CN110257314B

CN110257314B - 一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用

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Publication number: CN110257314B
Application number: CN201910589843.2A
Authority: CN
Inventors: 王喜亮; 李毕平; 周玉岩; 李越; 石德时; 金秀娥; 金卉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-07-02
Also published as: CN110257314A

Abstract

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，涉及一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用。通过同源重组将蚕源抗菌肽Cecropin B基因整合到枯草芽孢杆菌WB800基因组中，构建出能稳定表达Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌B.s‑CB。将本发明制备的重组枯草芽孢杆菌B.s‑CB应用于实验仔鼠，结果表明，该重组枯草芽孢杆菌B.s‑CB可以改善仔鼠的肠道功能，提高饲料转化率，增强机体免疫力，最终提高仔鼠的生产性能，为饲料添加剂的研发生产提供技术支撑。

Description

一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物基因工程技术领域，尤其涉及一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用。

背景技术

抗菌肽天蚕素B(Cecropin B,CB)是从惜古比天蚕中获得的第一个天然昆虫抗菌肽(Anti-bacterial peptides，ABP)(Dan H et al 1980)，仅含有35个氨基酸，分子大小在4kD左右。CB在疏水条件下易形成α-螺旋，其电荷在8.2-9.6之间，具有热稳定性强，水溶性好等诸多优点。研究表明，在已知的众多天蚕素家族中，CB对细菌、病毒、真菌、癌细胞等均有明显的抗菌活性(Suttmann H et al 2008，Tajui Chia et al 2010)。此外，抗菌肽CB在畜牧养殖业中有着较大的应用价值，王铁东等人在奶牛乳腺组织中成功实现了CB的高效表达，且表达出的蛋白对奶牛乳房炎的发生具有良好的防治作用(王铁东等2009)。张双将天蚕素B、高蛋氨酸以及赖氨酸串联至表达载体pHT43中，转化纳豆芽孢杆菌，获得高效表达天蚕素B的重组菌株，且该重组菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显优于野生株(张双2015)。

益生菌作为饲添抗生素的最佳替代品之一，能够适当调节动物肠道的菌群平衡，改善宿主的肠道功能，促进肠道对饲料的营养吸收，提高动物机体的生产性能(Casey etal 2007)。然而，作为饲料添加剂的大多益生菌存在着抗逆性差、益生效果单一以及见效慢等缺陷，限制了其在畜牧养殖生产中的广泛应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为食品安全级别的原核表达宿主，具备了E.coli以及其他原核表达系统没有的一些优良特性：(1)遗传背景清楚；(2)作为外源蛋白的表达宿主，能够将外源蛋白直接分泌到培养基上清中，简化蛋白纯化和回收的工艺流程；(3)培养环境以及发酵条件相对简单；(4)是美国食品与药物管理局(FDA)和中华人民共和国农业部批准使用的食品级安全菌株；(5)具有较强的抗逆特性；(6)无明显的密码子偏好性。近年来，利用枯草芽孢杆菌的表达系统表达外源蛋白已成为热点，但由于蛋白酶的分泌限制其外源蛋白的表达量，而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800缺失了8种胞外蛋白酶，减少外源蛋白被降解的风险以提高蛋白表达量。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用。该重组枯草芽孢杆菌B.s-CB既发挥了益生菌的益生作用又发挥了抗菌肽的抗菌作用。将本发明制备的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB应用于仔鼠，改善了仔鼠的肠道功能，提高饲料转化率，增强机体免疫力，最终提高仔鼠的生产性能，为饲料添加剂的研发生产提供技术支撑。

本发明是这样实现的，一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌，名称为枯草芽孢杆菌B.s-CB(Bacillus subtilis B.s-CB)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019368。

一种如上述的产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

S1：分别针对P43基因和SacB基因设计引物，并扩增获得相应基因片段；

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接；

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建；

S4：针对抗菌肽Cecropin B基因设计引物，并扩增获得目标片段；

S5：构建PDG-P43-SacB-CB重组表达载体；

S6：将步骤S5中获得的重组质粒转化至宿主菌。

进一步，步骤S1中针对P43基因设计的引物序列见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

进一步，步骤S1中针对SacB基因设计的引物序列见SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

进一步，步骤S3中所用质粒为PDG1730。

进一步，步骤S4中针对Cecropin B基因设计引物序列见SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9。

