CN109652334A

CN109652334A - 一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN109652334A
Application number: CN201910030845.8A
Authority: CN
Inventors: 谭瑛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本发明提供一种微生物复合菌剂，包括短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。本发明所述的微生物复合菌剂，抑制病原菌能力强且制为冻干粉后存活率高。本发明所述的微生物复合菌剂的四种菌株之间无相互拮抗作用，可以互利共生，且所述长双歧杆菌、所述乳酸杆菌、所述粪链球菌对病原菌均有强大的拮抗作用，进而使四种菌株形成的所述微生物复合菌剂具有良好的调理胃肠道健康、提高免疫力的功能。

Description

一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于人体微生态学技术领域，尤其涉及一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

各种微生物(细菌)经常从不同的环境附到人体，并能在一定部位定居和不断生长、繁殖后代，这种现象通常称为“细菌定植”。定植的微生物必须依靠人体不断供给营养物质才能生长和繁殖，才能进而对人体产生影响。

通常而言，人体具有如下几种免疫机制：

a.结构屏障：幼儿抵抗外来病原微生物感染的“结构屏障”包括体表屏障和内部屏障。体表屏障由覆盖在体表的皮肤及与外界相通的腔道内衬着的粘膜构成，是机体防御微生物的第一道防线。如小肠粘膜上皮不仅具有消化吸收营养物质的功能同时也是一道抵抗有害物质(包括细菌、病毒、病原体、变应原大分子物质等)的重要屏障(Kato等)，特别是血脑屏障，它能阻止血液中的病原微生物及其他大分子物质进入脑组织和脑室。此外，消化道的蠕动和呼吸道粘膜纤毛的运动不仅对肠腔内微生物有机械清除作用，粘膜上皮的定期脱落更替降低了各种微生物建群的机会。

b.化学屏障：呼吸道和消化道各器官分泌的各种分泌物(含有溶菌酶、补体、天然抗体等)构成了幼儿抗感染的“化学屏障”。如幼儿口腔中的唾液 (主要含有溶菌酶)可杀死多种病原微生物，胃分泌的胃酸和胃蛋白酶能破坏日粮抗原并能有效抑制多种微生物从口咽进入小肠，而进入小肠的某些微生物对小肠中的胆汁也非常敏感；另外，胰液中的蛋白酶可破坏细菌细胞膜。肠道杯状细胞分泌的粘液既可保护脆弱的肠上皮免受机械损伤，又可作为一种粘性基质来包栽抗原物质，使其更易被胰和上皮细胞分泌的酶降解(Gaskins，1999)；此外，粘膜可以保护上皮免受肠道菌群分泌的消化酶的破坏和阻止病原体侵入上皮(Nevtre等，1987).

c.生物屏障：肠道中的大量正常菌群又被称为“生物屏障”。Hentges 等(1983)认为正常菌群的主要作用是阻止入侵微生物在肠道中建群。Gaskin 等(1996)报道认为正常菌群可刺激动物机制的发育从而增强机体免疫。正常菌群分泌的各种抗菌物质如细菌素能抑制某些厌氧菌繁殖。此外，正常菌群与病原微生物在建群点，营养等生存条件上存在的竞争关系，也在抑制病原微生物的生长发育和繁殖。

d.吞噬细胞，自然杀伤细胞及体液中的抗菌物质：幼儿血液中的吞噬细胞(部分来自母乳)包括中性粒细胞和单核/巨噬细胞。中性粒细胞在机体防御细菌感染中具有重要作用。中性粒细胞中的杀菌/渗透增强蛋白(BPl)不仅对革兰氏阳性菌具有广谱抑制和杀伤作用，而且具有中和细菌内毒素，抑制细胞因子释放和抵御内毒素致死效应等作用(柯岩等，1998)。自然杀伤细胞 (NK细胞)可产生干扰素，发挥细胞毒作用而杀伤感染细胞。此外，体液中的补体、Tuftsin都发挥重要的非特异性免疫作用。

e.乳源非抗体保护蛋白：人乳铁蛋白(Loctoferrin，LTF)是母乳中一种非抗体保护蛋白，是新生幼儿转运铁离子并作为母亲乳腺及新生婴儿肠道的一种防御屏障，此外，还具有调节非特异性免疫，促进粒细胞和淋巴细胞有丝分裂等功能。

益生菌是对人体有益的一种菌种，具有调节肠道健康的功效，但现有的益生菌普遍具有如下缺陷：1、抑制病原菌能力较弱。2、冻干菌粉的冻干工艺直接关系到冻干后菌粉的存活率，其制为冻干菌粉后，活菌数量较低，影响其效用。

发明内容

为此，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种抑制病原菌能力强且制为冻干粉后存活率高的微生物复合菌剂。本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中的冻干菌粉工艺得到的微生物复合菌剂的活菌存活率低的问题，进而提供一种活菌存活率高的长微生物复合菌剂的制备方法。

本发明的微生物复合菌剂，包括短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。所述短乳杆菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 16125，其拉丁命名为Lactobacillus brevis；所述长双歧杆菌于2018年7月 17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO.16126，其拉丁命名为Bifldobacteriumlongum；所述贝酵母菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 16127，其拉丁命名为Saccharomycesbayanus；所述粪链球菌于2018年7 月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO.16128，其拉丁命名为streptococcusfaecalis。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)地址，即保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述短乳杆菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构，所述SEQ IDNO.1的序列结构具体如下：

