菌效果(2％甲醇浓度诱导96h后发酵液上清，100μL/孔)；①：未经酸化处理；②：96h未诱导对照上清；③：酸化处理15min；④：酸化处理30min；⑤：酸化处理1h；⑥：酸化处理2h。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)羊源重组SBD2抗菌肽的毕赤酵母真核表达

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒及菌株

克隆质粒pUC57-SBD2由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，表达载体pPIC9K质粒、巴斯德毕赤酵母GS115菌株购自淼灵生物工程公司。

1.1.2试剂

磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、丙三醇、葡萄糖等购自国药集团化学试剂有限公司；醋酸锂(LiAc)、二硫苏糖醇(DTT)、生物素、遗传霉素、山梨醇、YNB培养基购自北京索莱宝科技股份有限公司；鼠源6×组氨酸(Histidine，His)标签单克隆抗体、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由擎科生物技术有限公司合成；蛋白Marker购自北京全式金生物技术公司；酵母提取物、胰化蛋白胨购自英国OXOID公司；工具酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA连接酶均购自Takara公司。

1.1.3试验仪器

电子天平ALC-1100.2，北京赛多利斯仪器系统有限公司；超净工作台YT-CJ-2ND，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；T100型PCR仪、电转仪，美国Bio-Rad公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；DYCZ-24DN垂直电泳仪，北京市六一仪器厂；ThermoMultiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司。

1.2方法

1.2.1酵母表达菌株构建

1.2.1.1SBD2基因的优化与重组SBD2抗菌肽基因克隆质粒的构建

根据NCBI上公布的基因序列信息，查找绵羊β防御素2(SBD2)基因(参见表1中NM_001198545.1)，将SBD2基因完整的CDS中对应于蛋白氨基酸序列的核苷酸序列(重组SBD2抗菌肽原始基因)与羧基端延伸肽段(G4S与6×His)对应核苷酸序列(GGAGGTGGTGGTTCTCATCACCATCATCATCAT)连接，并在连接后的序列的3′端添加终止密码子。之后根据毕赤酵母(P.pastoris)密码子的偏好性优化其中的原始基因及连入的6×His对应的核苷酸序列，将优化好的基因序列(参见表2)两端分别加上EcoR I与Not I酶切识别位点，送至擎科生物科技有限公司进行合成，将含有目的基因的合成产物整合到大肠杆菌克隆质粒pUC57上，构建克隆质粒pUC57-SBD2。

表1.绵羊β防御素2氨基酸序列表(SEQ.ID.NO.1)

表2.核苷酸序列表(SEQ.ID.NO.2)

1.2.1.2pPIC9K-SBD2重组质粒构建

pPIC9K质粒和克隆质粒pUC57-SBD2使用Takara快切酶(EcoR I和Not I)进行双酶切，酶切体系见表3。

表3.双酶切反应体系

酶切条件：37℃水浴1h。酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳仪条件：150V电压、15min，以DL 2000DNA Marker作为参照；用凝胶紫外成像系统进行曝光拍照记录。

电泳产物切胶、回收、经DNA纯化试剂盒纯化DNA产物，将上述抗菌重组蛋白基因的纯化产物和pPIC9K质粒酶切后形成的骨架进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态中，经氨苄抗性筛选获取阳性菌株，将按照下述方法验证正确的重组质粒命名为pPIC9K-SBD2，该重组质粒用于在转化毕赤酵母后通过诱导表达获得抗菌重组蛋白(参见表4)。

表4.氨基酸序列表(SEQ.ID.NO.3)

1.2.1.3重组质粒的鉴定

(1)重组质粒pPIC9K-SBD2的提取

挑取大小适中的单个大肠杆菌菌落，接种至5mL的LB培养基(含Amp 100g/mL)中，37℃、220r/min条件下培养12h。使用质粒提取试剂盒进行提取。

(2)重组质粒pPIC9K-SBD2酶切鉴定

将提取的重组质粒用EcoR I和Not I进行双酶切鉴定，酶切体系参照表1。酶切条件：37℃水浴中保温1h；将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)重组质粒pPIC9K-SBD2序列分析

