CN102433342A - 一种合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法 - Google Patents
一种合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法，其中重组鸭β-防御素-2基因参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成，含该基因的重组质粒重组质粒的构建过程依次是：（1）鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物的设置过程；（2）鸭β-防御素-2基因片段的PCR扩增过程；（3）重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建；重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法包括（1）重组质粒的制备和线性化、（2）毕赤酵母电转化感受态细胞的制备、（3）毕赤酵母的电击转化；重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法包括（1）阳性酵母转化子的诱导表达。本发明与已有技术相比，具有抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物生物医药工程领域的基因的合成、重组质粒构建、重组酵母转化子的获得及重组蛋白的生产方法。
背景技术
现代畜牧业饲用动物在具有高产性能的同时，对环境应激和病原愈加敏感。特别是在集约化饲养条件下，饲用动物面临更多的应激和病原的侵袭。畜牧生产中迫切需要一种高效、无毒害、无残留的免疫促进剂和生长促进剂，在提高饲用动物抗病力的同时，又能提高饲用动物的生产性能及动物产品的安全，以促进畜牧业的健康发展，降低畜牧生产对人类健康及生态环境的破坏。前人研究发现，防御素具有广谱杀菌活性以及超强的抗微生物作用，且作用机理特殊，微生物不易产生抗性，对肿瘤细胞还有细胞毒性作用，同时也可以作为免疫增强剂用于调节动物机体免疫系统，给人们展现了一条开发理想促生长及免疫促进的新途径。
由于动物体天然防御素含量低，直接提取远不能满足需要，且成本高、得率低、工序繁；化学合成可行但成本太高，应用受到局限；随着基因工程技术的发展，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为可能。目前，防御素的基因工程已是生物医学领域研究的热点。基于防御素的重要生理功能及其在生产实际中具有非常好的应用前景，我们进行了一种重组鸭β-防御素-2蛋白体外重组表达生产方法的发明研究。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高的基因的合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法。
本发明重组鸭β-防御素-2基因是这样实现的，依次包括鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列设计与体外合成、重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建过程、含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子的筛选过程、含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子体外诱导表达过程，
本发明的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列设计与体外合成过程是这样实现的，
参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成（送上海生工生物工程技术有限公司进行基因合成），改造后合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列如下：
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。
本发明的含有重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒pPICZα-A-AvBD2是这样实现的，
重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建过程依次是：
1、鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物的设置过程：根据合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZα-A上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xho I酶切位点及Kex2与Ste13蛋白酶裂解位点，在Xho I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT；下游引物设计在基因末端，并加上Not I酶切位点，在Not I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物分别为，
鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物：
5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3’Xho I酶切位点 ，
鸭β-防御素-2（AvBD2）基因下游引物：
5’-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3’ Not I酶切位点 ，
2、鸭β-防御素-2（AvBD2）基因片段的PCR扩增过程：以合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2（AvBD2）上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer（包含0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）·HCl，0.001%明胶） 5μL，4×dNTPs（包含dATP（三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸）、 dTTP（三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸）、dCTP（三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸）和 dGTP（三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸）各2.5mmol/L）4μL，浓度均为20μmol/L的鸭β-防御素-2（AvBD2）上、下游引物各1μL，模板为合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因1μL，ddH2O（双蒸水）37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物，鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，可见大小约130bp的扩增条带，与预期的结果一致。