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所述长双歧杆菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.2所示的序列结构；所述SEQID NO.2的序列结构具体如下：

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所述贝酵母菌的26S rDNA序列具有如SEQ ID NO.3所示的序列结构；所述SEQ IDNO.3的序列结构具体如下：

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所述粪链球菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.4所示的序列结构。所述SEQ IDNO.4的序列结构具体如下：

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所述的微生物复合菌剂在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的保健品、乳制品、药物中的应用。

优选地，所述的微生物复合菌剂在制备治疗和/或预防腹泻的保健品、药物中的应用。

本发明的微生物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：取所述的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌分别制为冻干粉，再混合均匀即得。

优选地，所述微生物复合菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：分别向所述短乳杆菌、所述长双歧杆菌、所述贝酵母菌及所述粪链球菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于 -10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得所述短乳杆菌的冻干粉、所述长双歧杆菌的冻干粉、所述贝酵母菌的冻干粉及所述粪链球菌的冻干粉，将四种冻干粉混合均匀，即得。

优选地，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。

优选地，所述的微生物复合菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)取所述短乳杆菌、所述长双歧杆菌、所述贝酵母菌及所述粪链球菌，分别发酵培养，得到所述短乳杆菌的发酵液、所述长双歧杆菌的发酵液、所述贝酵母菌的发酵液、所述粪链球菌的发酵液；

(2)取步骤(1)中发酵得到的四种发酵液，分别将其置于转速为8000-12000 r/min下，离心10-30min，收集菌泥，得到四种菌泥；

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中分别加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，得到所述短乳杆菌的冻干粉、所述长双歧杆菌的冻干粉、所述贝酵母菌的冻干粉及所述粪链球菌的冻干粉，将四种冻干粉混合均匀，即得。

进一步优选地，步骤(1)中，所述短乳杆菌、所述长双歧杆菌、所述贝酵母菌及所述粪链球菌，均经过三级发酵得到发酵液。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明所述的微生物复合菌剂，从婴儿粪便分离大量的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌，根据抑制病源菌能力、产酸能力、消化能力等试验，筛选出能够较好地消化蛋白、肉渣、玉米、淀粉、树叶、草的菌株，得到本发明所述的微生物复合菌剂，将其用于人体，因为同源菌种好定殖，短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌会抑制有害菌，进而维护肠道菌群生态平衡，形成生物屏障，抑制有害菌对肠道的入侵。另外，所述微生物复合菌剂还可以通过产生大量的短链脂肪酸促进肠道蠕动及菌体大量生长改变渗透压而防止便秘。此外，菌体崩解产物和代谢物中含有多种酶、小肽、短链脂肪酸等成分，补充营养成分等优势。

(2)本发明所述的微生物复合菌剂，在人的胃肠道疾病中，特别是腹泻发挥了很好的预防和治疗作用，并且通过多种途径弥补了抗生素和疫苗的不足，为人类的健康和获得安全的食品开辟了新的途径。

(3)本发明所述的微生物复合菌剂，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌直径较大，具有较强的抑制病原菌能力。

(4)本发明所述的微生物复合菌剂，耐酸耐胆盐性良好，且经过冻干粉等工艺操作后菌株活性仍然较为理想、种子的保存期长。且通过本发明所述的微生物复合菌剂的制备方法制备，制备过程中，采用特定的保护剂，使制为冻干粉后各微生物的保持较高的存活率。

附图说明

图1是本发明所述的短乳杆菌的菌液镜检结果图；

图2是本发明所述的长双歧杆菌的菌液镜检结果图；

图3是本发明所述的贝酵母菌的菌液镜检结果图；

图4是本发明所述的粪链球菌的菌液镜检结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株的分离筛选

本实施例的微生物复合菌剂，包括短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。所述短乳杆菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 16125；所述长双歧杆菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCCNO. 16126；所述贝酵母菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO.16127；所述粪链球菌于2018年7月17日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，其保藏编号为CGMCC NO.16128。

本发明所述的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌从新生儿和婴儿的粪便中分离，并从其中的84种有益菌中经过抑菌试验、消化能力试验、耐酸、碱等试验优化筛选后选其中四个优秀菌种。其通过如下方法分离得到：

将人体肠道粪便1克，装入放由30个玻璃球的灭菌瓶内加生理盐水作 100倍稀释充分打均后，再作10^-3、10^-4、依次到10^-8稀释度，取10^-4、10^-5、 10^-6、10^-7、10^-8五个稀释度的菌液分别接种于LYT通用琼脂平板、伊红、美兰琼脂、BB(BS)双歧杆菌选择性培养基、LBS(LC)乳酸杆菌选择性培养基、EC 肠球菌择基和Sb酵母菌择基。每种培养基接6个平板，接种后立即上下翻转培养皿使接种液在平皿表面均匀扩散。其中3个作需氧培养，24小时后即观察。另3个作厌氧培养48小时。经过肉眼观察和解剖显微镜45℃角折射光观察。将每种菌落再移植到LYT琼脂一个菌落及液体培养基一个菌落，分别做厌氧和需氧，同时涂片作革兰氏染色镜检，分离出138个菌株，进行鉴定结果属于8个科，11个属的36种菌，其中所分离筛选出的菌种每月继代一次，5代前冻干保存。

