KR20010031131A

KR20010031131A - 돼지의 경쟁적 독점 배양

Info

Publication number: KR20010031131A
Application number: KR1020007004022A
Authority: KR
Inventors: 데이비드제이.니스벳; 도날드에이.코리어; 래리에이치.스탠커
Original assignee: 마이클 디. 러프; 미합중국 농무부
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2001-04-16
Also published as: US5951977A; BR9813074A; EP1037964A4; AU1188599A; CN1276007A; EP1037964A1; CA2305574A1; WO1999019459A1; AU736681B2

Abstract

돼지 살모넬라 군집을 제어 또는 억제하기에 유효한 혐기성 박테리아의 정의된 세균군 또는 조성물이 개시된다. 세균군은 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아의 집단 또는 배양물을 포함하며, 상기 박테리아들은 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme), 클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum), 클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) 및 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae)를 포함한다. 사용 시에, 세균군은 대상 돼지에 살모넬라 군집에 대한 내성을 증가시키기에 유효한 양으로 투여된다.

Description

돼지의 경쟁적 독점 배양{COMPETITIVE EXCLUSION CULTURE FOR SWINE}

종래 기술

주위 환경에 살모넬라가 널리 존재하고 있음을 고려할 때, 동물들이 살모넬라에 대한 노출로부터 완전하게 보호되기는 힘들 것으로 보인다. 따라서, 연구자들은 살모넬라에 노출된 동물에서 군집화에 대한 내성을 증가시키는 수단을 계속 연구하여 왔다. 이러한 연구들은 백신의 평가, 예방적인 정상 소장 플로라(normal intestinal flora)의 구축, 및 살모넬라의 성장과 군집화를 저해할 사료 첨가물의 확인 등에 초점이 맞추어져 왔다. 살모넬라 군집에 대항하는 숙주 면역의 역할은 잘 알려지지 않았으며, 이는 면역 반응의 자극이 군집 내성을 효과적으로 촉진시킨 다 하여도 여전히 불명확한 점을 갖는다. 실험적 백신은 지속적인 효과가 있는 것으로 입증되지 않았다.

정상 소장 마이크로플로라(microflora)의 개발이 위장관의 살모넬라 군집에 대항하는 내성을 증가시킬 수 있다는 것은 문헌에 공지되어 있다. 양계 산업에서, 역시 세균군으로 알려진(투여되는 동물에 대하여 유익한 영향을 갖는 세균 배양물로 정의됨), 성장한 닭의 맹장 또는 배설물로부터 제조된 마이크로 플로라의 혐기성 세균 배양물로 병아리에 경구 접종하는 것이 살모넬라 군집을 효과적으로 감소시킨다는 것이 판명되었다[Snoeyenbos et al., Avian Dis., 23:904-913, (1979), Schneitz et al., Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. B., 89:109-116, (1981), and Stavric et al., J. Food Prot., 48:778-782, (1985)]. 반대로, 이와 같은 맹장의 혐기성 세균이 닭에 군집화되는 것을 방지하는 양계 사육의 실제는, 닭이 살모넬라 군집화되기 더욱 쉽게 만든다[Pivnick et al., J. Food Prot., 44:909-916, (1981)]. 이러한 세균군은 어린 병아리의 장관을 급속도로 군집화함으로써(Pivnick 등, 위 문헌), 소장 벽 위에 부착 부위를 경쟁하도록 함으로써(Snoeyenbos 등, 위 문헌), 또는 장내 병원의 성장을 저해하는 세균정체성 또는 살세균성의 짧은 사슬 휘발성 지방산을 생성함으로써[Barnes et al., J. Hyg. Camb., 82:263-283, (1979) and Am. J. Clin. Nutr., 33:2426-2433, (1980), Corrier et al., Avian Dis., 34:668-676, (1990) and Avian Dis., 34:617-625, (1990), and Hinton et al., Avian Dis., 34:626-633, (1990)] 살모넬라 군집화를 감소시킬 수 있다.

생후 수일 경과된 병아리들에서 미생물들의 혼합된 배양물을 이용하여 정상 소장 플로라를 구축하는 것은 몇몇 유럽 국가에서 살모넬라 군집화를 제어하기 위해 널리 사용되어 왔다. 그러나, 상기 혼합된 배양물에 존재하는 미생물의 수와 종류가 정의되지 않았기 때문에, 상기 시스템은 미국에서는 널리 수용되지 못하였다. 상기 방법이 널리 사용되기 힘든 하나의 단점은 생성물의 조성이 표준화될 수 없고, 따라서 생성물이 조성 및 효과의 변함이 없이 대량으로 생산 또는 저장될 수 없다는 점이었다. 또한, 출발 물질이 항상 성장한 닭의 장내 내용물이므로, 생성물은 병원성 바이저스, 세균 또는 기생충을 함유할 수 있고, 이들이 닭의 건강에 위험할 수 있다. 뿐만 아니라, 최근 미국 식품의약국(FDA)은 모든 정의되지 않은 배양물은 인가를 받아야 할 것을 요구하고 있다.

발명의 요약

본 발명자들은 돼지의 살모넬라 군집화를 효과적으로 제어 또는 저해하는 박테리아의 정의된 세균군 또는 조성물을 이제 발견하였다. 상기 세균군은 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme), 클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum), 클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) 및 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae)를 포함하는 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아의 적어도 부분적으로 특징화된 군체 또는 배양물로 이루어진다.

사용시에, 세균군은 살모넬라 군집화를 저해하기 위한 유효량으로 대상 돼지에 투여된다. 상기 세균군은 통상의 사료와 함께 조합되어, 돼지에 의해 경구적으로 섭취될 수 있는 신규의 사료 제품을 제공할 수도 있다.

상기 발견을 바탕으로, 본 발명의 목적은 돼지의 살모넬라 군집화를 제어하기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 다음의 기재로부터 명백해질 것이다.

발명의 배경

발명의 분야

본 발명은 돼지의 살모넬라 군집을 제어하기 위해 정의된 경쟁적 독점 배양물 또는 세균군에 관한 것이다.

연구자들과 보건 당국의 노력에도 불구하고 인체 살모넬라증의 발생 빈도는 지난 20년 동안에 걸쳐 증가하여 왔다. 인체 살모넬라 감염의 실제 보고된 건수는 연간 40,000 건을 초과하고 있다. 그러나, 전염병 센터는 미국의 연간 인체 살모넬라 감염의 실제 빈도는 200만 내지 400만에 이를 것이라고 추정하고 있다. 돼지를 포함한 동물성 식료품은 인체 감염의 중대한 원인으로 계속되고 있다.