3、重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建：将过程2的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE（TE包含有10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸））溶解，TE溶解物用XohI、Not I进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZα-A质粒进行双酶切处理，胶回收大小约3.6kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因片段和3μL双酶切后胶回收的pPICZα-A质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer（10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl， 0.1mol/L MgCl2， 50mmol/L DTT（二硫苏糖醇），5mmol/L DATP，0.25mg/mL BSA（牛血清白蛋白）），1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化Top 10感受态细胞，在含有25μg/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37℃培养过夜，即完成重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建。培养板上长出来的白色菌落即为含有重组质粒pPICZα-A-AvBD2的阳性菌。pPICZα-A质粒为Invitrogen公司的产品。
不呢发明的重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法是这样实现的，
1、重组质粒的制备和线性化：挑取转化入重组质粒pPICZα-A-AvBD2的Top 10阳性菌接种于25 mL含25μg/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37℃，220 rpm振摇培养24 h。将菌液于4℃，5 000rpm离心10 min，沉淀细菌。然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒。用Sac I酶将抽提的重组质粒pPICZα-A-AvBD2线性化。
2、毕赤酵母电转化感受态细胞的制备：接种毕赤酵母宿主菌X33单菌落至5mL YPD（含1wt%酵母抽提物，21wt %蛋白胨，21wt %葡萄糖）培养基中，30℃过夜培养。然后接种0.1～0.5mL过夜培养菌液到500mL新鲜YPD培养液，30℃培养，使OD600nm达到1.2～1.3。4℃ 3 000r/m离心5min，弃上清；依次以500mL、250mL冰浴灭菌水及20mL冰冷1mol/L山梨糖醇重悬菌体洗涤，4℃ 3 000r/m离心5min，离心3次；最后将细胞重悬于1mL冰浴灭菌的1mol/L山梨糖醇，即为毕赤酵母感受态细胞。
3、毕赤酵母的电击转化：取80μL准备好的毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZα-A-AvBD2混合，转移到冰浴的0.2cm电转杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因导入仪进行电击转化，电脉冲参数为电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω。电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇到电转化小杯中，将小杯内悬液转移到一个灭菌的15mL的试管中，将试管在30℃下孵育1～2小时，取10、25、50、100与200uL分别铺到含有200μg/mL Zeocin YPDS（1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1M山梨糖醇，20g琼脂粉）平板上以筛选高拷贝转化子，30℃孵化平板2~3d至出现乳白色的酵母转化菌落即为含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子。
4、毕赤酵母转化子的PCR鉴定：抽提含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子，以其为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2（AvBD2）上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer（包含0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris·HCl，0.001wt%明胶） 5μL，4×dNTPs（包含dATP, dTTP, dCTP, dGTP各2.5mmol/L）4μL，浓度均为20μmol/L的鸭AvBD2上、下游引物各1μL，模板为抽提转化的酵母基因组DNA 1μL，ddH2O（双蒸水）37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；PCR扩增产物在1.5wt％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，即表明所抽提的酵母为阳性酵母转化子。
本发明重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法是这样实现的，
1、阳性酵母转化子的诱导表达：挑取经鉴定的阳性酵母转化子接种于3 mL YPD 液体中，30℃、250 r/min振摇培养过夜；再接种于50 mL BMGY（1wt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 wt %YNB（无酵母氮源），4×10-5 wt %生物素，1 wt %甘油）体培养基中，30℃振荡培养24 h，至菌体OD600nm达到2～6 时离心弃去上清，加入25 mL BMMY 液体培养基（1 wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 wt %YNB（无酵母氮源），4×10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇），连续诱导培养72 h，在诱导过程中，每间隔24h加入100 wt％甲醇使其终浓度为0.5%，培养至72h收集样品，离心，取上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳，结果显示诱导培养后的菌体蛋白与未诱导的对照组相比，有一条大小为4.32kD非常明显的蛋白表达条带。经超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定，与目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已经得到表达即重组鸭β-防御素-2基因蛋白已经生产出来。
将含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子体外诱导表达过程所生产的发酵液直接用于体外抗菌实验表明重组鸭β-防御素-2（AvBD2）蛋白具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌能力。体内治疗实验发现重组鸭β-防御素-2（AvBD2）蛋白有较好的体内防治大肠杆菌与沙门氏菌作用效果。
本发明与已有技术相比，是对重组鸭AvBD2蛋白进行体外表达生产研究，采用了酵母密码子优化方法对鸭AvBD2基因核苷酸进行优化，有利于鸭AvBD2在酵母中的诱导表达生产，能提高表达量。另外就是，酵母属于真核表达系统，表达出来的重组蛋白更接近于天然蛋白，有利于重组蛋白活性的保持。从活性检测也可以看出表达的重组蛋白呈现出鸭AvBD2蛋白所具有的抗菌促生长活性，适合于在畜牧生产中进行应用，而且生产成本低、生产效率高。
