CN105296408A - 一种新型抗i型糖尿病的重组乳酸菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种新型抗I型糖尿病的重组乳酸菌及其应用属于生物医药领域；本发明公开一种以乳酸乳球菌(Lactococcus？lactics)为载体的抗I型糖尿病疫苗及其制备方法和应用。利用本实验室的微基因技术平台，构建了一种以乳酸乳球菌为载体，经诱导后表达融合蛋白HSP65-6IA2P2的重组乳酸乳球菌疫苗。通过Westernblot鉴定检测融合蛋白疫苗的正确表达。体内动物实验证明该疫苗通过口服给药途径能显著降低NOD小鼠糖尿病的发生，能起到防治I型糖尿病的作用，对于糖尿病的预防有良好的临床应用前景。

Description

一种新型抗I型糖尿病的重组乳酸菌及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及到一种以乳酸乳球菌为载体的抗I型糖尿病疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期高血糖会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。临床上主要表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食、消瘦等表现。糖尿病是现代疾病中的第二杀手，其对人体的危害仅次于癌症。I型糖尿病(IDDM)是由于胰岛β细胞破坏或功能缺失导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病，患者血糖水平持续升高，出现糖尿病。目前治疗I型糖尿病的方法主要有以下几种：皮下注射胰岛素及其类似物、胰岛移植、干细胞治疗、通过基因工程技术再造能分泌胰岛素的克隆细胞来代替胰岛细胞、以及预防或治疗性疫苗。目前，利用疫苗来预防1型糖尿病的越来越受到人们的关注。

热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)60是胰岛β细胞主要的自身抗原之一，它具有抗原肽分子伴侣作用；巨噬细胞、DC和NK细胞等表面均存在HSP60受体，抗原和HSP60的融合蛋白具有靶向免疫细胞的作用；另外，HSP60也具有免疫佐剂功能，可诱导DC活化，HSP60通过其受体与APC细胞作用，可诱发一系列的免疫激活事件，包括免疫细胞成熟、活化和抗原的交叉激活。实验发现，结合分歧杆菌HSP65与人源HSP60有大约50％的同源性，且HSP65作为卡介苗的主要抗原已广泛用于人类肺结核的防治，因此本疫苗选用HSP65作为抗原表位的载体。

IA2P2是一段小肽，含有至少一个对I型糖尿病发生有重要作用的T细胞表位。其相应的自身抗体也是I型糖尿病的特异性血清标志物，对新发病的I型糖尿病患者敏感性很高。实验证实，通过诱发机体产生针对IA2P2的强免疫应答，可有效地抑制I型糖尿病的发生。但IA2P2的免疫源性较弱，发明人通过多次重复串联和大分子承载的方法发现可增强其免疫源性。因此，鉴于HSP65可承载的表位长度及IA2P2可能含有的表位数，本发明IA2P2进行6次重复串联，并与HSP65融合，构建出HSP65-6IA2P2的编码基因序列。

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在食品工业中应用广泛，是一种公认的食品级微生物，安全性较高。此外，乳酸乳球菌作为一种肠道益生菌，具备多种生理功能：控制肠内感染、抗肿瘤活性等，还能促进小肠局部细胞免疫和体液免疫。并且乳酸乳球菌的遗传背景明确，基因操作技术纯熟。因此，乳酸乳球菌是安全的疫苗递送载体，不会在肠道内定植，不会危害肠道内正常益生菌群和造成潜在的基因污染。消化道每天都会接触到食物中的非己抗原，但多数人对食物均不产生免疫反应，主要因为人类的肠道黏膜免疫系统能及时诱导对食物中无害抗原的耐受。这种粘膜耐受机制能够扩散到全身，诱导全身性的耐受反应。而用乳酸菌递呈的蛋白也会被识别为食物中的无害抗原而产生耐受。因此，本疫苗选用乳酸乳球菌作为载体。通过口服活菌疫苗的方式，达到黏膜耐受的效果，克服了传统疫苗安全性差、生产成本高、接种方式难接受的缺陷。

发明内容

本发明目的之一是提供一种以乳酸乳球菌为载体的抗I型糖尿病疫苗的制备和应用，该疫苗能有效预防和治疗I型糖尿病。

一种重组乳酸菌，其特征在于该重组乳酸乳球菌命名为乳酸乳球菌NZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2LactococcuslacticsNZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏时间：2014年11月28日；保藏编号：CCTCCNO：M2014609。