进一步，步骤S6中宿主菌为野生型枯草芽孢杆菌WB800。

进一步，步骤S6中将重组表达载体pDG-P43-SacB-CB以枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因作为同源臂，将片段P43-SacB-CB整合至枯草芽孢杆菌基因组中。

如上述的产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌在生产抗菌肽Cecropin B中的应用。

如上述的产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌在益生菌制剂或动物饲料制备中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明运用基因工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产抗菌肽CB的有效途径，该重组枯草芽孢杆菌B.s-CB既发挥了益生菌的益生作用又发挥了抗菌肽的抗菌作用，打破了CB提取纯化困难的瓶颈，为饲料添加剂无抗化提供技术支撑，为养殖业的健康、持续发展提供技术保障，为实现CB的工业化生产奠定了坚实的基础。

本发明将蚕源抗菌肽天蚕素B基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中，同时敲除枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因Amy E，构建出能够稳定表达CB的基因工程菌，不会出现质粒随着菌株的传代次数增加而丢失的现象。采用原核表达系统成功实现真核来源的抗菌肽天蚕素B(CB)异源高效活性表达，CB通过发酵方式直接分泌到发酵上清中，且本发明构建的枯草芽孢杆菌B.s-CB菌株产生的CB对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和大肠杆菌O157有良好的抑菌活性。

本发明的枯草芽孢杆菌B.s-CB基因工程菌株为“食品级”工业菌株，易培养，发酵时间短，生产强度大，为实现CB的工业化生产奠定了基础。本发明的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB能显著修复断奶仔鼠的肠道损伤，有效缓解仔鼠的应激，改善肠道形态结构、调肠道菌群平衡、增强免疫功能的作用，最终提高仔鼠的生长性能。

附图说明

图1是本发明从合成的P43载体PJET1.2上获得的P43片段的电泳图，泳道M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：P43；泳道2：阴性对照；

图2是本发明从枯草芽孢杆菌中获得的信号肽SacB片段的电泳图，泳道M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：SacB；泳道2：阴性对照；

图3是本发明构建PDG-P43-SacB整合载体示意图；

图4是本发明利用重叠PCR方法获得的P43+SacB片段的电泳图，泳道1为阴性对照；泳道2：P43+SacB；

图5是本发明从合成的CB载体pUC57上获取CB片段电泳图，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照；泳道2-3：CB基因；

图6是本发明构建的整合表达载体pDG-P43-SacB双酶切电泳结果，其中M:DL15000DNA分子量标准，泳道1-2：双酶切电泳结果；

图7是本发明构建的CB双交换枯草芽孢杆菌中CB基因电泳结果，其中M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照；泳道2-8：CB基因；

图8是本发明获得的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB中淀粉酶基因(Amy E)电泳结果，其中M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照；泳道2：阳性对照；泳道3-8：Amy E基因；

图9是本发明获得的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB中壮观基因(Spec)电泳结果，其中M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照；泳道2：Spec阳性对照；泳道3-8：Spec基因；

图10是本发明用0.2％淀粉平板通过碘液染色法对重组枯草芽孢杆菌B.s-CB淀粉酶基因的缺失株进行鉴定，左边图为：原始枯草芽孢杆菌WB800；右边图为：重组枯草芽孢杆菌B.s-CB；

图11是用Western-blot检测本发明所构建的重组菌株B.s-CB经发酵培养后，发酵上清液中含有的CB蛋白；

图12是本发明构建的重组菌株B.s-CB发酵的上清液对致病菌大肠杆菌O139、O157、K88、K99，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果；

