KR20150046813A - M 세포 표적형 mIL-6 분비 Lactococcus lactis IL1403 재조합 유산균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 M 세포 표적형 mIL-6를 분비하는 형질전환 유산균주 및 재조합 단백질에 관한 것으로서 본 발명은 mIL-6 및 M 세포 특이 펩타이드를 각각 클로닝한 다음 발현벡터에 삽입하는 단계와; 상기 발현벡터에 Usp45 분비신호를 도입하고 형질전환 유산균주를 구축하는 단계와; 상기 형질전환 유산균주에서 면역활성물질을 발현시켜 분비검정하는 단계와; 상기 형질전환 유산균주의 생리활성 특징 및 단백질 분비효율을 검정하는 단계와; 상기 면역조절 단백질의 활성을 in vitro에서 평가하고 in vivo에서 M세포 표적능을 확인하는 단계로 구성된다. 따라서 본 발명은 mIL6 단백질과 M 세포 특이 펩타이드가 도입된 신규한 재조합 발현벡터 및 상기 신규의 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균주를 제공하여 점막 면역반응을 보다 강하게 유도할 수 있는 재조합 단백질 분비 형질전환 유산균주와 이를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여용 백신을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 M 세포 표적형 mIL-6를 분비하는 형질전환 유산균주 및 이를 이용한 재조합 단백질에 관한 것이다.
세계적으로 인간이나 가축에서 발생하고 있는 질병의 90%는 Food born disease나 Water born disease와 같은 소화기성 질병이라고 알려져 있다. 이질, 콜레라 등 세균 및 바이러스성 소화기성 전염병을 감염 경로상에서 직접적으로 차단하고 예방하기 위해서는 주사방식의 백신에 비해 경구백신을 통해 소화장관 내 점막면역반응을 활성화시키는 것이 효과적인 전략이다. 그럼에도 불구하고 현재까지 이러한 질병을 예방하기 위한 백신은 대부분 근육을 통하여 주사하는 방식의 약독화 생백신이다. 주사방식의 약독화 생백신의 가장 큰 단점은 잠재적인 안전성 문제와 장내 점막면역반응 유도 효율이 낮다는 것이다. 경구백신의 주요 구성 요소인 단백질 등은 위산에 의한 낮은 pH, 소화장관의 각종 영양소 분해효소 등에 의해 변성되어 그 고유 기능을 잃기 쉽고 (운송과정 중의 문제점), 안전하게 소화장관까지 전달되더라도 소장점막층에서의 흡수효율 (체내 흡수의 문제점)이 저조해 경구백신의 활용은 현재까지 매우 제한적이다.
한편, 소장점막층에는 Peyer's patch와 같은 점막면역기구 (GALT: Gut-Associated Lymphoid Tissue)가 존재하고 이러한 Peyer's patch 상부에서 M cell과 같이 특별히 분화된 세포들이 소장 내 항원을 흡수하여 하부의 면역기구에 전달하여 점막면역반응을 유도함으로써 소화장관을 통해 침입한 병원균에 대해 효과적으로 방어할 수 있다. M cell을 표적하여 항원을 전달할 수 있는 경구백신 시스템이 개발된다면 점막면역반응 유도 효율을 크게 증진시킬 수 있을 것으로 전망되어 현재 세계적으로 다양한 연구전략 (M cell 표적형 작용기 도입 등)을 통한 M cell 표적 연구가 진행 중에 있다.
유산균(LAB: lactic acid bacteria)은 인간이 발효식품을 제조할 때 이용해 온 대표적인 식품 미생물(GRAS: generally recognized as safety)로 이미 많은 연구를 통해 그 이용성이나 영양적 가치가 밝혀져 있고, 최근 생명공학 기술의 발달로 인하여 유산균의 대사 작용과 특성이 밝혀지면서 다양한 활용 가능성이 제시되고 있다. 현재 유산균은 축산분야에서 생균제로서 동물의 면역기능과 성장률 개선의 목적으로 사용이 되고 있으며, 식품분야에서도 치즈나 발효유와 같은 낙농발효식품에서 접종 균주로 사용되고 있다. 유산균을 이용하여 약물을 전달할 때 장점으로는 1) 약물을 보다 안전하게 소장에 전달(Jerry M. Wells et al,. 2008 Nat Reviews immunology). 2) 유산균이 장내에서 살아남아 서식하면서 약물을 계속적으로 분비, 3) 주사방식보다 편리하고 환자의 스트레스 최소화, 4) 최근 유산균이 항원제시세포 Dendritic cell 표면의 Toll like recptor 2 신호를 자극하여 면역반응을 촉진시켜 자체만으로도 어느 정도 adjuvant 효과가 있어 더욱 유리함(K Ramirez et al,. 2009 Mucosal immunity) 등이 있다.