将重组质粒送擎科生物科技有限公司进行测序，通过Snapgene软件将测序得到的序列与抗菌重组蛋白基因序列(表2)进行比对分析。

1.2.1.4毕赤酵母感受态的制备

从YPD平板上挑取一巴斯德毕赤酵母GS115单菌落，接种于5mL YPD液体培养基中，28℃、250r/min振荡培养过夜至OD600为4～6；取1mL接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、250r/min振荡培养至OD600为0.8；4000r/min离心收集菌体，用100mL预冷LiAc-DTT山梨醇溶液重悬菌体，静置30min，离心弃上清；加入25mL预冷的1M的山梨醇重悬菌体，离心弃上清，重复两次；用预冷1M山梨醇1mL重悬菌体，无菌分装100μL/管，-80℃保存备用。

1.2.1.5毕赤酵母的电击转化

(1)将构建好的重组质粒pPIC9K-SBD2用Sal I限制性内切酶线性化，胶回收线性化DNA后备用。

(2)取线性化DNA 15μg与80μL的新鲜毕赤酵母感受态菌体混匀，转至2mm型冰预冷的电转化杯中。

(3)将电转化杯冰浴5min。

(4)根据电转化仪提供的资料，以1.5kV、25μF、200Ω进行电击。

(5)电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL离心管中。

(6)将菌体悬液涂布于MD平板上，每300μL涂布一块平板。

(7)将涂布好的平板置于28℃培养，直至单菌落出现。

(8)逐一挑取MD平板上正常生长的转化子，点种至含终浓度10mg/mL G418的YPD平板，用来筛选高拷贝转化子。

1.2.1.6重组毕赤酵母菌液PCR鉴定

从含G418的YPD平板上挑取单菌落于试管(含G418的YPD培养基)中摇菌2天；取菌液1mL加入Eppendof管中，9000r/min室温离心4min，收集菌体；用索莱宝公司酵母菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，50μL TE(pH 8.0)溶解提取的基因组DNA，-20℃保存，备用。PCR鉴定引物及反应体系见表5和表6。

表5.鉴定引物

表6.PCR扩增反应体系

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；之后72℃再延伸10min，4℃保存。

取10μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。阳性重组酵母菌株基因送擎科进行序列测定。最后将鉴定正确的重组酵母菌株编号保存。

1.2.2抗菌重组蛋白的诱导表达

(1)挑选一整合有抗菌重组蛋白基因的重组毕赤酵母菌株单菌落，置于装有25mLBMGY培养基的100mL摇瓶中，于28℃、250rpm培养至OD600＝2～6(16～18h)。

(2)吸取1mL菌液到100mL BMGY培养基中，继续培养至OD600为4～6，4000r/min离心收集菌体，然后加入100mL BMMY培养基，连续培养四天，期间每隔24h取样并补充甲醇至浓度0％、0.5％、1％、2％或3％(其中0％指不诱导)，从而以不同浓度甲醇诱导抗菌重组蛋白基因的表达。

(3)分别取不同条件表达产物(具体取的是除菌后的发酵液上清)加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液进行制样处理，以鼠源His标签单克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体为二抗进行Western Blot分析。

2.结果与分析

2.1重组质粒pPIC9K-SBD2的鉴定

通过对构建好的重组质粒pPIC9K-SBD2进行双酶切鉴定，所得酶切后经电泳检测的结果如图1所示，结合质粒测序结果，表明重组粒质构建正确，抗菌重组蛋白基因对应条带大小为228bp。

2.2G418筛选整合有抗菌重组蛋白基因的重组毕赤酵母菌株

通过将MD平板长出的菌落逐一接种到含10mg/mL G418的YPD平板上，对高拷贝重组毕赤酵母菌株进行筛选，所得筛选结果如图2所示，结果表明高拷贝重组毕赤酵母菌株在高抗性筛选压力下仍具有较好的生长性能，在相同条件培养下，随着时间增加，阳性菌落逐渐变大。