살모넬라의 인체 건강에 미치는 영향 외에도, 돼지의 살모넬라 감염은 미국의 돼지 축산 산업에 연간 1억 달러를 넘는 비용을 요하고 있다(Schwartz, 1990, "Salmonellosis in Midwestern Swine", 미합중국 동물 보건 협회의 회보 중 443-449면). 미국에서는, 돼지 파라티푸스의 병원인 에스 콜레라수이스(S. cholerasuis)로 인한 살모넬라증이 가장 빈번히 발생한다. 돼지들은 다양한 근원으로부터 에스 티피무리움(S. typhimurium) 같은 살모넬라의 넓은 숙주 영역에 노출될 수 있는 한편, 에스 콜레라수이스(S. cholerasuis)는 돼지 아닌 원천(Schwartz 등)으로부터는 드물게 분리되는 숙주 적응된 병원이다. 따라서, 에스 콜레라수이스에 의한 새로운 동물의 자연적인 감염은 주로 그들의 위장관으로부터 병원을 제공하는 감염된 동물로부터 수평적인 전달에 의해 발생한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 세균군은 돼지에 투여될 경우, 위장관으로부터 살모넬라의 배출을 감소시키고, 돼지 군체 중 살모넬라의 평균 농도를 감소시키고, 및/또는 병원에 의해 군집화된 돼지의 백분율을 저하시킴으로써 돼지의 살모넬라 군집화를 제어하는데 효과적이다. 본 발명은 국내산 돼지를 비제한적으로 포함하여, 각종의 돼지 종류에 실용화될 수 있다. 돼지에 투여하게 되면, 상기 세균군이 다양한 살모넬라종, 특히, 에스 콜레라수이스 및 에스 티피무리움에 대항하는 지속적인 예방효과를 제공한다.

세균군은 살모넬라가 없는 돼지의 맹장으로부터 개발되었다. 실시예 1에서 더욱 상세히 기술하는 바와 같이, 돼지로부터 맹장을 회수하여, 적절한 배양 배지에 접종하고, 즉시 안정한 상태 또는 평형에 도달할 때까지 특정의 배지 변경 조건 하에 연속-흐름 배양 조건 하에 둔다. Pcf1으로 표시되는 위에서 수득된 안정한 상태의 배양물을 회수하여 돼지에 투여하면, 처리된 동물의 살모넬라 군집화를 제어하기 위한 세균군으로서 확실한 효과를 나타낸다.

안정한 상태의 배양물 Pcf1은 다른 환경에서도 생존할 수 있는 혐기성 박테리아 40 종 이하의 안정한 혼합물로 이루어진다. Pcf1의 조성은 부분적으로 특징화되었고, 적어도 아래와 같은 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아의 군체를 포함한다:

엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme), 클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum), 클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) 및 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae).

안정한 상태의 배양물 Pcf1은 세균군으로서 바로 사용될 수도 있고, 다음에 사용하기 위해 저장될 수도 있다. 후자의 경우에, 배양물은 표시된 혼합물로 저장되어도 좋고, 개개의 박테리아를 분리하여 저장한 후 나중에 재조합하여도 무방하다.

돼지의 살모넬라를 제어하기 위한 세균군으로서 효능을 갖는 부가적 배양물은 안정한 상태의 배양물 Pcf1로부터 유도될 수 있다. 하나의 선택적 구현예에 따르면, 안정한 상태의 배양물 Pcf1에서 종의 수는 그 배양물을 연속적으로 희석함에 의해 감소될 수 있다. 안정한 상태가 다시 이루어질 때까지 일련의 희석된 배양물을 접종물로 사용하여 연속-흐름 배양을 계속할 수 있다. 이러한 과정은 연속적으로 감소된 군체를 갖는 추가의 안정한 상태의 배양물을 수득하기 위해 새로운 안정한 상태 배양물을 접종물로 사용하여 또다시 반복될 수도 있다.

이러한 방식으로 연속적으로 희석함에 의해, 두 가지 추가의 안정하고 견고한 상태의 배양물(Pcf2 및 Pcf3로 표시됨)이 Pcf1으로부터 유도되었다. 이들 배양물은 Pcf1보타 적은 종류의 박테리아으로 구성되어 있지만, 이들은 돼지 내에서 세균군으로써 사용될 만한 효과를 보유한다. 분석해보면, 안정한 상태의 배양물 Pcf3는 상기 확인된 박테리아의 10종으로 이루어져 있는 것이 밝혀졌다. Pcf1과 마찬가지로, 안정한 상태의 배양물 Pcf2 및 Pcf3도 세균군으로서 바로 사용될 수도 있고, 또는 나중 사용을 위해 혼합물로 저장되거나 개개의 박테리아으로 단리, 저장한 후 재조합할 수도 있다.

안정한 상태의 배양물 Pcf1 및 Pcf3는 부다페스트 조약에 따라 1997년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn drive, Rockville, MD 20852, USA)에 기탁되었고, 각각 수탁 번호 ATCC 2022036 및 ATCC 202037을 부여 받았다. Pcf1 및 Pcf3의 각 균주는 실시예 1 및 실시예 2에서 특정화되어 있다.

안정한 상태의 배양물 Pcf1 또는 Pcf3의 조성은 그 효과를 거의 또는 전혀 경감시키지 않으면서 그 군체에서 하나 또는 그 이상의 박테리아종을 제거함으로써 수정될 수도 있다. 비제한적인 예를 들면, 다수의 균주 또는 종을 갖는 속의 많이 존재하는 박테리아 균주는 효율을 실질적으로 경감시키지 않고도 제거될 수 있을 것으로 생각된다.

