CN105524158A

CN105524158A - 一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用

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Publication number: CN105524158A
Application number: CN201610030444.9A
Authority: CN
Inventors: 任辉; 李海峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-01-18
Filing date: 2016-01-18
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2036-01-18
Also published as: CN105524158B

Abstract

本发明公开了一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用，所述蝇蛆抗菌肽氨基酸序列为SEQ？ID？NO.2所示；由于所使用的表达系统及所有的表达调控原件都来自于食品级乳酸菌、干酪乳酸菌自身，所以最终表达抗菌肽的重组乳酸菌是真正的食品级产品；抗菌肽展示在乳酸菌细胞壁表面，在宿主肠道内具有较高的稳定性，不容易在肠道环境中降解，便于长期发挥作用；未使用乳酸菌表达常用的诱导型启动子，而使用组成型启动子，发酵时不需要使用Nisin等诱导物，因而其生产工艺十分简便；与从蝇蛆直接提取的抗菌肽相比，表达抗菌肽的重组乳酸菌更加安全，规模化生产成本更低。

Description

一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其应用，特别涉及一种蝇蛆抗菌肽、表达抗菌肽的食品级重组乳酸菌及其制备抗菌添加剂中的应用。

(二)背景技术

抗菌肽(antibacterialpeptides)是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，它除具有非特异性的抵抗细菌、真菌、病毒等病原体外，还有抗肿瘤细胞的作用，特别对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，而不破坏人体的正常细胞，是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药。抗菌肽这类活性多肽具有免疫原性小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广等优点。已有研究表明，在动物日粮中添加抗菌肽能够提高动物的生产性能和饲料利用率、改善动物肠道微生态环境、促进动物的细胞和体液免疫应答，提高动物的免疫机能与抗病力。此外，在饲料中添加抗菌肽，可以取代抗生素，消除抗生素的过度使用导致致病菌产生耐药性和农产品抗生素残留的问题。

蝇及幼虫蛆主要生长在腐物、粪便和垃圾等含有大量细菌的恶劣环境中，其体表带有许多病原菌，能传播多种疾病，但其自身却不会因为感染病原菌而引起死亡，这说明蝇应该对病原微生物有强大的免疫力，并能产生强效抗菌物质。这种物质就是蝇蛆抗菌肽。

蝇蛆抗菌肽是蝇蛆经过病原菌诱导后而产生的一系列具有抗菌活性的弱酸性多肽物质，热稳定高，其分子量通常在5-10kDa。蝇蛆抗菌肽不仅具有杀灭细菌的功能，还具有抵抗真菌等微生物的功能，甚至病毒、真菌、藻类、原虫及寄生虫，甚至肿瘤等都具有抑制或杀灭作用。

蝇蛆抗菌肽是一系列多种抗菌肽的混合物，单独纯化其中一种抗菌肽极其困难。目前其生产和提取主要依赖天然蝇蛆中提取总抗菌肽，产率低，而且抗菌活性不稳定。同时由于蝇蛆生长环境含有大量病原细菌，因此抗菌肽提取生产过程要严格注意卫生防护，否则产品用于饲料添加用途容易造成病害传播和扩散。蝇蛆抗菌肽距离规模化生产，还有较长的技术差距。

肠道病原菌是家畜和家禽养殖业造成死亡的主要原因之一。养殖业对抗生素的长期使用，造成耐药菌的泛滥。据统计，从猪肠道分离的56株肠道病原菌，85％的菌株对诺氟沙星、环丙沙星、青霉素、氨苄西林和头孢噻吩均有耐药性。抗生素过度使用还造成水产品中抗生素残留量过高的严重问题，对消费者的健康造成严重威胁。土霉素，氯霉素等常见水产用抗生素在市售鱼虾蟹类产品中屡有检出，甚至出口产品也屡遭检出。

