ES2949659T3

ES2949659T3 - Composiciones bacterianas sinérgicas y procedimientos de producción y utilización de las mismas

Info

Publication number: ES2949659T3
Application number: ES19194787T
Authority: ES
Inventors: Maltzahn Geoffrey Von; Matthew R Henn; Anthony Mario D'onofrio; Kevin Daniel Litcofsky; David A Berry; David Cook; Noubar Afeyan; John Aunins
Original assignee: Seres Therapeutics Inc
Current assignee: Seres Therapeutics Inc
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2023-10-02
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: EP2953472A4; AU2020201598A1; EP2953472A1; JP2015537042A; KR20150108357A; WO2014082050A1; JP2022028787A; KR102617655B1; AU2013347805A1; AU2013347805B2; KR20220108205A; NZ709392A; JP2024129008A; US12083151B2; PT3628161T; PL3628161T3; CA3212772A1; BR112015011933A2; JP6506173B2; EP4233545A3

Abstract

Se proporcionan composiciones terapéuticas que contienen poblaciones ecobiotic™ para la prevención, el tratamiento y la reducción de los síntomas asociados con una disbiosis de un sujeto mamífero tal como un ser humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones bacterianas sinérgicas y procedimientos de producción y utilización de las mismas

INTRODUCCIÓN

[0001] Los mamíferos están colonizados por microbios en el tracto gastrointestinal (GI), en la piel y en otros nichos epiteliales y tisulares tales como cavidad oral, superficie ocular y vagina. El tracto gastrointestinal alberga una comunidad microbiana abundante y diversa. Es un sistema complejo que proporciona un ambiente o un nicho para una comunidad de muchos especies u organismos diferentes, que incluye diferentes cepas de bacterias. Cientos de especies diferentes pueden formar una comunidad comensal en el tracto GI de una persona sana, y este complemento de organismos involucra desde el tiempo de nacimiento hasta el final la formación de una población microbiana madura de manera funcional un período de aproximadamente 3 años de edad. Las interacciones entre cepas microbianas en estas poblaciones y entre microbios y el huésped, por ejemplo, el sistema inmune de huésped, forman la estructura de comunidad con la disponibilidad de y la competencia por los recursos que afectan a la distribución de microbios. Tales recursos pueden ser alimento, localización y la disponibilidad de espacio para crecer o una estructura física a la que puede adherirse el microbio. Por ejemplo, la dieta del huésped implica la formación de la flora del tracto GI.

[0002] Una microbiota sana proporciona el huésped con múltiples beneficios, que incluyen resistencia de colonización frente a un espectro amplio de patógenos, biosíntesis y absorción de nutrientes esenciales y estimulación inmune que mantiene un epitelio intestinal sano y una inmunidad sistémica controlada de manera adecuada. En el contexto de «disbiosis» o simbiosis alterada, las funciones de microbiota pueden perderse o degenerar, provocando una sensibilidad aumentada a patógenos, perfiles metabólicos alterados o inducción de señales proinflamatorias que pueden provocar inflamación local o sistémica o autoinmunidad. Por consiguiente, la microbiota intestinal juega un papel importante en la patogénesis de muchos enfermedades y trastornos, que incluyen una variedad de infecciones patogénicas del intestino. Por ejemplo, los pacientes se vuelven más propensos a infecciones patogénicas cuando la microbiota intestinal normal ha sido alterada debido al uso de antibióticos de espectro amplio. Muchos de estos enfermedades y trastornos son condiciones crónicas que disminuyen de manera importante la calidad de vida de un paciente y a la larga pueden ser fatales.