바람직한 구현예에서, 세균군은 기탁된 안정한 상태의 배양물 Pcf1 또는 Pcf3로부터이 박테리아 혼합물로 이루어진다. 그러나, 다른 대체가능한 구현예에서, 사용되는 박테리아의 다수는 공지의 또는 표준의 균주로부터 수득되거나 돼지로부터 회수한 단리물로부터 얻어질 수도 있다. 비제한적인 예를 들면, 엔테로코커스, 스트렙토코커스, 클로스트리디움 또는 박테로이데스의 하나 이상의 다른 균주가 기탁된 안정 상태의 배양물에 있는 같은 속 또는 종의 균주를 대체할 수도 있다. 공지된 균주의 군체 배양물을 사용하는 경우 효능을 높이기 위해, 박테리아은, 바람직하게는 안정상태의 배양물로부터의 다른 생물들과 함께, 통과하는 경로에 의해 돼지에 적용된 다음, 배설물 또는 맹장의 내용물로부터 벌충되거나 단리될 수 있다. 돼지 단리물이 사용될 경우, 박테리아는 당업계의 통상적인 기술을 사용하거나 딜로우취 등에 의해 기술된 방법[DeLoach et al., 미합중국 특허 제 5,308,615 호 / 문헌의 내용은 본 발명의 참고문헌으로 채택됨]에 의하여 성숙된 돼지의 배설물 또는 맹장 내용물로부터 개별적으로 단리 및 회수될 수 있다.

본 발명의 박테리아 균주의 일부는 누르미 등의 기술[Nurmi et al., 미합중국 특허 제 4,689,226 호 / 문헌의 내용은 본 발명의 참고문헌으로 채택됨]에 준하여 대상 돼지의 소화관의 상피 세포에 부착하는 능력을 위해 선택적으로 선택된 것일 수도 있다.

안정 상태의 배양물 Pcf1 및 Pcf3의 수정에 의해 결과된 모든 배양물은 대상 동물의 살모넬라 군집화를 저해하기 위한 적정의 효능을 나타내는 조성을 선택하기 위해 선택적으로 스크리닝할 수 있다. 한 구현예에서, 스크리닝은 종래 기술에서 통상적이고 실시예 3 내지 7에 기재된 바와 같은 방법으로 살모넬라 챌린지로써 생체 내에서 수행될 수 있다. 요약하면, 안정한 상태의 배양물은 여기에 기재된 바와 같이 살모넬라가 없는 동물에 투여된다. 배양물이 장내에 구축되기 위한 충분한 시간이 경과한 후, 일반적으로 약 1일 후, 동물에 항온처리된 살모넬라의 생활력있는 배양물을 챌린지하고, 이어서 동물을 죽여 맹장의 내용물에 대하여 살모넬라 군집을 분석한다. 살모넬라 군집의 효과적인 저해는 비처리 대조군에 비하여 처리된 군체에서 살모넬라 배출물 빈도의 감소, 평균 살모넬라 농도(CFU)의 감소, 또는 군집화된 동물의 낮은 백분율에 의해 나타난다.

본 발명의 세균군은 당업계에 통상적인 혐기성 배양기술을 사용하여 적절한 배양 배지에서 박테리아의 배치식 또는 연속적인 배양에 의해 다량으로 생산될 수 있다. 그중에서도, 연속적인 배양이 특히 유리한데, 그 이유는 안정한 상태의 배양물이 극히 안정하고, 안정 상태의 배양물 하에 무제한 유지될 수 있기 때문이다. 대량 배양을 위한 접종물은 안정상태의 배양물의 샘플 또는 종자, 퇴적물, 또는 박테리아의 스톡 배양물 또는 실질적으로 생물학적으로 순수한 단리물일 수 있다. 박테리아는 조합되어 배양되어도 좋고, 또는 분리된 배양배지에서 배양된 후 표준화를 위해 조합되어도 무방하다. 후자의 방법에 따르면, 조합 이전 각 박테리아의 최종 농도는 약 10⁸내지 10⁹마리/ml 사이여야 한다. 그러나, 당업자는 상기 농도가 결정적인 것은 아니며 변화될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 대량 생산이 배치 배양으로 수행될 경우, 배양은 수확 이전 약 6 내지 72 시간 동안 항온처리되어야 한다.

본 발명의 세균군의 사용은 특정한 제조방법에 의해 영향을 받지 않는다; 상술한 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 세균군이 같은 방식으로 사용될 수 있다. 제조 후, 박테리아 배양물은 단독으로 또는 조합에 의해 대상 동물에 직접 투여될 수 있다. 임의로, 세균군은, 유당 또는 탈지우유를(이에 국한되는 것은 아니지만) 포함하는 적절한 담체와 함께 조제되거나, 프리믹스로 사용하기 위해 소량의 사료와 함께 조합될 수도 있다. 배양물은 저장 안정성 및 취급 용이성을 위해 동결건조되어도 좋다. 이와 같이 동결건조된 배양물은 동물에 직접 투여될 수도 있고, 아니면, 사용에 앞서 재구성될 수도 있다. 특별히, 알기네이트 겔 중에 캡슐화하는 것을 포함하는(이에 국한되는 것은 아님) 당업계에 공지된 기술에 의하여 박테리아의 1종 또는 모두가 캡슐화되어도 좋다. 이론에 얽매이지 않는다면, 이러한 방식으로 캡슐화하는 것은 몇몇 박테리아가 상부 위장관에서 젖산의 농도를 바람직하지 못한 수준으로 감소시키는 것을 막을 수도 있다. 이 방법은 또한 박테리아를 보호하여 이들이, 젖산 활용이 바람직한 맹장에 도달하도록 해준다.

본 발명의 세균군은 국산 가축 또는 돼지의 살모넬라를 제어하기에 유효한 기타 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아, 특히 젖산 또는 휘발성 지방산을 생성하는 박테리아와 조합될 수도 있다. 기타 적절한 박테리아로서 비제한적으로 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus) 또는 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) 종을 들 수 있다. 국산 가축 및 돼지를 처리하기 위한 여타의 당업계에 통상적이거나 공지된 보조제, 특히 장내병원의 저해 또는 치료를 위한 보조제가 상기 세균군에 첨가될 수 있다. 적절한 보조제의 예로서, 항독소, 구충제, 또는 호그(Hogg)에 의해 기재된 바와 같은 선택된 항생제("Digestive System Diseases", In: 1984 Yearbook of Agriculture: Animal Health Livestock and Pets, U.S. Government Printing Office, 1984-451-784, pp. 290-293)를 들 수 있다. 비-치료 수준의 몇몇 항생제가 당업계의 통상적인 방법에 의해 돼지에 투여될 수도 있다. 그러나, 세균군의 효능에 유해한 영향을 줄 수 있는 어떠한 항생제의 사용도 금해야 한다. 사용시에, 상기와 같은 항생제는 세균군과 조합으로 또는 별도로 투여될 수 있다.