RepE 변이단백질 및 상기 단백질의 코팅유전자를 함유하는 고발현벡터를 형질도입시켜서 목적 단백질을 미생물 표면에 생성시키는 방법에 관하여는 대한민국 공개공보 제10-2010-0082154호가 개시된 바 있고, 돼지 유행성 설사병 바이러스 감염에 대한 억제효과를 가진 단백질을 대장균에 도입하여 백신이나 생균제로 사용하는 방법에 관하여는 국내 등록공보 제10-0773241호가 개시된 바 있다. 외인성 항원을 발현하는 형질전환 식물 또는 재조합 미생물을 이용하여 조류독감 HA 유전자를 백신으로 사용하는 방법에 관하여는 EP 0 925 364 (WO 98/010079)가 개시되어 있으며, 마이코박테리아 항원인자를 발현하는 재조합 유산균벡터를 이용하여 상기 미생물의 폴리펩티드를 생백신으로 이용하는 방법에 관하여는 WO 2011/008735가 개시되어 있다.
본 발명자들은 IL2 단백질 및 M 세포 특이 펩타이드를 발현벡터에 도입하여 소장으로의 전달효율 및 흡수효율을 증대시키는 발명에 관하여 국내 특허출원한 바 있다(특허 출원번호 제10-2012-0135294호).
인터루킨-6(Interleukin-6)는 면역세포인 뿐만 아니라 여러 가지 세포유형에서 분비되는 사이토카인으로써 multifunctional cytokine이다. 면역작용에서 주로 B cell의 plasma B cell로의 분화를 유도하고 T cell의 proliferation을 증진시키며 기타 여러 선천성 면역과 후천성 면역에 작용한다. 본 발명은 약물의 소장에서의 흡수를 증진시킬 목적으로 자체개발한 본 발명자들의 상기 특허출원의 M cell 특이 표적 펩타이드를 IL-6의 말단에 도입하였다. 이 때, IL-6는 M cell 특이 펩타이드의 도움으로 장내 중요한 lymphoid tissue인 Payer’s Patch의 표면에 있는 M cell을 보다 효율적으로 통과한 후 그 하부에 있는 면역세포(T cell, Bcell) 에 전달되어 그 들을 activation 시킴으로써 점막 면역반응을 보다 강하게 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 M 세포 특이 펩타이드 CKS9가 도입되어 USP45-IL6-CKS9을 발현시키는 신규한 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 USP45-IL6-CKS9 퓨전단백질을 분비하는 형질전환 유산균주를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여 백신조성물 및 가축용 사료조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 IL-6 및 M 세포 특이 펩타이드를 각각 클로닝한 다음 발현벡터에 삽입하는 단계와; 상기 발현벡터에 Usp45 분비신호를 도입하고 형질전환 유산균주를 구축하는 단계와; 상기 형질전환 유산균주에서 면역활성물질을 발현시켜 이를 검정하는 단계와; 상기 형질전환 유산균주의 생리활성 특징 및 면역조절 단백질 분비효율을 검정하는 단계와; 상기 면역조절 단백질의 활성을 in vitro에서 평가하고 in vivo에서 M세포 표적능을 확인하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 M 세포 특이 펩타이드가 도입되어 USP45-IL6-CKS9를 발현시키는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환 유산균주를 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 경구투여 백신 조성물 및 가축용 사료조성물을 제공한다.
다수의 실험결과에 따르면 본 발명의 상기 형질전환 유산균주는 일반 사료 전체중량의 0.1% 이상 함유하는 경우 면역 증강 효과가 유효한 것으로 나타났다.