该重组乳酸乳球菌由融合蛋白HSP65-6IA2P2的编码基因通过质粒PCYT电转入乳酸乳球菌中获得；其中所述融合蛋白HSP65-6IA2P2是由疫苗肽IA2P2重构肽段重复六次融合在HSP65载体的C端构成；所述乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000基因工程重组菌；所述HSP65-6IA2P2融合蛋白的氨基酸序列如SEQNO：1所示。

所述的HSP65-6IA2P2融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQNO：2所示。

具体的来说：将IA2P2重构肽段，重复六次融合在HSP65载体的C端(HSP65-6IA2P2)，共由690个氨基酸组成。序列表中SEQNO：1的氨基末端第1-540位为HSP65序列，氨基末端第541-542位为AS(丙氨酸-丝氨酸)，氨基末端第543-565位为IA2P2序列，其中IA2P2段中的前10个氨基酸来自于IA2，后13个氨基酸来自于人HSP60蛋白序列。自氨基酸第566-567、591-592、616-617、641-642、666-667为5个重复的柔性连接肽SS(丝氨酸-丝氨酸)。氨基酸第568-590、593-615、618-640、643-665、668-690为5个重复的IA2P2肽段。

所述HSP65-6IA2P2融合蛋白的核苷酸序列具体可如序列表中SeqNO.3所示。

所述HSP65-6IA2P2融合蛋白的编码基因可通过重组质粒PCYT：HSP65-6IA2P2导入乳酸乳球菌。所述重组质粒PCYT：HSP65-6IA2P2是将PCYT：HSP65-6P277中的P277基因用所述融合蛋白编码基因替代得到的重组质粒；而所述的PCYT：HSP65-6P277是将PCYT：NUC中的NUC基因用HSP65-P277编码基因代替得到。所述表达载体PCYT：NUC为PWV01衍生载体，启动子为PnisA，携带氯霉素抗性基因以及多克隆位点(MCS)。

所述的重组乳酸乳球菌在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

所述的HSP65-6IA2P2在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

一种抗I型糖尿病疫苗，其特征在于其活性成分含有权利要求1所述的重组乳酸乳球菌。

一种检测试剂盒，其特征含有权利要求1所述的权利要求1所述的重组乳酸乳球菌或HSP65-6IA2P2。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌可为LactococcuslactisNZ9000型，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌。

本发明所提供的表达载体可为PCYT-NUC，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌表达载体。

有益效果：

1、由于IA2P2为小肽，免疫原性较弱。而HSP65的强抗原性可以起到免疫佐剂的作用，可显著增强与其结合的抗原肽的免疫原性，并且6次串联IA2P2重复表位序列，也可以加强免疫原性。因此，本疫苗将6次串联IA2P2重复表位序列与HSP65羧基端融合，更容易产生高滴度、高特异性的抗体，从而对于I型糖尿病的治疗效果更好。

2、研究表明，HSP65自身有蛋白酶的催化活性，容易被自身的蛋白酶降解。这样就限制了热休克蛋白的应用。在HSP65的分离纯化过程中，HSP65及其融合蛋白容易发生降解。即使在纯化过程中添加蛋白酶抑制剂或者对HSP65进行改构，也不能得到明显抑制HSP65降解的效果。因此，需要严格控制操作条件及利用组氨酸标签系统来尽量减少热休克蛋白及其融合蛋白降解程度。这给纯化过程造成极大不便，而本疫苗通过乳酸乳球菌作为递送融合蛋白HSP65-6IA2P2的载体，使蛋白在机体中进行表达，巧妙地避免了蛋白降解的问题，同时也省去了复杂的纯化过程，间接的节约了生产成本，对于实现大规模生产有重要意义。

3、本疫苗选用PCYT质粒作为载体，适用于异源性抗原在乳酸菌中的诱导表达。PCYT载体不仅能在E.coliDH5i中复制，而且可以在LactococcuslactisNZ90000中稳定表达。

4、传统疫苗一般通过皮下注射的方式进行给药，不仅存在安全性问题，而且这种侵入式的给药方式很难被接种者接受，尤其是青少年和儿童。而本疫苗打破桎梏，通过口服给药的方式，方便快捷，经济适用，易为青少年儿童接受。经实验证实，本疫苗经过抗体检测能稳定表达融合蛋白，实现粘膜给药发挥药效。