具体实施方式：
现结合实施例对本发明作进一步详细描述：
本发明的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列设计与体外合成过程是这样实现的，
参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成（送上海生工生物工程技术有限公司进行基因合成），改造后合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列如下：
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。
本发明的含有该基因的重组质粒pPICZα-A-AvBD2是这样实现的，
重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建过程依次是：
1、鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物的设置过程：根据合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZα-A上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xho I酶切位点及Kex2与Ste13蛋白酶裂解位点，在Xho I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT；下游引物设计在基因末端，并加上Not I酶切位点，在Not I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物、下游引物分别为，
鸭β-防御素-2（AvBD2）基因上游引物：
5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3’Xho I酶切位点 ，
鸭β-防御素-2（AvBD2）基因下游引物：
5’-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3’ Not I酶切位点 ，
2、鸭β-防御素-2（AvBD2）基因片段的PCR扩增过程：以合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2（AvBD2）上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer（包含0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris·HCl，0.001%明胶） 5μL，4×dNTPs（包含dATP, dTTP, dCTP, dGTP各2.5mmol/L）4μL，浓度均为20μmol/L的鸭β-防御素-2（AvBD2）上、下游引物各1μL，模板为合成的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因1μL，ddH2O（双蒸水）37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物，鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，可见大小约130bp的扩增条带，与预期的结果一致。
3、重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建：将过程2的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE（TE包含有10mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA）溶解，TE溶解物用XohI、Not I进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZα-A质粒进行双酶切处理，胶回收大小约3.6kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭β-防御素-2（AvBD2）基因片段和3μL双酶切后胶回收的pPICZα-A质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer（10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl， 0.1mol/L MgCl2， 50mmol/L DTT，5mmol/L DATP，0.25mg/mL BSA），1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化Top 10感受态细胞，在含有25μg/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37℃培养过夜，即完成重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建。培养板上长出来的白色菌落即为含有重组质粒pPICZα-A-AvBD2的阳性菌。pPICZα-A质粒为Invitrogen公司的产品。
用于生产重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子是这样实现的，
1、重组质粒的制备和线性化：挑取转化入重组质粒pPICZα-A-AvBD2的Top 10阳性菌接种于25 mL含25μg/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37℃，220 rpm振摇培养24 h。将菌液于4℃，5 000rpm离心10 min，沉淀细菌。然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒。用Sac I酶将抽提的重组质粒pPICZα-A-AvBD2线性化。
2、毕赤酵母电转化感受态细胞的制备：接种毕赤酵母宿主菌X33单菌落至5mL YPD（含1wt%酵母抽提物，21wt %蛋白胨，21wt %葡萄糖）培养基中，30℃过夜培养。然后接种0.1～0.5mL过夜培养菌液到500mL新鲜YPD培养液，30℃培养，使OD600nm达到1.2～1.3。4℃ 3 000r/m离心5min，弃上清；依次以500mL、250mL冰浴灭菌水及20mL冰冷1mol/L山梨糖醇重悬菌体洗涤，4℃ 3 000r/m离心5min，离心3次；最后将细胞重悬于1mL冰浴灭菌的1mol/L山梨糖醇，即为毕赤酵母感受态细胞。
3、毕赤酵母的电击转化：取80μL准备好的毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZα-A-AvBD2混合，转移到冰浴的0.2cm电转杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因导入仪进行电击转化，电脉冲参数为电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω。电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇到电转化小杯中，将小杯内悬液转移到一个灭菌的15mL的试管中，将试管在30℃下孵育1～2小时，取10、25、50、100与200uL分别铺到含有200μg/mL Zeocin YPDS（1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1M山梨糖醇，20g琼脂粉）平板上以筛选高拷贝转化子，30℃孵化平板2~3d至出现乳白色的酵母转化菌落即为含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子。