图13是本发明获得的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB的生长曲线；

图14是本发明对小鼠分别灌胃15d、21d后，测定各组小鼠平均日增重；

图15是本发明对小鼠灌胃15d后，测定各组小鼠十二指肠(A)和空肠(B)绒毛结构形态；

图16是本发明对小鼠灌胃15d(A)、21d(B)后，测定各组小鼠十二指肠、空肠绒毛高度分析；

图17是本发明对小鼠灌胃15d(A)、21d(B)后，qRT-PCR测定各组小鼠大肠中大肠杆菌和乳酸杆菌的含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过对枯草芽孢杆菌WB800进行基因工程技术的改造，得到一株产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用，该菌株于2019年5月17日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，名称为枯草芽孢杆菌B.s-CB(Bacillus subtilis B.s-CB)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019368。其构建方法及应用具体如下各实施例所示。

实施例1产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌的构建

本实施例中，起始质粒PDG1730和野生型枯草芽孢杆菌WB800，由华中农业大学生命科技学院孙明教授惠赠，大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。

S1：分别针对P43基因和SacB基因设计引物，并扩增获得相应基因片段。

根据NCBI中P43基因(启动子)片段序列(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与信号肽SacB基因片段序列(登陆号NCBI-Gene ID:MH614588.1)，设计引物如下：

正向引物P43-F:CGggatccgagctcagctttattgagtgg，见SEQ ID NO:1；

反向引物P43-R:GCAAACTTTTTGATGTTCATgtgtacattcctctcttacc，见SEQ ID NO:2；

正向引物SacB-F:ggtaagagaggaatgtacacATGAACATCAAAAAGTTTGC，见SEQ ID NO:3；

反向引物SacB-R:aacccaagcttCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCT，见SEQ ID NO:4。

P43基因片段由天一辉远生物科技有限公司合成，并克隆在PJET1.2载体(公知公用)上。

P43基因片段的制备：用正向引物P43-F和反向引物P43-R，从含有P43基因片段的载体PJET1.2中扩得。采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F/P43-R引物各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃2min预变性；98℃10s,，60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸至7min。将所得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，所得的片段大小与预期相符，为337个碱基对，见图1，该片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:5。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

信号肽SacB基因片段制备：用正向引物SacB-F和反向引物SacB-R，从野生型枯草芽孢杆菌WB800基因组中扩得。反应程序：采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入正向引物SacB-F/反向引物SacB-R各1.5μL、基因模板2μL、去离子水20μL，混匀后置于PCR仪上，按如下程序运行：94℃2min预变性，98℃10s，60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸7min。将PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳,所得的片段大小与预期相符，为87个碱基对，见图2，该片段的核苷酸序列见SEQ ID NO:6。将剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接。

使用常用重叠PCR方法(陈国梁等，重叠PCR一步法对三种淀粉合成酶融合基因的构建，2010)将P43基因(启动子)片段与信号肽SacB基因片段相连，然后将PDG1730(登陆号NCBI-Gene ID:EF473728.1)与P43+SacB经BamHI和HindIII酶切后连接，构建得到整合载体PDG-P43-SacB，见图3。

P43+SacB基因片段的制备：用上述纯化后的P43和SacB基因片段为模板，采用2×PrimeSTAR Max Premix 25μL，加入P43-F和SacB-R引物各1.5μL，基因模板P43和SacB各1μL，去离子水20μL，混匀后置于PCR仪，按如下程序运行：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃10s，32个循环后72℃延伸7min。将产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，片段大小与预期相符，为424个碱基对，见图4。剩余PCR产物纯化后置-20℃保存待用。

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建

(1)质粒PDG1730的酶切

向1μg的质粒PDG1730中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(2)P43+SacB基因片段的酶切

向1μg的P43+SacB基因片段中分别加入1.5μL限制性内切酶BamHI和HindIII，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg基因片段。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(3)PDG-P43-SacB重组质粒的构建

将步骤(1)和(2)中保存的片段按以下配比加连接酶进行连接处理：PDG1730 1μL，P43+SacB基因片段5μL，T4DNA连接酶1μL，Buffer 2μL，去离子水11μL。22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，用含壮观霉素(100μg/mL)的抗性平板筛选，挑取单菌落进行新的PCR验证，反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，P43-F和SacB-R各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃30s，32个循环后72℃延伸7min。对获得的阳性重组质粒PDG-P43-SacB进行测序，从测序结果正确的菌落中提取质粒，用于下一步试验。