其中，所述贝酵母菌的分离及选育具体方法如下：

取1g样品，加入100ml PTYG培养基中，于恒温摇床中培养，培养温度 30℃，转速180r/min，培养时间为24h。

将富集后的样品，取1ml进行10倍梯度稀释，取3个适宜的稀释度在改良SB平板上进行涂布，30℃培养36h，挑取典型菌落进一步用改良SB平板划线纯化2～3次。

其中，酵母菌则未见选择特性，故无从配制选择性培养基。因其对万古霉素的耐受特性，并结合其特有的菌落形态，在有氧条件下培养后，即可与其他菌落区分开。因此，采用的所述改良SB培养基包括如下原料：蛋白胨 (Oxoid)1％，麦芽糖4％，10％酒石酸1.4％，牛肉粉0.35％，氯化钠0.5％，万古霉素10ug/ml，琼脂2％；其培养条件如下：pH值为5.8-6.0，温度为30℃，培养36h。

所述粪链球菌的分离及选育具体方法如下：

取粪便1g，置于装有10ml缓冲蛋白胨水的三角瓶中，振荡均匀。按10 倍梯度稀释，选3个适宜稀释度各0.1ml涂布KF琼脂平板，37℃培养48h。挑选白色、表面光滑凸起、边缘整齐，直径约1.0～1.5mm的特征菌落。传于 PTYG斜面培养后进行革兰氏染色，挑选镜检为革兰氏阳性，圆形成卵圆形，单个、成对或短链状排列的菌株纯化培养。将纯化后的菌株进行生长特性试验，接种6.5％氯化钠肉汤培养基和七叶苷斜面，37℃培养48h后，选择七叶苷水解阳性、6.5％氯化钠肉汤培养基上生长的菌株作为待筛菌株。

将待测菌株接种PTYG液体培养基，37℃培养48h，转接平板，挑取单菌落，分别接种于PTYG基础半固体培养基和PTYG固体斜面上，38℃培养48 h，并通过筛选得到耐酸和耐胆盐性能优良，且生长良好的、符合安全性试验的菌株。

其中，所述粪链球菌的分离培养基为缓冲蛋白胨水溶液，具体包括如下成分：蛋白胨10g，Na₂HPO₄ 2g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 2g，KCl 5g，蒸馏水 1000ml。制备方法如下：取10ml缓冲蛋白胨水置于50ml三角瓶，加入少量玻璃珠，121℃灭菌15min后备用。由于粪链球菌对叠氮钠有耐受性，同时具有能耐受45℃高温的特性，所述粪链球菌选择性培养基选择市售的KF 培养基，结合高温培养条件，进行肠球菌的分离。经过验证，该方法能有效地分离出粪链球菌。

按照如下标准进行种子菌株的筛选：⑴.无内外毒素、无毒、无害、安全、无副作用；⑵.有利于促进体内菌群平衡或预防生态失调；⑶.高产抗菌活性物质、产酸能力强；⑷.来源于自身肠道的益生菌才具有较好的粘附性能，得到具有抑制病原菌、调节肠道微生态平衡、提高机体免疫力的菌株。

得到的所述短乳杆菌的菌种为革兰氏阳性菌，其特性如下：所述短乳杆菌大小为0.7～1.0×2～4μm，呈单个或双链排列，其菌落为小菌落，呈乳白色，半透明，表面粗糙，45°折光观察，其分布均匀，有彩色光带，其微观结构如图1所示。

得到的所述长双歧杆菌为革兰氏阳性杆菌，其特性如下：大小为0.5-0.8 ×2-8μm，呈杆状、棒状或分叉为V、Y型，所述长双歧杆菌中到大菌落，呈灰白色，中央隆起，表面平滑或粘液状。显微镜下45°折光性观察，菌落结构较为细致，边缘不规则，有荧光度刻纹，边缘一部分有彩色光带。

得到的所述的贝酵母菌的形态及染色特征：为革兰氏阳性菌，大小3～6 ×5～14μm，呈卵圆形，见图1。其菌落特征为中等大菌落，呈白色，粗糙，圆形或不规则。所述贝酵母菌为专性需氧，最适宜生长初始pH值为6.0，最适宜培养温度为30℃，摇瓶培养最适宜接种量为3％，能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和甘露醇，不发酵半乳糖、棉子糖、乳糖，硝酸还原阳性。

得到的所述粪链球菌为革兰氏阳性杆菌，其特性如下：粪链球菌为革兰氏阳性球菌，直径0.5-1.0μm，菌体单个或成对存在，也常形成不规则的团堆，如图1所示。所述粪链球菌中等偏大菌落，呈灰白色，光滑，边缘整齐。其检验标准为：应无杂菌，转种时OD600值为1.9-2.4。

所述短乳杆菌能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、麦芽糖、松三糖和核糖。以下对所述短乳杆菌9084株的第1代、第10代、第13代生产种第 1代、第10代、第13代生产种子制备的菌液活菌数进行测试。所述长双歧杆菌的代谢产物以乙酸为主。能发酵葡萄糖，阿拉伯糖、木糖、核糖和乳糖。以下对所述长双歧杆菌生产种子传至第1代、第10代、第13代，对不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数进行了测定。将所述贝酵母菌的基础种子分别接种至培养基，静置培养18h制备生产种子。将生产种子在培养基中连传13代，观察和测定不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数，以确定生产菌种的代次。将所述粪链球菌N9024株的基础种子分别接种PTYG液体培养基，粪链球菌37℃静置培养18h制备生产种子。将生产种子在PTYG液体培养基中连传13代(培养方法同上)，观察和测定不同代次菌种的形态、培养特性、和活菌数，以确定生产菌种的代次。其结果如下：

