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CN107474142A - 促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用 - Google Patents

促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用 Download PDF

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CN107474142A CN201710786984.4A CN201710786984A CN107474142A CN 107474142 A CN107474142 A CN 107474142A CN 201710786984 A CN201710786984 A CN 201710786984A CN 107474142 A CN107474142 A CN 107474142A
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Abstract

本发明公开了促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用。该多肽是SPUspmut或SPUspmut‑leiss：所述SPUspmut的氨基酸序列为序列表中序列4的第1‑27位氨基酸残基的多肽；所述SPUspmut‑leiss的氨基酸序列为序列表中序列4的第1‑36位氨基酸残基的多肽。突变型分泌表达信号肽SPUspmut和SPUspmut‑leiss与野生型分泌表达信号肽SPUsp45和SPUsp‑leiss相比，不但显著增加了目的蛋白质在生物细胞中分泌表达的效率(分泌表达效率提高了1.27倍)，而且还显著增加分泌表达的目的蛋白质的产量(分泌表达的目的蛋白质的产量提高了1.58倍)。

Description

促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用。
背景技术
干扰素(Interferon,IFN)是具有广谱抗病毒活性的一类蛋白质，由病毒或其他诱导剂作用于易感细胞后产生的一种小分子糖类蛋白，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等功能。根据干扰素的抗原特性和分子结构分成不同的类型。干扰素(IFN)分为I型和II型，I型干扰素基因缺少内含子，包括α、β、δ、ω、τ5种类型，II型仅有γ型1种，含有内含子。据报道在各种类型的IFN中，IFN-α的抗病毒作用最强。
IFN-α是天然免疫和获得性免疫的桥梁，可以激活NK细胞的细胞毒性并促进其增殖，调节机体免疫，增强免疫系统对病原菌的清除作用。同时，IFN-α可抑制感染细胞中病毒mRNA翻译，并促使病毒mRNA降解。
目前，干扰素以其抗病毒作用广泛、残留小、廉价、无污染、无耐药性、无药物残留等优点，已广泛用于人类医学临床，但动物干扰素和细胞因子的应用在我国兽医临床中起步较晚。因此，研究开发的猪基因工程IFN-α制剂可有效控制当前对我国养猪业危害严重的病毒性疾病，具有广阔的应用前景。
乳酸菌(Lactococcus lactis)是与人类生活紧密相关的细菌，不仅存在于人体和各种动物的肠道以及其它器官的黏膜表面，也存在于土壤、水、植物(水果、蔬菜、粮食)、酒、奶和肉制品中。乳酸菌是公认安全(generally regard as safe,GRAS)的食品级微生物，表达的外源蛋白无需纯化就可直接连同菌体一起服用，因此利用L.lactis表达各种治疗性成分作为口服制剂的研究日益受到人们的关注。此外，肠道中存在乳酸菌可以竞争性抑制有害菌的定殖，或者通过其发酵产物产生抗菌机制阻碍有害菌的生长，是用于提高机体对外源病菌抵抗力的有益菌。同时，乳酸菌能激活巨噬细胞，提高自然杀伤细胞的活力，刺激细胞因子的产生，从而增强机体的非特异性免疫应答。乳酸菌同样能刺激与获得性免疫相关的功能，包括激活淋巴细胞与刺激抗体(特别是分泌IgA)产生，其促进免疫功能的主要机理之一是充当免疫佐剂的角色。
乳酸乳球菌生长迅速，易于进行实验室操作，通常被用作乳酸菌分子生物学研究的模式菌和外源蛋白表达的重要工程菌，目前已经相继研发了一系列适用于乳酸菌的克隆和表达载体。
NICE(The Nisin Controlled gene Expression)表达系统，是乳酸菌表达系统中应用效果最好、控制性最强、宿主范围最广的表达系统，在加入诱导物nisin后，其诱导表达效率可提高1000倍以上。NICE表达系统受严格的双组份表达系统的调控，其启动子PnisA常用于载体的构建，双组份调控基因nisR和nisK整合到合适的宿主菌染色体中。当外源基因克隆到PnisA启动子的下游，并且转入到含nisRK的宿主菌中时，通过添加诱导剂nisin可以诱导PnisA的转录，随后通过双组分调控系统起始目的基因的表达。NICE系统中外源蛋白的表达水平可由加入nisin的量来控制，这种诱导作用与nisin的浓度在一定范围内成正比例，诱导效率可达1000倍以上。
但是，如何将乳酸菌表达的蛋白分泌于胞外，发挥其生物学活性，是困扰乳酸菌作为口服治疗性制剂的难点。
对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的研究表明，该菌除一个功能未知的分泌蛋白Usp45(an unknown secreted protein of 45kDa，Usp45)外，几乎不分泌其它蛋白质。研究表明，利用Usp45信号肽序列可成功分泌表达多种外源蛋白。有研究发现，在SPUsp45信号肽(其氨基酸序列是mkkkiisail mstvilsaaa plsgvya,GenBank:ABY84357.1)后加上一段带有负电荷的9氨基酸残基的人工肽LEISSTCDA，可以使金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)核酸酶Nuc的分泌效率提高80％。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率和/或如何提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量。
为了解决以上技术问题，本发明提供了名称分别为SPUspmut或SPUspmut-leiss的多肽：
所述SPUspmut的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基；
所述SPUspmut-leiss的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基。