본 발명의 세균군이 일차적으로 투여되거나, 세균군의 경구 섭취 이후 동물의 사료나 식수와 조합되어 소화관에 도달할 수 있다면, 동물의 구강 내에 제제를 직접 분무함으로써 경구투여될 수도 있다고 생각된다. 그렇지 않으면, 위장관에 직접 주사하는 방법도 들 수 있다.

세균군의 투여는 동물의 생애 도중 어느 시기에도 가능하다. 그러나, 바람직한 구현예에서 세균군은 생후 약 4시간 이내의 갓태어난 돼지에 투여하고, 약 24시간 후 다시 투여한다.

세균군은 처리된 돼지의 살모넬라 군집화를 실질적으로 저해할 수 있도록 유효한 양으로 투여된다. 위와 같은 저해는 비처리 동물에 비하여 살모넬라 배출물 의 감소, 평균 살모넬라 농도의 감소, 또는 군집화된 동물의 낮은 백분율 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적절한 양은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 동물의 연령 및 크기에 따라 어느 정도 변할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 갓태어난 돼지를 처리할 경우, 활성을 지닌 안정상태의 배양물 5 ml가 경구 투여된다.

다음의 실시예는 단지 본 발명을 더 설명하기 위한 것으로, 특허 청구의 범위에 의해 정의되는 특허 내용의 범위를 한정하는 것으로 여겨져서는 아니된다.

실시예 1

세균군의 제조

초기 접종물. 초기 접종물은 항생제가 없는 전형적인 돼지 사료로 계속 기른 5주령의 시판되는 돼지(텍사스, 칼리지 스테이션의 USDA-FAPRL에서 사육)의 맹장으로부터 얻었다. 돼지를 희생시키고, 그 맹장 내용물을 즉시 무공기실(Coy Laboratory Products, Ann Arbor, MI)에 넣은 다음, 50 그램 부분을 연속-흐름 배양 장치 내에서 종자 접종물로 즉시 사용하였다. 나머지 맹장 내용물은 5% 글리세롤과 혼합하여 -70℃에서 보관하였다. 모든 과정은 위생적인 조건하에서 무공기적으로 수행되었다.

연속 흐름 장치. 연속 흐름 배양은 1150 ml의 작업 용적을 갖는 2.0 리터 항화학(chemostat) 용기(Wier 형)가 고정된 BioFlo I 발효기(New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 수행하였다. 배양물이 성장하여 연속 흐름 조건 하에서 유지될 때, 다음의 매개변수들이 사용되었다:

-- 희석율 0.0416^-1(0.80 ml/분의 유동 속도 및 24 시간의 용기 교체 시간에 해당함)

-- 온도 39℃, 및

-- 교반 속도 200 rpm.

무산소 CO₂의 일정한 기류를 흘려줌으로써 용기 내 무공기 조건을 유지하였다.

연속 흐름 조건 하에서 맹장내 생물의 성장

사용된 배지는 바안드 레뷔르(VL) 브로쓰 배지(pH 5.5)였다. 배지를 13.3 리터의 파이렉스 용기에서 제조하여, 15 psi에서 1.5 시간 동안 오토클레이브로 처리하였다. 배지 성분은 다음과 같다:

배지 성분 그램/리터

트립토오스 10

효모 추출물 5

NaCl 5

쇠고기 추출물 2.4

1-시스테인 HCL 0.6

포도당 2.5

멸균 후, 배지를 무산소 CO₂의 분위기 하에 두고, 실온까지 식혔다.

1150 ml 항화학 용기를 멸균된 VL 배지로 채우고 맹장 내용물을 접종하기에 앞서 무균성을 확인하기 위해 48 시간 동안 방치하였다. 항화학 용기를 50 g의 맹장 내용물로 접종하고, 즉시 상술한 연속-흐름 배양으로 무공기 항온처리하였다. 휘발성 지방산과 pH 분석을 위한 샘플을 매일 채취하였다. 배양은 6일 후 pH 6.1에서 안정한 상태에 도달하였다. 이 배양물을 Pcf1으로 표시하였다. 배양액 pH, OD₆₀₀및 휘발성 지방산 농도가 거의 일정하게 유지될 때를 안정한 상태의 조건이라 가정하였다.

안정한 상태의 조건이 이루어진 후, 멸균 조건 하에 Pcf1의 5개의 일련의 1:10 희석을 행함으로써 Pcf1으로부터 두 번째 배양을 진행시켰다. 마지막 희석은 멸균된 VL 배지로 채워진 두 번째 항화학 용기를 접종하는데 사용되었고, 연속-흐름 배양은 안정한 상태가 얻어질 때까지 상술한 방법으로 반복되었다. 이러한 두 번째 안정한 상태의 배양물을 Pcf2라 표시하였다. 이와 같은 일련의 희석/연속-흐름 배양 과정을 반복하여 Pcf2로부터 세 번째 배양을 전개하였다. Pcf2는 1:10의 비율로 총 8회 연속적으로 희석되었다.

희석물은 또다른 항화학 용기를 접종하는데 사용되었고, 연속-흐름 배양은 안정한 상태가 얻어질 때까지 같은 조건 하에 다시 반복되었다. 이러한 세 번째 안정한 상태의 배양물을 Pcf3으로 나타내었다.

연속-흐름 배양물의 시료를 무균적으로 수집하고, 고체 배양 배지 상에 플레이트 하여 순수한 군집을 단리한 다음, 개개의 단리물을 니스벳 등(USP 5,478,557, 이 문헌의 내용은 본 발명의 참고문헌으로 채택됨)에 의해 기술된 것과 실질적으로 같은 방식으로 특징화하였다. 안정상태의 배양물 Pcf3에서 10개의 박테리아 단리물이 동정되었다. 10개의 박테리아 단리물은 생화학적 및 효소학적 방법, 그리고 당업계에 공지된 항미생물 감수성 프로파일(antimicrobial susceptibility profile)(Holdeman et al., 1977, Anaerobe Laboratory Manual, 4th ed., Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA; Farmer et al., 1985, J. Clin. Microbiol., 21:46-76; Lennette et al., 1985, Clinical Microbiology, 4th ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C.; and Devriese et al., 1987, Int. J. Syst. Bacteriol., 37: 257-259, 각각의 문헌 내용은 본 발명에서 참고문헌으로 채택됨)을 사용하여 동정하였다. 안정 상태의 배양물 Pcf3에 대한 결과는 실시예 2에 기술한다. Pcf3은 Pcf1의 연속적 희석으로부터 유래되었으므로, Pcf1은 같은 단리물을 함유해야 한다.

