CN1974767A

CN1974767A - 猪表皮生长因子基因及其应用

Info

Publication number: CN1974767A
Application number: CN 200610114038
Authority: CN
Inventors: 杨桂香; 汪洋; 彭险峰; 黄显会; 陈杖榴; 曾振灵; 吴波浪
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2006-10-25
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2026-10-25
Also published as: CN100532551C

Abstract

本发明提供了一种猪表皮生长因子基因，其具有如序列表SEQID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还提供了含有该基因的基因工程菌C32，该菌株含有上述基因的14个拷贝，该基因工程菌的pEGF表达量高，并且纯化简单，生产成本低，为工业化生产猪表皮生长因子提供了可能。

Description

猪表皮生长因子基因及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪表皮生长因子基因，本发明还涉及由该基因构建的表达载体及其转化子。

背景技术

表皮生长因子是在60年代Cohen(1962)就从雄性小鼠的颌下腺中分离提取出一种可以使新生鼠眼睑早开、牙齿早萌的蛋白质。后来在1975年从人尿中分离到人表皮生长因子。人及小鼠的表皮生长因子可刺激表皮和内皮细胞的增殖，可用于治疗烧伤、角膜创伤、胃肠溃疡等。1991年猪表皮生长因子基因被克隆，并在酵母中表达，发现表达的猪表皮生长因子能促进昆明小鼠3T3细胞的DNA合成(Pascall JC，Jones DS，Doel SM，Clements JM，Hunter M，Fallon T，Edwards M，andBrown KD.Cloning and characterization of a gene encoding pigepidermal growth factor.J Mol Endocrinol，1991，6：63-70)。然后在猪肾及子宫内膜都检测到了猪表皮生长因子的mRNA(Kim J G，Vallet JL，Christenson R K.2001.Characterization of uterine epidermal growthfactor during early pregnancy in pigs.Domest Anim Endocrinol，20(4)：253-265)。与人表皮生长因子(hEGF)和小鼠表皮生长因子(mEGF)一样，猪表皮生长因子也是一个不带糖基、含有53个氨基酸的单链多肽，分子内含有三对二硫键，维持其生物活性。分子量约6147.9道尔顿，等电点为5.46。pEGF与和人表皮生长因子、鼠表皮生长因子的氨基酸序列同源性分别为85％及75.5％，在Gly18、Tyr37、Gly39、Arg41、Leu47以及六个半胱氨酸残基为保守区域(Pascall et al.，J MolEndocrinol，1991，6：63-70)。猪表皮生长因子主要存在于猪的各种组织(肾脏、胰腺、子宫内膜)以及猪乳中。

2001年美国专利6300311B1表明，pEGF具有促进静止期的初级母卵泡变成活化卵泡，从而加速卵子的排出，因此具有提高哺乳动物的窝产仔数的功能。McGlone等(2003)的研究表明大肠杆菌表达的重组pEGF可提高窝产仔数20.79％(McGlone J J，Anderson DL，Vaughan H L.2003.Prepubertal administration of porcine EpidermalGrowth Factor increases litter size.The Annual meeting of the SouthernSection，American Society of Animal Science)。在胃肠道，表皮生长因子可刺激胃肠道的生长以及诱导小肠消化酶的表达(Jaeger L A，et al.Effect of orally administered epidermal growth factor on the jejunalmucosa of weaned pigs.American Journal of Veterinary Research，1990，51：471-474；Black D D，Ellinas H.Apolipoprotein synthesis in ofdiarrhoea in newborn piglet intestinal explants.Pediatr.Res.1992，32：553-558；James P S，el al.Epidermal growth factor selectively increasesmaltase and sucrase activities in neonatal piglet intestine.Journal ofPhysiology，1987，393：583-594；Xua R J，Wang F，Zhang S H.Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigs：apossible role of milk-borne growth factors.Livestock ProductionScience，2000，66：95-107)。此外，在早期断奶仔猪的饲料中添加毕赤酵母表达的重组猪表皮生长因子(1.5ppm)，饲喂7天时能使早期断奶仔猪的平均日增重从对照组的24.39g/d提升到70.35g/d，并具有统计学的显著性差异(Lee D N，Kuo T Y，Chen M C，et al.Expression of porcine epidermal growth factor in Pichia pastoris and itsbiology activity in early-weaned piglets.Life Sci，2006，78：649-654)。