上述多肽中，SPUspmut为突变型分泌表达信号肽，其与名称为SPUsp45的野生型分泌表达信号肽(其氨基酸序列是序列表中序列2的第1-27位氨基酸残基)相比，可促进目的蛋白质(如α干扰素或重组干扰素)在生物细胞中表达的分泌效率。SPUspmut和SPUsp45的氨基酸一致性为51.85％(图1)。SPUspmut-leiss为促进目的蛋白分泌的多肽，是在SPUspmut的羧基末端连接分泌增强子九肽LEISSTCDA得到的融合多肽。SPUspmut-leiss与SPUsp-leiss(在SPUsp45的羧基末端连接分泌增强子九肽LEISSTCDA得到的融合多肽，其氨基酸序列是序列表中序列2的第1-36位氨基酸残基)相比，可促进目的蛋白质(如α干扰素或重组干扰素)在生物细胞中表达的分泌效率。
含有SPUspmut或SPUspmut-leiss的蛋白质也属于本发明的保护范围。
上述蛋白质中，所述蛋白质的氨基酸序列的自氨基末端第1-27位氨基酸残基为序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基。
上述蛋白质中，所述蛋白质的氨基酸序列的自氨基末端第1-36位氨基酸残基为序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基。
上述蛋白质具体为将猪α干扰素与SPUspmut或SPUspmut-leiss进行融合得到的蛋白质，如氨基酸序列为序列表中序列4的融合蛋白SPUspmut-leiss-SPifn。
与上述多肽或蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
所述生物材料具体可为A或B：
A、所述多肽相关的生物材料，为下述A1)至A16)中的任一种：
A1)编码SPUspmut或SPUspmut-leiss的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B、所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本文中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子可为如下NA1)、NA2)、NA3)或NA4)的DNA分子：
NA1)编码序列是SEQ ID No.3第3-83位所示的DNA分子；
NA2)与NA1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SPUspmut的DNA分子；
NA3)编码序列是SEQ ID No.3第3-110位的DNA分子；
NA4)与NA3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SPUspmut-leiss的DNA分子。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下NB1)或NB2)的DNA分子：
NB1)编码序列是SEQ ID No.3第3-680位所示的DNA分子；
NB2)与NB1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SPUspmut-leiss-SPifn的DNA分子。
上述生物材料中，A5)所述重组微生物可为将编码SPUspmut或SPUspmut-leiss的基因导入受体微生物，得到表达所述多肽的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C5)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)乳球菌属细菌；
C4)乳酸乳球菌；
C5)乳酸乳球菌NZ9000。
上述生物材料中，B5)所述重组微生物为将编码所述蛋白质的基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为所述C1)-C5)中的任一种。
上述生物材料中，90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性。
上述生物材料中，A3)、A4)、B3)或B4)的重组载体可为pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn。pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn是将pNZ8148(核苷酸序列是序列5)的NcoI识别位点和SphI识别位点之间的片段(包括NcoI识别位点和SphI识别位点在内的小片段)替换为SEQID No.3所示的DNA分子，保持pNZ8148的其它核苷酸序列不变的环状DNA分子。即pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn是将序列5的第202-222位核苷酸替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子，保持序列5的其它核苷酸序列不变的环状DNA分子。
上述生物材料中，A5)-A8)和B5)-B8)重组微生物具体可为将pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn导入乳酸乳球菌NZ9000得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn。
上述生物材料中，A9)至A16)和B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。
下述D1)至D6)中的任一种应用也属于本发明的保护范围：
D1)SPUspmut或SPUspmut-leiss在提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率中的应用；
D2)SPUspmut或SPUspmut-leiss在提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量中的应用；
D3)SPUspmut或SPUspmut-leiss在制备分泌蛋白中的应用；
D4)SPUspmut或SPUspmut-leiss、所述蛋白质或所述生物材料在生产目的蛋白质中的应用；
D5)SPUspmut或SPUspmut-leiss、所述蛋白质或所述生物材料在制备α干扰素中的应用；
D6)SPUspmut或SPUspmut-leiss、所述蛋白质或所述生物材料在制备分泌α干扰素的重组乳酸菌中的应用。
上述D1)中，提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率是指SPUspmut与SPUsp45相比提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率，SPUspmut-leiss与SPUsp-leiss相比提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率；
