CN113845584A - 一种重组禽表皮生长因子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，具体而言本发明利用生物信息学手段确定了禽EGF(cEGF)基因序列信息，提供了一种重组禽表皮生长因子的制备方法，该制备方法借助改造后的质粒在乳酸菌表达系统进行表达，其无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体的，本发明涉及一种重组禽表皮生长因子的制备方法。
背景技术
表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)属于多肽，可以从唾液腺，肾脏，乳腺，胎盘和十二指肠Brunner腺体分泌和产生的体液中分离出来，同时也与动物肠道结构和功能密切相关。肠道是体内细胞更新速度较快的组织之一，EGF是肠道内环境平衡的调节因子和营养因子，具有促进胃肠上皮细胞增殖和分化的能力和对肠细胞更新产生影响。据报道，EGF具有多种生物学功能，外源供给EGF可提升肠道中消化酶活力、抑制肠道有害菌的定植和提高肠细胞吸收营养物质的能力，从而提高饲料利用率和营养物质的消化吸收。用EGF喂饲感染肠致病性大肠杆菌的断奶仔兔，可发现在各段小肠以及结肠病原菌定居数量的减少，说明EGF通过有效缓解致病菌的定植保护肠道。研究表明，EGF可以加速上皮细胞恢复和改善胃肠道疾病，如坏死性肠炎，腹泻以及短肠综合症。目前人用EGF已被日本列入化妆品添加剂名录，在畜禽方面虽有所研究但仍未广泛应用。
目前EGF的生产主要有两种途径，一种是从组织或体液成分中分离提取(201711285671.7)，一种是利用基因重组技术获取重组EGF蛋白。后者由于技术成熟、成本低廉、工艺简单且易于规模化生产得到了广泛的发展应用。相关专利也主要集中于人用EGF以及猪EGF重组技术方面，而其他动物方面暂时没有相关记录。目前，猪EGF(pEGF)主要有两种途径获得，一是从母猪乳液中进行分离，其工艺复杂且数量相当有限，另一种是通过工程菌表达获得，目前采用生物技术表达外源性的pEGF的工程菌有大肠杆菌(单雪芹等人，202010611379.5)、芽孢杆菌(王喜亮等人，201910391304.8)、乳酸菌(钟泽民等人，2015；刘淑杰等人，2021)、毕赤酵母等(刘洁等人，202011586279.8)等。
在现有的EGF制备方法中，主要存在以下两个问题：一是目前EGF基因序列信息只有人、猪、犬等动物的较为清楚，其他动物的序列信息尚无明确记录以及相关研究的记载；二是现有用于重组表达的手段均有明显的短板，如抗生素使用量大，存在耐药性基因扩散隐患；诱导剂毒性；分离纯化操作复杂导致成本升高等。因此，迫切需要对其他动物的EGF序列信息进行开发并对EGF制备的方法进行改进，从而降低EGF的生产成本以及后续应用上的隐患。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组禽表皮生长因子的制备方法，该方法借助改造后的质粒在乳酸菌表达系统进行表达，其无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题，以解决上述现有技术中存在的缺陷。为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种重组禽表皮生长因子(rcEGF)，所述rcEGF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个方面，提供一种用于表达重组禽表皮生长因子的重组载体，其中，所述重组载体包含信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列，所述重组载体是重组乳酸菌表达载体pLL32a-cEGF。
在一种实施方式中，所述信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
本发明的第三个方面，提供一种上述重组载体的构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：
(1)对人工合成的氨苄抗性基因序列和pMG36e质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pLL32a；
(2)对人工合成的含有信号肽、锚定蛋白以及cEGF序列的基因片段和pLL32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得重组质粒pLL32a-cEGF。
本发明的第四个方面，提供一种重组禽表皮生长因子的制备方法，其中，所述方法为将上述构建的重组载体在乳酸菌中表达获得重组的EGF。
在一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。作为一种优选方式，所述所述乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将上述构建的重组载体电转化至乳酸菌感受态细胞中，电转化结束后将带有重组质粒的乳酸乳球菌移入复苏培养基中37℃静置培养2h，然后涂布带有0.5ug/ml氨苄抗性的MRS平板，37℃恒温培养；
(2)挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行测序鉴定，得到重组菌；
(3)将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的MRS液体培养基中37℃振荡培养4h，而后降低培养温度至30℃继续培养，终止发酵后离心发酵液，重悬菌体后加入适量溶菌酶裂解菌体获得所述重组禽表皮生长因子。
优选的，所述电转化条件为：12kV/cm、200Ω、25μF。
本发明相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：
1.本发明填补了禽用重组表皮生长因子研究及应用方面的技术空白；
2.本发明利用改造后的乳酸菌系统表达的重组禽表皮生长因子相比其他表达系统而言，无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：跨膜结构预测；
图2：二级结构预测；
图3：亚细胞定位预测；
图4：cEGF质粒双酶切鉴定；
图5：pLL32a质粒双酶切鉴定；
图6：重组菌western blot检测结果：1道为乳酸乳球菌1363-空菌上清；2道为乳酸乳球菌1363-空菌沉淀；3道为重组乳酸乳球菌1363-上清；4道为重组乳酸乳球菌1363-沉淀；5道为重组乳酸乳球菌1363-灭活菌体。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1：确定禽EGF基因序列
文献记载成熟EGF蛋白由约53个氨基酸，159个核苷酸构成。目前只有人，猪，犬，鼠，马等少数物种的EGF序列较为明晰。虽然在GENBANK数据库中能够查到禽EGF相关序列，然而所记载的序列仅为禽EGF的前体核苷酸序列，并非成熟EGF蛋白对应的核苷酸序列。为了确定禽成熟EGF蛋白对应的核苷酸序列，我们通过比对人、猪、鼠、马等动物的成熟EGF核苷酸序列发现它们的关键结构残基表现出高度的保守性，尤其是三个甘氨酸残基(残基18、36和39)、六个半胱氨酸残基(残基6、14、20、31、33和42)以及酪氨酸残基(残基37)。最终，我们根据成熟EGF蛋白关键结构残基高度保守的性质分析，确认禽成熟EGF(cEGF)的核苷酸序列及氨基酸序列，并通过TMHMM、SOPMA及PSORT在线软件进行跨膜结构、二级结构及亚细胞定位预测(图1-3)，用于后续实验。