[0003] El trasplante de microbiota fecal ha demostrado ser eficaz en pacientes que padecen infecciones GI graves o resistentes repoblando el intestino con una variedad de microbios diferentes que controlan patógenos claves creando un ambiente ecológico hostil para su proliferación y supervivencia. Tales enfoques han demostrado potencial importante para disminuir la sensibilidad del huésped a la infección. Sin embargo, el trasplante de microbiota fecal se considera ser un procedimiento de último recurso, debido a que tiene el potencial de transmitir agentes infecciosos o alergénicos entre huéspedes, implica la transmisión de cientos de cepas desconocidas potencialmente del donante al paciente y es difícil de realizar a gran escala. Adicionalmente, el trasplante de microbiota fecal no está sometido a estándares de manera apropiada y se puede transmitir distinto material deseado y/o no deseado en una donación determinada. El trasplante de microbiota fecal no está aprobado por la FDA y es improbable que obtenga autorización debido a que el producto no se puede someter a estándares y categorizar de acuerdo con requisitos reglamentarios de identidad, eficacia, pureza y seguridad. Por consiguiente, existe una necesidad de composiciones definidas que se pueden utilizar para disminuir la predisposición a infección y/o que facilitan la recuperación de una microbiota de intestino sano.

[0004] Por consiguiente, los médicos precisan un tratamiento más seguro y reproducible de trastornos tratados actualmente con carácter experimental (no aprobados por la FDA) que utilizan el trasplante de microbiota fecal. Para preparar un terapéutico con potencial comercial, se han diseñado composiciones bacterianas de cepas bacterianas aisladas con una pluralidad de propiedades ventajosas basándose en el entendimiento de aquellas cepas bacterianas y el análisis de las propiedades que potenciarían la utilidad y la comercialización de una composición bacteriana.

[0005] Por lo tanto, en respuesta a la necesidad de composiciones resistentes, eficientes y eficaces y procedimientos de tratamiento de enfermedades GI, en particular, infecciones patogénicas serias, a través de la recuperación o mejoría de funciones de microbiota, se abordan estas y otras carencias de la técnica anterior proporcionando composiciones y procedimientos de tratamiento de pacientes.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0006] En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende como mínimo una primera especie de bacteria aislada capaz de formar una espora y una segunda especie de bacteria aislada capaz de formar una espora, en la que:

(i) la primera especie comprende un Clostridium innocuum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 534, y la segunda especie comprende un (a) Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 548, (b) Clostridium bolteae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 501, (c) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 379, (d) Clostridium butyricum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 502, (e) Clostridium hylemonae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 532, (f) Clostridium mayombei que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 544, (g) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 591, (h) Coprococcus comes que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 613, (i) Eubacterium rectale que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 786, (j) Faecalibacterium prausnitzii que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 810, (k) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 979, (I) Ruminococcus bromii que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1534, o (m) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1538;

(ii) la primera especie comprende un Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 548, y la segunda especie comprende un (a) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 379, (b) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 591, (c) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 979, o (d) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO:

1538; o

(iii) la primera especie comprende un Clostridium bolteae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 501, y la segunda especie comprende un (a) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 379, (b) Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 548, (c) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 591, (d) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 979, o (e) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es como mínimo un 95 % idéntica a la SEQ ID No : 1538; y

en la que la primera especie y la segunda especie son capaces de disminuir y/o inhibir el crecimiento y/o la colonización de Clostridium difficile.

[0007] En otros aspectos, la presente invención proporciona una unidad de dosis única que comprende la composición de la invención, un producto comestible que comprende lo mismo, así como conjuntos incluidos en uno o más recipientes de lo mismo. Se proporciona adicionalmente una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición de la invención, y que comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un agente antiparasitario, un agente antifúngico, un agente antivírico y/o un agente antiparasitario. Se proporciona también una composición de la invención para ser utilizada en un procedimiento de poblado de manera funcional del tracto gastrointestinal de un sujeto humano, así como una composición de la invención para ser utilizada en un procedimiento de la inhibición de crecimiento de Clostridium difficile en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano.

[0008] La presente invención y algunas realizaciones de la misma se establecen en las reivindicaciones adjuntas.