S4：针对CB基因设计引物，并扩增获得目标片段

本实施例中涉及到的CB基因序列见SEQ ID NO:7，针对该序列设计引物如下：

CB-F:CGCAAGCTTATGAAGTGGAAGGTTTTCA，见SEQ ID NO:8；

CB-R:CGGGATTCTTAATGGTGATGATGGTGATGAAGT，见SEQ ID NO:9；

由天一辉远公司合成CB基因，并插入载体PUC57中(公知公用)，用正向引物CB-F和反向引物CB-R从载体PUC57中扩得CB基因。具体步骤为：采用2×PrimeSTAR Max Premix25μL，加入CB-F/R引物各1.5μL、基因模板cDNA2μL、水20μL，混匀后置于PCR仪，按如下程序：94℃5min预变性，94℃30s,60℃30s,72℃10s，32个循环后72℃延伸7min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，片段大小与预期相符，为147个碱基对，见图5。

S5：重组pDG-P43-SacB-CB表达载体的构建

(1)质粒pDG-P43-SacB的酶切

向1μg的质粒中分别加入1.5μL限制性内切酶Hind III和EcoR I，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg质粒。酶切产物电泳结果如图6。

(2)CB基因片段的酶切

向1μg的CB基因片段中分别加入1.5μL限制性内切酶Hind III和EcoR I，置于37℃恒温培养箱中1h进行双酶切处理，酶切2μg基因片段。将酶切产物纯化后置-20℃保存待用。

(3)重组pDG1730-P43-SacB-CB表达载体的构建

将步骤(1)和步骤(2)中保存的片段按照以下配比加连接酶进行连接处理：pDG-P43-SacB1μL；CB基因片段5μL；T4DNA连接酶1μL；Buffer 2μL；水11μL。22℃连接1h，转化DH5α。采用本领域通用方法将感受态细胞用壮观霉素进行筛选，挑取单菌落进行PCR验证，阳性重组质粒pDG-P43-SacB-CB进行测序，挑选测序结果正确的菌落提取质粒，用于下一步试验。本实施例中采用本领域标准化学转化法转化至感受态细胞，以及公知通用的抗性筛选方法进行PCR验证，并送至三方测序，详细实验方案在此不再赘述。

S6：将步骤S5中获得的重组质粒转化至宿主菌。

该重组表达载体pDG-P43-SacB-CB以枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因作为同源臂，将片段P43-SacB-CB整合至枯草芽孢杆菌基因组中。

将上述重组质粒PDG-P43-SacB-CB转化至野生型枯草芽孢杆菌WB800中，枯草芽孢杆菌感受态细胞制备遵循Anagnostopoulos和Spizizen在1961描述的经典营养降档法进行(Anagnostopoulos C.,et al.,1961，Requirements for transformation in Bacillussubtilis)。重组克隆子B.s-CB经壮观基因Spec(反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，Spec-F:gaacaaggatacattcctcagaag，见SEQ ID NO:10和Spec-R:tggtatgattttacccgtgtcc，见SEQ ID NO:11各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃20s，32个循环后72℃延伸7min)、缺失的淀粉酶基因AmyE(反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix10μL，AmyE-F:ggttcttagacagggcattgaatga，见SEQ ID NO:12和AmyE-R:acatcagatgcatagtgggagata，见SEQ ID NO:13各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃20s，32个循环后72℃延伸7min)以及天蚕素Cecropin B基因(反应体系：2×PrimeSTAR Max Premix 10μL，pGS-F/R各1μL，去离子水8μL；反应程序：94℃2min预变性；98℃10s,60℃5s，72℃1min，32个循环后72℃延伸7min)PCR验证，电泳结果如图7-图9所示。用淀粉平板通过碘液染色法验证阳性克隆子的淀粉酶基因缺失，结果如图10所示。