5、本疫苗采用乳酸乳球菌作为载体。乳酸乳球菌不会在肠道内定植，也不会危害肠道内正常益生菌群和造成潜在的基因污染。口服乳酸乳球菌试验显示其在肠道内能够存活3天，且4天后在排泄物中检测不到任何关于乳酸乳球菌的特征基因标记。乳酸乳球菌能够顺利避开胃酸的侵袭，但在十二指肠却有大部分的被溶解，但其余的乳酸乳球菌能够在小肠的后段得到复苏。小肠内环境温和，肠道长度较长，蠕动缓慢。分泌表达的蛋白能定向在这里得到较好的吸收，并被免疫细胞所识别。此外乳酸菌基因操作技术成熟，抗原蛋白能稳定表达，也便于工业化生产。

附图说明：

图1融合蛋白组成结构示意图。

HSP65是结核分枝杆菌热休克蛋白65，IA2P2是由人热休克蛋白HSP60中的一段肽段和胰岛瘤抗原-2中的B表位融合形成的肽段，AS(丙氨酸-丝氨酸)和SS(丝氨酸-丝氨酸)是柔性连接氨基酸。

图2PCYT：HSP65-6IA2P2质粒构建示意图。

以PUC19：6IA2P2质粒为模板，PCR扩增出6IA-2-P2序列。用NheI和HindIII双酶切6IA2P2，并插入到经NheI和HindIII双酶切后的PCYT：HSP65-6P277，得到PCYT：HSP65-6IA2P2。

图3经过PCR获得6IA2P2基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

M为marker，A图中Lane1表示PCR后的产物IA2P2，Lane2表示pCYT：HSP65-6P277经过NheI和HindIII双酶切后的产物，Lane3表示pCYT：HSP65-6P277经NheI酶切后的产物。

B图Lane1为PCR的产物IA2P2，Lane2表示质粒经过双酶切后的产物。

图4融合蛋白编码基因的测序图。

图5WesternBlot检测重组乳酸乳球菌在不同培养时间表达融合蛋白结果。

图6重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠的发病率影响。

糖尿病发病的情况用高血糖值来表示，连续两次血糖值高于11.1mmol/1判定为发病。如图所示，在4周龄时，各组小鼠都是健康且未发病的，而从12周龄起，对照组.lactisNZ9000组)NOD小鼠即陆续发病，在16周龄时发病率明显上升，到26周龄时，累积有92％的NOD小鼠发病；而实验组(L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)的发病率在20～32周内一直维持在较低水平，到观测期结束(32周)时发病率只有58％。结果表明，重组乳酸乳球菌疫苗可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率。

图7重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠的糖耐量影响。

如图所示，在进食后的一段时间，实验组(L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)的糖耐量始终比对照组(L.lactisNZ9000组)低，表明重组乳酸乳球菌疫苗可以较好控制NOD小鼠的糖耐量。

图8重组乳酸乳球菌疫苗对终末期NOD小鼠的血糖影响。

如图所示，对照组(L.lactisNZ9000组)仅有一只NOD小鼠血糖正常，一只高血糖，其余死亡。而实验组(L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)有5只NOD小鼠血糖正常。表明重组乳酸乳球菌疫苗可在一定程度上控制小鼠血糖。

具体实施方式：

以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。

本说明书中所提到的材料：

1.菌种，质粒和动物

(1)克隆用大肠杆菌EscherichiacoliDH5a来源于Novagen，(2)表达用乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000和穿梭表达载体PCYT：NUC按照文献“EnoufV，LangellaP，CommissaireJ，etal.Bovinerotavirusnonstructuralprotein4producedbyLactococcuslactisisantigenicandimmunogenic[J].Appl.Environ.Microbiol，2001，67(4)：1423-1428.”的方法制备获得(3)4周龄的雌性NOD小鼠，购自扬州大学实验动物中心，许可证号：SC’XK(Su)2012-0004。

2.酶、试剂和主要仪器

(1)分子克隆工具酶为加拿大Fermentence公司产品；(2)质粒抽提试剂盒、PCR胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒和DAB显色试剂盒为BBI有限公司产品；(3)诱导剂Nisin为浙江银象生物公司产品；(4)酶标仪、电击转化仪等美国Bio-Rad公司产品；PCR仪为德国Eppendorf公司产品。

3.培养基

(1)LB培养基，配方如下：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，121℃高压蒸气灭菌。

(2)GM17培养基，配方如下：称取大豆胨5.0g，蛋白胨2.5g，酪蛋白胨2.5g，酵母浸粉2.5g，牛肉粉5.0g，乳糖5.0g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19.0g，硫酸镁0.25g，葡萄糖5g，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至7.2，115℃高压蒸气灭菌。

本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、限制性内切酶酶切、DNA片段的回收、连接、化学转化大肠杆菌和电击转化乳酸乳球菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，PP.16-340。