[0009] Por consiguiente, la invención proporciona una composición bacteriana que comprende como mínimo un primer tipo de bacteria aislada que es capaz de formar una espora y un segundo tipo de bacteria aislada que es capaz de formar una espora, en donde el primer tipo y el segundo tipo no son idénticos, y en donde como mínimo uno del primer tipo y el segundo tipo son capaces de disminuir y/o inhibir el crecimiento y/o la colonización de como mínimo un tipo de bacteria patógena, denominada Clostridium difficile. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas que son capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 5 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 2 tipos de bacterias aisladas que son capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende: i) como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas, ii) como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas desconocidas de ser capaces de formar esporas, o iii) cualquier combinación de e ii). En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones aproximadamente iguales. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones sustancialmente no iguales. En una realización, el primer tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del segundo tipo, o en donde el segundo tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del primer tipo. En una realización, la composición consiste esencialmente en: i) entre dos y aproximadamente veinte tipos de bacterias aisladas, en donde como mínimo dos tipos de bacterias aisladas son capaces de formar esporas de manera independiente; ii) entre dos y aproximadamente veinte tipos de bacterias aisladas, en donde se desconocen como mínimo dos tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas, o Ni) cualquier combinación de i) e ii). En una realización, una combinación del primer tipo y del segundo tipo es: i) citotóxico, ii) citostático, iii) capaz de disminuir el crecimiento de bacteria patógena, iv) capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria patógena, v) capaz de disminuir la colonización de la bacteria patógena, vi) capaz de inhibir la colonización de la bacteria patógena o vii) cualquier combinación de i)-vi). En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo igual a la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente doble de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente diez veces de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica para inhibir las bacterias patógenas.

[0010] En otro aspecto, se dan a conocer unidades de dosis únicas que comprenden las composiciones de la presente invención. En una realización, la unidad de dosis comprende como mínimo 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 o superior a 1x1011 de unidades formadoras de colonias (UFC) o de esporas o células bacterianas vegetativas. En una realización, la unidad de dosis comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un recubrimiento entérico o una combinación de los mismos. En una realización, la unidad de dosis comprende adicionalmente un fármaco seleccionado entre corticoesteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistamínicos, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolina sódica, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para rinitis, descongestivos anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos anti-IgE monoclonales, vacunas y combinaciones de los mismos. En una realización, la unidad de dosis se formula para la administración oral, administración rectal o una combinación de administración oral y rectal o se formula para la administración tópica, nasal o por inhalación.

[0011] En otro aspecto, se dan a conocer conjuntos que comprenden uno o más recipientes de la composición de la invención. En las realizaciones, los conjuntos comprenden uno o más recipientes: una primera población purificada del primer tipo de esporas bacterianas sustancialmente libres de células bacterianas vegetales; y una segunda población purificada del segundo tipo de esporas bacterianas sustancialmente libres de células bacterianas vegetales viables, en donde el primer tipo y el segundo tipo de esporas bacterianos no son idénticos, y en donde el primer tipo y el segundo tipo de esporas bacterianas, cuando se ubican conjuntamente en una región diana de un tracto gastrointestinal de un sujeto humano que lo necesita, son capaces de poblar de manera funcional el tracto gastrointestinal. En una realización, la primera población purificada y la segunda población purificada están presentes en un recipiente único. En una realización, la primera población purificada y la segunda población purificada están presentes en dos recipientes. En una realización, la primera población purificada y la segunda población purificada se liofilizan o deshidratan sustancialmente. En una realización, el conjunto comprende adicionalmente en uno o más recipientes una cantidad eficaz de un agente antibacteriano, una cantidad eficaz de un agente antiviral, una cantidad eficaz de un agente antifúngico, una cantidad eficaz de un agente antiparasitario o una combinación de los mismos en uno o más recipientes. En una realización, el conjunto comprende adicionalmente un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

[0012] Se proporcionan también formulaciones farmacéuticas que comprende una cantidad eficaz de las composiciones de la invención, y que comprenden adicionalmente una cantidad eficaz de un agente antibacteriano, una cantidad eficaz de un agente antifúngico, una cantidad eficaz de un agente antivírico, una cantidad eficaz de un agente antiparasitario.