经测所述长双歧杆菌、所述乳酸杆菌、所述粪链球菌、所述贝酵母菌第 1代、第10代、第13代生产种第1代、第10代、第13代生产种子制备的菌液活菌数，结果显示生产种子传至13代时，所述长双歧杆菌不低于1.0× 108CFU/mL，所述乳酸杆菌不低于1.0×108CFU/mL，所示粪链球菌不低于 1.0×109CFU/mL，所述贝酵母菌不低于1.0×108CFU/mL，其能够保证生物制品生产的正常进行，表明四种菌株的生产种子在1～13代活力稳定。

实施例2微生物复合菌剂的制备

本实施例的微生物复合菌剂，包括实施例1中所述的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。

其制备方法如下：

A、制备短乳杆菌冻干粉；

(1)取所述的短乳杆菌，按照1％的接种量接种至装有35L的LYT发酵培养基的50L发酵罐中，在温度为37℃、转速为50rpm、发酵罐的罐压为 0.05Mpa的条件下，发酵18h，在对数生长期得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照8％的接种量接种至装有LYT发酵培养基的发酵罐中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养20h，得到对数期生长的二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照7.5％的接种量接种至LYT发酵培养基中，在温度为37℃、转速为150rpm、发酵罐的罐压为0.05Mpa的条件下，厌氧培养24h，得到对数期生长的短乳杆菌的三级发酵液。

其中，所述LYT发酵培养基的pH值为7.0，具体包括如下重量份的原料：蛋白胨2.0重量份；酵母浸粉2.0重量份；葡萄糖2.0重量份；微量盐4.0 重量份，L-半胱氨酸盐0.05重量份；

所述微量盐包括如下原料：氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.48g/L，碳酸氢钠 10g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，氯化钠2.0g/L。

由于短乳杆菌为兼性厌氧菌，厌氧培养长的更好，因此，采用上述方法培养所述短乳杆菌，菌株活性、繁殖生长状况更优。作为本实施例的优选实现方式，还包括在制备所述一级发酵液、二级发酵液、三级发酵液时进行检验的步骤，其具体如下：得到所述一级发酵液应纯粹，且OD₆₀₀值为1.8-2.3；得到的所述二级发酵液应纯粹，且OD₆₀₀值为1.8-2.4；得到的所述三级发酵液应纯粹。

(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心60min，收集菌泥；

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得短乳杆菌冻干粉。

B、制备长双歧杆菌冻干粉

(1)取所述长双歧杆菌，在温度为37℃下，初始pH值为7.5的凝固牛乳中培养36～48小时，作为本实施例的优选实现方式，所述长双歧杆菌按3％的接种量接种至作为培养基的凝固牛乳上，并采用摇瓶培养的方式培养；

(2)取步骤(1)中发酵得到的所述发酵液，将其置于离心机中，转速为8000r/min，离心30min，收集菌泥；

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得长双歧杆菌冻干粉。

C、制备贝酵母菌冻干粉；

(1)取所述贝酵母菌培养6h-12h后得到的对数生长期的菌液，作为一级种子液，将一级种子液按照4-10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为150-200rpm的条件下，培养24-36h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照4-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为 28-32℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液。

其中，所述发酵培养基的pH值为6.0-6.5，且包括如下成分：酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖与微量盐。作为本实施例的优选实现方式，所述发酵培养基包括如下重量份的原料：5重量份酵母浸粉、10重量份蛋白胨、5重量份葡萄糖、5重量份氯化钠、1重量份微量盐。所述微量盐为氯化钙、硫酸镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾与氯化钠中按照1:2:6:4:1:2的重量比混合而成。

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得贝酵母菌冻干粉。

D、制备粪链球菌冻干粉；

(1)取所述的粪链球菌，按照1％的接种量接种至一级发酵培养基中培养，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，发酵12-14h，得到一级发酵液；然后，取所述一级发酵液，按照5-10％的接种量接种至二级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为100-180rpm的条件下，培养4-6h，得到二级发酵液；再取所述二级发酵液，按照5-12％的接种量接种至三级发酵培养基中，在温度为37±3℃、转速为150-250rpm的条件下，培养14-16h，得到三级发酵液。其中，所述一级发酵培养基、所述二级发酵培养基、所述三级发酵培养基为同一培养基，其pH值均为7.0-7.4，并均包括如下组分：蛋白胨1.5重量份；酵母浸出粉0.6重量份；葡萄糖2重量份；可溶性淀粉 0.05重量份；氯化钠0.5重量份；L-半胱氨酸盐0.05重量份；西红柿汁20重量份；吐温-80 0.01重量份；水解乳蛋白0.5重量份；琼脂粉2重量份。

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中加入所述保护剂，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1的重量比混合而成。将所述蔗糖、所述脱脂奶粉、所述明胶混合均匀，经115℃灭菌30min，待冷却至室温后，在无菌条件下与所述菌泥按照3:1的重量比混匀，制成菌悬液，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h后，使所述菌泥的含水量小于5％，即得粪链球菌冻干粉。