实施例2利用基因重组枯草芽孢杆菌分泌表达天蚕素B

将验证正确的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB菌株进行发酵。具体步骤为：挑取单克隆接种于5mL的含有Spc抗性的LB液体培养基中，37℃、200r/min活化14h，OD值达到0.6-0.8时。按体积比为1％的接种量接种在50mL LB培养基中，37℃、200r/min培养24h，取重组枯草芽孢杆菌的发酵液与对照菌(野生型枯草芽孢杆菌WB800)的发酵液进行Western-blot检测。

Western blot步骤：

1.使用小分子蛋白胶试剂盒(索莱宝)，按照说明书配制分离胶、夹层胶、浓缩胶；

2.蛋白上样：用移液器将制备好的重组枯草芽孢杆菌的发酵液与对照菌(野生型枯草芽孢杆菌WB800)的发酵液样品加至样品孔的底部，避免带入气泡；

3.30V电泳1h后，然后调节电压为100V电泳至结束；

4.电转：当溴酚蓝指示的电泳条带迁移至距分离胶底部约1cm处，关闭电源，将含预测目的条带的凝胶放入1×电转缓冲液中；

5.转膜(Transfer)：使用Bio-Rad的标准湿式转膜方式，电流150mA，转膜时间为1h；

6.封闭(Blocking)：转膜完毕后，用TBST洗去膜上的转膜液，将PVDF膜放入5％脱脂牛奶中室温封闭1h；

7.一抗孵育(Primary antibody incubation)：用TBST按1：5000稀释Cecropin B抗体(鼠源)。用TBST洗去蛋白膜上的封闭液；立即加入稀释好的Cecropin B抗体，室温在侧摆摇床上30r/min孵育1h；

16.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)：用TBST洗去PVDF膜上的一抗，加入稀释好的羊抗鼠IgG(TBST按1:1000稀释)，室温在侧摆摇床30r/min缓慢摇动孵育1h。用TBST洗去PVDF膜上的二抗，使用化学发光系统检测CB的表达量，结果如图11所示，在4.6kD处有明显蛋白条带，与预测蛋白大小相符，说明目的蛋白CB成功表达。

实施例3重组基因工程菌株抑菌活性测定

将枯草芽孢杆菌B.s-CB按比例接种在发酵培养基(配方同前)中发酵培养24h，以大肠杆菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99，金黄色葡萄球菌，沙门氏杆菌为指示菌(10⁷CFU/mL)，分别吸取0.1mL均匀涂布于LB固体平板(90mm×20mm)上，(6个平板依次为大肠杆菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。平板上A为重组菌发酵液上清，B为野生型枯草芽孢杆菌WB800发酵液上清，C为天蚕素B的商品化标准品)；将牛津杯(内径Φmm×10mm)小心的放置在涂有指示菌的平板上，每个平板放置3个牛津杯，调整好各牛津杯间的距离，确保牛津杯与平板培养基无空隙的接触，然后依次分别吸取200μl枯草芽孢杆菌B.s-CB发酵液、野生型枯草芽孢杆菌WB800发酵液上清及CB标准品(50μg/mL)于牛津杯中，在4℃冰箱扩散4-8h后，小心转移至37℃恒温箱中培养近12-15h，观测并测量抑菌圈的直径大小，枯草芽孢杆菌B.s-CB的抑菌结果如图12所示。结果表明：枯草芽孢杆菌B.s-CB对大肠杆菌O157、大肠杆菌K88和大肠杆菌K99有较好的抑菌活性，抑菌群直径大小分别为10±1.15mm、12±0.58mm、14±1.00mm，而野生型枯草芽孢杆菌WB800对指示菌无明显抑菌活性。

实施例4枯草芽孢杆菌B.s-CB菌株的生物学特性研究

(1)生长曲线的测定

为了验证外源的重组质粒对原始枯草芽孢杆菌WB800的整体生长水平是否有影响，将活化好的枯草芽孢杆菌B.s-CB及野生型枯草芽孢杆菌WB800按1％体积接种量接入LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养8h，制备种子液。用LB调节种子液OD值到1.0，按1％的接种量接种到3瓶50mL的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养，每隔2h取样，将菌液倍比稀释到合适的梯度，通过平板倾注法测定活菌数以研究其生长状况；以时间为横坐标，细菌数的对数值为纵坐标绘制其生长曲线。结果如图13所示，结果表明重组外源质粒的转入及淀粉酶基因的成功敲除对枯草芽孢杆菌WB800的生长性能无影响。