[0013] Se proporcionan también productos comestibles que comprenden una composición de la invención. En las realizaciones, los productos comestibles comprenden una primera población purificada del primer tipo de esporas bacterianas y una segunda población purificada del segundo tipo de esporas bacterianas, en donde el primer tipo y el segundo tipo de esporas bacterianos no son idénticos, en donde el producto comestible está sustancialmente libre de células bacterianas vegetales viables, y en donde el primer tipo y el segundo tipo de esporas bacterianas, cuando se administran a un sujeto humano que lo necesita, son capaces de poblar de manera funcional el tracto gastrointestinal del sujeto humano. En una realización, el producto comestible comprende un alimento o aditivo alimentario, una bebida o aditivo de bebida o un alimento médico. En una realización, el producto comestible comprende como mínimo 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 o superior a 1x1011 de unidades formadoras de colonias (UFC) o de esporas viables.

[0014] Una composición de la invención puede administrarse a un sujeto humano que lo necesita en donde como mínimo uno del primer tipo y del segundo tipo de bacterias aisladas ejercen un efecto inhibidor sobre bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano, de tal modo que el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal no aumenta de manera detectable o no disminuye de manera detectable durante un periodo de tiempo. En una realización, el sujeto humano se diagnostica como el que padece una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, la composición bacteriana se administra de manera simultánea con i) un antibiótico, ii) un probiótico o iii) una combinación de i) e ii). En una realización, la composición bacteriana se administra antes de la administración de i) un antibiótico, ii) un probiótico o Ni) una combinación de i) e ii). En una realización, la composición bacteriana se administra de posteriormente a la administración de i) un antibiótico, ii) un probiótico o iii) una combinación de i) e ii). En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en o expulsadas del tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce de manera detectable en un periodo de un mes, en un periodo de dos semanas o en un periodo de una semana de administración de la composición bacteriana. En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en o expulsadas del tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce de manera detectable en un periodo de tres días, dos días o un día de administración de la composición bacteriana. En una realización, el sujeto humano está libre de manera detectable de las bacterias patógenas en un periodo de un mes, dos semanas, una semana, tres días o un día de administración de la composición bacteriana. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas que son capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 5 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 2 tipos de las bacterias aisladas son capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende: i) como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas, ii) como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas desconocidas de ser capaces de formar esporas, o iii) cualquier combinación de i) e ii). En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 5 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 1 tipo de las bacterias aisladas es capaz de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas, en donde i) como mínimo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas son capaces de formar esporas, ii) como mínimo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas no son capaces de formar esporas o iii) cualquier combinación de i) e ii). En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones aproximadamente iguales. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones sustancialmente no iguales. En una realización, el primer tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del segundo tipo, o en donde el segundo tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del primer tipo. En una realización, la composición consiste esencialmente en entre dos y aproximadamente diez tipos de bacterias aisladas, en donde como mínimo dos tipos de bacterias aisladas son capaces de formar esporas de manera independiente. En una realización, la composición consiste esencialmente en entre dos y aproximadamente diez tipos de bacterias aisladas, en donde como mínimo dos tipos de bacterias aisladas no son capaces de formar esporas. En una realización, una combinación del primer tipo y el segundo tipo es citotóxica o citostática en relación con las bacterias patógenas. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo igual a la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente doble de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente diez veces de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica para ser citotóxicos en relación con las bacterias patógenas. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica para ser citostáticos en relación con las bacterias patógenas.