实施例2：重组载体的构建和目标蛋白的表达
1、对人工合成的氨苄青霉素抗性基因序列(如SEQ ID NO：3所示)和pMG36e(淼灵生物，MLCC1262)质粒进行双酶切(mlu I和Xho I)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用100ug/ml氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pLL32a(序列如SEQ ID NO：5所示)；
2、对人工合成的含有信号肽(如SEQ ID NO：1所示)、锚定蛋白(如SEQ ID NO：2所示)以及cEGF序列(如SEQ ID NO：4所示)的基因片段和pLL32a质粒进行双酶切(Xba I和Hind III)(图4-5)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用100ug/ml氨苄青霉素进行筛选，获得重组质粒pLL32a-cEGF；
3、将重组质粒pLL32a-cEGF电转化至乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中，电转化条件为：12kV/cm、200Ω、25μF。电转化结束后将带有重组质粒的乳酸乳球菌移入复苏培养基中37℃静置培养2h，然后涂布带有0.5ug/ml氨苄抗性的MRS平板，37℃恒温培养。复苏培养基组分为：0.5mol葡萄糖+MRS液体培养基+2mmol氯化钙+20mmol氯化镁。
4、挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒送上海生工进行测序鉴定，得到重组菌。
5、将重组菌置于含有0.5ug/ml氨苄的MRS液体培养基中37℃振荡培养4h，而后降低培养温度至30℃继续过夜培养。过夜培养后各取1ml发酵液2管，离心获取菌体沉淀后一管加100ulPBS重悬置于65℃水浴锅中灭活处理1h，而后制样备用；另一管用50ul PBS重悬菌体加入适量溶菌酶裂解菌体，离心后分别取上清和沉淀制样备用。将上述三份样品连同空白乳酸乳球菌进行SDS-PAGE电泳而后转膜，利用His标签抗体进行Western blot验证。
结果如图6所示，重组菌可成功表达重组cEGF(即rcEGF)，且重组蛋白主要集中在菌体表面部位。
实施例3：重组蛋白的活性验证
将上述实施例2中表达重组EGF的重组菌制备成菌粉进行笼养817白羽肉鸡饲喂实验。按照进雏批次饲养分为实验组、对照组。实验选用饲喂条件相同的鸡舍各3栋，作为实验组和对照组(见下表)。实验组在肉鸡日常饲料中添加实验品EGF，对照组饲喂常规饲料，饮水及其他饲养条件相同。
实验分组如下：
结果统计见下表：
从表格种可以看出，使用EGF的实验组平均日增重比对照组平均每只鸡多出2g。出 栏体重实验组比对照组每只鸡多出90g。实验组的上市率与对照组的上市率相比，实验组的 上市率均高于对照组2％，说明实验组的鸡群均匀整齐、健康体壮，残次鸡少。与对照组相 比，实验组的料重比平均低0.1，欧洲指数实验组152与对照组142相比较，差异10，说明EGF 促进生长、提高成活率、减少出栏时间等综合指标的作用明显。
通过实验证明，在817白羽肉鸡全程饲养过程中，饲喂全价颗粒饲料中添加EGF，可以有效提高817白羽肉鸡养殖的出栏体重、降低料重比，提高了2％的上市率，使杂交品种的817白羽肉鸡有效的改善欧洲指数，提高经济效益。
实施例4：重组菌抗生素抗性水平探究
制备氨苄青霉素浓度分别为0.5、1、3、5、7、10ug/ml的MRS平板，将上述实施例2中的重组菌涂布于制备好的MRS平板上，37℃过夜培养。
结果表明，重组菌在氨苄青霉素浓度为5ug/ml以上的MRS平板上已不能生长，说明本发明所制备的重组菌具有极低的抗生素抗性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 江苏三仪生物工程有限公司；大连三仪动物药品有限公司
<120> 一种重组禽表皮生长因子的制备方法
<130> 4
<141> 2021-11-08
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc t 81
<210> 2
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgcttctt ctgctggtac ttctaattcc ggtggttcaa cagctacaaa taccaataat 60
aattcaaata caagctcaac cacttataca gttaaatctg gcgatacact ttggggaatt 120
tcgcaaaaat atggaattag tgttgctcaa attcaaagcg caaacaatct taaaagtaca 180
gtcatctata ttgggcaaaa gcttgtattg acaacttcaa gttcttcgtc taatacaaat 240
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gccaaaccag cttcacagac gacgattaag gttaaatctg gtgatacgct ttggggactc 360
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acaggttcaa gctcagcctc tacgagttca acttctaact cttctgcagc ttcaaatacc 540
tctatccata aggttgttaa aggagatacg ctttggggac tttcacaaaa atctggtagc 600
ccaattgctt caattaaggc ttggaatcat ttatcaagtg ataccatttt aattggtcaa 660
tatcttcgta ttaaa 675
<210> 3
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420
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tcactgatta agcattggta a 861
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 3739
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 120
ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 180
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ctctgtatct ttcaatacgc tcttttaagt ccttaatttc tttttttaat tcctcatttt 1380