본 발명은 IL6 단백질과 M 세포 특이 펩타이드가 도입된 신규한 재조합 발현벡터와 상기 신규한 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 유산균주를 제공하는 효과가 있으며 상기 형질전환 유산균주를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 경구투여용 백신 및 축산용 사료조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 단백질 발현벡터를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 Lactococcus lactis IL1403 유산균의 균체 및 상층액에서 단백질 추출을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 형질전환 유산균 균주에서 mIL6, mIL6-CKS9, CKS9-mIL6 발현 및 분비를 나타낸 사진도이다.
도 4는 본 발명에 따른 mIL6, mIL6-CKS9, CKS9-mIL6 형질전환체의 배양상층액 내 단백질 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 시간에 따른 균주의 성장률과 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 세포증식 실험을 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명에 따른 7TD1 증식실험에서 세포조절활성을 평가한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 Closed ileal loop assay 및 immunohistochemistry의 모식도이다.
도 9는 본 발명에 따른 유산균 생산 면역조절 단백질의 M 세포 표적능을 확인한 사진도이다.
도 2는 본 발명에 따른 Lactococcus lactis IL1403 유산균의 균체 및 상층액에서 단백질 추출을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 형질전환 유산균 균주에서 mIL6, mIL6-CKS9, CKS9-mIL6 발현 및 분비를 나타낸 사진도이다.
도 4는 본 발명에 따른 mIL6, mIL6-CKS9, CKS9-mIL6 형질전환체의 배양상층액 내 단백질 함량을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 시간에 따른 균주의 성장률과 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 세포증식 실험을 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명에 따른 7TD1 증식실험에서 세포조절활성을 평가한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 Closed ileal loop assay 및 immunohistochemistry의 모식도이다.
도 9는 본 발명에 따른 유산균 생산 면역조절 단백질의 M 세포 표적능을 확인한 사진도이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
:
mIL
-6 유전자
클로닝
및 재조합 발현벡터 구축
Murine Interleukin 6 (mIL-6)를 유산균 내에서 발현시키기 위해 Usp45 분비 서열(secreation signal), mIL-6, M-cell targeting peptide ligand (CKSTHPLSC)를 순서를 달리하여 연결한 유전자 Usp45-IL6, Usp45-IL6-CKS9, USP45-CKS9-IL6 (하기 [표 1]참조)의 서열을 유산균 숙주에 적합하도록 codon optimization 후 oligo-annealing 기법 및 PCR 기법을 통해 클로닝하였다.
| 서열목록 1 USP45-IL6 (651bp) |