[0015] Se da a conocer también una composición para su uso en un procedimiento de poblado de manera funcional del tracto gastrointestinal de un sujeto humano, el procedimiento comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición bacteriana de la invención bajo las condiciones de tal modo que el primer tipo y el segundo tipo de bacterias poblan de manera funcional el tracto gastrointestinal del sujeto humano. En una realización, la composición bacteriana se administra por la vía oral, se administra por la vía rectal o se administra mediante una combinación de la vía oral y rectal. En una realización, la composición bacteriana se administra por la vía tópica o nasal o mediante inhalación. En una realización, la composición bacteriana consiste esencialmente en esporas, en donde las esporas comprenden esporas del primer tipo de bacterias aisladas y esporas del segundo tipo de bacterias aisladas. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la prevención de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende el tratamiento de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la prevención de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la reducción de uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la prevención de colonización del tracto gastrointestinal por una bacteria patógena. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la reducción de colonización del tracto gastrointestinal y/o crecimiento por una bacteria patógena. En una realización, en donde el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende la reducción del número de uno o más tipos de bacterias patógenas en el tracto gastrointestinal. En una realización, el poblado funcional del tracto gastrointestinal comprende el aumento del número de una o más bacterias no patógenas en el tracto gastrointestinal. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 5, 7 o 9 tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 5 tipos de bacterias aisladas y como mínimo 2 tipos de las bacterias aisladas son capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende como mínimo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas, en donde i) como mínimo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas son capaces de formar esporas, ii) como mínimo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas no son capaces de formar esporas o iii) cualquier combinación de i) e ii). En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones aproximadamente iguales. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo están presentes en la composición a concentraciones sustancialmente no iguales. En una realización, el primer tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del segundo tipo, o en donde el segundo tipo está presente en la composición a una concentración de como mínimo aproximadamente 150 % de la concentración del primer tipo. En una realización, una combinación del primer tipo y el segundo tipo de bacterias es inhibidora de las bacterias patógenas. En una realización, la combinación reduce la velocidad de crecimiento de las bacterias patógenas. En una realización, la combinación es citostática o citotóxica en relación con las bacterias patógenas. En una realización, la combinación es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo igual a la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente doble de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patógenas presentes a una concentración de como mínimo aproximadamente diez veces de la concentración de la combinación del primer tipo y el segundo tipo. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica para reducir o inhibir el crecimiento de las bacterias patógenas. En una realización, el primer tipo y el segundo tipo interactúan de manera sinérgica para reducir o inhibir la colonización de las bacterias patógenas. En una realización, el procedimiento comprende la administración al sujeto humano de una unidad de dosis única que comprende como mínimo 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 o superior a 1x1011 de unidades formadoras de colonias (UFC) o de bacterias viables. En una realización, la unidad de dosificación comprende una población bacteriana de manera sustancial en forma de esporas. En una realización, la unidad de dosificación comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y/ un recubrimiento entérico. En una realización, la dosis unitaria se formula para la administración oral, administración rectal o la combinación de administración oral y rectal. En una realización, la dosis unitaria se formula para la administración tópica o nasal o mediante inhalación.

[0016] Una composición de la invención se puede utilizar también en un procedimiento de reducción del número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano, el procedimiento comprende la administración al sujeto humano de una cantidad eficaz de una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición y comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano, bajo las condiciones de tal modo que se reduzca el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano en un periodo de aproximadamente un mes de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce en un periodo de aproximadamente dos semanas de administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce en un periodo de aproximadamente una semana de administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce en un periodo de aproximadamente tres días de administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patógenas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce en un periodo de aproximadamente un día de administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el agente antimicrobiano comprende agente antibacteriano. En una realización, el agente antimicrobiano comprende agente antifúngico. En una realización, el agente antimicrobiano comprende agente antivírico. En una realización, el agente antimicrobiano comprende agente antiparasitario.

[0017] Se puede preparar un producto comestible de la invención mediante un procedimiento que comprende la combinación de un portador comestible de una primera población purificada que comprende como mínimo el primer tipo de bacterias aisladas y una segunda población purificada que comprende como mínimo el segundo tipo de bacterias aisladas, en donde el producto comestible está sustancialmente libre de materiales no comestibles. En una realización, como mínimo una de la primera población purificada y la segunda población purificada consiste esencialmente en esporas viables. En una realización, la primera población purificada y la segunda población purificada consisten esencialmente en esporas viables. En una realización, el producto comestible está sustancialmente libre de células bacterianas vegetales viables. En una realización, las esporas viables, cuando el producto comestible se consume por un sujeto humano que lo necesita, son capaces de poblar de manera funcional el tracto gastrointestinal del sujeto humano. En una realización, el producto comestible comprende un alimento o un aditivo alimentario. En una realización, el producto comestible comprende una bebida o un aditivo de bebida. En una realización, el producto comestible comprende un alimento medicinal. En una realización, el producto comestible comprende como mínimo 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1x1011 o superior a 1x1011 de u formadoras de colonias (UFC) de esporas viables. En una realización, las esporas son de una bacteria seleccionada de la Tabla 1.