(2)抗逆性试验

芽胞悬液的制备:将重组菌株B.S-CB按1％比例接种于液体LB培养基中，在37℃200r/min摇床中培养24h或更久时间后，用革兰氏染色法镜检，当镜检芽胞率达到85％以上，取菌液置于70℃水浴锅中水浴5min，4℃8000r/min冷冻离心10min收集芽胞，弃去上清，重悬于PBS缓冲液中。

枯草芽孢杆菌B.s-CB耐高温试验。将菌液放入60℃、70℃、80℃、90℃水浴锅中热处理0min、5min、10min后，将菌液进行倍比稀释至合适的梯度，通过平板倾注法测定活菌数，37℃设为对照。

枯草芽孢杆菌B.s-CB耐胃酸试验。模拟胃液制备：将胃蛋白酶溶解在生理盐水中，使其终浓度为3g/L，将pH调至2.0和2.5，过滤除菌。取0.5mL芽胞悬液加入到4.5mL模拟胃液中，迅速混匀，置于37℃培养箱静置培养0h、2h、4h后，将菌液进行倍比稀释至合适的梯度，通过平板倾注法测定活菌数，等量芽胞悬液置于无菌生理盐水(pH为6.4)中作对照。

枯草芽孢杆菌B.s-CB耐胆盐试验。取0.5mL芽胞悬液加入到4.5mL 0.3％模拟胆盐中，迅速混匀，置于37℃培养箱静置培养0h，24h后，将菌液进行倍比稀释至合适的梯度，通过平板倾注法测定活菌数，等量芽胞悬液置于无菌生理盐水中作对照。

表1重组枯草芽孢杆菌B.s-CB对高温的耐受性

表2重组枯草芽孢杆菌B.s-CB对胃酸的耐受性

表3重组枯草芽孢杆菌B.s-CB对胆盐的耐受性

耐高温结果、耐胃酸结果、耐胆盐结果见表1、表2和表3，由上述结果表明本发明的基因工程菌B.s-CB具有较强的抗逆性，能够在畜禽的胃肠道环境中存活。

实施例5枯草芽孢杆菌B.s-CB对断奶仔鼠生长性能的影响及肠道修复作用

为了验证本发明重组菌株B.s-CB修复动物受损肠道的能力，将枯草芽孢杆菌B.s-CB作为益生菌制剂(B.s-CB在摇床中以37℃，200r/min培养12h的发酵菌悬液)饲喂肠道受损的断奶仔鼠。

1.试验分组

动物试验选取144只3周龄，体重相近的断奶仔鼠分为8个组，每组3个重复，试验期为21d，其中基础日粮为华中农业大学动物实验中心提供，如常规仔鼠基础日粮相同，具体试验分组处理见表4。

表4饲喂试验分组处理

注：野生型枯草芽胞杆菌WB800和B.s-CB约为8×10 ⁸CFU/mL；K88约为5×10 ⁹CFU/mL。

2.试验过程

将所有小鼠饲养在温度受控的环境中(23±2℃)，光照12h，以动物实验中心提供的标准小鼠饲料喂养，采用自由采食和饮水方式。每组小鼠每天上午9：00通过无菌灌胃针按照表1进行灌胃一次，连续灌胃21d。在整个实验过程中监测仔鼠的腹泻，行为异常或死亡现象。

3.测定指标

(1)试验小鼠一般体态特征观察

试验期间1-10d各组小鼠呼吸平稳，其它体征如行为、精神状态、皮毛光泽等没有异常，未出现中毒和死亡现象。第11d用K88进行灌胃，致小鼠腹泻率达到80％以上，但未出现中毒和死亡现象。