안정 상태의 배양물 Pcf3 중 박테리아는 다음과 같이 동정되었다:

엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis),

스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis),

클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme),

클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum),

클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum),

박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis),

박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis),

박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus),

박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron), 및

박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae).

10개의 박테리아 단리물로 구성된 것으로 특징화된 상기 연속-흐름 배양물은 혼합 배양액 중에서 필적할만한 성장, 산성 환경(pH 5.0 내지 6.5)에서의 생존 능력, 및 발효 최종 생성물로서 휘발성 지방산(VFA)의 생성을 나타내었다.

상기 언급된 박테리아 균주 10종 모두를 포함하는 안정 상태의 또는 경쟁적 독점 배양물인 Pcf1 및 Pcf3는 1997년 9월 17일자로 부다페스트 조약 하에 ATCC(American Type Culture Collection, 12301 Parlawn Drive, Rockville, MD 20852, USA)에 기탁되었고, 각각 기탁 번호 ATCC 202036 및 202037을 부여받았다.

실시예 2

박테리아의 특징화

실시예 1로부터 수득된 10개의 박테리아 단리물을 각각 특징화하였다. 니스벳 등에 의해 기술된 것과 실질적으로 같은 기술(USP 5,478,557)을 사용하여 분석을 수행하였다. 각 단리물에 대한 결과는 이하에 기재한다. 모든 박테리아는 표준 배양액 및 생화학적 기준에 의하여 동정되었다.

단리물 1

세포 특성. 박테리아 1은 그램-양성, 운동성이 없는 코커스였다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 1은 다른 환경에서도 생존할 수 있는 혐기성 박테리아로서, 혈액 한천 상에서 공기 중 또는 무공기 조건에서 항온처리할 경우 잘 성장하였다. 군집은 비용혈성이었다. 박테리아는 37℃ 및 45℃에서 공기 중 항온처리되는 경우, 담즙 에스큘린 및 m 엔테로코커스 한천 상에서 좋은 성장을 나타내었다. 박테리아는 에스큘린을 가수분해하였다. 박테리아는 또한 10℃의 트립신 대두 브로쓰에서 좋은 성장을 나타내었다.

카탈라아제 및 옥시다아제 시험. 박테리아 1은 카탈라아제-음성 및 옥시다아제-음성을 나타내었다.

API 급속 STREP 시스템 시험 (Analytab Products, Plainview, NY). 박테리아 1에 대한 결과는 표 1에 나타낸다.

추가 시험들. 박테리아 1은 그램-양성 코커스를 위한 염분 내성 배지에서 좋은 성장을 나타내었다. 박테리아는 텔루라이트 내성 및 반코마이신-민감성을 나타내었다.

박테리아의 동정. 상기 결과를 이용하여, 박테리아 1은 엔테로코커스 파에칼리스 2로 동정되었다.

단리물 2

세포 특성. 박테리아 2는 그램-양성, 운동성이 없는 코커스였다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 2는 다른 환경에서도 생존할 수 있는 혐기성 박테리아로서, 혈액 한천 상에서 공기 중 또는 무공기 조건에서 항온처리할 경우 잘 성장하였다. 군집은 비용혈성이었다. 박테리아는 37℃ 및 45℃에서 공기 중 항온처리되는 경우, 담즙 에스큘린 및 m 엔테로코커스 한천 상에서 좋은 성장을 나타내었다. 박테리아는 에스큘린을 가수분해하였다. 박테리아는 10℃의 트립신 대두 브로쓰에서 눈에 띄는 성장을 나타내지 못하였다. 박테리아 2는 그램-양성 코커스를 위한 염분 내성 배지에서 눈에 띄는 성장을 나타내지 못하였다. 박테리아는 텔루라이트 내성을 갖지 않았지만, 반코마이신-민감성을 나타내었다.

카탈라아제 및 옥시다아제 시험. 박테리아 2는 카탈라아제-음성 및 옥시다아제-음성을 나타내었다.

API 급속 STREP 시스템 시험 (Analytab Products, Plainview, NY). 박테리아 2에 대한 결과는 표 2에 나타낸다.

박테리아의 동정. 상기 결과와 API 급속 STREP 동정법을 이용하여, 박테리아 2는 에스. 보비스 바이오타입 1로 동정되었다.

단리물 3

세포 특성. 박테리아 3은 그램-변화성, 아포형성의 바실러스였다. 세포는 끝부분을 향하고, 단독으로 또는 쌍으로 출현하였다. 아포는 타원형 및 준말단형(subterminal)이었다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 3은 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 크고, 흰 색이며, 약간 부채꼴의 모서리를 갖는 약간 돋아난 모양이었고 비용혈성이었다.

API AN-IDENT 시스템 시험 (Analytab Products, Plainview, NY). 박테리아 3에 대한 결과는 표 3에 나타낸다.

GC 결과. PYG 배양물에서 박테리아 3에 의해 생성된 VFA의 양은 표 4에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 II.1에 대한 결과는 표 5에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 3은 카나마이신, 반코마이신, 리팜핀 및 페니실린에 대하여 민감하나, 콜리스틴 및 에리스로마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

유사성 지수에 근거한 미생물 동정 시스템. 전체 세포의 세포 지방산 함량을 통한 MIDI 미생물 동정 시스템은 박테리아 3을 88%의 유사성 지수를 갖는 클로스트리디움 클로스트리디이포르메(Clostridium clostridiiforme)라고 동정하였다. 상기 결과와 MIDI 동정법을 이용하여, 박테리아 3은 씨. 클로스트리디이포르메로 동정되었다.

단리물 4

세포 특성. 박테리아 4는 그램-양성, 아포형성의 바실러스였다. 세포는 끝부분을 향하고, 단독으로 또는 쌍으로 출현하였다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 4는 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 중간크기의 회색, 약간 부채꼴의 모서리를 갖는 편평한 모양이었고 비용혈성이었다.

질산염 시험. 박테리아 4는 질산염-양성이다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 4에 대한 결과는 표 6에 나타낸다.