抗菌肽作为饲料添加剂，可以完全替代抗生素的使用，而且抗菌范围广，无耐药性和抗生素残留的问题。但是抗菌肽的天然来源匮乏和提取成本过高是限制其使用的主要障碍。

采用基因工程技术，利用微生物细胞工厂，导入抗菌肽基因，获得重组表达抗菌肽的工程菌。利用工业化发酵技术，规模化生产重组抗菌肽是可行的技术路线。很多重组药物蛋白使用大肠杆菌，毕赤酵母，芽孢杆菌表达系统已经实现了规模化生产。

乳酸菌是美国FDA认证的可用于食品生产的安全微生物，常见用途之一为饲料添加的益生菌剂，具有改善肠道微生态体系，维持肠道平衡和机能，提高宿主免疫力的功效。乳酸菌是宿主肠道天然共生菌，能够在消化道内黏附和定植，长期发挥益生作用。利用乳酸菌作为宿主，表达重组蝇蛆抗菌肽，抗菌肽分泌或者展示于重组乳酸菌的细胞壁表面。重组活性乳酸菌作为益生菌添加入饲料，饲喂动物。重组乳酸菌在宿主肠道内定殖，不断分泌抗菌肽，杀灭肠道病原菌，促进宿主免疫应答，兼具发挥抗菌和益生菌功效，具有巨大应用潜力。

乳酸菌重组表达载体是乳酸菌应用中的关键技术之一，但是作为穿梭载体，很多都带有抗生素抗性基因作为筛选标记，这些抗性基因如果跟随菌体进入宿主，可能会以基因水平转移的方式进入宿主肠道菌群传播，加速菌群的抗药性发展。开发一种不含抗生素标记的乳酸菌表达载体是其在食品，医药领域拓展应用的前提。

相对于胞内表达，工程菌细胞壁表面展示和分泌表达重组蛋白，更有利于蛋白的释放和发挥效用。而且展示在细胞壁表面的蛋白比游离的蛋白稳定性更好，能够在宿主体内长期发挥效用。

乳酸菌表达和展示表达外源抗原蛋白，在活菌疫苗产品领域屡有应用，取得了不错的效果。但是乳酸菌作为表达外源抗菌肽的细胞工厂，特别是在细胞壁表面展示，却至今是研究的空白领域。

近年来，随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，以活体乳酸菌为递送载体的药物递送逐渐成为乳酸菌应用研究的一个热点。乳酸菌是一个十分良好递送载体，因为它是益生菌，适应肠道环境，更重要的是，它的定殖位点是小肠内壁的上皮细胞，能够竞争许多病毒的空间位点，从而起到抗病毒的作用。同时，乳酸菌本身又是天然的免疫佐剂，能够分泌多糖，对人体有良好的免疫促进作用。

使用食品级乳酸菌开发蝇蛆抗菌肽还具有如下优势：

重组抗菌肽可以活菌形式使用，无需纯化，成本低廉，易于大量生产。乳酸菌本身就能产生细菌素等抗菌物质，可以起到与蝇蛆抗菌肽联合抗菌的作用。

国内专利(公开号CN103908668A)公布了具有免疫佐剂作用的蝇蛆抗菌肽及其制备方法和含该抗菌肽佐剂的疫苗制剂，以及它们在制备疫苗制剂中的应用。该专利与直接提取抗菌肽有关，没有用到重组抗菌肽的技术手段。

乳酸菌活载体已经广泛应用于黏膜免疫的疫苗开发。

欧盟专利(EP1066375B1)公布了一种罗伊氏乳杆菌细胞壁表面展示抗原的方法，美国专利live(US2009/0324638A1)公布了一种用于乳酸菌分泌或者细胞壁展示蛋白质或者多肽的方法。但是都没有关于蝇蛆抗菌肽在乳酸菌中表达或者展示的专利公布。

截至目前，还没有一种食品级乳酸菌重组表达蝇蛆抗菌肽的整体解决方案。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种食品级表达蝇蛆抗菌肽重组乳酸菌及其应用，即提供一种蝇蛆抗菌肽、编码基因、载体、工程菌及其作为抗菌剂的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种蝇蛆抗菌肽，所述蝇蛆抗菌肽氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。