上述D2)中，提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量是指SPUspmut与SPUsp45相比提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量，SPUspmut-leiss与SPUsp-leiss相比提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量。上述应用中，所述生物可为微生物、植物或非人动物。所述微生物可为上述C1)-C5)中的任一种。
上述应用中，所述目的蛋白质可为α干扰素或重组α干扰素。所述重组α干扰素具体可为重组猪α干扰素(leiss-SPifn)，它的氨基酸序列是序列表中序列2的第28-225位氨基酸残基。
本发明还提供了利用SPUspmut或SPUspmut-leiss促进α干扰素(目的蛋白)分泌的方法，即制备重组α干扰素的方法。
本发明所提供的制备重组α干扰素的方法，包括使编码所述蛋白质的基因在生物中进行表达得到所述重组α干扰素的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；
所述微生物为上述C1)-C5)中的任一种。
上述方法中，所述重组α干扰素可为重组猪α干扰素。所述重组猪α干扰素具体为重组猪α干扰素leiss-SPifn(分泌表达)或重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn(胞内表达)。leiss-SPifn的氨基酸序列是序列表中序列4的第28-225位氨基酸残基。SPUspmut-leiss-SPifn的氨基酸序列是序列表中序列4的第1-225位氨基酸残基。
上述方法中，所述蛋白质具体可为将猪α干扰素与SPUspmut或SPUspmut-leiss进行融合得到的蛋白质，如氨基酸序列为序列表中序列4的融合蛋白SPUspmut-leiss-SPifn。
上述方法中，编码所述蛋白质的基因可为所述NB1)或NB2)的DNA分子。
上述方法中，使编码所述蛋白质的基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入所述微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述α干扰素。
上述方法中，所述重组微生物为将所述pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn导入乳酸乳球菌NZ9000得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn。
实验证明，突变型分泌表达信号肽SPUspmut和SPUspmut-leiss与野生型分泌表达信号肽SPUsp45和SPUsp-leiss相比，不但显著提高了目的蛋白质在生物细胞中分泌表达的效率(分泌表达效率提高了1.27倍)，而且还显著提高了分泌表达的目的蛋白质的产量(分泌表达的目的蛋白质的产量提高了1.58倍)。本发明的含有突变型分泌表达信号肽SPUspmut编码基因的重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn能够稳定表达和分泌重组猪α干扰素leiss-SPifn，可用于提高猪体对各种病原体的抵抗力，特别是经口服后可提高对胃肠道病原菌的抵抗力，对生猪疫病的防控具有重要意义。
附图说明
图1为SPUsp45和SPUspmut的氨基酸序列比对结果。
图1中，第一行为SPUsp45的氨基酸序列，第二行为SPUspmut的氨基酸序列，第三行为相同的氨基酸残基。
图2为Western-blotting验证NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn中目的蛋白重组猪α干扰素的表达情况。C表示重组蛋白胞内蛋白样品，S表示重组蛋白胞外蛋白样品，M为Marker。箭头示目的蛋白条带。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、分泌表达重组猪α干扰素的重组乳酸菌的构建
本实施例使用名称为SPUsp45的野生型分泌表达信号肽使目的蛋白重组猪α干扰素leiss-SPifn分泌到生物细胞外，SPUsp45的氨基酸序列是MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA(序列表中序列2的第1-27位氨基酸残基)，作为对照。本实施例使用名称为SPUspmut的突变型分泌表达信号肽使目的蛋白重组猪α干扰素leiss-SPifn分泌到生物细胞外，SPUspmut的氨基酸序列是MKKKVLKAHLAVVVMLTTAAPISNVKA(序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基)，二者的氨基酸序列比对结果如图1所示，二者的一致性为51.85％。
本实施例在分泌表达信号肽SPUsp45和SPUspmut的羧基末端分别连接分泌增强子九肽LEISSTCDA，分别得到名称为SPUsp-leiss和SPUspmut-leiss的促进目的蛋白分泌的多肽。SPUsp-leiss的氨基酸序列是MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYALEISSTCDA(序列表中序列2的第1-36位氨基酸残基)，SPUspmut-leiss的氨基酸序列是MKKKVLKAHLAVVVMLTTAAPISNVKALEISSTCDA(序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基)。SPUsp-leiss为SPUspmut-leiss的对照。本实施例使用SPUsp-leiss和SPUspmut-leiss使重组猪α干扰素leiss-SPifn分泌到生物细胞外。
本实施例根据乳酸菌的密码子偏爱性，优化了猪α干扰素的编码基因，得到名称为SPifn的猪α干扰素的基因。SPifn基因的核苷酸序列是序列表中序列1或序列3的第111-680位核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的第37-225位氨基酸残基(或序列表中序列4的第37-225位氨基酸残基)的猪α干扰素SPifn。
将SPUspmut-leiss和猪α干扰素SPifn融合得到氨基酸序列是序列表中序列4的融合蛋白，其名称为SPUspmut-leiss-SPifn。
将SPUsp-leiss和猪α干扰素SPifn融合得到氨基酸序列是序列表中序列2的融合蛋白，其名称为SPUsp-leiss-SPifn。
SPUsp-leiss-SPifn和SPUspmut-leiss-SPifn在氨基酸序列上的区别仅在于SPUsp45和SPUspmut，即序列表中序列2的第27位至225位氨基酸残基和即序列表中序列4的第27位至225位氨基酸残基相同。
具体实验方法和实验结果如下：
1、制备表达重组猪α干扰素的两种表达载体pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn。
pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn与乳酸菌表达载体pNZ8148(pNZ8148的核苷酸序列是序列表中的序列5)在核苷酸序列上的区别仅在于pNZ8148的NcoI识别位点和SphI识别位点之间的片段(包括NcoI识别位点和SphI识别位点在内的小片段)不同。
pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn是将pNZ8148的NcoI识别位点和SphI识别位点之间的片段(包括NcoI识别位点和SphI识别位点在内的小片段)替换为SEQ ID No.1所示的DNA分子，保持pNZ8148的其它核苷酸不变的环状DNA分子，即pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn是将序列5的第202-222位核苷酸替换为SEQ ID No.1所示的DNA分子，保持序列5的其它核苷酸不变的环状DNA分子。SEQ ID No.1所示的DNA分子为融合蛋白SPUsp-leiss-SPifn基因。SPUsp-leiss-SPifn基因表达SEQ ID No.2所示的融合蛋白SPUsp-leiss-SPifn。SPUsp-leiss-SPifn是名称为SPUsp-leiss的促进目的蛋白分泌的多肽和名称为SPifn的猪α干扰素融合得到的蛋白质。SPUsp-leiss是在名称为SPUsp45的分泌表达信号肽的羧基末端连接分泌增强子九肽LEISSTCDA得到的促进目的蛋白分泌的多肽。SEQ ID No.1中，第3-83位核苷酸为分泌表达信号肽SPUsp45基因的核苷酸序列，第84-110位核苷酸为分泌增强子九肽LEISSTCDA基因的核苷酸序列，第111-680位核苷酸为猪α干扰素SPifn基因的核苷酸序列，第681-686位核苷酸为SphI识别位点。pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn导入乳酸乳球菌(lactococcus lactis)NZ9000可分泌表达氨基酸序列是序列表中序列2的第28-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素leiss-SPifn，胞内表达氨基酸序列是序列表中序列2的第1-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn。
pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn是将pNZ8148的NcoI识别位点和SphI识别位点之间的片段(包括NcoI识别位点和SphI识别位点在内的小片段)替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子，保持pNZ8148的其它核苷酸不变的环状DNA分子，即pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn是将序列5的第202-222位核苷酸替换为SEQ ID No.3所示的DNA分子，保持序列5的其它核苷酸不变的环状DNA分子。SEQ ID No.3所示的DNA分子为融合蛋白SPUspmut-leiss-SPifn基因。SPUspmut-leiss-SPifn基因表达SEQ ID No.4所示的融合蛋白SPUspmut-leiss-SPifn。SPUspmut-leiss-SPifn是名称为SPUspmut-leiss的促进目的蛋白分泌的多肽和名称为SPifn的猪α干扰素融合得到的蛋白质。SPUspmut-leiss是在名称为SPUspmut的分泌表达信号肽的羧基末端连接分泌增强子九肽LEISSTCDA得到的促进目的蛋白分泌的多肽。SEQ ID No.3中，第3-83位核苷酸为分泌表达信号肽SPUspmut基因的核苷酸序列，第84-110位核苷酸为分泌增强子九肽LEISSTCDA基因的核苷酸序列，第111-680位核苷酸为猪α干扰素SPifn基因的核苷酸序列，第681-686位核苷酸为SphI识别位点。pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn导入乳酸乳球菌(lactococcus lactis)NZ9000可分泌表达氨基酸序列是序列表中序列4的第28-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素leiss-SPifn，胞内表达氨基酸序列是序列表中序列4的第1-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn。
pNZ8148的核苷酸序列是序列表中的序列5，基本信息如下：启动子:PnisA；复制子:repA，repC；终止子:T；质粒分类:乳酸杆菌表达质粒；质粒大小:3167bp；原核抗性:氯霉素chloramphenicol；筛选标记:氯霉素chloramphenicol；克隆菌株:MC1061；培养条件:37℃，有氧，LB；表达宿主:乳酸杆菌。序列5的第202-207位为NcoI识别位点，序列5的第217-222位为SphI识别位点。
2、制备产生重组猪α干扰素的重组乳酸菌
首先从-80℃冰箱取出乳酸乳球菌(lactococcus lactis)NZ9000(杭州宝赛生物科技有限公司)感受态细胞，置冰上缓慢融化；之后分别取5μLpNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn和pNZ8148-SPUsp-leiss-SPifn加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀，并将上述溶液转移到冰预冷的0.2cm干净电击杯(BioRad)中，置于冰上；再后，用Bio-Rad公司GenePulserX-cell电击仪进行电击操作，电击条件为25μF，200Ω，2000V，电击时间4.5-5.0ms；电击后立即向电击杯中加入950μL复苏液，吹打混匀后将转化菌液移入无菌的离心管中，冰上放置10min后转移到30℃温箱中复苏2h；最后取菌液涂布于含有5μg/ml氯霉素和2.5mM CaCl2的培养基平板上，倒置于30℃温箱培养72h至长出单菌落。
从上述平板筛选获得转化菌落，提取质粒经测序和限制性内切酶消化鉴定，将鉴定结果表明含有pNZ8148-SPUsp-leiss-SPifn的重组菌株命名为NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn，将鉴定结果表明含有pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn的重组菌株命名为NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-SPifn。
NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn为分泌表达氨基酸序列是序列表中序列2的第28-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素leiss-Spifn和胞内表达氨基酸序列是序列表中序列2的第1-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn的重组乳酸菌。NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn为分泌表达氨基酸序列是序列表中序列4的第28-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素leiss-SPifn，胞内表达氨基酸序列是序列表中序列4的第1-225位氨基酸残基的重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn的重组乳酸菌。
实施例2、NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn分泌表达重组猪α干扰素的比较
将实施例1构建的NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn分别接种到含有5μg/mL氯霉素的液体培养基(GMl7培养基)中，30℃静置培养过夜，之后按照1:50稀释转接于新鲜的含有5μg/mL氯霉素的液体培养基中，30℃静置培养到OD600均为0.5(约需2.5-3h)(以液体培养基为空白对照)，加入nisin诱导物，使其终浓度为10ng/mL，最后30℃继续静置培养6小时，分别得到NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液。
取等体积的NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液，4℃，5,000g离心10min，菌体沉淀和上清液分别按照下面的步骤处理。上清液：用孔径为0.22μm的滤膜过滤上清液，除去残留的细胞，加入80％(w/v)三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)至终浓度为16％(w/v)，冰上放置20min，12,000g离心10min。加入1ml预冷的丙酮洗涤沉淀两次，将沉淀溶解于1/40体积的50mM NaOH中，得到重组蛋白胞外蛋白样品。沉淀：用PBS洗涤菌体沉淀一次，重悬于1/20或1/40体积的PBS中。超声破碎菌体悬液至半透明状，4℃以12,000g离心20min，收集上清液备用，得到重组蛋白胞内蛋白样品。
用12％SDS-PAGE凝胶分离上述制备得到的重组蛋白胞外蛋白样品和重组蛋白胞内蛋白样品，在靠外侧的泳道中加入预染蛋白Marker，用以显示蛋白的位置。电泳结束后，将凝胶上的蛋白条带电转到PVDF膜，利用5％脱脂奶粉封闭后，加入鼠抗猪α干扰素抗体作用，之后加入兔抗鼠IgG作用，最后加入底物显色。结果表明NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞外蛋白样品均检测到了20kDa的杂交信号，NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞外蛋白样品含有重组猪α干扰素leiss-Spifn(氨基酸序列是序列表中序列4的第28-225位氨基酸残基)；NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞内蛋白样品均检测到23kDa的杂交信号，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞内蛋白样品含有重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn(氨基酸序列是序列表中序列4的第1-225位氨基酸残基)，NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn的重组蛋白胞内蛋白样品含有重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn(氨基酸序列是序列表中序列2的第1-225位氨基酸残基)，说明猪α干扰素获得了表达，且有部分分泌到了细胞外(图2)。
对比三次重复试验的NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn重组蛋白胞外蛋白样品和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn重组蛋白胞外蛋白样品中的重组猪α干扰素leiss-SPifn的含量，得到NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液中分泌的重组猪α干扰素leiss-SPifn(胞外重组猪α干扰素leiss-SPifn)的含量为1.37×104U/mL发酵液，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液中分泌的重组猪α干扰素leiss-SPifn的含量为3.53×104U/mL发酵液，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液中分泌的重组猪α干扰素leiss-SPifn的含量是NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液中分泌的重组猪α干扰素leiss-SPifn的含量的2.58倍。重组猪α干扰素leiss-SPifn的含量均以猪α干扰素的含量计，猪α干扰素的含量用抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性计，具体方法如下文。
对比三次重复试验的NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn的重组蛋白胞内蛋白样品中的重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn的含量和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞内蛋白样品中的重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn的含量，得到NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液中胞内重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn的含量为8.44×104U/mL发酵液，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液中胞内重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn的含量为7.62×104U/mL发酵液，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn发酵液中胞内重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn的含量与NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn发酵液中胞内重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn的含量相当。其中，重组猪α干扰素SPUsp-leiss-SPifn的含量和重组猪α干扰素SPUspmut-leiss-SPifn的含量均以猪α干扰素的含量计，猪α干扰素的含量用抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性计，具体方法如下文。