E、四种冻干粉的混合；

将步骤A、B、C、D中制备得到的所述短乳杆菌的冻干粉、所述长双歧杆菌的冻干粉、所述贝酵母菌的冻干粉及所述粪链球菌的冻干粉，将四种冻干粉按照1:1:1:1的重量比混合均匀，即得。

实施例3微生物复合菌剂的制备

本实施例的微生物复合菌剂，包括实施例1中所述的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。其制备方法如下：

所述的微生物复合菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(3)向步骤(2)中得到的菌泥中分别加入所述保护剂，所述保护剂与所述菌泥的重量比为3:1，混合均匀，将其置于-40℃的温度下预冻3h，然后置于-15℃的温度下升华15h，再置于25℃的温度下升华2h，在真空下放置2h 后，使所述菌泥的含水量小于5％，得到所述短乳杆菌的冻干粉、所述长双歧杆菌的冻干粉、所述贝酵母菌的冻干粉及所述粪链球菌的冻干粉，将四种冻干粉混合均匀，即得。其中，所述保护剂为蔗糖、脱脂奶粉和明胶按照5:3:1 的重量比混合而成。

实施例4长双歧杆菌冻干粉的制备

分别向所述短乳杆菌、所述长双歧杆菌、所述贝酵母菌及所述粪链球菌中加入保护剂，混合均匀，将其置于-30～-50℃的温度下预冻1-3h，然后置于-10～-20℃的温度下升华10-20h，再置于-10～-25℃的温度下升华10-20h，再在20-30℃的温度下二次升华1-5h，在真空下放置1-5h后，即得所述短乳杆菌的冻干粉、所述长双歧杆菌的冻干粉、所述贝酵母菌的冻干粉及所述粪链球菌的冻干粉，将四种冻干粉混合均匀，即得。

本实施例中，所述保护剂为脱脂奶粉，作为本实施例可替换的实现方式，所述保护剂还可替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。

效果试验例

实验一、所述微生物复合菌剂的制备保存期试验

取保藏编号为CGMCC NO.16125的所述短乳杆菌的、保藏编号为 CGMCC NO.16126的所述长双歧杆菌、保藏编号为CGMCC NO.16127的所述贝酵母菌、保藏编号为CGMCCNO.16128的所述粪链球菌，将基础种子冻干粉于-80℃条件下保存，保存期为2年，每两年检测一次。

其中，活菌计数的方法具体如下：

无菌称取3g所述长双歧杆菌制剂，加入27mL液体培养基或生理盐水，充分摇匀(用数个玻璃球摇打)后作10倍系列稀释，选择适宜稀释度进行接种。采用LBS选择性培养基，细菌的每个稀释度按0.2mL接种3个平板，并迅速转动平板，使菌液在培养基表面流匀。培养48小时后，观察每个平板上的细菌生长情况，并计数。当每个平皿上的菌落数小于10或大于300 时，应重新调整最后稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数：

检测结果如下:

菌株在-80℃保存不同时间的活菌数

菌株在4℃保存不同时间的活菌数

菌株在25℃保存不同时间的活菌数

实验二、微生物复合菌剂的两种菌株的活菌数对比实验

取实施例2中制备得到的所述的短乳杆菌冻干粉，记为CGMCC No.16125 组；取中国专利文献CN102660477A中保藏编号为CGMCC No.5760的短乳杆菌，按照该文献中的方法制备得到冻干粉，记为CGMCC No.5760组；按照实验一的方法检测两组的菌粉在常温下保存不同时间的活菌数。

其实验结果如下：

取实施例2中制备得到的所述的长双歧杆菌冻干粉，记为CGMCC No.

16126组；取中国专利文献CN104120093A中保藏编号为CGMCC No.6283的长双歧杆菌，按照实施例2中的方法制备得到冻干粉，记为CGMCC No.6283组；按照实验一的方法检测两组的菌粉在常温下保存不同时间的活菌数。

其实验结果如下：

实验三、菌株的耐酸耐胆盐特性实验

为了模拟动物体内的胃肠道环境，配制人工胃液和人工肠液，进行体外的耐酸耐胆性能的研究。此外作用时间也是进行此类试验时应考虑的重要问题之一。由于胆盐的存在改变了菌体外膜的通透性，所以对益生菌产生抑制、杀灭作用，进而影响益生菌的存活。

(一)短乳杆菌

耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，以人工胃液为基础，然后按10％接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定活菌数。

耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，以人工肠液为基础，加入0.3％的3号胆盐，然后按照10％的接种量接入活化两代的双歧杆菌液体培养物，37℃静置培养，分别于0、1、2、4h取样测定活菌数，并计算存活率。

耐胃酸的检测结果如下：

耐胆酸盐的检测结果如下：

(二)长双歧杆菌

耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16126的所述长双歧杆菌，置于人工胃液中，37℃静置培养2h，取样测定活菌数，并计算存活率。

耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16126的所述长双歧杆菌，以人工肠液为基础，向其中加入0.3％的胆盐，然后所述长双歧杆菌置于其中，在 37℃静置培养2h，取样测定活菌数，并计算存活率。