4.抗体

(1)大鼠IA2P2抗血清按照文献“黄丽，潘科，孙远明.克喘免疫原CL13.2-BSA制备3中鼠抗血清效果比较[J].食品科学，2005，26(9)：494-497.”的方法制备获得，用作WesternBlot一抗；(2)辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品，用作WesternBlot二抗。

5.酶连免疫吸附实验(ELISA)试剂

(1)包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)。称取0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。(2)PBS缓冲液：0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)。称取0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。(3)抗体稀释液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.2％BSA。称取0.2gBSA加入配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml。(4)封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)和2.0％BSA。2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml。(5)洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)和0.05％Tween-20。将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。(6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(7)终止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

实施例1HSP65-6IA2P2基因的克隆

以载体上位于目地基因两侧的通用引物M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’和M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’分别作为上游、下游引物，两条引物由上海生工生物工程有限公司合成。PUC19质粒为模板进行PCR，获得了编码6IA2P2序列的基因片段。再用NheI和HindIII双酶切，连入同样用NheI和HindIII双酶切后的PCYT：HSP65-6P277载体，构建出PCYT：HSP65-6IA2P2。

PCR反应按如下条件进行：每步反应中上下引物都按1∶1比例混合，反应程序设置为94℃，1s；50℃，45s；72℃，50s；共30个循环，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图3)，条带位置与预期的一致。

将重组质粒PCYT：HSP65-6IA2P2转化至EcoliDH5a感受态细胞后，涂布到含12.5μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落。经酶切初筛阳性克隆，将阳性克隆送至上海生工生物公司进行测序，测序结果经比对后完全正确，至此融合蛋白基因，在大肠杆菌中构建完成。

实施例2重组质粒PCYT：HSP65-6IA2P2经电击转化导入乳酸乳球菌感受态细胞

乳酸乳球菌感受态细胞制备的过程大致如下：从新鲜GM17琼脂平板挑选单个菌落，接种10mLGM17培养基，30℃过夜静置培养。然后将1mL过夜培养物接种于50mL含1-2.5％甘氨酸的预热的GM17培养基中，30℃静置培养。监测OD_600nm。当培养物的OD值接近0.2-0.7时，取出培养物在冰上冷却10min-30min，再用灭菌管离心培养物，4℃5000g离心15min，弃上清，用等体积的冰预冷的OSPS缓冲液悬浮细胞沉淀两次，用1/100的OSPS重悬细胞。最后将细胞加入灭菌1.5mL的离心管，在干冰-乙醇浴中急冻，存细胞于-70℃或直接使用。电转化过程大致如下：将感受态细胞和重组质粒PCYT：HSP65-6IA2P2混合均匀后加入电击杯，加盖后将电击杯整个放入电转化仪槽子内进行瞬时电击。电脉冲为25μ、电压2.0-2.5kV。在此条件下，进行电脉冲，仪器显示4-5ms即可。电击过后，30℃静置恢复培养2h，然后涂布适量菌液至含氯霉素的GM17平板上筛选阳性克隆。至此我们成功获得含有目的蛋白基因的乳酸乳球菌菌株，该重组乳酸乳球菌命名为乳酸乳球菌NZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2LactococcuslacticsNZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏时间：2014年11月28日；保藏编号：CCTCCNO：M2014609；简称重组乳酸乳球菌菌株CCTCCNO：M2014609。

实施例3诱导重组乳酸乳球菌菌株CCTCCNO：M2014609表达融合蛋白HSP65-6IA2P2

将实施例2获得重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609，接种于GM17培养基中，30℃过夜培养；过夜培养液1∶100转接GM17培养基，30℃扩大培养，待菌生长至OD值为0.4～0.7时加入诱导剂Nisin，继续培养一段时间，收菌制备蛋白样品。

实施例4重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609疫苗的WesternBlot鉴定

鉴别实施例3获得蛋白样品用WesternBlot鉴定方法如下：用12％SDS-PAGE分离后，于含甲醇的转移缓冲液中30V电压过夜转移至硝酸纤维素膜上。然后将加入封闭液37℃摇动封闭1至2h，加入用PBS稀释200倍的血清样品进行杂交，37℃摇动杂交1h。50mL洗涤液洗膜4次，每次15min。洗涤后加入5000倍稀释的HRP标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育1h。洗涤后加入DAB显色液，直至出现明显条带后，用蒸馏水冲洗膜以终止反应。