4、毕赤酵母转化子的PCR鉴定：抽提含鸭β-防御素-2（AvBD2）的酵母重组转化子，以其为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2（AvBD2）上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer（包含0.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris·HCl，0.001wt%明胶） 5μL，4×dNTPs（包含dATP, dTTP, dCTP, dGTP各2.5mmol/L）4μL，浓度均为20μmol/L的鸭AvBD2上、下游引物各1μL，模板为抽提转化的酵母基因组DNA 1μL，ddH2O（双蒸水）37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；PCR扩增产物在1.5wt％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，即表明所抽提的酵母为阳性酵母转化子。
重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法，
1、阳性酵母转化子的诱导表达：挑取经鉴定的阳性酵母转化子接种于3 mL YPD 液体中，30℃、250 r/min振摇培养过夜；再接种于50 mL BMGY（1wt%酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 wt %YNB（无酵母氮源），4×10-5 wt %生物素，1 wt %甘油）体培养基中，30℃振荡培养24 h，至菌体OD600nm达到2～6 时离心弃去上清，加入25 mL BMMY 液体培养基（1 wt %酵母抽提物，2 wt %蛋白胨，1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 wt %YNB（无酵母氮源），4×10-5 wt %生物素，0.5 wt %甲醇），连续诱导培养72 h，在诱导过程中，每间隔24h加入100 wt％甲醇使其终浓度为0.5%，培养至72h收集样品，离心，取上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳，结果显示诱导培养后的菌体蛋白与未诱导的对照组相比，有一条大小为4.32kD非常明显的蛋白表达条带。经超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定，与目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已经得到表达即重组鸭β-防御素-2基因蛋白已经生产出来。
本发明所使用的限制性内切酶Xho I、Not I、Sac I、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。菌株X-33、Zeocin抗生素、pPICZα-A质粒为Invitrogen公司的产品。
体外抗菌活性检测发现重组鸭AvBD2蛋白具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌能力，对大肠杆菌44103、猪霍乱沙门氏菌（ATCC13312）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、枯草芽孢杆菌（ATCC6633）、分离株大肠杆菌和分离株猪霍乱沙门氏菌的最小抑菌浓度分别为16.41、65.63、32.81、16.41、65.63和131.25μg/ml。以两周龄的雏鸡为对象，初步研究了重组鸭AvBD2蛋白防治雏鸡细菌感染的效果。在治疗实验中，对大肠杆菌攻毒的雏鸡注射250μg重组鸭AvBD2蛋白治疗效果最好，一周后雏鸡存活率达到90%；对沙门氏菌攻毒雏鸡注射300μg重组鸭AvBD2蛋白治疗效果最好，一周后雏鸡存活率达到80%；结果表明，重组鸭β-防御素-2蛋白有较好的体内防治效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
张, 辉华
韩, 小凤
马, 保华
毕, 英佐
马, 静云
谢, 青梅
李, 辰
<120> 一种合成的鸭β-防御素-2基因、含该基因的重组质粒与重组酵母转化子及重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(117)
<400> 1
gat atg ttt ttg tgt aga att ggt tct tgt cat ttt ggt aga tgt cca 48
Asp Met Phe Leu Cys Arg Ile Gly Ser Cys His Phe Gly Arg Cys Pro
1 5 10 15
att cat ttg gtt aga gtt ggt tcc tgt ttt ggt ttt aga tct tgt tgt 96
Ile His Leu Val Arg Val Gly Ser Cys Phe Gly Phe Arg Ser Cys Cys
20 25 30
aag tct cca tgg gat gtt taa 117
Lys Ser Pro Trp Asp Val
35
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> 合成鸭防御素-2基因
<400> 2
Asp Met Phe Leu Cys Arg Ile Gly Ser Cys His Phe Gly Arg Cys Pro
1 5 10 15
Ile His Leu Val Arg Val Gly Ser Cys Phe Gly Phe Arg Ser Cys Cys
20 25 30
Lys Ser Pro Trp Asp Val
35
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)..(39)
<400> 3
tctctcgaga aaagagaggc tggatatgtt tttgtgtag 39
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成序列
<220>
<221> misc_difference
<222> (1)..(25)
<400> 4
gctggcggcc gcttaaacat cccat 25
Claims (4)
1.一种合成的重组鸭β-防御素-2基因，其特征在于参照GenBank中注册的鸭AvBD2基因cDNA基因序列，同时根据酵母密码子偏好性对鸭AvBD2基因成熟肽段核苷酸序列进行改造，然后利用基因合成方法合成，改造后合成的鸭β-防御素-2基因核苷酸序列如下：
GATATGTTTTTGTGTAGAATTGGTTCTTGTCATTTTGGTAGATGTCCAATTCATTTGGTTAGAGTTGGTTCCTGTTTTGGTTTTAGATCTTGTTGTAAGTCTCCATGGGATGTTTAA。
2.一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒，其特征在于，
含有重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒的构建过程依次是：
（1）鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物的设置过程：根据合成的鸭β-防御素-2基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，同时根据表达载体pPICZα-A上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xho I酶切位点及Kex2与Ste13蛋白酶裂解位点，在Xho I酶切位点前加有3个保护性碱基TCT；下游引物设计在基因末端，并加上Not I酶切位点，在Not I酶切位点位点前加有4个保护性碱基GCTG，所设置的鸭β-防御素-2基因上游引物、下游引物分别为，