(2)平均日增重

本试验结果表明：在1-15d，重组菌B.s-CB益生菌组、预防组的小鼠平均日增重与对照组相比差异均极显著(p＜0.01)；在15-21d，重组菌B.s-CB益生菌组、治疗组的小鼠平均日增重与对照组相比差异显著。说明重组枯草芽孢杆菌B.s-CB对小鼠具有促生长的作用且效果优于野生型枯草芽胞杆菌WB800，结果如图14所示。

(3)十二指肠绒毛与隐窝形态学观察

试验第15d、21d时，将采血后的小鼠解剖，快速剪下每组小鼠的十二指肠、空肠、回肠组织约2cm直接放入固定液(4％甲醛溶液)过夜→取材→水洗30min→脱水(70％乙醇3h、80％过夜、90％乙醇2h、95％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h、100％乙醇1h)→水杨酸甲酯透明过夜→透蜡→包埋→制作蜡块(S.Ashraf et al 2013)。HE染色，肠道结构形态见图15。分析各肠道绒毛高度可知(如图16所示)，第21d重组B.s-CB益生菌组、治疗组十二指肠、空肠绒毛高度和宽度明显优于对照组，且绒毛排列整齐。故本发明重组枯草芽孢杆菌B.s-CB能够防止炎症对肠绒毛的损伤，促进肠绒毛发育。

(4)重组菌株对BALB/c小鼠肠道大肠杆菌、乳酸杆菌菌群数量的影响

将大肠杆菌(E.coli-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT，见SEQ ID NO:14；E.coli-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC，见SEQ ID NO:15)、乳酸杆菌(Lac-F:GCAGCAGTAGGGAATCTTCCA,Lac-R:GCATTYCACCGCTACACATG；见SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)进行PCR扩增。反应体系：模板2μL，2×PCR Mix 25μL，E.coli-F/R各1μL，加去离子水补足至50μL；反应程序：95℃5min预变性，95℃30s,55℃30s,72℃30s，32个循环后72℃延伸7min。将扩增产物连接到pMD18T载体上，转化DH5α，挑取单菌落进行PCR鉴定。反应体系：模板1μL，2×PCR Mix 10μL，E.coli-F/R各1μL，加去离子水补足至20μL；反应程序：95℃5min预变性，95℃30s,55℃30s,72℃30s，32个循环后72℃延伸7min。将扩增产物送至三方测序，将获得的序列通过NCBI的Blast软件进行同源序列比对，确定标准菌为大肠杆菌和乳酸杆菌。将大肠杆菌和乳酸杆菌扩大培养，提取质粒，测定其浓度并调整为50μg/mL，OD为0.685。根据质粒拷贝数计算公式计算该质粒为标准品的核酸片段浓度，大肠杆菌K88的拷贝数为6.82×10¹³copies/g，乳酸杆菌拷贝数为9.52×10¹³copies/g。分别对其进行连续稀释10个浓度梯度。使拷贝数在10⁹-10³copies/g之间。定量检测大肠杆菌和乳酸杆菌数量的qRT-PCR反应体系为：SYBR PremixEx Taq II 10μL、E.coli-F/R引物(10μM)各0.4μL、基因模板2μL、加水补足20μL，反应程序按照95℃30s预变性，95℃5s,55℃20s,72℃30s，40个循环后72℃延伸30s；构建绝对定量扩增曲线。得到乳酸杆菌标准曲线为：Y＝3.257X+2.9354，R²为0.9904；大肠杆菌标准曲线为：Y＝3.866X+3.007，R²为0.9936。提取小鼠肠道内容物的基因组后，按制备标准曲线相同的反应体系和反应条件进行qRT-PCR反应，结果如图17所示，说明本发明的枯草芽孢杆菌B.s-CB能促进乳酸杆菌在肠道中生长，抑制大肠杆菌的增殖。

(5)血清指标测定

血清指标包括促炎症因子白细胞介素-1(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白细胞介素-17(1L-17A)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、抗炎症因子白细胞介素-10(IL-10)。试验第15天和21天时，各组随机抽取9只小鼠，进行眼眶采血。将采取的血液迅速装于真空促凝管中，倾斜静置于37℃恒温箱1h后，4℃放置2h，4℃3000r/min离心15min；吸取上清液，置于-20℃保存，用相应超敏电化学发光试剂盒(MESO SCALE DISCOVERY)按照说明书操作对多个细胞因子指标进行测定。