本发明还提供一种所述蝇蛆抗菌肽编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

本发明涉及一种由所述蝇蛆抗菌肽编码基因构建的重组载体。

本发明还涉及一种由所述重组载体转化制备的食品级重组基因工程菌。

此外，本发明还提供一种所述蝇蛆抗菌肽编码基因在制备抗菌肽中的应用，所述的应用为：将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组载体转化至乳酸菌中，接种至MRS培养基，30℃培养48小时，当菌体OD_600nm大于20且pH值低于4时反应结束，将培养液在4℃、6000rpm离心30min，收集菌体，即获得含蝇蛆抗菌肽的菌体细胞。

本发明还涉及一种所述蝇蛆抗菌肽在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的抗菌剂，优选所述革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或蜡状芽孢杆菌，革兰氏阴性菌为李氏杆菌或大肠杆菌。所述抗菌剂是将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌(优选重组乳酸菌)经发酵培养获得的培养物，所述抗菌剂的用量为100毫升菌液(10⁷～10⁹CFU/mL)每公斤饲料。具体所述抗菌剂按如下方法制备：将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌(优选重组乳酸菌)接种MRS培养基，30℃培养48小时，检测菌体密度和培养体系pH值，菌体OD_600nm大于20且pH值低于4即可认为发酵结束，4℃、6000rpm离心30min，收集菌体，即为抑菌剂，使用时可以将菌体用等体积灭菌PBS缓冲液悬浮菌体制备菌悬液。

本发明所述含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌按如下方法获得：(1)抗菌肽表达框为：LDH启动子(SEQIDNO.4)-信号肽(SEQIDNO.5)-锚定蛋白(SEQIDNO.6)-蝇蛆抗菌肽(SEQIDNO.3)；

(2)alr基因(丙氨酸消旋酶)表达框：以植物乳杆菌基因组DNA为模板，使用引物alrF(SEQIDNO.10)和alrR(SEQIDNO.11)，PCR扩增，获得alr(丙氨酸消旋酶)基因(SEQIDNO.9)，将P_GADPH基因片段(SEQIDNO.8)和alr的PCR扩增产物(SEQIDNO.9)为模板，加入引物P_GADPHF(SEQIDNO.12)和alrR(SEQIDNO.11)，将启动子P_GADPH与alr基因融合，构建alr基因表达框。

(3)alr基因(丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳酸乳球菌株：将DNA片段：alr基因上游500bp同源臂(SEQIDNO.17)-lox位点序列(SEQIDNO.13)-氯霉素抗性基因表达框(SEQIDNO.16)-lox位点序列(SEQIDNO.15)-alr基因下游500bp同源臂(SEQIDNO.18)电击转化至乳酸乳球菌株，筛选alr基因(丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳酸乳球菌株。

本发明由所述蝇蛆抗菌肽编码基因构建的重组载体是通过IDH启动子，USp45信号肽和GSA锚定子的组合使用构建重组载体，再将重组载体转化至乳酸菌中，获得的重组基因工程菌使抗菌肽被分泌表达到细胞外，或者展示在细胞壁的表面。表达载体不携带外源性抗生素，通过载体自带的丙氨酸消旋酶，在不添加D-丙氨酸的MRS培养基中培养，筛选阳性克隆。

抗菌肽的表达由组成型启动子控制，载体线性化后，去除抗生素抗性基因，通过信号肽和锚定蛋白的控制，抗菌肽最终分泌到表达宿主乳酸菌细胞外，或者锚定展示在细胞壁上。

本发明所述的乳酸菌是指卫生部颁发的《可用于食品的菌种名单》(卫办监督发(2010)65号)所包含的所有乳酸菌属的所有菌株：即嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)，德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)，瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)，约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，以及乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubspecieslactis)等。

本发明所述的抗菌肽和锚定蛋白都根据乳酸菌对密码子的使用偏好性对核苷酸序列进行了优化，以利于在乳酸菌细胞表达。其优化原则为：TTCTTT；GTAGTT；TCCTCT；GAGGAA；TGCTGT；AGACGT；AGGCGT。