ATGAAAAAGAAAATCATCTCTGCGATCCTGATGTCTACCGTTATCCTGTCTGCGGCAGCACCGCTGTCTGGTGTTTACGCGGACACCTTCCCGACCTCTCAGGTTCGTCGCGGCGACTTCACTGAAGACACTACTCCGAATCGCCCGGTTTACACTACCTCTCAAGTTGGCGGTCTGATTACCCATGTGCTGTGGGAGATTGTTGAAATGCGTAAAGAACTGTGTAATGGTAACAGCGATTGCATGAATAATGACGACGCGCTCGCAGAGAACAACCTGAAGCTCCCAGAGATCCAGCGCAATGACGGTTGTTATCAAACTGGTTATAATCAAGAAATTTGCCTGCTGAAGATTTCCTCTGGCCTGCTCGAATACCACAGCTACCTGGAGTACATGAAGAATAACCTCAAAGACAATAAGAAGGATAAGGCGCGTGTGCTCCAGCGTGATACCGAGACTCTCATTCATATCTTTAATCAGGAGGTAAAGGATCTGCATAAGATCGTTCTGCCAACTCCAATCTCTAACGCTCTGCTGACTGATAAACTGGAAAGCCAGAAAGAATGGCTGCGTACCAAGACTATCCAATTTATCCTCAAATCCCTCGAAGAATTTCTCAAGGTAACTCTCCGTTCTACTCGCCAGACTTAA |
| 서열목록 2 USP45-IL6-CKS9 (699bp) |
ATGAAAAAGAAAATCATCTCTGCGATCCTGATGTCTACCGTTATCCTGTCTGCGGCAGCACCGCTGTCTGGTGTTTACGCGGACACCTTCCCGACCTCTCAGGTTCGTCGCGGCGACTTCACTGAAGACACTACTCCGAATCGCCCGGTTTACACTACCTCTCAAGTTGGCGGTCTGATTACCCATGTGCTGTGGGAGATTGTTGAAATGCGTAAAGAACTGTGTAATGGTAACAGCGATTGCATGAATAATGACGACGCGCTCGCAGAGAACAACCTGAAGCTCCCAGAGATCCAGCGCAATGACGGTTGTTATCAAACTGGTTATAATCAAGAAATTTGCCTGCTGAAGATTTCCTCTGGCCTGCTCGAATACCACAGCTACCTGGAGTACATGAAGAATAACCTCAAAGACAATAAGAAGGATAAGGCGCGTGTGCTCCAGCGTGATACCGAGACTCTCATTCATATCTTTAATCAGGAGGTAAAGGATCTGCATAAGATCGTTCTGCCAACTCCAATCTCTAACGCTCTGCTGACTGATAAACTGGAAAGCCAGAAAGAATGGCTGCGTACCAAGACTATCCAATTTATCCTCAAATCCCTCGAAGAATTTCTCAAGGTAACTCTCCGTTCTACTCGCCAGACTAGCGGCGGTGGCGGTGCTTGCAAAAGCACTCATCCGCTGTCTTGTGGTTAA |
| 서열목록 3 USP45-CKS9-IL6 (696bp) |
ATGAAAAAGAAAATCATCTCTGCGATCCTGATGTCTACCGTTATCCTGTCTGCGGCAGCACCGCTGTCTGGTGTTTACGCGGACACCGCTTGCAAAAGCACTCATCCGCTGTCTTGTGGCGGTGGCGGTAGCTTTCCGACTTCCCAAGTGCGTCGCGGCGACTTCACTGAAGACACTACTCCGAATCGCCCGGTTTACACTACCTCTCAAGTTGGCGGTCTGATTACCCATGTGCTGTGGGAGATTGTTGAAATGCGTAAAGAACTGTGTAATGGTAACAGCGATTGCATGAATAATGACGACGCGCTCGCAGAGAACAACCTGAAGCTCCCAGAGATCCAGCGCAATGACGGTTGTTATCAAACTGGTTATAATCAAGAAATTTGCCTGCTGAAGATTTCCTCTGGCCTGCTCGAATACCACAGCTACCTGGAGTACATGAAGAATAACCTCAAAGACAATAAGAAGGATAAGGCGCGTGTGCTCCAGCGTGATACCGAGACTCTCATTCATATCTTTAATCAGGAGGTAAAGGATCTGCATAAGATCGTTCTGCCAACTCCAATCTCTAACGCTCTGCTGACTGATAAACTGGAAAGCCAGAAAGAATGGCTGCGTACCAAGACTATCCAATTTATCCTCAAATCCCTCGAAGAATTTCTCAAGGTAACTCTCCGTTCTACTCGCCAGACTTAA |
본 발명의 상기 유전자서열 mIL-6, CKS-mIL6, mIL6-CKS9의 발현을 위하여 플라스미드 pIL252를 이용하였다(도 1). pIL252 벡터시스템에서 Usp45 secreation signal을 도입하여 유산균에서 분비되도록 하였고 mIL6의 N 말단과 C 말단에 M cell 표적 펩타이드를 결합시킨 단백질을 발현할 수 있는 형질전환 유산균주를 구축한 후 표적 펩타이드의 연결 유무와 연결위치에 따른 표적능을 비교하기 위하여 하기 실험을 실시하였다.
상기 형질전환된 유산균주 Lactococcus lactis IL1403(USP45-IL6-CKS9)를 한국생명공학연구원에 2013년 9월 25일자로 기탁번호 KCTC12492BP로 기탁하였다.