结果显示(见表5)，与野生型枯草芽孢杆菌WB800预防组、治疗组相比，本发明的枯草芽孢杆菌B.s-CB预防组、治疗组在第15天时，抗炎症因子IL-10表达量升高且促炎症因子IL-1、IL-1β、IFN-γ表达量降低。在第21天时，由于小鼠的自我修复作用，炎症因子差异不明显。说明本发明的枯草芽孢杆菌B.s-CB对肠道损伤引发的炎症因子升高具有较好的抑制作用。

表5各组小鼠第15天血清炎症因子水平

注：表中数据以平均值±标准差表示；同列数据之间，未标肩标者表示差异不显著(P>0.05)，肩标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标无相同字母表示差异显著(P<0.05)。

将本发明产抗菌肽天蚕素B的重组枯草芽孢杆菌B.s-CB添加于饲料中，通过仔鼠的肠道结构形态、绒毛高度、血清指标等综合分析，验证了本发明菌株具有较好的修复肠绒毛损伤功能，改善动物肠道形态结构、调肠道菌群平衡、增强免疫功能的作用，能提高BALB/c小鼠的生长性能。所以本发明的菌株有望作为一种饲料添加剂，为绿色养殖的推广打下坚实的基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(P43-F)

<400> 1

cgggatccga gctcagcttt attgagtgg 29

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(P43-R)

<400> 2

gcaaactttt tgatgttcat gtgtacattc ctctcttacc 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(SacB-F)

<400> 3

ggtaagagag gaatgtacac atgaacatca aaaagtttgc 40

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(SacB-R)

<400> 4

aacccaagct tcgcaaacgc ttgagttgcg cct 33

<210> 5

<211> 337

<212> DNA

<213> P43(P43)

<400> 5

gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat gttttcgctt 60

gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 120

cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttac cgtgatttcg 180

tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 240

attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 300

atagcggtac cattataggt aagagaggaa tgtacac 337

<210> 6

<211> 87

<212> DNA

<213> SacB(SacB)

<400> 6

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc gtttgcg 87

<210> 7

<211> 147

<212> DNA

<213> CB(CB)

<400> 7

cccaagctta tgaagtggaa ggttttcaag aagattgaaa agatgggaag gaatattagg 60

aatggaattg ttaaggcagg accagcaatt gcagttcttg gagaagcaaa ggcacttcat 120

caccatcatc accattaaga attcccg 147

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(CB-F)

<400> 8

cgcaagctta tgaagtggaa ggttttca 28

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(CB-R)

<400> 9

cgggattctt aatggtgatg atggtgatga agt 33

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Spec-F)

<400> 10

gaacaaggat acattcctca gaag 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Spec-R)

<400> 11

tggtatgatt ttacccgtgt cc 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(AmyE-F)

<400> 12

ggttcttaga cagggcattg aatga 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(AmyE-R)

<400> 13

acatcagatg catagtggga gata 24

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(E.coli-F)

<400> 14

cctacgggag gcagcagt 18

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(E.coli-R)

<400> 15

cgtttacggc gtggactac 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Lac-F)

<400> 16

gcagcagtag ggaatcttcc a 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Lac-R)

<400> 17

gcattycacc gctacacatg 20

Claims

1.一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2019368，所述重组枯草芽孢杆菌的制备方法包括以下步骤：

S2：P43基因片段与SacB基因片段连接；

S3：PDG-P43-SacB重组质粒的构建；所用质粒为PDG1730；

S5：构建PDG-P43-SacB-CB重组表达载体；

S6：将重组表达载体pDG-P43-SacB-CB以枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因作为同源臂，将片段P43-SacB-CB整合至枯草芽孢杆菌基因组中。

2.如权利要求1所述的产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌在生产抗菌肽Cecropin B中的应用。

3.如权利要求1所述的产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌在益生菌制剂或动物饲料制备中的应用。