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gtcaatatca aaatcattaa tgttcaaaat atcttttttt gtcgtatata tgtttattct 1740
tagcaatagc gtcctttgat tcatgagtca aatattcata tgaacctttg atataatcaa 1800
gtatctcaac atgagcaact gaactattcc ccaattttcg cttaatcttg ttcctaacgc 1860
tttctattgt tacaggattt cgtgcaatat atataacgtg atagtgtggt tttttatagt 1920
gctttccatt tcgtataaca tcactactat tccatgtatc tttatctttt ttttcgtcca 1980
tatcgtgtaa aggactgaca gccatagata cgcccaaact ctctaatttt tctttccaat 2040
cattaggaat tgagtcagga tataataaaa atccaaaatt tctagcttta gtatttttaa 2100
tagccatgat ataattacct tatcaaaaac aagtagcgaa aactcgtatc cttctaaaaa 2160
cgcgagcttt cgcttatttt ttttgttctg attcctttct tgcatattct tctatagcta 2220
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cttttgtcag agaaatcata actctttttt tcgattctga aatcaccatt taaaaaactc 2340
caatcaaata attttataaa gttagtgtat cgctttgtaa tcataaaaac aacaataaag 2400
ctacttaaat atagatttat aaaaaacgtt ggcgaaaacg ttggcgattc gttggcgatt 2460
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aagcaatttt taaaatcaaa cccatgaggg aatttcattc cctcatattc ccttgagcct 2700
cctccaaccg aaatagaagg gcgctgcgct tattatttca ttcagtcatc ggctttcata 2760
atctaacaga caacatcttc ctgcaaagcc acgctacgct caagggcttt tacgctacga 2820
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tgaacctcaa ctccaaatat cgtagcgccg gggtaccttg accgccgcct ttgtcgctag 3120
taccggttgt accgtcgcct ttaccaactg tcttggccgc ttcaacggca gctgccacct 3180
tcgttttcag actttgcaaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcgatcccc 3240
gggcgagctc gaattacgaa tttttctgct gaaacgattg ccatttcaaa attcctccga 3300
atattttttt acctacctag tatagcattt tgtgaagttt ttttctagtc caagctcaca 3360
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agctaccaag acgaagagga tgaagaggat gaggaggcag attgccttga atatattgac 3540
aatactgata agataatata tcttttatat agaagatcga ccgtgctata attatactaa 3600
ttttataagg aggaaaaaat atgggcattt ttagtatttt tgtaatcagc acagttcatt 3660
atcaaccaaa caaaaaataa gtggttataa tgaatcgtta ataagcaaaa ttcatataac 3720
caaattaaag agggttata 3739
Claims (9)
1.一种重组禽表皮生长因子(rcEGF)，其特征在于，所述rcEGF的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.一种用于表达重组禽表皮生长因子的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列，所述重组载体是重组乳酸菌表达载体pLL32a-cEGF。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
4.如权利要求2或3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对人工合成的氨苄抗性基因序列和pMG36e质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pLL32a；
(2)对人工合成的含有信号肽、锚定蛋白以及cEGF序列的基因片段和pL L32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得重组质粒pLL32a-cEGF。
5.一种重组禽表皮生长因子的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4构建的重组载体在乳酸菌中表达获得重组的EGF。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述所述乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。
8.如权利要求5-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将权利要求4构建的重组载体电转化至乳酸菌感受态细胞中，电转化结束后将带有重组质粒的乳酸乳球菌移入复苏培养基中37℃静置培养2h，然后涂布带有0.5ug/ml氨苄抗性的MRS平板，37℃恒温培养；所述复苏培养基组分为：
(2)挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行测序鉴定，得到重组菌；
(3)将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的MRS液体培养基中37℃振荡培养4h，而后降低培养温度至30℃继续培养，终止发酵后离心发酵液，重悬菌体后加入适量溶菌酶裂解菌体获得所述重组禽表皮生长因子。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述电转化条件为：12kV/cm、200Ω、25μF。
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