由于猪表皮生长因子具有多种生物学活性以及在畜牧业生产中具有很好的应用价值和应用前景，因此有必要开发能高效表达重组pEGF的工程菌和规模生产重组pEGF的方法。

对于猪表皮生长因子在体外的表达研究，Lee等(2006)用猪表皮生长因子的原始基因在毕赤酵母系统表达，表达量870mg/L(Lee DN，Kuo T Y，Chen M C，et al.Expression of porcine epidermal growthfactor in Pichia pastoris and its biology activity in early-weaned piglets.Life Sci，2006，78：649-654)，但是没有建立纯化表达产物的方法，也没有对表达产物进行纯化。2001年美国专利6300311B1报道了用大肠杆菌表达在C端含有6个组氨酸的融合蛋白6His-pEGF，并用Ni-凝胶柱从细菌中纯化表达产物，但是表达产物在C-端含有19个来源于表达载体的氨基酸。Pascall等(1991)S.cerevisiae表达了小量pEGF的融合蛋白。目前国际上只有澳大利亚的Gropep公司有商品化的产品(大肠杆菌表达产物)，但是价格昂贵(325美金/1mg)，难以满足生产需要。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种猪表皮生长因子pEGF基因；

本发明的第二个目的在于提供一种含有pEGF基因的重组载体；

本发明的第三个目的在于提供含有所述载体的基因工程菌；

本发明的再一个目的在于提供构建上述基因工程菌的方法。

本发明的技术方案是：根据毕赤酵母的密码子偏爱性，设计合成pEGF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在pEGF基因的上游引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-factor信号肽编码序列，使pEGF能在毕赤酵母中分泌表达；下游引入6个组氨酸(his)编码序列(使表达产物易于纯化)以及一个终止密码TGA，并与pPIC9载体重组，获得pPIC9-pEGF表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

pPIC9-pEGF用BglII单酶切线性化后，转化毕赤酵母，通过MD、MM培养基筛选转化子，并进一步筛选高拷贝数的转化子。

筛选高拷贝转化子的方法是，根据pEGF基因设计探针并作标记，通过斑点杂交选择杂交信号强的转化子。本发明筛选出了含有14个pEGF基因拷贝的转化菌株，并将其命名为C32(Pichia pastoris/pPIC9-pEGF)(已于2006年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号中国微生物研究所，分类命名：巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)，保藏号CGMCC No.1826)。

本发明还提供了C32发酵培养的方法，首先将C32基因工程菌接种BMGY培养基上，进行扩大培养(30℃培养18h)，然后接种到生长培养基中，30℃培养，持续滴加氨水维持pH5.4，溶氧20％，20h后流加甘油至细胞湿重达300mg/ml，然后流加甲醇进行pEGF的诱导表达。将产物在8000-10000×g下离心，收集上清，1kD截流下超滤，然后用Ni-NTA亲和层析纯化方法纯化。收集Ni-NTA亲和层析柱的流脱液进行透析即可。

本发明的pEGF基因，是根据毕赤酵母对密码子使用的偏好性而合成的基因，因此用它构建的毕赤酵母工程菌能得到高效的表达；构建重组表达载体，首先采用分泌性表达载体，其次是在pEGF的下游，引入6个组氨酸，这样有利于表达产物的纯化；转化筛选得到的C32基因工程菌，其染色体中含有14个拷贝数的pEGF基因，该基因工程菌的pEGF表达量高达2g/L，并且纯化简单，生产成本低，为工业化生产猪表皮生长因子提供了可能。

附图说明

图1是表达载体pPIC9-pEGF；

图2是pPIC9-pEGF的序列结构图；

图3是pPIC9-pEGF的Xho I和EcoR I的双酶切图谱，其中M表示分子量标准；

图4是斑点杂交的扫描结果；

图5是多拷贝整合转化子摇瓶诱导培养上清的SDS-PAGE分析，其中，M表示蛋白质分子量标准，1～5是含有pEGF不同拷贝数菌株，6是C32，7是GS115/His⁺Mut^S albumin菌株，9是pPIC9载体转化子；

图6是工程菌C32摇瓶诱导培养上清经Ni-NTA纯化后SDS-PAGE分析，其中1～8是浓度梯度下的流出液。

图7是工程菌C32高密度发酵上清的SDS-PAGE分析，其中M表示蛋白质分子量标准，1～8是不同诱导时间下的产物。

图8是C32表达产物的Western blotting分析，其中M表示预染蛋白质分子量标准，1、2泳道为纯化的表达产物；

图9是用CCK-8测定的纯化表达产物pEGF-6His对BALB/c 3T3的生物活性。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 表达载体的构建