실험예
1. 형질전환 유산균의 단백질 발현 검정실험
표적 펩타이드 연결유무와 연결위치에 따른 상기 [표 1]의 3종의 면역활성물질 IL6를 발현할 수 있는 형질전환 L. lactis IL1403 유산균주에서 면역활성물질의 발현과 분비를 웨스턴 블럿팅(western blot)을 이용하여 검증한 후 선발하였다. 형질전환된 Lactococcus lactis IL1403를 M17G(M17, 5% Glucose) 배지에서 배양하여 mIL6의 발현여부를 검정하였다.
37℃에서 16시간 배양한 형질전환 Lactococcus lactis IL1403 10 mL을 원심분리기(4,500rpm)에서 배양 상층액과 균체로 분리하였다(도 2). 배양 상층액을 버리고 균체는 증류수로 2번 세척(washing)한 후, 펠릿(pellet)에 500 ul의 증류수와 glass bead를 첨가하고 bead beater를 이용하여 30분 동안 균체를 파쇄하였다. 다시 원심분리기(13,000rpm)를 이용해 세포질 단백질이 용해된 상층액만 취하여 SDS page와 western blot을 진행하여 단백질 발현을 검정하였다. 배양 상층액은 TCA(trichloroacetic acid)로 단백질을 농축시켜서 검정하였다. 농축방법은 1.6 mL의 배양상층액에 80% TCA(trichloroacetic acid)(v/v) 0.4 mL을 첨가하여 얼음에서 30분 동안 배양(incubation)한 다음 원심분리기(13,000rpm)로 분리하여 단백질 침전을 얻었다. 여기에 cold acetone 0.3 mL를 첨가하여 vortexing으로 세척하고 다시 원심분리기(13,000rpm)로 상층액을 제거하였다. 단백질 침전물은 Tris-Hcl (pH=8.0) 0.5 mL 에 녹여 SDS page 및 western blot을 진행하여 단백질 발현을 검정하였다.
실험결과, 세포 내 단백질에서 mIL6 특이적인 밴드를 감지할 수 있었고 IL6-CKS9과 CKS9-IL6 단백질의 경우 표적 펩타이드가 연결되어 있기 때문에 mIL6보다 조금 위에서 감지되는 양상을 보였다(도 3). 상층액으로의 분비되는 단백질 또한 세 가지 균주에서 전부 감지되었고 밴드 양상은 세포 내 단백질보다 secretion signal이 떨어져 나갔기에 낮은 밴드 패턴을 보였다.
하기 [표 2]에는 상기 세 가지 밴드의 아미노산 서열을 나타내었다.
| 서열목록 4 USP45-IL6 (216 a.a) |
MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYADTFPTSQVRRGDFTEDTTPNRPVYTTSQVGGLITHVLWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLLKISSGLLEYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKLESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQT |
| 서열목록 5 USP45-IL6-CKS9 (232 a.a) |
MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYADTFPTSQVRRGDFTEDTTPNRPVYTTSQVGGLITHVLWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLLKISSGLLEYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKLESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQTSGGGGACKSTHPLSCG |
| 서열목록 6 USP45-CKS9-IL6 (231a.a) |
MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYADTACKSTHPLSCGGGGSFPTSQVRRGDFTEDTTPNRPVYTTSQVGGLITHVLWEIVEMRKELCNGNSDCMNNDDALAENNLKLPEIQRNDGCYQTGYNQEICLLKISSGLLEYHSYLEYMKNNLKDNKKDKARVLQRDTETLIHIFNQEVKDLHKIVLPTPISNALLTDKLESQKEWLRTKTIQFILKSLEEFLKVTLRSTRQT |
실험예
2. 형질전환
유산균주의
성장능력 및
pH
변화실험
본 발명에 따라 3종의 면역활성물질을 분비할 수 있는 형질전환 L. lactis IL1403 유산균주를 선발한 후 배양하여 wild type 대비 균체 성장능력 및 산 생성능력 차이를 검정하였고, signal peptide 종류에 다른 배양 상층액 상의 단백질 분비 효율을 ELISA 기법을 통해 비교 분석하였다.