GC 결과. PYG 배양물에서 박테리아 4에 의해 생성된 VFA의 양은 표 7에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 4에 대한 결과는 표 8에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 4는 카나마이신, 반코마이신, 리팜핀 및 페니실린에 대하여 민감하나, 콜리스틴 및 에리스로마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

유사성 지수에 근거한 미생물 동정 시스템. 전체 세포의 세포 지방산 함량을 통한 MIDI 미생물 동정 시스템은 박테리아 II.2를 81%의 유사성 지수를 갖는 클로스트리디움 심비오섬 CFA 2군이라고 동정하였다. 상기 결과와 MIDI 동정법을 이용하여, 박테리아 II.2는 씨. 심비오섬으로 동정되었다.

단리물 5

세포 특성. 박테리아 5는 그램-변화성, 아포형성의 바실러스였다. 세포는 길고 가늘었다. 아포는 둥글고 말단형이었다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 5는 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 중간크기, 회녹색의 완전한 부채꼴의 모서리를 갖는 볼록하게 올라온 모양이었고 비용혈성이었다.

질산염 시험. 박테리아 5는 질산염-음성이었다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 5에 대한 결과는 표 9에 나타낸다.

추가 시험. 박테리아 5는 반코마이신에 민감하고, 리팜핀에는 내성을 가졌다.

박테리아 동정. 상기 결과와 함께 API AN-IDENT 동정법을 사용하여, 박테리아 5는 클로스트리디움 라모섬으로 동정되었다.

단리물 6

세포 특성. 박테리아 6은 그램-음성의 바실러스였다. 세포는 다양한 길이의 콕코바실리 또는 직선형 바실리였다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 6은 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 약간 돌기가 있는 중간크기, 흰색의 온전한 모서리를 갖는 원형이었다. 박테리아는 박테로이데스 담즙 에스큘린 한천(BBE) 상에서 명백한 에스큘린 가수분해로 좋은 성장을 나타내었다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 6에 대한 결과는 표 10에 나타낸다.

PRAS (PY) 탄수화물 발효 시험. 박테리아 6의 경우, pH 값을 표 1에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 6에 대한 결과는 표 12에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 6은 리팜핀에 대하여 민감하나, 페니실린, 카나마이신, 콜리스틴 및 반코마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

박테리아 동정. 상기 결과와 API AN-IDENT 동정법을 이용하여, 박테리아 6은 박테로이데스 프라길리스로 동정되었다.

단리물 7

세포 특성. 박테리아 7은 그램-음성의 바실러스였다. 세포는 둥근 말단을 갖는 직선형이고 단독으로 나타났다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 7은 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 볼록한, 중간 크기, 황백색의 온전한 모서리를 갖는 원형이었다. 박테리아는 박테로이데스 담즙 에스큘린 한천(BBE) 상에서 명백한 에스큘린 가수분해로 좋은 성장을 나타내었다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 7에 대한 결과는 표 13에 나타낸다.

PRAS (PY) 탄수화물 발효 시험. 박테리아 7의 경우, pH 값을 표 14에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 7에 대한 결과는 표 15에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 7은 리팜핀에 대하여 민감하나, 페니실린, 카나마이신, 콜리스틴 및 반코마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

박테리아 동정. 상기 결과와 API AN-IDENT 동정법을 이용하여, 박테리아 7은 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis)로 동정되었다.

단리물 8

세포 특성. 박테리아 8은 그램-음성의 바실러스였다. 세포는 콕코바실리였고, 단독으로 및 경우에 따라 쌍으로 나타났다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 8은 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 볼록한, 백색의, 작은, 온전한 모서리를 갖는 원형이었다. 박테리아는 박테로이데스 담즙 에스큘린 한천(BBE) 상에서 좋은 성장을 나타내었지만, 에스큘린은 가수분해되지 않았다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 8에 대한 결과는 표 16에 나타낸다.

PRAS (PY) 탄수화물 발효 시험. 박테리아 8의 경우, pH 값을 표 17에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 8에 대한 결과는 표 18에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 8은 리팜핀에 대하여 민감하나, 페니실린, 카나마이신, 콜리스틴 및 반코마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

박테리아 동정. 상기 결과를 이용하여, 박테리아 8은 박테로이데스 벌가투스로 동정되었다.

단리물 9

세포 특성. 박테리아 9는 그램-음성의 바실러스였다. 불규칙하게 얼룩진 세포는 둥근 모서리를 갖는 플레오모르픽 바실리(pleomorphic bacilli)로, 단독으로 및 쌍으로 나타났다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 9는 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 볼록한, 중간 크기, 백색의 온전한 모서리를 갖는 원형이었다. 박테리아는 박테로이데스 담즙 에스큘린 한천(BBE) 상에서 명백한 에스큘린 가수분해로 좋은 성장을 나타내었다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 9에 대한 결과는 표 19에 나타낸다.

PRAS (PY) 탄수화물 발효 시험. 박테리아 9의 경우, pH 값을 표 20에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 9에 대한 결과는 표 21에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 9는 리팜핀에 대하여 민감하나, 페니실린, 카나마이신, 콜리스틴 및 반코마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

박테리아 동정. 상기 결과와 API AN-IDENT 동정법을 이용하여, 박테리아 9는 박테로이데스 테타이오타미크론으로 동정되었다.

단리물 10

세포 특성. 박테리아 10은 그램-음성의 바실러스였다. 세포는 콕코바실리였고, 단독으로 나타났다.

배양 및 군집 특성. 박테리아 10은 생활 상태가 단일한 혐기성 박테리아로서, 혐기성 브루셀라 혈액 한천(BRU) 상에서 무공기 조건 하에 항온처리할 경우 잘 성장하였으나, 공기 중 항온 처리할 경우에는 BRU 상에서 성장하지 못하였다. BRU 상에서 3일 간 혐기성 항온처리한 후, 군집은 볼록한, 작은 내지 중간 크기, 백색의 온전한 모서리를 갖는 원형이었다. 박테리아는 박테로이데스 담즙 에스큘린 한천(BBE) 상에서 명백한 에스큘린 가수분해로 좋은 성장을 나타내었다.

API AN-IDENT 시스템 시험. 박테리아 10에 대한 결과는 표 22에 나타낸다.

PRAS (PY) 탄수화물 발효 시험. 박테리아 10의 경우, pH 값을 표 23에 나타낸다.

프레섬토 플레이트 시험. 박테리아 10에 대한 결과는 표 24에 나타낸다.

시차 디스크 결과. 박테리아 10은 리팜핀에 대하여 민감하나, 페니실린, 카나마이신, 콜리스틴 및 반코마이신에 대하여는 내성을 나타냈다.