根据pEGF的氨基酸序列以及毕赤酵母对密码子的偏好性，人工合成pEGF基因。其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和2所示。以上序列由上海英骏公司合成。以合成的pEGF基因为模板，设计一对引物，使上游引物的5’端含有pPIC9载体上Xho I至SnaB I之间的序列，下游引物的5’端含有编码6个组氨酸、一个TGA终止密码以及EcoR I位点，本实施例中采用的上游引物是：5’GCGCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAATTCTTACTCTGAATGTCCAC，下游引物：5’GGGCCGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCTCAACTCCCACCATTTCAAG。用这一对引物进行PCR扩增。PCR产物和pPIC9载体分别用Xho I和EcoR I进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用Qiaquick Gel Extraction试剂盒回收210bp的pEGF片段和8000bp的载体条带，然后进行连接反应。连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。用Qiaprep Spinminiprep试剂盒提取阳性转化子的质粒，进行酶切鉴定以及测序鉴定。

图1为由pPIC9和pPEGF构建的重组表达载体为pPIC9-pEGF。pPIC9-pEGF的序列如SEQ ID NO.1所示。插入的PCR产物(pEGF)的上游含有5’AOX1启动子以及内含酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α-factor信号肽编码序列。

如图2所示，图中Xho I上游及EcoR I下游的碱基均为pPIC9载体上的碱基序列。Xho I至EcoR I之间的210碱基中含有合成的pEGF序列(159bp)，在pEGF基因上游含有24个碱基(CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，编码信号肽中的Leu Glu Lys-Arg ^*Glu Ala GluAla)，毕赤酵母中的KEX2信号肽切除酶可以在^*位置切除信号肽，靶蛋白上的Glu Ala Glu Ala残基由毕赤酵母中的STE13信号肽切除酶切除。如果STE13切除效率高，则靶蛋白的N端上不会有Glu Ala Glu Ala残基；在pEGF基因下游含有编码6个组氨酸的序列以及一个终止密码(TGA)和酶切位点EcoR I。

用Xho I和EcoR I酶切pPIC9-pEGF，电泳后可以看到酶切图谱中具有210bp大小的片断。参见图3。

实施例2.感受态宿主菌的制备、转化及转化子表型的筛选

酵母表达体系常用溶液和培养基：

10×D：称取D-葡萄糖20g，加双蒸水至100mL，加温至完全溶解后过滤除菌或高压灭菌，保存于4℃，保存期为一年。

YPD培养基(Yeast Extract Peotone Dextrose Medium)：称取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于900mL双蒸水中，高压灭菌20min，再加入100mL已灭菌的10×D。

10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfatewithout Amino Acid)：称取酵母氮碱(YNB)67g，加双蒸水至500mL，加温至完全溶解后过滤除菌，保存于4℃，保存期为一年。

500×B(0.02％D-Biotin，D-生物素)：称取D-生物素10mg，加双蒸水至50mL，加温至完全溶解后过滤除菌，保存于4℃，保存期为一年。

10×M(10％Methanol，甲醇)：取甲醇10mL，加双蒸水至100mL，过滤除菌，保存于4℃，保存期为两个月。

10×GY(10％Glycerol，甘油)：取甘油10mL，加双蒸水至100mL，过滤除菌或高压灭菌，保存于4℃，保存期为一年。

1M磷酸缓冲液pH6.0(1M Potassium Phosphate Buffer)：量取33mL的1M K₂HPO₄和217mL的1M KH₂PO₄混合后，可用磷酸或KOH调节pH6.0，过滤除菌或高压灭菌，保存于4℃，保存期为一年。

MD平板：称取1.5g琼脂粉，加双蒸水80mL溶解，高压灭菌后冷却至60℃时，快速加入10mL10×YNB，10mL10×D以及200μL500×B后，快速倒板，冷却后4℃保存。

MM平板：称取1.5g琼脂粉，加双蒸水80mL溶解，高压灭菌后冷却至60℃时，快速加入10mL10×YNB，10mL10×M，200μL500×B后，快速倒板，冷却后4℃保存。