本发明所述的LDH启动子指组成型启动子，该组成型启动子是干酪乳杆菌LDH启动子的类似序列。

与现有抗菌肽生产技术相比，本发明具有以下优势：

(1)由于所使用的表达系统及所有的表达调控原件都来自于食品级乳酸菌、干酪乳酸菌自身，所以最终表达抗菌肽的重组乳酸菌是真正的食品级产品；

(2)抗菌肽展示在乳酸菌细胞壁表面，在宿主肠道内具有较高的稳定性，不容易在肠道环境中降解，便于长期发挥作用。

(3)未使用乳酸菌表达常用的诱导型启动子，而使用组成型启动子，发酵时不需要使用Nisin等诱导物，因而其生产工艺十分简便。

(4)与从蝇蛆直接提取的抗菌肽相比，表达抗菌肽的重组乳酸菌更加安全，规模化生产成本更低。

(四)附图说明

图1为抗菌肽和锚定蛋白的表达框示意图。

图2为重组乳酸菌抑制革兰氏阳性菌抑菌圈实验图，a为5微升菌悬液，b为10微升菌悬液，c为20微升菌悬液，d为50微升菌悬液，CK为无菌水对照，1为1微升菌悬液，25为25微升菌悬液，5为5微升菌悬液。

图3为重组乳酸菌抑制革兰氏阴性菌抑菌圈实验图，a为5微升菌悬液，b为10微升菌悬液，c为20微升菌悬液，d为50微升菌悬液，CK为无菌水对照。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：抗菌肽和锚定蛋白编码基因密码子优化

由于乳酸菌具有较强的密码子偏好性。因此为了能够使昆虫来源的抗菌肽基因(核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，氨基酸序列为SEQIDNO.2)顺利在乳酸菌细胞高表达，需要对其核苷酸系列进行优化，去除稀有密码子。其优化原则为：TTC→TTT；GTA→GTT；TCC→TCT；GAG→GAA；TGC→TGT；AGA→CGT；AGG→CGT；

蝇蛆抗菌肽优化后的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。

实施例2：抗菌肽和锚定蛋白表达框的构建

抗菌肽的表达和定位是通过多个表达调控原件的组合使用来实现的。这些表达调控原件包括启动子，信号肽序列，抗菌肽基因，锚定蛋白序列，以及各个表达调控原件之间的连接序列(见图1)，抗菌肽表达框为：LDH启动子(SEQIDNO.4)-信号肽(SEQIDNO.5)-锚定蛋白(SEQIDNO.6)-蝇蛆抗菌肽(SEQIDNO.3)。

本发明中，抗菌肽的表达最终是以组成型启动子来控制的，该组成型启动子来源于干酪乳杆菌乳酸脱氢酶(LDH)启动子，核苷酸序列为SEQIDNO.4所示。

信号肽序列是乳杆菌USP45信号肽，核苷酸序列为SEQIDNO.5所示。

锚定蛋白核苷酸序列为SEQIDNO.6所示。

锚定蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.7所示。

实施例3：alr基因(丙氨酸消旋酶)表达框的构建

全基因合成乳酸菌的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子P_GADPH(核苷酸序列为SEQIDNO.8所示)，以植物乳杆菌基因组DNA为模板，使用引物alrF(SEQIDNO.10)和alrR(SEQIDNO.11)，PCR扩增，获得alr(丙氨酸消旋酶)基因(核苷酸序列为SEQIDNO.9所示)。

以上述P_GADPH基因片段(SEQIDNO.8)和alr的PCR扩增产物(SEQIDNO.9)为模板，加入引物P_GADPHF(SEQIDNO.12)和alrR，将启动子P_GADPH与alr基因融合，构建成功alr基因表达框。

融合PCR条件：94度预变性5min，94度变性1min，58度退火30秒，72度延伸2分钟，32循环。

实施例4：alr基因(丙氨酸消旋酶)缺陷型乳酸乳球菌株的构建

(1)带loxp位点的氯霉素抗性表达盒构建

采用OverlappingPCR技术，将带有lox位点DNA片段(SEQIDNO.13)，氯霉素抗性基因表达框(SEQIDNO.14)，带有lox位点的DNA片段(SEQIDNO.15)，融合为一个DNA片段(SEQIDNO.16)，即为lox位点序列-氯霉素抗性基因表达框-lox位点序列。