鸭β-防御素-2基因上游引物：
5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGGATATGTTTTTGTGTAG-3’Xho I酶切位点 ，
鸭β-防御素-2基因下游引物：
5’-GCTGGCGGCCGCTTAAACATCCCAT-3’ Not I酶切位点 ，
（2）鸭β-防御素-2基因片段的PCR扩增过程：以合成的鸭β-防御素-2基因为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸭β-防御素-2上/下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸭β-防御素-2上、下游引物各1μL，模板为合成的鸭β-防御素-2基因1μL，ddH2O37.5μL，浓度为5μmol/L的 ExTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer包含0.5mmol/L MgCl2、50mmol/L KCl、10mmol/L Tris·HCl、0.001wt%明胶，4×dNTPs包含用量均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP，反应过程依次为：a、94℃处理3min；b、依次94℃处理30s、56℃处理30s、72℃处理30s；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸭β-防御素-2基因的PCR产物，
（3）重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建：将过程（2）的鸭β-防御素-2基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE包含有10mmol/L Tris·HCl、1mmol/L EDTA ，TE溶解物用XohI、Not I进行双酶切处理，胶回收大小约130bp的条带；以同样的方法对pPICZα-A质粒进行双酶切处理，胶回收大小为3.6kb的DNA片段，分别取5μL双酶切后胶回收的鸭β-防御素-2基因片段和3μL双酶切后胶回收的pPICZα-A质粒，加入1μL 的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4 DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化Top 10感受态细胞，在含有25μg/mL Zeocin的低盐LB琼脂培养板中，37℃培养过夜，即完成重组质粒pPICZα-A-AvBD2的构建，形成转化入重组质粒pPICZα-A-AvBD2的Top 10阳性菌，10×T4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/L Tris·HCl、 0.1mol/L MgCl2、 50mmol/L DTT、5mmol/L DATP。
3.一种合成的重组鸭β-防御素-2蛋白的重组酵母阳性转化子的生产方法，其特征在于，
（1）重组质粒的制备和线性化：挑取转化入重组质粒pPICZα-A-AvBD2的Top 10阳性菌接种于25 mL含25μg/mL Zeocin的低盐液体LB培养基中，37℃，220 rpm振摇培养24 h，将菌液于4℃，5 000rpm离心10 min，沉淀细菌，然后用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒，用Sac I酶将抽提的重组质粒pPICZα-A-AvBD2线性化，
（2）毕赤酵母电转化感受态细胞的制备：接种毕赤酵母宿主菌X33单菌落至5mL YPD培养基中，30℃过夜培养，YPD含1wt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖，然后接种0.1～0.5mL过夜培养菌液到500mL新鲜YPD培养液，30℃培养，使OD600nm达到1.2～1.3，4℃ 3 000r/m离心5min，弃上清；依次以500mL、250mL冰浴灭菌水及20mL冰冷1mol/L山梨糖醇重悬菌体洗涤，4℃ 3 000r/m离心5min，离心3次；最后将细胞重悬于1mL冰浴灭菌的1mol/L山梨糖醇，即为毕赤酵母感受态细胞，
（3）毕赤酵母的电击转化：取80μL准备好的毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZα-A-AvBD2混合，转移到冰浴的0.2cm电转杯中，冰浴15min，于2000-Y型基因导入仪进行电击转化，电脉冲参数为电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω，电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇到电转化小杯中，将小杯内悬液转移到一个灭菌的15mL的试管中，将试管在30℃下孵育1～2小时，取10、25、50、100与200uL分别铺到含有200μg/mL Zeocin YPDS平板上以筛选高拷贝转化子，30℃孵化平板2~3d至出现乳白色的酵母转化菌落即为含鸭β-防御素-2的酵母重组转化子，Zeocin YPDS包含1 wt %酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、2 wt %葡萄糖、1M山梨糖醇、20g琼脂粉。
4.一种重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法，其特征在于，
含鸭β-防御素-2的酵母重组转化子体外诱导表达过程：
（1）阳性酵母转化子的诱导表达：挑取经鉴定的阳性酵母转化子接种于3 mL YPD 液体中，30℃、250 r/min振摇培养过夜；再接种于50 mL BMGY体培养基中，BMGY包含1wt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨，1mol/L的 pH为6.0的磷酸钾缓冲液、1.34wt%无酵母氮源、4×10-5wt %生物素、1%wt甘油，30℃振荡培养24 h，至菌体OD600nm达到2～6 时离心弃去上清，加入25 mL BMMY 液体培养基，BMMY 液体培养基包含1wt%酵母抽提物、2 wt %蛋白胨、1mol/L的pH为6.0的磷酸钾缓冲液、1.34 wt %无酵母氮源、4×10-5 wt %生物素、0.5 wt %甲醇，连续诱导培养72 h，在诱导过程中，每间隔24h加入100％甲醇使其终浓度为0.5%，培养至72h收集样品，离心，取上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳，结果显示诱导培养后的菌体蛋白与未诱导的对照组相比，有一条大小为4.32kD非常明显的蛋白表达条带，经超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定，与目的蛋白氨基酸序列相吻合，表明目的基因已经得到表达即重组鸭β-防御素-2蛋白已经生产出来。
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| CN101538582A (zh) * | 2009-04-30 | 2009-09-23 | 东北农业大学 | 天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法 |
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