BMGY培养基(Buffered Glycerol-complex Medium)：称取酵母提取物10g，蛋白胨20g，溶于700mL双蒸水中，高压灭菌20min后，冷却至室温，分别加入100mL已除菌的1M磷酸缓冲液(pH6.0)、10×YNB、10×GY及2mL500×B。放置4℃保存，保存期为两个月。

BMMY培养基(Buffered Methanol-complex Medium)：称取酵母提取物10g，蛋白胨20g，溶于700mL双蒸水中，高压灭菌20min后，冷却至室温，分别加入100mL已除菌的1M磷酸缓冲液(pH6.0)、10×YNB、10×M及2mL 500×B。放置4℃保存，保存期为两个月。

BMM培养基(Buffered Minimal Methanol)：将700mL双蒸水高压灭菌20min后，冷却至室温，分别加入100mL已除菌的1M磷酸缓冲液(pH6.0)、10×YNB、10×M及2mL500×B。放置4℃保存，保存期为两个月。

酵母裂解缓冲液：0.01M Tris-Cl(pH7.6)，0.5M EDTA(pH8.0)，β-巯基乙醇(1％V/V)。

毕赤酵母GS115感受态宿主菌的制备：

毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)，接种YPD板，30℃培养2d，挑取单菌落至3mL YPD液体培养基中，30℃，300rpm培养过夜；转移500μL过夜的培养液至200mL的新鲜YPD液体培养基中，并于1L的培养瓶中摇菌至OD600为1.2-1.3，4℃，1500×g离心5分钟，收集细胞沉淀，用200mL冰冻的无菌去离子水重悬，离心同上，去上清。用100mL冰冻的无菌去离子水重悬，离心同上，去上清。用20mL冰冻的1mol/L山梨醇溶液重悬细胞沉淀，离心同上，去上清。加入约1mL冰冻的1mol/L山梨醇，使终体积为1.5mL左右，细胞密度在1×10¹⁰左右。

重组质粒pPIC9-pEGF线性化：

10.0μg重组质粒pPIC9-pEGF用BglII单酶切线性化。将线性化完全的酶切产物用酚/氯仿抽提一次，用1/10体积3mol/L乙酸钠和2.5倍体积无水乙醇-20℃沉淀20min，12000r/min离心，用70％的乙醇洗涤后晾干，加入20μL双蒸水溶解线性化产物。-20℃保存备用。

线性化pPIC9-pEGF的电转化：

取80μL GS115感受态细胞与10μg线性化的重组质粒DNA混匀后，将其转入预冷的电转移杯中，冰浴5min。将电转移杯放入电转移槽中，1500V电击转化。电击后，立即加入1mL预冷的山梨醇，轻轻移至无菌的1mL EP管中。取500μL混合液均匀涂布于MD平板中，在30℃恒温培养箱中培养2至3天，直至长出明显的菌落。

转化子的Mut⁺和Mut^S筛选：

将MD板中长出的单个菌落用牙签挑出，沾于新的MD板中，并将沾上的菌落做好标记，30℃恒温培养箱中培养2至3天。将新的MD板中长出的菌落重新用牙签挑出，沾于新的MM板中，做好相同的标记，30℃恒温培养箱中培养2至3天后，观察菌落生长的快慢，确定Mut表型：在MD板中，所有的转化子生长情况相似，转化子之间大小没有明显的差异，但是在MM板中，Mut⁺(利用甲醇快)型转化子生长快，克隆大；Mut^S(利用甲醇慢)型转化子生长较慢，克隆较小。在鉴定的200个转化子中，有一半是Mut⁺(利用甲醇快)型转化子。

实施例3 斑点杂交筛选多拷贝整合转化子

斑点杂交液(1×)：20×SSC 250mL，5％SDS 5mL，10％Sarkosyl10mL，ddH₂O 735mL，Blocking Reagent 5g。