(2)alr敲除盒构建

克隆嗜酸乳杆菌菌株alr基因上游侧翼500bpDNA序列(SEQIDNO.17)，带lox位点序列的氯霉素抗性基因表达框(SEQIDNO.16)，下游侧翼500bpDNA序列(SEQIDNO.18)，将上述序列按照下述的顺序，融合成一个DNA片段：alr基因上游500bp同源臂(SEQIDNO.17)-lox位点序列-氯霉素抗性基因表达框-lox位点序列(SEQIDNO.16)-alr基因下游500bp同源臂(SEQIDNO.18)，这个融合后的DNA片段即为alr敲除盒片段。克隆上游侧翼序列用到的引物为UparmF和UparmR(SEQIDNO.19和SEQIDNO.20)，克隆下游侧翼序列用到的引物为DownarmF和DownarmR(SEQIDNO.21和SEQIDNO.22)。

(3)将步骤(2)构建的alr敲除盒片段通过电击转化至乳酸乳球菌菌株，涂布抗性/丙氨酸平板。抗性/丙氨酸平板用M17琼脂培养基配置(购买于上海鼎国生物工程有限公司)，添加氯霉素浓度10微克/毫升，D-丙氨酸10毫克/毫升。配置MRS琼脂平板(培养基购买于上海鼎国生物工程有限公司)。筛选在抗性/丙氨酸平板生长的菌落，而在MRS琼脂培养基中不能生长的菌落，初步确定为阳性克隆。

进一步通过菌落PCR验证，以获得双交换重组子。菌落PCR所用引物为UparmF和DownarmR(SEQIDNO.19和SEQIDNO.22)。

(4)含Cre重组酶编码基因的温敏质粒pFED760(红霉素抗性)转化步骤(3)通过验证了的双交换重组子(需提前制备感受态)，37℃培养于含10微克/毫升氯霉素和10毫克/毫升D丙氨酸的MRS平板，菌落出现后平行转接点种于分别含有30微克/毫升红霉素和10微克/毫升氯霉素的MRS琼脂平板培养基，筛选对氯霉素敏感但有红霉素抗性的重组子，使用菌落PCR方法验证氯霉素抗性基因的切除。

(5)将步骤(4)获得的重组子于10ml不含任何抗生素的MRS(添加10毫克/毫升D丙氨酸)培养基，37℃过夜培养，以使含有Cre重组酶编码基因的质粒丢失，将培养液涂MRS平板，37℃过夜培养，取菌落平行涂板于含有30微克/毫升红霉素的MRS平板和不含任何抗生素的MRS平板，以筛选对红霉素敏感的重组子，通过菌落PCR验证含有Cre重组酶编码基因的质粒的丢失。确认为alr基因(丙氨酸消旋酶)缺陷型无抗生素标记的乳酸乳球菌菌株。

实施例5：表达蝇蛆抗菌肽食品级重组乳酸菌的构建，转化和筛选

(1)克隆乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的16srDNA基因序列。

(2)克隆alr基因表达框，以实施例3中的质粒为模板。

(3)OverlappingPCR技术将16srDNA上半片段(SEQIDNO.23)，抗菌肽表达框(实施例2)，alr基因表达框(实施例3)，16srDNA下半片段(SEQIDNO.24)，融合为一个DNA片段。

(4)将融合的DNA片段通过电击转化至实施例4中获得的缺陷型乳酸乳球菌，涂布不添加D丙氨酸的MRS培养基平板。选取能够生长的菌落，进一步通过菌落PCR验证，以获得双交换重组菌，即含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组乳酸菌。

实施例6：表达蝇蛆抗菌肽食品级重组乳酸菌的发酵

将实施例5获得的双交换重组菌株接种MRS培养基，30度培养48小时，检测菌体密度和培养体系pH值，菌体OD_600nm大于20同时pH值低于4即可认为发酵结束。4度6000rpm离心30min，收集菌体，等体积灭菌PBS缓冲液悬浮菌体制备菌悬液，菌数达到10⁹CFU/ml，作为下一步的实验材料。