耐胃酸的检测结果为存活率66.0％；耐胆酸盐的检测结果为存活率51.1％。

(三)粪链球菌

耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16128的所述粪链球菌，置于人工胃液中，37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。

其实验结果如下：

时间	0h	1h	2h	4h
					活菌率(％)	100	90.0	87.7	73.8

耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16128的所述粪链球菌，以人工肠液为基础，向其中加入0.3％的胆盐，然后所述粪链球菌置于其中，在37℃ 静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。其实验结果如下：

时间	0h	1h	2h	4h
					活菌率(％)	100	83.6	73.6	65.4

本实验中还采用上述方法对市售的三种粪链球菌进行实验，市售的三种粪链球菌在模拟胃酸、胆酸盐的环境中培养4h后，活菌率均低于43％。由此可见，本发明的保藏编号为CGMCC No.16128的所述粪链球菌的耐酸和耐胆盐性能优良。

(四)贝酵母菌

耐胃酸试验：取保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，按10％接种量接入人工胃液中，37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。其实验结果如下：

时间	0h	1h	2h	4h
					活菌率(％)	100	100	93	76.7

耐胆酸盐试验：取保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌，以人工肠液为基础，再向其中加入0.3％的胆盐，然后所述贝酵母菌按照10％的接种量接入其中，在37℃静置培养0h、1h、2h、4h，取样测定活菌数，并计算存活率。其实验结果如下：

时间	0h	1h	2h	4h
					活菌率(％)	100	81.4	72.5	57.5

本实验中还采用上述方法对市售的三种贝酵母菌进行实验，市售的三种贝酵母菌在模拟胃酸、胆酸盐的环境中培养4h后，活菌率均低于51％。由此可见，本发明的保藏编号为CGMCC No.16127的所述贝酵母菌的耐酸和耐胆盐性能优良。

实验四、抑制病原菌能力实验

(一)短乳杆菌：取本发明的保藏编号为CGMCC No.16125的所述短乳杆菌，以及中国专利文献CN102660477A中保藏编号为CGMCC No.5760的短乳杆菌，分别检测其对强毒大肠杆菌EC82—86、强毒沙门氏菌C79—14、腐生葡萄球菌SS9084(由中国药检所提供)的抑菌半径，并记录。其检测结果如下：

(二)长双歧杆菌：取本发明的保藏编号为CGMCC No.16126的所述长双歧杆菌、中国专利文献CN104120093A中保藏编号为CGMCC No.6283的长双歧杆菌，再取由中国药品监察所提供致病菌：致病性强毒大肠杆菌44365、致病性强毒沙门氏菌C-79-14、致病性强毒沙门氏菌C-79-20。分别检测各菌株对各致病菌的抑菌半径，并记录。其检测结果如下：

(三)粪链球菌：取本发明的保藏编号为CGMCC No.16128的所述粪链球菌、市售的粪链球菌，再取由中国药品监察所提供致病菌：致病性强毒大肠杆菌44365、致病性强毒沙门氏菌C-79-14、致病性强毒沙门氏菌C-79-20。分别检测各菌株对各致病菌的抑菌半径，并记录。其检测结果如下：

(四)实施例2中的微生物复合菌剂：按照上述方法检测，对各致病菌的抑菌半径，并记录。其检测结果如下：大肠杆菌38mm、沙门氏菌32mm、葡萄球菌37mm。由此可见，本发明所述的微生物复合菌剂的四种菌株之间无相互拮抗作用，可以互利共生。

实验五、保护剂对冻干粉工艺的影响实验

本实验以存活率为指标，考察对保护剂的冻干保护作用。按照实施例2 中的方式制备所述微生物复合菌剂，区别仅在于：将保护剂分别替换为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶、甘露醇，制备得到长双歧杆菌，分别测试得到的微生物复合菌剂在常温下保存30天后的存活率。

由此可见，单一的成分作为保护剂的效果并不理想，且保护剂对所述双歧杆菌的保护效果差异较大。为了验证该工艺的稳定性，对实施例2中的方案进行三次实验验证，活菌率结果误差率＜4％，证实结果稳定可靠。

按照实施例2中的方式制备微生物复合菌剂，区别仅在于：将保护剂分别替换为将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:1:1的重量比混合，并将其记为第一组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:3:2的重量比混合，并将其记为第二组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照1:5:3的重量比混合，并将其记为第三组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:1:2的重量比混合，并将其记为第四组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:3:3的重量比混合，并将其记为第五组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照2:5:1的重量比混合，并将其记为第六组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照3:1:3 的重量比混合，并将其记为第七组；将脱脂奶粉、蔗糖、明胶三种成分按照 3:3:2的重量比混合，并将其记为第八组；将实施例2制备得到的微生物复合菌剂，记为第九组。分别测试上述各组得到的长双歧杆菌冻干粉在常温下保存30天后的存活率。

其检测结果如下：

组别	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										活菌率(％)	53.8	65.9	71.6	64.4	83.0	84.4	64.1	74.7	91.7

实验六、所述微生物复合菌剂对小白鼠安全性试验

取20-22g的小白鼠，清洁级试验用小白鼠40只，分4组，每组10只，其中1-3组均给于实施例2中制备得到的所述的微生物复合菌剂的活菌制剂，剂量不低于1.0×10⁷CFU，给药周期为3天，给药结束后，观察所有小白鼠的临床症状，对试验结果进行评价。