按照重组猪α干扰素的分泌效率＝发酵液中分泌的重组猪α干扰素的含量/(发酵液中分泌的重组猪α干扰素的含量+胞内重组猪α干扰素的含量)，计算得到NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组猪α干扰素leiss-Spifn的分泌效率为31.66％，NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn的重组猪α干扰素leiss-Spifn的分泌效率为13.97％，NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组猪α干扰素leiss-Spifn的分泌效率是NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn的重组猪α干扰素leiss-Spifn的分泌效率的2.27倍。说明突变型分泌表达信号肽SPUspmut和SPUspmut-leiss与野生型分泌表达信号肽SPUsp45和SPUsp-leiss相比，不但显著增加了目的蛋白质(重组猪α干扰素leiss-SPifn或猪α干扰素)在生物细胞中分泌表达的效率(分泌表达效率提高了1.27倍)，而且还显著增加分泌表达的目的蛋白质的产量(分泌表达的目的蛋白质的产量提高了1.58倍)。
其中，猪α干扰素的含量(抗病毒的比活性)按照如下方法检测：
从液氮罐中取出Marc-145细胞(猪肾细胞)管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10mL无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5min。用含8％牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，37℃培养，当长成单层(72小时左右)时，用0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，按1:3比例传代增殖培养至96孔细胞培养板，待细胞生长到95％单层时，分别接种4倍倍比稀释的上述NZ9000/pNZ8148-SPUsp-leiss-Spifn和NZ9000/pNZ8148-SPUspmut-leiss-Spifn的重组蛋白胞外蛋白样品和重组蛋白胞内蛋白样品，作用24小时后，加入100TCID50HP-PRRSV JXA1-R株(高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗JXA1-R株，Xiuling Yu.et al.Assessment ofthe Safety and Efficacy of an Attenuated Live Vaccine Based on HighlyPathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.Clinical andVaccine Immunology.May 2015Volume 22Number 5)培养液，之后24-48h，观察细胞数量的变化，根据Reed-Muench法计算活性单位，半数细胞出现病变对应的稀释倍数为1个活性单位(U)。
其中，TCID50的测定方法如下：将已长成单层的Marc-145细胞弃去生长液，按10％(V/V)接种HP-PRRSV JXA1-R株毒种，加入含2％牛血清的DMEM细胞培养液，置37℃下培养观察2～3日，当70％以上细胞出现病变时收获，置-40℃下冻融1次，-70℃保存，备用。将病毒培养液用含2％牛血清的DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7共4个稀释度，分别接种于已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Marc-145细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，同时设正常细胞对照。置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。
<110> 中国动物疫病预防控制中心
<120> 促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<221> CDS
<222> (3)..(680)
<400> 1
ccatgaaaaa aaaaattatt tcagctattt taatgtcaac agttatttta tcagctgcag 60
ccccattatc aggagtttat gctttagaaa tttcatcaac atgtgatgct atggctccaa 120
catcagcttt tcttacagct cttgttcttt tatcatgtaa agctatttgt tcacttggat 180
gtgatcttcc acaaacacat tcacttgctc atacacgtgc tcttcgttta cttgctcaaa 240
tgcgtcgtat ttcaccattt tcatgtcttg atcatcgtcg tgattttgga tttccacaag 300
aagctttagg aggaaatcaa gttcaaaaag ctcaagctat ggctttagtt catgaaatgt 360
tacaacaaac atttcaatta ttttcaacag aaggatcagc tgctgcttgg aatgaatcat 420
tacttcatca attttgtact ggattagatc aacaattacg tgatttagaa gcttgtgtta 480
tgcaagaagt tggattagaa ggaacaccat tacttgaaga agattcaatt ttagctgttc 540
gtaaatattt tcatcgttta acattatatt tacaagaaaa atcatattca ccatgtgctt 600
gggaaattgt tcgtgctgaa gttatgcgtg ctttttcttc atcacgtaat ttacaagatc 660
gtttacgtaa aaaagaatga gcatgc 686