实施例7：重组乳酸菌抑制病原菌实验

重组乳酸菌抑制病原菌实验操作：

(1)无菌滤纸片，裁剪直径为7mm的圆形。

(2)吸取5微升、10微升、20微升、50微升不同体积的实施例6制备的菌悬液(编号为a，b，c，d)，分别滴入滤纸片，吹风机冷风晾干，体积大可分多次滴入，多次吹干。编号CK为无菌水对照。

(3)指示病原菌用营养肉汤培养基培养至OD值＝1.0(菌数达到10⁹个/ml)，吸取100微升，涂布营养肉汤琼脂平板，超净台晾干30min。

(4)无菌操作将滤纸片分别放置在营养肉汤琼脂平板上，37度过夜培养，观察抑菌圈。

抑菌圈结果见图2和图3，所用到的病原菌名称如表1、表2所示：

表1革兰氏阳性细菌

金黄色葡萄球菌ATCC6538	粪肠球菌ATCC29212
		枯草芽孢杆菌ATCC23857	蜡状芽孢杆菌CICC10040
四联球菌ATCC35098	金黄色葡萄球菌

表2革兰氏阴性细菌

猪大肠杆菌	猪李氏杆菌
		粪产碱杆菌ATCC8750	哈维氏弧菌
嗜水气单胞菌

该实验结论是重组乳酸菌具有较强的抑制多种病原细菌的能力。

实施例8：重组乳酸菌溶血实验

(1)准备2％红细胞

兔子，自心脏抽取血液5ml，加入0.2ml抗凝剂EDTA，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤、离心，除去表面的白细胞，至上清液不显红色，弃上清液后取1ml再加入50ml的PBS即可。

(2)实验过程

每次使用红细胞前，用PBS洗，直至上清液中无明显红色(略黄)，吸取底物200μl，稀释至10ml，制成2％的红细胞溶液。现用现配，用时摇匀。

将0.5ml的实施例6制备的菌悬液与0.5ml的2％的红细胞溶液混合，室温条件下静止3h，之后用10050r/min离心3min。取出100μl于96孔板上，用545nm的波长检测。分别以水和PBS缓冲液作为阳性对照和阴性对照。每个样品2个平行，以平均值为结果，结果见表3所示。

溶血率(％)＝(样品吸收-阴性对照吸收)/(阳性对照吸收-阴性对照吸收)×100％。溶血率超过5％视为溶血。

表3溶血结果

乳酸菌菌悬液体积	溶血率
		5微升	0.2％
10微升	0.3％
		20微升	0.3％
50微升	1％

结论：该实验结果说明，重组乳酸菌没有溶血能力。

实施例9：重组乳酸菌作为抗腹泻感染饲料添加剂的应用实验

(1)准备10周龄SPF级C57BL/6小鼠，建立侵袭性大肠杆菌ATCC43893预感后灌胃空肠弯曲菌的小鼠腹泻感染模型。

(2)微生物准备

乳酸菌：以体积浓度2％的接种量将冻存于-80℃的菌体(实施例5制备的含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组乳酸菌)接种至液体MRS培养基中，37℃下过夜静置培养18-24h，此为初次传代，结束后再进行两次传代，离心(5000r/min，10min，4℃)，收集菌体及发酵上清液。收集的菌体由PBS清洗两次，重悬，浓度调整到10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL和10⁹CFU/mL，待用；上清液过0.22μm无菌微孔滤膜，保存于4℃冰箱中。

大肠杆菌ATCC43893：以体积浓度2％的接种量将冻存于-80℃的菌体接种至液体LB培养基中，37℃下过夜静置培养18-24h，此为初次传代，完成后再进行两次传代，离心(5000r/min，10min，4℃)，收集菌体，PBS清洗两次，重悬，浓度调整到10⁸CFU/mL。