将已经确定表型的转化子置于每孔含100μl YPD培养基的96孔板中，30℃培养48h，取10μl接种每孔含100μl新鲜YPD培养基的96孔板中，继续培养48h。然后每孔取50μl培养的菌液于2ml离心管中，离心去上清后，用80μl含有酵母裂解酶(lyticase)的酵母裂解缓冲液重悬细胞沉淀，37℃裂解4h，100℃作用10min后，立即将离心管放入冰中，并加入等体积的20×SSC，得到裂解液。利用斑点杂交加样器，将制备的裂解液转移至硝酸纤维素膜上，变性后80℃烘烤2h，置入杂交管，加入预杂交液预杂交4h。用引物(上游引物AOX primer5’-GACTGGTTCCAATTGACAAG-3’，下游引物pPSEGF primer5’-CCTAGGGAATTCTC AATGATGA-3’)从pPIC9-pEGF上扩增出长度为535bp含有pEGF基因的片段。用Qiaquick Gel Extraction试剂盒回PCR产物，以之为模板，用Takara Random Primer DNA labeling试剂盒以及[α-³²P]dCTP进行同位素探针标记反应。将标记的探针加入预杂交的管中，杂交过夜。洗膜后，取出硝酸纤维素膜压磷板24h。将该磷板在Bio-Rad FX扫描仪上扫描，筛选多拷贝转化子。

参见图4，图中D3、D4为pPIC9转化子；D5、D6为未转化的GS115；D7、D8为pPIC9-pEGF质粒；其他为pPIC9-pEGF转化子。多拷贝整合转化子是信号较强的转化子，如A8、B2、B7、B8、C6、C7。其中C6的信号最强，含有14pEGF基因拷贝数，C6所对应的菌株C32为基因工程菌。

实施例4 工程菌摇瓶培养时pEGF的表达与纯化

工程菌C32摇瓶诱导：工程菌C32菌落接种40mL BMGY中扩大培养16-18h后，于10mL BMMY(含1％Casamino Acid)中诱导表达，分别在0、24、48、72、96、120h收获100μL上清，-20℃备用。表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析。

结果参见附图5，图中1-5泳道为拷贝数不同的5个菌株的诱导72h的表达上清，6泳道为基因工程菌C32的诱导72h表达上清；7为GS115/His⁺Mut^S albumin诱导72h表达上清；M，蛋白质分子量标准；9，pPIC9载体转化子的诱导表达上清。从该图可以看出，工程菌C32的表达很高。

摇瓶表达的蛋白质的纯化：将工程菌接种400ml BMGY培养基，30℃摇瓶培养16-18h，离心，去上清，细胞接种100ml BMMY培养基，继续摇瓶培养，用1％甲醇诱导96h；诱导表达的上清用磷酸钾调pH值至7.8。离心去细胞及碎片，离心上清用过Ni-NTA亲和层析柱纯化，用洗脱液(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，250mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)从亲和层析柱上洗脱目标产物，流出液按1ml体积分装到2ml EP管。取各EP管中的流出液少量，进行Tricine-SDS-PAGE分析，将含靶蛋白流出液对1L 10mM的磷酸缓冲液透析24h，然后冻干保存。

结果参见附图6。附图6中1-8泳道为第1-8离心管接收的洗脱液，M为蛋白质分子量标准。所以表达上清过Ni-NTA亲和柱后，靶蛋白主要集中在第2、3、4管洗脱液中，表达上清过Ni-NTA新和柱后，杂蛋白非常少。

实施例5 工程菌高密度发酵及产物的纯化

C32基因工程菌接种2个含有250ml的BMGY培养基的2L三角瓶中，30℃培养18h，然后接种到含有3L生长培养基的5L发酵罐(上海保兴公司)中(高密度发酵培养)，30℃培养，持续滴加氨水维持pH5.4，溶氧20％，20h后流加甘油至细胞湿重达300mg/ml，然后流加甲醇进行pEGF的诱导表达。高密度发酵时，在不同诱导时间取表达上清，用15μl表达产物进行SDS-PAGE分析。

生长培养基：

H₃PO₄ 26.7ml

CaSO₄·2H₂O 0.9g

K₂SO₄ 18g

MgSO₄ 15g

KOH 4.13g

甘油 40g

PTM1盐溶液 4.4ml

加水至1L

结果参见图7。M：蛋白质分子量标准；1：甲醇诱导2h；2：甲醇诱导8h；3：甲醇诱导14h；4：甲醇诱导26h；5：甲醇诱导32h；6：甲醇诱导38h；7：甲醇诱导49h；8：甲醇诱导58h。从该图可以看出，诱导26h，表达上清中表达产物大量增加，以后随着时间延长，表达产物的含量也增加。最高表达量可达2g/L。