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Leu Glu Ile Ser Ser
20 25 30
Thr Cys Asp Ala Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Lys Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln
50 55 60
Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met
65 70 75 80
Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly
85 90 95
Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala
100 105 110
Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser
115 120 125
Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe
130 135 140
Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met
145 150 155 160
Gln Glu Val Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile
165 170 175
Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met
195 200 205
Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys
210 215 220
Glu
225
<210> 3
<211> 686
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<221> CDS
<222> (3)..(680)
<400> 3
ccatgaaaaa gaaggtcctc aaggcccact tggccgtagt cgttatgcta accacggctg 60
ctccaatatc taacgtaaaa gccttagaaa tttcatcaac atgtgatgct atggctccaa 120
catcagcttt tcttacagct cttgttcttt tatcatgtaa agctatttgt tcacttggat 180
gtgatcttcc acaaacacat tcacttgctc atacacgtgc tcttcgttta cttgctcaaa 240
tgcgtcgtat ttcaccattt tcatgtcttg atcatcgtcg tgattttgga tttccacaag 300
aagctttagg aggaaatcaa gttcaaaaag ctcaagctat ggctttagtt catgaaatgt 360
tacaacaaac atttcaatta ttttcaacag aaggatcagc tgctgcttgg aatgaatcat 420
tacttcatca attttgtact ggattagatc aacaattacg tgatttagaa gcttgtgtta 480
tgcaagaagt tggattagaa ggaacaccat tacttgaaga agattcaatt ttagctgttc 540
gtaaatattt tcatcgttta acattatatt tacaagaaaa atcatattca ccatgtgctt 600
gggaaattgt tcgtgctgaa gttatgcgtg ctttttcttc atcacgtaat ttacaagatc 660
gtttacgtaa aaaagaatga gcatgc 686
<210> 4
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Lys Lys Val Leu Lys Ala His Leu Ala Val Val Val Met Leu
1 5 10 15
Thr Thr Ala Ala Pro Ile Ser Asn Val Lys Ala Leu Glu Ile Ser Ser
20 25 30
Thr Cys Asp Ala Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Lys Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln
50 55 60
Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met
65 70 75 80
Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly
85 90 95
Phe Pro Gln Glu Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala
100 105 110
Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser
115 120 125
Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe
130 135 140
Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met
145 150 155 160
Gln Glu Val Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile
165 170 175
Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met
195 200 205
Arg Ala Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Lys Lys
210 215 220
Glu
225
<210> 5
<211> 3167
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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cgttatcgta gcgtaaaagc ccttgagcgt agcgtggctt tgcagcgaag atgttgtctg 600
ttagattatg aaagccgatg actgaatgaa ataataagcg cagcgtcctt ctatttcggt 660
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ttgcttgcaa ttttgccgag cggtagcgct ggaaaatttt tgaaaaaaat ttggaatttg 780