박테리아 동정. 상기 결과를 이용하여, 박테리아 10은 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae)로 동정되었다.

실시예 3

어린 돼지의 생체내 실험

Pcf1 및 Pcf3의 살모넬라 맹장 군집화, 및 어린 돼지에서 살모넬라 분비물을 감소시키는 효능을 결정하기 위해 실험을 수행하였다.

실험 고안. 출생한 날에 입수된 어린 돼지를 세 개의 군으로 분류하였다: 미처리 대조의 살모넬라 도전, Pcf1 처리된 돼지새끼의 살모넬라 도전 및 Pcf3 처리된 돼지 새끼의 살모넬라 도전. Pcf1 및 Pcf3를 받는 돼지새끼에게는 마리 당 5 ml의 활성을 가진 안정 상태의 배양물을 출생 후 약 4시간에, 및 이유시 다시 경구 제공하였다. 돼지 새끼는 이유 후 첫째 날에 7×10⁶cfu 살모넬라 콜레라수이스로 경구 투여를 통해 도전받도록 하였다.

살모넬라 도전 후, 각 돼지 새끼로부터 수집된 장내 스웹(swab)을 배양함으로써 에스 콜레라수이스의 분비물을 측정하였다. 분비물의 누적된 빈도수를 살모넬라에 대해 양성적으로 배양하는 각 처리군으로부터 스웹의 개수로서 측정하였다. 살모넬라는 니스벳 등(USP 5,478,557)이 기술한 것과 실질적으로 같은 방법을 사용하여 검출하였다. 이유한 지 2주 후에 모든 돼지 새끼를 희생시키고, 조직 및 맹장 내용물을 해부에 의해 수집하고, 살모넬라에 의한 군집화를 조사하였다. 조사된 조직은 편도선, 폐, 기관지 림프 결절, 회장 접합부를 포함하였다. 결과를 표 25에 나타낸다.

실시예 4

Pcf1은 조사하지 않고, 살모넬라 도전 투여량을 7×10⁸cfu로 하며, 돼지 새끼를 도전 7일 후 희생시키는 것을 제외하고는 실시예 3의 분석을 반복하였다. 결과를 표 26에 나타낸다.

실시예 5

살모넬라 도전 투여량을 10⁸cfu로 하며, 모든 돼지 새끼를 도전 7일 후 희생시키는 것을 제외하고는 실시예 3의 분석을 반복하였다. 결과를 표 27에 나타낸다.

실시예 6

Pcf3은 조사하지 않고, Pcf1을 생후 4시간 및 24시간에 투여하며, 돼지 새끼를 10⁴cfu 살모넬라 콜레라수이스로 생후 48 시간에 도전하며, 돼지 새끼를 도전9일 후 희생시키는 것을 제외하고는 실시예 3의 분석을 반복하였다. 결과를 표 28에 나타낸다.

실시예 7

살모넬라 도전 투여량을 10⁴cfu로 하고, 돼지 새끼를 도전 9일 후 희생시키는 것을 제외하고는 실시예 3의 분석을 반복하였다. 결과를 표 29에 나타낸다.

이제까지 상술한 것은 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위와 정신에 위배되지 않고 적당한 수정 및 변법이 가해질 수 있음을 알 수 있다.

표 1. 박테리아 1에 대한 API 급속 STREP 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 2. 박테리아 2에 대한 API 급속 STREP 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이타임

표 3. 박테리아 3에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 4. 박테리아 3의 PYG 배양물의 GC 분석 결과

VFA의 양은 다음과 같이 표시된다: - = 생성되지 않음; T = 미량 생성됨; + = 소량 생성됨; ++ = 보통의 양으로 생성됨; 및 +++ = 다량 생성됨.

* 접종되지 않은 PYG 배지

표 5. 박테리아 3에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

LD 기재와 비교한 LD-담즙 한천 상에서의 상대적 성장: I = 열등한 성장; 및 E = 동등한 성장

표 6. 박테리아 4에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 7. 박테리아 4의 PYG 배양물의 GC 분석 결과

* 접종되지 않은 PYG 배지

표 8. 박테리아 4에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

LD 기재와 비교한 LD-담즙 상에서의 상대적 성장: I = 열등한 성장; 및 E = 동등한 성장

표 9. 박테리아 5에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 10. 박테리아 6에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 11. 박테리아 6에 대한 탄수화물 발효 시험 결과

표 12. 박테리아 6에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

표 13. 박테리아 7에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 14. 박테리아 8에 대한 탄수화물 발효 시험 결과

표 15. 박테리아 7에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

표 16. 박테리아 8에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 17. 박테리아 8에 대한 탄수화물 발효 시험 결과

표 18. 박테리아 8에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

표 19. 박테리아 9에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

* 복제 1/ 복제 2의 데이터임

표 20. 박테리아 9에 대한 탄수화물 발효 시험 결과

표 21. 박테리아 9에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의 결과

표 22. 박테리아 10에 대한 API An-IDENT 시스템 시험의 결과

표 23. 박테리아 10에 대한 탄수화물 발효 시험 결과

표 24. 박테리아 10에 대한 프레섬토(Presumpto) 플레이트 시스템 시험의결과

표 25. 경쟁적 독점 배양물로 출생시 및 이유시 처리한 돼지의 선택된 조직 및 맹장 내용물에 살모넬라 콜레라에수이스의 분비물 빈도 및 분포

^a에스 콜레라에수이스에 대해 양성인 배양의 수/처리 당 돼지의 수. Tonsl, 편도선; BLym, 기관지 림프 결절; ILym, 회장 림프 결절; IJctn, 회장 접합부. 조직 및 맹장 내용물을 이유한 지 2주 후 해부에 의해 수집하였다.

^b경구 투여를 통해 처리하였다 (5 ml/돼지). 돼지는 이유 후 첫째 날에 7 ×10⁶CFU S. 콜레라에수이스로 경구 투여를 통해 도전되었고, 모든 동물은 도전 2주 후 해부되었다. 참고 실험 RA-MSBS/USDA#1-50.

^c누적 빈도수는 에스. 콜레라에수이스에 대하여 양성으로 배양되는 장내 스웹의 수/배양된 총 스웹수로 나타난다. 다섯 마리 미처리된 돼지 모두 및 Pcf1으로 처리된 6마리 모두는 도전 후 적어도 1회 에스. 콜레라에수이스를 분비하였고, Pcf3로 처리된 돼지는 4 마리 중 2 마리만이 에스. 콜레라에수이스를 분비하였다.