앞서 선발된 세 가지 유산균주 Lactococcus lactis IL1403(IL6), L. lactis IL1403(IL6-CKS9)과 L. lactis IL1403(CKS9-IL6)의 형질전환체 세포 외 mIL6 분비효율을 검증하기 위해 mIL6 특이적인 항체를 이용한 고감도 ELISA 기법을 이용하여 배양 상층액의 단백질의 함량을 측정하였다. 형질전환 균주를 배양하기 시작한 0시간에서 25시간까지 배양 상층액으로 분비되어 축적되는 mIL6의 양을 측정한 결과, L.lactis IL1403(IL6) 형질전환체가 L. lactis IL1403 (IL6-CKS9), L. lactis IL1403 (CKS9-IL6)보다 단백질 분비 양 및 축적량이 더 높은 양상을 보였고 1,000ng/mL 이상의 수준까지 도달하였다(도 4).
한편, 재조합 mIL6를 분비하는 능력을 가지는 본 발명 형질전환체가 wild type 유산균과 비교하여 생리적 특성에 변화가 초래하였는지 알아보기 위해 시간에 따른 균주의 성장률과 산 생산능력 (pH 변화)를 살펴보았다. 실험 결과, 본 발명 3종의 형질전환체가 wilt type에 비해 log phase로 들어가는 시점이 다소 지연되는 것을 관찰할 수 있었고, 산 생산능력 또한 wild type에 비해 형질전환체에서 다소 떨어지는 것을 볼 수 있었다(도 5). 그러나 성장률과 산 생산능력에 있어서는 wild type과 두 가지 형질전환체는 전체적으로 두드러진 큰 차이를 보이지는 않았다.
실험예
3. 본 발명 재조합 단백질의
In
vitro
세포증식실험
본 발명에 따른 형질전환 유산균에 의해 분비된 배지 내의 mIL-6, CKS-mIL6, mIL6-CKS9 단백질의 세포조절 활성 여부를 검정하기 위해서 IL-6에 의존적으로 성장하는 7TD1 cell line(hybridoma cell)을 이용하여 in vitro cell proliferation assay를 실시하였다(도 6).
7TD1 cell을 계대배양을 통해 100mm 세포배양접시에서 RPMI 1640 (5% FBS, 2.5×10-5M 2-mercaptoethanol, 0.5ng.ml recombinant mouse IL6) 10 mL에 배양을 하다가 실험하기 4일 전에 recombinant mouse IL6가 존재하지 않는 배양액으로 2번 washing한 후 다시 recombinant mouse IL6가 존재하지 않는 배양액에서 2일 동안 배양하여 굶주림 상태로 만들어 준다. 2일 후, trypan blue로 세포 수를 센 후 96 well에 2×106이 되게끔 분주한 후 적정한 농도로 희석한 재조합 유산균 균주의 상층액을 IL6 자원이 되게끔 첨가하여 준다. 첨가한 최종 IL6의 농도는 5pg/mL,10pg/mL, 20pg/mL이 되게끔 정량하여 첨가하였고 상용 mIL6와 mIL6를 첨가하지 않은 그룹을 대조군으로 하여 본 발명에 따른 형질전환 유산균주에 의해 생산/분비된 재조합 mIL-6, CKS-mIL6, mIL6-CKS9의 세포 성장 촉진 여부를 MTS assay를 통해 확인하였다.
실험 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 세 가지 수준의 처리농도에서 재조합 IL6-CKS9과 IL6를 분비하는 유산균주의 상층액을 처리한 그룹에서는 세포증식이 상용 purified mIL6처리 그룹과 같은 수준으로 나타내고 있었지만 CKS9-IL6를 분비하는 유산균주의 상층액을 처리한 그룹에서는 세포증식이 mIL6를 첨가하지 않은 그룹만큼 한 정도밖에 미치지 못하였다. 따라서 본 발명 유산균주가 분비하는 IL6와 IL6-CKS9은 면역활성물질로서의 단백질 활성을 보인 반면, CKS9-IL6는 그 단백질 활성을 잃는 결과를 초래하였다.
실험예
4.
본 발명 재조합 단백질의
In
vivo
M 세포
표적능
실험
본 발명에 따른 형질전환 유산균주에 의해 배양상층액에 분비된 재조합 mIL-6, CKS-mIL6, mIL6-CKS9 단백질의 M cell 표적능 보유 여부를 In vivo 에서 검정하기 위해 실험동물의 Peyer's patch 주위의 소장 부위를 결착한 후 mIL-6, CKS-mIL6, mIL6-CKS9를 주입하여 관찰하는 closed-ileal loop assay를 진행하여 immunohistochemistry 방법을 통해 M cell을 표적능을 검정하였다(도 8).