2.3PCR鉴定重组毕赤酵母菌株

通过挑取阳性菌落进行扩大培养，随后对酵母菌基因组进行提取和菌液PCR鉴定，所得鉴定结果如图3所示(由于抗菌重组蛋白基因插入在毕赤酵母AOX基因组内，所以显示AOX基因片段对应500bp大小的条带为空载对照菌株，重组毕赤酵母菌株则显示含抗菌重组蛋白基因的片段的对应的728bp大小条带)。

2.4重组毕赤酵母表达产物检测

在诱导时间和甲醇浓度这两个表达条件进行优化的情况下，通过对鉴定为阳性的重组酵母菌株摇瓶表达，对表达产物进行Western Blot分析，所得结果如图4所示，可见在96h和2％甲醇浓度时抗菌重组蛋白(含融合表达的重组SBD2抗菌肽)的表达量最高。

(二)羊源重组SBD2抗菌肽的抑菌活性检测

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1实验菌株

实验菌株170#(O111)、200#(O8)为实验室保存的从腹泻羔羊(山羊)粪便中分离出的2株致病性大肠杆菌。

1.1.2试剂

羊源重组SBD2抗菌肽具体采用参照以上(一)中方法制备的抗菌重组蛋白(即未去除His标签)；其他试剂均为分析纯。

1.1.3试验仪器

生物安全柜(苏净安泰公司)；二氧化碳细胞恒温培养箱(Thermo Scientific，美国)；小型低温高速台式离心机(Eppendorf，德国)。

1.2试验方法

1.2.1利用表达产物考察体外抑菌活性

采用牛津杯法，以实验室前期从腹泻羔羊粪便中分离出的2株致病性大肠杆菌O8、0111为实验菌株，按下述步骤操作：

(1)复苏以上2株实验菌株的冻存菌，划线37℃培养过夜，挑取典型单菌落，接种至含3mL LB液体培养基的试管中，培养至OD600＝0.4～0.6(1OD＝3～5×10⁷个菌/mL)。调细菌数约10⁸CFU/mL，直接用菌悬液500μL涂布MH培养基平板。待菌液涂布均匀吸收完全后，把高压灭菌后的牛津杯放在平板上并轻轻按压。然后每孔内加入不同表达时间的发酵液上清100μL，同时取空载发酵液上清以及未诱导发酵液上清作为对照。置于37℃培养箱培养24h，观察抑菌效果。

1.2.2利用表达产物考察酸耐受性

(1)酸化处理组：将1mL发酵液上清用盐酸调pH为1.0；(2)正常组：发酵液上清不做酸化处理。同时设置未诱导发酵液上清作为对照。将各组发酵液上清放入37℃培养箱分别孵育2小时，酸化处理组在此期间按不同时间点取样，通过牛津杯法进行抑菌试验并分析酸性环境对抗菌肽抑菌效果的影响。

2.结果与分析

2.1体外抑菌活性检测结果

牛津杯抑菌检测结果(图5)显示，空载对照组、未诱导对照组对2株致病性大肠杆菌均无抑菌效果。而表达产物中因含有羊源重组SBD2抗菌肽，对2株致病性大肠杆菌均具有较好的抑菌效果。

2.2体外验证对酸耐受性结果

通过使用盐酸模拟胃酸环境(模拟羊皱胃环境)，即在调节发酵液上清的pH值并分别孵育不同时间之后，再进行抑菌效果分析，所得结果如图6所示，结果表明发酵液上清随处理时间的变化，抑菌活性未明显降低，提示表达产物中含有的羊源重组SBD2抗菌肽对胃酸有良好的耐受性，可经过皱胃到达肠道，并在肠道内继续发挥抑菌活性。

Claims (3)

1.一种抗菌添加剂，其特征在于：该添加剂含有如SEQ.ID.NO.3所示的耐酸重组抗菌肽。

2.一种羊饲料，其特征在于：该饲料含有如SEQ.ID.NO.3所示的耐酸重组抗菌肽。

3.一种如SEQ.ID.NO.3所示的耐酸重组抗菌肽在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述菌为致病性大肠杆菌。