^d한 마리 돼지로부터의 장내 스웹은 도전 후 12일 째에 수득되지 않았다.

표 26. 경쟁적 독점 배양물(Pcf3)로 출생시 및 이유시 처리한 돼지 및 미처리 돼지의 맹장 내용물 중 살모넬라 콜레라에수이스의 분비물 빈도 및 분포

^a경쟁적 독점 배양이 경구 투여를 통해 수행되었다 (5 ml/돼지). 돼지는 이유 후 첫째 날 7×10⁸CFU 에스. 콜레라에수이스로 경구 투여로 도전되었고, 모든 동물은 도전 후 7일 째에 해부되었다. 모든 돼지로부터의 해부시 수집된 림프 결절은 에스. 콜레라에수이스에 대하여 양성으로 배양되었다. 참고 실험 RA-MSBS/USDA#1-70.

^b누적 빈도수는 에스 콜레라에수이스에 대하여 양성으로 배양된 장내 스웹의 수/배양된 스웹이 총수로 표시된다.

^cCC, 맹장 내용물. 무처리 돼지 및 Pcf3을 투여한 돼지 모두에 대하여 4.3 log₁₀ CFU/g으로 평균화된 맹장 내용물 중 살모넬라 콜레라에수이스 농도.

표 27. 경쟁적 독점 배양물로 출생시 및 이유시 처리한 돼지의 선택된 조직 및 맹장 내용물에 살모넬라 콜레라에수이스의 분비물 빈도 및 분포

^aILym, 회장 림프 결절; IJctn, 회장 접합부; CC, 맹장 내용물.

^bLog₁₀CFU/g 맹장 내용물.

^c경쟁적 독점 배양이 경구 투여에 의해 수행됨(5 ml/돼지). 돼지는 이유 후 첫째 날에 10⁸CFU 에스. 콜레라에수이스로 경구 투여에 의해 도전되고, 모두는 도전 후 7일 째에 해부되었다. 참고 실험 RA-MSBS/USDA#1-139.

^d분비물의 누적 빈도는 에스 콜레라에수이스에 대해 양성으로 배양되는 장내 스웹의 수/배양된 스웹의 총수로 나타낸다.

표 28. 돼지 유래 경쟁적 독점 배양물로 생후 4시간 및 24시간에 처리된 돼지 새끼의 조직 및 창자에서 살모넬라 콜레라에수이스의 분비물 빈도 및 분포

^aILym, 회장 림프 결절; IJctn, 회장 접합부; Col, 결장; CC, 맹장 내용물.

^bLog₁₀CFU/g 맹장 내용물.

^c경쟁적 독점 배양이 경구 투여에 의해 수행됨(5 ml/돼지). 돼지는 생후 48시간에 10⁴CFU 에스. 콜레라에수이스로 경구 투여에 의해 도전되고, 모두는 도전 후 9일 째에 해부되었다. 참고 실험 RA-MSBS/USDA#1-134.

표 29. 돼지 유래의 경쟁적 독점 배양물로 출생시 및 이유시 처리한 돼지새끼의 선택된 조직 및 창자에서 살모넬라 티피무리움의 분비물 빈도 및 분포

^aILym, 회장 림프 결절; Col, 결장; CC, 맹장 내용물.

^bLog₁₀CFU/g 맹장 내용물.

^c경쟁적 독점 배양이 경구 투여에 의해 수행됨(5 ml/돼지). 돼지는 이유 후 첫째 날에 10⁴CFU 에스. 콜레라에수이스로 경구 투여에 의해 도전되고, 모두는 도전 후 9일 째에 해부되었다. 참고 실험 RA-MSBS/USDA#2-70.

^d분비물의 누적 빈도는 배양되는 장내 스웹의 수로 나타낸다.

Claims

1. 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아의 군체를 함유하며, 상기 박테리아는 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme), 클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum), 클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) 및 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae)를 실질적으로 모두 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 살모넬라 군집화를 저해하기 위한 조성물.

2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 ATCC 수탁 번호 202036 또는 수탁 번호 202037를 함유하는 조성물.

3. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아의 적어도 7종, 바람직하게는 8종, 더욱 바람직하게는 9종을 함유하는 조성물.

4. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아를 모두 함유하는 조성물.

5. 제 1 항에 있어서, 담체를 더 함유하는 조성물.

6. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아가 캡슐화된 조성물.

7. 제 1 항에 따르는 조성물과 조합된 동물 사료를 포함하는 사료 제품.

8. 돼지에 실질적으로 생물학적으로 순수한 박테리아의 군체를 포함하며, 상기 박테리아가 실질적으로 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 클로스트리디움 클로스트리디포르메(Clostridium clostridiforme), 클로스트리디움 심비오섬(Clostridium symbiosum), 클로스트리디움 라모섬(Clostridium ramosum), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 박테로이데스 디스타소니스(Bacteroides distasonis), 박테로이즈 벌가투스(Bacteroids vulgatus), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) 및 박테로이데스 카카에(Bacteroides caccae) 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 투여하는 것으로 이루어지는, 돼지의 살모넬라 군집화를 저해하는 방법으로, 상기 조성물을 상기 돼지 소장의 살모넬라 군집화를 저해하기 위한 유효량으로 투여하는 방법.

9. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물이 ATCC 수탁 번호 202036 또는 수탁 번호 202037를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 박테리아의 적어도 7종, 바람직하게는 8종, 더욱 바람직하게는 9종을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

11. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 박테리아를 모두 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

12. 제 9 항에 있어서, 상기 돼지가 국산 돼지로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

13. 제 14 항에 있어서, 상기 돼지가 생후 약 2일 미만의 동물임을 특징으로 하는 방법.

14. 제 9 항에 있어서, 상기 박테리아의 군체가 담체와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.

15. 제 9 항에 있어서, 상기 박테리아가 캡슐화된 것임을 특징으로 하는 방법.

16. 제 9 항에 있어서, 투여 단계가 상기 군체를 상기 돼지에 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.

17. 제 18 항에 있어서, 상기 투여 단계가 상기 군체를 상기 돼지를 위한 사료와 조합하여 제공하는 것을 포함하는 방법.

18. 제 18 항에 있어서, 상기 투여 단계가 상기 군체를 상기 돼지를 위한 식수와 조합하여 제공하는 것을 포함하는 방법.