8주령의 BalB/c 쥐를 하룻밤 굶주린 후 마취를 통해 개복하여 소장을 들어낸 후 illeum 부분의 peyer’s patch를 기준으로 양 옆 1cm의 간격을 두고 끈으로 묶어 ileal loop을 만들었다. 정량을 통하여 1ug/200ul의 재조합 mIL6, mIL6-CKS9, CKS9-IL6를 함유한 재조합 유산균 상층액을 ileal loop에 주입하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. ileal loop을 조심히 잘라서 PBS를 이용하여 세척한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 1시간, 20% 수크로즈(sucrose)에 overnight으로 담근 후 OCT compound를 이용하여 cryo-section이 용이하게끔 조직을 얼린 후 14um의 두께로 cryosectioning을 하였다. Sectioning한 조직단편은 아세톤(acetone)에서 5분 동안 고정시키고 PBS로 세척을 한 후 3%의 goat serum으로 blocking을 1시간 진행하였다. Mouse anti-IL6를 1시간, goat anti-mose IgG를 1시간 처리하여 mIL6를 detection하였고 UEA-1을 1시간 처리하여 Peyer’s patch 의 M cell을 염색하고 DAPI로 세포핵을 염색하였다. 실험 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 IL6-CKS9, 즉 C 말단에 표적 펩타이드가 연결된 단백질만 표적능을 보유하고 있었고 N 말단에 표적펩타이드를 연결한 CKS9-IL6는 표적능력을 나타내고 있지 않았다(도 9).
<110> SNU R&DB FOUNDATION
<120> M cell targeting moiety conjugated IL-6 producing recombinant
Lactococcus lactis IL1403
<130> 1
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 651
<212> DNA
<213> murine
<400> 1
atgaaaaaga aaatcatctc tgcgatcctg atgtctaccg ttatcctgtc tgcggcagca 60
ccgctgtctg gtgtttacgc ggacaccttc ccgacctctc aggttcgtcg cggcgacttc 120
actgaagaca ctactccgaa tcgcccggtt tacactacct ctcaagttgg cggtctgatt 180
acccatgtgc tgtgggagat tgttgaaatg cgtaaagaac tgtgtaatgg taacagcgat 240
tgcatgaata atgacgacgc gctcgcagag aacaacctga agctcccaga gatccagcgc 300
aatgacggtt gttatcaaac tggttataat caagaaattt gcctgctgaa gatttcctct 360
ggcctgctcg aataccacag ctacctggag tacatgaaga ataacctcaa agacaataag 420
aaggataagg cgcgtgtgct ccagcgtgat accgagactc tcattcatat ctttaatcag 480
gaggtaaagg atctgcataa gatcgttctg ccaactccaa tctctaacgc tctgctgact 540
gataaactgg aaagccagaa agaatggctg cgtaccaaga ctatccaatt tatcctcaaa 600
tccctcgaag aatttctcaa ggtaactctc cgttctactc gccagactta a 651
<210> 2
<211> 699
<212> DNA
<213> murine
<400> 2
atgaaaaaga aaatcatctc tgcgatcctg atgtctaccg ttatcctgtc tgcggcagca 60
ccgctgtctg gtgtttacgc ggacaccttc ccgacctctc aggttcgtcg cggcgacttc 120
actgaagaca ctactccgaa tcgcccggtt tacactacct ctcaagttgg cggtctgatt 180
acccatgtgc tgtgggagat tgttgaaatg cgtaaagaac tgtgtaatgg taacagcgat 240
tgcatgaata atgacgacgc gctcgcagag aacaacctga agctcccaga gatccagcgc 300
aatgacggtt gttatcaaac tggttataat caagaaattt gcctgctgaa gatttcctct 360
ggcctgctcg aataccacag ctacctggag tacatgaaga ataacctcaa agacaataag 420
aaggataagg cgcgtgtgct ccagcgtgat accgagactc tcattcatat ctttaatcag 480
gaggtaaagg atctgcataa gatcgttctg ccaactccaa tctctaacgc tctgctgact 540
gataaactgg aaagccagaa agaatggctg cgtaccaaga ctatccaatt tatcctcaaa 600
tccctcgaag aatttctcaa ggtaactctc cgttctactc gccagactag cggcggtggc 660
ggtgcttgca aaagcactca tccgctgtct tgtggttaa 699
<210> 3
<211> 696
<212> DNA
<213> murine
<400> 3
atgaaaaaga aaatcatctc tgcgatcctg atgtctaccg ttatcctgtc tgcggcagca 60
ccgctgtctg gtgtttacgc ggacaccgct tgcaaaagca ctcatccgct gtcttgtggc 120
ggtggcggta gctttccgac ttcccaagtg cgtcgcggcg acttcactga agacactact 180
ccgaatcgcc cggtttacac tacctctcaa gttggcggtc tgattaccca tgtgctgtgg 240
gagattgttg aaatgcgtaa agaactgtgt aatggtaaca gcgattgcat gaataatgac 300
gacgcgctcg cagagaacaa cctgaagctc ccagagatcc agcgcaatga cggttgttat 360
caaactggtt ataatcaaga aatttgcctg ctgaagattt cctctggcct gctcgaatac 420
cacagctacc tggagtacat gaagaataac ctcaaagaca ataagaagga taaggcgcgt 480
gtgctccagc gtgataccga gactctcatt catatcttta atcaggaggt aaaggatctg 540
cataagatcg ttctgccaac tccaatctct aacgctctgc tgactgataa actggaaagc 600
cagaaagaat ggctgcgtac caagactatc caatttatcc tcaaatccct cgaagaattt 660