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tttttcaatc gccaacgaat cgccaacgtt ttcgccaacg ttttttataa atctatattt 960
aagtagcttt atttttgttt ttatgattac aaagtgatac actaatttta taaaattatt 1020
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caaaagagca agataaaaaa ttaacagata tggcgaaaca aaaagatttt tcaaaatctg 1140
cggttgcggc gttagctata gaagaatatg caagaaagga atcagaacaa aaaaaataag 1200
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taaaaattta ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac aattggaaga 2460
gaaaagagat atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata accacagaaa 2520
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cactaacctg ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctcc 3167

Claims (10)

1.多肽，其特征在于：所述多肽为SPUspmut或SPUspmut-leiss：
所述SPUspmut的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基；
所述SPUspmut-leiss的氨基酸序列为序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基。
2.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列含有序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基或序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列的自氨基末端第1-27位氨基酸残基为序列表中序列4的第1-27位氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列的自氨基末端第1-36位氨基酸残基为序列表中序列4的第1-36位氨基酸残基。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为将猪α干扰素与权利要求1所述的多肽进行融合得到的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列4。
7.生物材料，其特征在于：所述生物材料为A或B：
A、权利要求1所述的多肽相关的生物材料，为下述A1)至A16)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述多肽的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B、权利要求2-6中任一所述的蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B16)中的任一种：
B1)编码权利要求2-6中任一所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：
A1)所述核酸分子为如下NA1)、NA2)、NA3)或NA4)的DNA分子：
NA1)编码序列是SEQ ID No.1第3-83位所示的DNA分子；
NA2)与NA1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中所述SPUspmut的DNA分子；
NA3)编码序列是SEQ ID No.1第3-110位的DNA分子；
NA4)与NA3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中所述SPUspmut-leiss的DNA分子；
和/或，
B1)所述核酸分子为如下NB1)或NB2)的DNA分子：
NB1)编码序列是SEQ ID No.1第3-680位所示的DNA分子；
NB2)与NB1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求6所述蛋白质的DNA分子；
和/或，
A5)所述重组微生物为将编码权利要求1所述多肽的基因导入受体微生物，得到表达权利要求1所述多肽的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C5)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)乳球菌属细菌；
C4)乳酸乳球菌；
C5)乳酸乳球菌NZ9000；
和/或，
B5)所述重组微生物为将编码权利要求2-6中任一所述蛋白质的基因导入受体微生物，得到表达权利要求2-6中任一所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为所述C1)-C5)中的任一种。
9.D1)至D6)中的任一种应用：
D1)权利要求1所述的多肽在提高目的蛋白在生物细胞中的分泌表达效率中的应用；
D2)权利要求1所述的多肽在提高生物细胞中分泌表达的目的蛋白质的产量中的应用；
D3)权利要求1所述的多肽在制备分泌蛋白中的应用；
D4)权利要求1所述的多肽、权利要求2-6中任一所述的蛋白质、权利要求7或8中任一所述的生物材料在生产目的蛋白质中的应用；
D5)权利要求1所述的多肽、权利要求2-6中任一所述的蛋白质、权利要求7或8中任一所述的生物材料在制备α干扰素中的应用；
D6)权利要求1所述的多肽、权利要求2-6中任一所述的蛋白质、权利要求7或8中任一所述的生物材料在制备分泌α干扰素的重组乳酸菌中的应用。
10.制备重组α干扰素的方法，包括使编码权利要求6所述蛋白质的基因在生物中进行表达得到所述重组α干扰素的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；
所述微生物为C1)-C5)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)乳球菌属细菌；
C4)乳酸乳球菌；
C5)乳酸乳球菌NZ9000。
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