空肠弯曲杆菌：以体积浓度2％的接种量将冻存于-80℃的菌体接种至培养空肠弯曲杆菌专用的BHI脑心浸液肉汤培养基(购自上海鼎国生物科技有限公司)中，置于三气(气体成分为5％O₂、10％CO₂和85％N₂)培养箱，于37℃隔天培养48h，此为初次传代，再涂布于含5％无菌绵羊血的哥伦比亚血平板(购自上海鼎国生物科技有限公司)中，相同条件下再次培养48h，传代两次，从平板表面将表面菌体轻轻刮取下来，在5000r/min、10min、4℃的条件下离心，PBS清洗两次，PBS重悬，调整浓度至10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL和10⁹CFU/mL，待用。

(3)小鼠感染模型建立

大肠杆菌菌悬液感染组：10周龄SPF级C57BL/6小鼠正常喂养一周后，灌胃大肠杆菌菌悬液0.3mL(步骤2制备，10⁸CFU/mL)，每天不间断灌胃。8天后，每只小鼠每日增加灌胃空肠弯曲杆菌菌悬液0.3mL(步骤2制备，10⁹CFU/mL)，期间大肠杆菌的灌胃仍不间断，直到24天后结束。

未感染组：10周龄SPF级C57BL/6小鼠正常喂养一周后，灌胃无菌水，灌胃量和频率等同于感染组。

(4)感染小鼠的乳酸菌灌胃实验

将感染成功的小鼠分为两组，样品组灌胃步骤2制备的乳酸菌菌悬液(菌浓度为10⁸CFU/mL)0.3mL，对照组灌胃同样体积的无菌水，两组均为每天不间断灌胃，一共灌胃12天。

未感染小鼠分为两组，样品组灌胃步骤2制备的乳酸菌菌悬液0.3mL(菌浓度为10⁸CFU/mL)，对照组灌胃同样体积的无菌水，两组均为每天不间断灌胃，一共灌胃12天。

(5)肠道内空肠弯曲杆菌数量测定

从开始灌胃乳酸菌和无菌水至其结束，共12天，平均每四天取样，每组每次取样为6只，解剖小鼠并取其结肠部分内容物(粪便)，进行研磨，梯度稀释后接种于空肠弯曲杆菌的选择性培养基-哥伦比亚血平板中，于三气培养箱(5％O₂、10％CO₂和85％N₂)中培养48h，统计空肠弯曲杆菌单菌落个数，每次取样的菌数按照6只小鼠的菌落数量平均值来测算。

(6)实验结果见表4

表4空肠弯曲菌数量测定结果

结论：重组乳酸菌灌胃空肠弯曲杆菌感染小鼠后，能够明显降低小鼠肠道内空肠弯曲菌的数量，菌数下降了4个数量级，达到未感染小鼠的菌数水平；而无菌水灌胃的感染小鼠菌数上升了1个数量级，这说明重组乳酸菌能够明显降低感染小鼠的肠道空肠弯曲菌的数量，使其能够达到正常未感染小鼠的水平。

Claims

1.一种蝇蛆抗菌肽，其特征在于所述蝇蛆抗菌肽氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。

2.一种权利要求1所述蝇蛆抗菌肽编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

3.一种由权利要求2所述蝇蛆抗菌肽编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述蝇蛆抗菌肽编码基因在制备抗菌肽中的应用，其特征在于所述的应用为：将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组载体转化至乳酸菌中，接种至MRS培养基，30℃培养48小时，当菌体OD_600nm大于20且pH值低于4时反应结束，将培养液在4℃、6000rpm离心30min，收集菌体，即获得含蝇蛆抗菌肽的菌体细胞。

6.一种权利要求1所述蝇蛆抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗菌剂为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的抗菌剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌，革兰氏阴性菌为李氏杆菌、大肠杆菌。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗菌剂按如下方法制备：将含蝇蛆抗菌肽编码基因的重组基因工程菌接种MRS培养基，30℃培养48小时，当菌体OD_600nm大于20且pH值低于4时发酵结束，4℃、6000rpm离心30min，收集菌体，即为抑菌剂。