如图5所示，从图中可见重组蛋白表达株CCTCCNO：M2014609诱导5h后蛋白表达量最高。

实施例5重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609疫苗特异性抗体的检测

偶联BSA的IA2P2为包被抗原检测PCYT：HSP65-6IA2P2组抗IA2P2抗体的产生情况，将抗原溶于包被稀释液中，浓度为100μg/mL。96孔酶标板每孔加入100μL包被抗原，4℃包被过夜。弃去包被液，加入封闭液200μL，37℃封闭1h。弃去封闭液，加入样品稀释液稀释的血清样本100μL(稀释比1∶50)，37℃孵育1h。弃去血清，PBST和自来水间隔洗涤三次。洗涤后，每孔加入样品稀释液稀释酶标二抗100μL(稀释比1∶10000)，37℃孵育1h。弃去二抗，洗涤。洗涤后，每孔加入100μL底物液(50μL底物A，50μL底物B)，37℃反应30min后，加入50μL2MH₂SO₄终止反应，用酶标仪在450nm波长测定每孔的光密度值OD_450nm。结果：通过ELISA检测，实施例2获得重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609，即以乳酸乳球菌为载体的PCYT：HSP65-6IA2P2疫苗能够产生抗IA2P2抗体。

实施例6重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609抗I型糖尿病疫苗药效学评价。

重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609抗I型糖尿病疫苗药效学评价主要有以下3个方面：

设置两组小鼠，一组为实验组(重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609，即L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)，一组为对照组(L.lactisNZ9000组)，每组12只NOD小鼠。

(1)发病率考察：动态检测两组NOD小鼠在观测期内发病率的变化。

(2)糖耐量考察：两组小鼠过夜禁食不禁水，第二天腹腔注射2g/kg葡萄糖。分别在第0min、15min、30min、60min、90min、120min剪尾尖测血糖。

(3)血糖考察：每次免疫前从NOD小鼠眼眶静脉取丛血一次，最后一次免疫结束后每两周取血一次。取血时用血糖检测仪检测血糖水平。两次连续测定血糖浓度＞11.1mmol/L视为发生糖尿病。

药效学实验结果：

(1)重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609疫苗对NOD小鼠的发病率影响。

糖尿病发病的情况用高血糖值来表示，连续两次血糖值高于11.1mmol/L判定为发病。如图6所示，在4周龄时，各组小鼠都是健康且未发病的，而从12周龄起，对照组(L.lactisNZ9000组)NOD小鼠即陆续发病，在16周龄时发病率明显上升，到26周龄时，累积有将92％的NOD小鼠发病；而实验组(L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)的发病率在20～32周内一直维持在较低水平，到观测期结束(32周)时发病率只有58％。结果表明，重组乳酸乳球菌疫苗可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率。

(2)重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609对NOD小鼠的糖耐量影响。

如图7所示，在进食后的一段时间，实验组(重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609，即L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)的糖耐量始终比对照组(L.lactisNZ9000组)低，表明重组乳酸乳球菌疫苗可以较好控制NOD小鼠的糖耐量。

(3)重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609疫苗对NOD小鼠的血糖影响。

如图8所示，对照组(L.lactisNZ9000组)仅有1只NOD小鼠未发病，一只发病，其余死亡。而实验组(重组乳酸乳球菌CCTCCNO：M2014609，即L.lactisPCYT：HSP65-6IA2P2组)有5只NOD小鼠存活且未发病。表明重组乳酸乳球菌疫苗可在一定程度上控制小鼠血糖。

除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种重组乳酸菌，其特征在于该重组乳酸乳球菌命名为乳酸乳球菌NZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2LactococcuslacticsNZ9000pCYT：HSP65-6IA2P2；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏时间：2014年11月28日；保藏编号：CCTCCNO：M2014609。

2.根据权利要求1所述的一种重组乳酸乳球菌，其特征在于该重组乳酸乳球菌由融合蛋白HSP65-6IA2P2的编码基因通过质粒PCYT电转入乳酸乳球菌中获得；其中所述融合蛋白HSP65-6IA2P2是由疫苗肽IA2P2重构肽段重复六次融合在HSP65载体的C端构成；所述乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000基因工程重组菌；所述HSP65-6IA2P2融合蛋白的氨基酸序列如SEQNO：1所示。

3.根据权利要求2所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述的HSP65-6IA2P2融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQNO：2所示。

4.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于所述的HSP65-6IA2P2在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

6.一种抗I型糖尿病疫苗，其特征在于其活性成分含有权利要求1所述的重组乳酸乳球菌。

7.种检测试剂盒，其特征含有权利要求1所述的重组乳酸乳球菌或HSP65-6IA2P2。