ctcaaggtaa ctctccgttc tactcgccag acttaa 696
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> murine
<400> 4
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr Phe Pro Thr
20 25 30
Ser Gln Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg
35 40 45
Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu
50 55 60
Trp Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp
65 70 75 80
Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro
85 90 95
Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu
100 105 110
Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr
115 120 125
Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala
130 135 140
Arg Val Leu Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln
145 150 155 160
Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr
180 185 190
Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val
195 200 205
Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr
210 215
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> murine
<400> 5
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr Phe Pro Thr
20 25 30
Ser Gln Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg
35 40 45
Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu
50 55 60
Trp Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp
65 70 75 80
Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro
85 90 95
Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu
100 105 110
Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr
115 120 125
Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala
130 135 140
Arg Val Leu Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln
145 150 155 160
Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn
165 170 175
Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr
180 185 190
Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val
195 200 205
Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ala Cys Lys
210 215 220
Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Gly
225 230
<210> 6
<211> 651
<212> PRT
<213> murine
<400> 6
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
370 375 380
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
435 440 445
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
530 535 540
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
580 585 590
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
595 600 605
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
610 615 620
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
625 630 635 640
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
645 650
Claims (6)
- 서열목록 5에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 USP45-IL6-CKS9 단백질.
- 제 1항의 USP45-IL6-CKS9 단백질을 코딩하는 서열목록 2에 기재된 염기서열.
- 제 2항의 USP45-IL6-CKS9 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제 3항의 재조합 벡터가 유산균주에 도입된 것이 특징인 형질전환된 유산균주 Lactococcus lactis IL1403(USP45-IL6-CKS9) KCTC 12492BP 균주.
- 제 4항 기재의 형질전환 유산균주 Lactococcus lactis IL1403(USP45-IL6-CKS9)를 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 면역 증강용 경구투여 백신 조성물.
- 제 4항 기재의 형질전환 유산균주 Lactococcus lactis IL1403(USP45-IL6-CKS9)를 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 면역 증강용 가축사료.
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|---|---|---|---|---|
| KR102538643B1 (ko) * | 2022-11-14 | 2023-06-01 | 주식회사 유니베라 | 항염 활성, 항균 활성, 내산성 및 내담즙성을 가지는 알로에 유래 신규 락토코쿠스 락티스 아종 호르드니아에 uab1 균주 및 이의 용도 |
-
2013
- 2013-10-22 KR KR1020130126051A patent/KR101590553B1/ko active IP Right Grant
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