观察喂药后小白鼠的精神、采食、饮水、生长、增重等临床情况，以及观察试验期间动物是否有与药物相关的不良反应，如呼吸、行为异常、精神抑制及排粪异常等变化情况。并于给药前当天(第1天)以及实验结束的第 13天记录每组小白鼠的重量，计算小白鼠的日均增重。

其实验结果如下：

各组在试验期间小白鼠全部健活，精神良好，食欲旺盛，皮毛肤色正常，排便排尿色泽形态正常，无其他异常临床症状、无生病及死亡显现。

分别于给药前当天(第1天)、实验结束后第13天对每组小白鼠进行称重，并计算各组平均日增重。结果见下表：

从表中发现3个实验组的小白鼠日均增重明显高于空白对照的第4组，表明本发明所述的微生物复合菌剂对小白鼠有明显增重作用，且给药安全性检验合格。

实验七、所述微生物复合菌剂对犬肠道菌群失调腹泻模型的改善效果实验

本试验采用头孢氨苄作为诱导药物，通过持续给药导致比格犬肠道菌群紊乱，构建试验犬抗生素相关性腹泻，具体包括如下步骤：取3.5～4月龄，体重5.0～6.5kg的普通级试验用比格犬25只，其中5只，作为对照组，另外 20只以梯度增加诱导药物剂量的方式，连续给予抗生素诱导，构建试验犬肠道菌群失调腹泻模型，抗生素诱导15～20天，构模成功。将经抗生素诱导的 20只比格犬分为高剂量组、中剂量组、低剂量组、模型组，对高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予高、中、低剂量的本发明所述的长双歧杆菌的活菌制剂，模型组不给药，给药周期为6～8天，给药结束后，观察所有犬只的临床症状。

其实验结果如下：

比格犬体重是一个直观、易考察的指标，且与多种因素密切相关。对治疗前后比格犬的体重进行分析。造模后对不同组的比格犬体重进行两两比较，组间试验犬的平均体重P＞0.05，说明使用抗生素造模对比格犬体重变化影响不大。连续给予所述微生物复合菌剂7天后，将模型组、低、中、高剂量组两两比较P＞0.05，说明不同剂量的菌剂对试验犬的体重影响不显著。

造模前，各组比格犬活泼好动，被毛平整光滑、粪便干燥成形，较为正常。造模结束时，对照组比格犬饮食正常，行动活跃，排便次数规律，粪便干燥成形。经抗生素诱导的试验犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，属于抗生素过量致肠道菌群失调所导致的典型症状。

制剂对试验犬粪便状态的影响检测结果如下表：

其中，粪便状态：--成形便；+成形但水分稍多；++粘稠的溏稀便；+++水样便。

连续给活菌制剂5天后，通过犬只临床症状、粪便情况及菌群检测结果，统计不同剂量组对幼犬肠道菌群失调症的疗效。其检测结果如下：

组别	动物数	治愈	显效	有效	无效	有效率
							低剂量组	5	2	1	4	1	80％
中剂量组	5	4	1	5	0	100％
							高剂量组	5	4	1	5	0	100％

微生物复合菌剂以2.0g/只/次，每天2次，连续喂服5天，可以缓解幼犬因肠道菌群失调症所致腹泻症状，促进犬只恢复菌群平衡。由此可见，本发明所述的微生物复合菌剂的四种菌株之间无相互拮抗作用，可以互利共生。且所述长双歧杆菌、所述乳酸杆菌、所述粪链球菌对病原菌均有强大的拮抗作用，进而使四种菌株形成的所述微生物复合菌剂具有良好的调理胃肠道健康、提高免疫力的功能。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 谭瑛

<120> 一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1469

<212> DNA

<213> 短乳杆菌

<400> 1

ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgagttctcg ttgatgatcg 60

gtgcttgcac cgagattcaa catggaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgccctta agtgggggat aacatttgga aacagatgct aataccgcat agatccaaga 180

accgcatggt tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg 240

tattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg atacgtagcc gaactgagag 300

gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt 420

cgggtcgtaa aactctgatg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgccggcgtg 480

acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540

tggcaagcgt tatccagatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 600

atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag 660

aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 720

gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 780

acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt 840

ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca 900

aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc acgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcactt gagagatcag 1020

gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1080

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt 1140

gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1200

tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga 1260

gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact 1320

cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt 1380

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg 1440

gcgtaaccct tttagggagc gagccgtct 1469

<210> 2

<211> 1448

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌

<400> 2

caggatgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgggatcc ctggcagctt 60

gctgtcgggg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accaacctgc cctgtgcacc 120

ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatac cggatgctcc gctccatcgc atggtggggt 180

gggaaatgct tttgcggcat gggatggggt cgcgtcctat cagcttgttg gcggggtgat 240

ggcccaccaa ggcgttgacg ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac attgggactg 300

agatacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360

cctgatgcag cgacgccgcg tgcgggatgg aggccttcgg gttgtaaacc gcttttgttc 420

aagggcaagg cacggtttcg gccgtgttga gtggattgtt cgaataagca ccggctaact 480

acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt atccggattt attgggcgta 540

aagggctcgt aggcggttcg tcgcgtccgg tgtgaaagtc catcgcctaa cggtggatct 600

gcgccgggta cgggcgggct ggagtgcggt aggggagact ggaattcccg gtgtaacggt 660

ggaatgtgta gatatcggga agaacaccaa tggcgaaggc aggtctctgg gccgtcactg 720

acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780

taaacggtgg atgctggatg tggggccctt tccacgggtc ccgtgtcgga gccaacgcgt 840

taagcatccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaagaaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggc 960

ttgacatgtg ccggatcgcc gtggagacac ggtttccctt cggggccggt tcacaggtgg 1020

tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080

ccctcgccgc atgttgccag cgggtgatgc cgggaactca tgtgggaccg ccggggtcaa 1140

ctcggaggaa ggtggggatg acgtcagatc atcatgcccc ttacgtccag ggcttcacgc 1200

atgctacaat ggccggtaca acgcggtgcg acacggtgac gtggggcgga tcgctgaaaa 1260

ccggtctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaaggcggag tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcaacgccgc ggtgaatgcg ttcccgggcc ttgtacacgc cgcccgtcaa 1380

gtcatgaaag tgggtagcac ccgaagccgg tggcccgacc cttgtggggg gagccgtcta 1440

aggtgaga 1448

<210> 3

<211> 571

<212> DNA

<213> 贝酵母菌

<400> 3

atgcttagta cggcgagtga gcggcaaaag ctcaaatttg aaatctggta ccttcggtgc 60

ccgagttgta atttggagag ggcaactttg gggccgttcc ttgtctatgt tccttggaac 120

aggacgtcat agagggtgag aatcccgtgt ggcgaggagt gcggttcttt gtaaagtgcc 180

ttcgaagagt cgagttgttt gggaatgcag ctctaagtgg gtggtaaatt ccatctaaag 240

ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtacagtg atggaaagat gaaaagaact 300

ttgaaaagag agtgaaaaag tacgtgaaat tgttgaaagg gaagggcatt tgatcagaca 360

tggtgttttg tgccctctgc tccttgtggg taggggaatc tcgcatttca ctgggccagc 420

atcagttttg gtggcaggat aaatccatag gaatgtagct tgcctcggta agtattatag 480

cctgtgggaa tactgccagc tgggactgag gactgcgacg taagtcaagg atgctggcat 540

aatggttata tgccgcccgt cttgaaacac g 571

<210> 4

<211> 1412

<212> DNA

<213> 粪链球菌

<400> 4

gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gtagaacgct gaagagagga gcttgctctt 60

cttggatgag ttgcgaacgg gtgagtaacg cgtaggtaac ctgccttgta gcgggggata 120

actattggaa acgatagcta ataccgcata acaatggatg acacatgtca tttatttgaa 180

aggggcaatt gctccactac aagatggacc tgcgttgtat tagctagtag gtgaggtaat 240

ggctcaccta ggcgacgata catagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttcggcaa tgggggcaac 360

cctgaccgag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtaa 420

gtcaagaacg ggtgtgagag tggaaagttc acactgtgac ggtagcttac cagaaaggga 480

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtc ccgagcgttg tccggattta 540

ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtttga taagtctgaa gttaaaggct gtggctcaac 600

catagttcgc tttggaaact gtcaaacttg agtgcagaag gggagagtgg aattccatgt 660

gtagcggtga aatgcgtaga tatatggagg aacaccggtg gcgaaagcgg ctctctggtc 720

tgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgagt gctaggtgtt ggatcctttc cgggattcag tgccgcagct 840

aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 900

cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960

ccaggtcttg acatcccgat gctatttcta gagatagaaa gttacttcgg tacatcggtg 1020

acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080

gagcgcaacc cctattgtta gttgccatca ttcagttggg cactctagcg agactgccgg 1140

taataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggtt ggtacaacga gttgcgagtc ggtgacggcg agctaatctc 1260

ttaaagccaa tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc 1320

tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gt 1412

Claims

1.一种微生物复合菌剂，其特征在于，包括短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌。

2.根据权利要求1所述的微生物复合菌剂，其特征在于，所述短乳杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16125；所述长双歧杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16126；所述贝酵母菌的保藏编号为CGMCC NO.16127；所述粪链球菌的保藏编号为CGMCC NO.16128。

3.根据权利要求2所述的微生物复合菌剂，其特征在于，所述短乳杆菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构；所述长双歧杆菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.2所示的序列结构；所述贝酵母菌的26S rDNA序列具有如SEQ ID NO.3所示的序列结构；所述粪链球菌的16SrDNA序列具有如SEQ ID NO.4所示的序列结构。

4.权利要求1-3中任意一项所述的微生物复合菌剂在制备调理胃肠道健康和/或提高免疫力的保健品、乳制品、药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的微生物复合菌剂在制备治疗和/或预防腹泻的保健品、药物中的应用。

6.一种微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取权利要求1-3中任意一项所述的短乳杆菌、长双歧杆菌、贝酵母菌及粪链球菌分别制为冻干粉，再混合均匀即得。

7.根据权利要求6所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂奶粉、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇、谷氨酸钠、L-半胱氨酸、明胶中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(2)取步骤(1)中发酵得到的四种发酵液，分别将其置于转速为8000-12000r/min下，离心10-30min，收集菌泥，得到四种菌泥；

10.根据权利要求9所述的微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述短乳杆菌、所述长双歧杆菌、所述贝酵母菌及所述粪链球菌，均经过三级发酵得到发酵液。