表达蛋白质的纯化：将发酵液在8000-10000×g下离心，收集上清，磷酸钾调pH至7.8。1kD截流下超滤，超滤液直接加入到用缓冲液(300mM NaCl，50mM NaH₂PO₄，10mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)已经平衡的Ni-NTA层析柱，控制流速在0.8-1.2mL/min范围。待超滤液全部通过层析柱后，用10倍柱体积的wash buffer(300mMNaCl，50mM NaH₂PO₄，20mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)清洗柱子。然后用5倍柱体积的Elution buffer(300mM NaCl，50mMNaH₂PO₄，250mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)从亲和层析柱上洗脱目标产物。表达产物纯度达95％以上。

实施例6 表达产物的鉴定

western bloting：将Ni-NTA亲和层析柱纯化产物进行SDS-PAGE电泳，再经转PVDF膜、封闭，然后用小鼠源性的抗His-Tag单克隆抗体(Novagen公司)以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行免疫印迹反应。结果见图8。在图8的1、2泳道为纯化的表达产物；M：预染蛋白质分子量标准。

N端氨基酸测序

取少量冻干的纯化表达产物，用蒸馏水溶解，加β-巯基乙醇(终浓度为5％)，100℃反应10min，使分子中的二硫键还原。然后将样品进行Tricine-SDS-PAGE电泳以及转PVDF膜。将含有目的条带的PVDF膜送上海基康生物技术有限公司进行N端的氨基酸测序，测定N端15个氨基酸残基。结果样品中含有2条多肽，其N端的15氨基酸残基的序列分别为NSYSECPPSHDGYCL和EANSYSECPPSHDGY，说明检测得到的多肽为pEGF-6His，同时也表明宿主菌GS115的蛋白酶STE13对pEGF-6His的氨基端的Glu-Ala切除不完全。

实施例7 融合蛋白生物活性检测

材料和试剂：

BALB/c 3T3细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心；DMEM基础培养基、胎牛血清、青链霉素、链霉素、胺酰胺购自GBICO公司。重组人表皮生长因子(Recombinant Human EGF，hEGF)，英国PeproTech House公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)，Dojindo Molecular Technologies公司。

BALB/c3T3细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基(完全培养基)传代培养，用完全培养基稀释至5×10⁴/ml，以每孔100μl加入到96孔细胞培养板中，37℃培养24小时，用含1％小牛血清的DMEM培养基(基础培养基)饥饿培养12小时，加入系列稀释的含纯化的pEGF样品或hEGF标准品的培养基，37℃继续培养48小时，加10μl的CCK-8溶液，37℃作用2小时后测定600nm波长的吸收度值(OD)。

结果见附图9。从图9可见，本研究表达纯化的pEGF蛋白对BALB/c 3T3细胞具有显著的细胞增殖活性(P＜0.01)，与重组人表皮生长因子对照品的细胞增殖活性相比，无统计学学差异(P＞0.05)。

序列表

<110>华南农业大学

<120>猪表皮生长因子基因及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(159)

<400>1

aat tct tac tct gaa tgt cca cca tcc cac gac ggt tac tgt ttg cac 48

Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

ggt ggt gtt tgt atg tat att gaa gcc gtc gac tct tat gcc tgt aac 96

Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

tgt gtt ttt ggt tac gtt ggc gag aga tgt caa cac aga gac ttg aaa 144

Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys

35 40 45

tgg tgg gag ttg aga 159

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210>2

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210>3

<211>236

<212>DNA

<213>重组质粒

<400>3

aagaaggggt atctctcgag aaaagagagg ctgaagctaa ttcttactct gaatgtccac 60

catcccacga cggttactgt ttgcacggtg gtgtttgtat gtatattgaa gccgtcgact 120

cttatgcctg taactgtgtt tttggttacg ttggcgagag atgtcaacac agagacttga 180

aatggtggga gttgagacat catcatcatc atcattgaga attccctagg gcggcc 236

Claims

1、一种猪表皮生长因子基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2、含有权利要求1所述基因的表达载体。

3、如权利要求2所述的表达载体，其具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

4、含有权利要求2或3所述表达载体的宿主。

5、如权利要求4所述的宿主，其为毕赤酵母。

6、如权利要求4或5所述的宿主，其是通过将权利要求2或3所述表达载体导入毕赤酵母GS115菌株制备的。

7、一种基因工程菌巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)C32 CGMCCNo.1826，其特征在于，该菌株含有权利要求1所述基因的14个拷贝。

8、通过权利要求7所述菌株获得的猪表皮生长因子。

9、如权利要求8所述的猪表皮生长因子，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。