[0018] También se proporciona una composición de la invención para su uso en un procedimiento de reducción de la abundancia de un patógeno en el tracto gastrointestinal de un paciente, el procedimiento comprende la administración de la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz y facilita la competencia de la composición bacteriana con el patógeno en el tracto gastrointestinal de un paciente.

[0019] Las composiciones de la invención se pueden utilizar también para el tratamiento de diarrea, conforme el cual la administración de la composición reduce el efecto de diarrea de un patógeno en el tracto gastrointestinal de un paciente, en donde el patógeno es Clostridium difficile. En una realización, la composición se administra por vía oral.

[0020] También se dan a conocer las composiciones de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de reaparición de una infección por Clostridium dUficile, el procedimiento comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición terapéutica a un sujeto humano que lo necesita bajo las condiciones de tal modo que la primera población de esporas bacterianas purificadas y la segunda población de esporas bacterianas purificadas ejercen un efecto citotóxico o citostático sobre una bacteria patógena presente en el tracto gastrointestinal del sujeto humano, de tal modo que el número de bacterias Clostridium difficile presentes en el tracto gastrointestinal no aumenta de manera detectable o no disminuye de manera detectable durante un periodo de tiempo. En una realización, el número de bacterias Clostridium difficile presentes en o expulsadas del tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce de manera detectable en un periodo de un mes de administración de la composición bacteriana. En una realización, la primera población de esporas bacterianas purificadas y la segunda población de esporas bacterianas purificadas interactúan de manera sinérgica para ser citotóxicas y/o citostáticas en relación con las bacterias Clostridium difficile. En una realización, la composición terapéutica se administra por vía oral. En una realización, la composición terapéutica comprende un alimento medicinal.

[0021] En otro aspecto, se dan a conocer conjuntos que comprenden uno o más recipientes: las composiciones de la invención y en donde el primer tipo y el segundo tipo de bacterias purificadas, cuando se ubican conjuntamente en una región diana de un tracto gastrointestinal de un sujeto humano que lo necesita, son capaces de poblar de manera funcional el tracto gastrointestinal. En una realización, la primera población purificada y la segunda población purificada están presentes en un recipiente único. En una realización, el conjunto se formula para ser utilizado como un suplemento nutricional y, opcionalmente, comprende un material probiótico.

[0022] Los objetivos y ventajas adicionales se establecerán en parte en la descripción que sigue y en parte serán obvios a partir de la descripción o pueden extraerse mediante la práctica de las realizaciones. Los objetivos y las ventajas se realizarán y se obtendrán mediante los elementos y las combinaciones señalados de manera particular en las reivindicaciones adjuntas.

[0023] Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la descripción a continuación solamente sirven de ejemplo y son explicativas y no limitan las reivindicaciones. Se apreciará que la presente divulgación incluya y proporcione el contexto para la invención tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

[0024] Las figuras adjuntas, en conjunto con la descripción, sirven para explicar adicionalmente las realizaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0025] Figura 1A proporciona un esquema de gen de ARNr 16S e indica las coordinadas de las regiones hipervariables 1-9 (V1-V9). Las coordinadas de V1-V9 son 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435-1465 respectivamente, basándose en la numeración que utiliza el sistema de E. coli de terminología definido por Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA) from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978). Figura 1B señala en negrita las secuencias de nucleótidos para cada región hipervariable en la secuencia 16S de E. coli de referencia de ejemplo descrita por Brosius et al.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS

[0026]

Tabla 1 proporciona especies bacterianas y Unidades Taxonómicas Operativas (UTO) de las composiciones bacterianas de la presente divulgación, que incluyen el estado taxonométrico y la habilidad de las UTO para formar una espora viable tal como se da a conocer en el presente documento.

Tabla 2 proporciona combinaciones representativas de las composiciones bacterianas de la presente divulgación. Tabla 3 proporciona secuencias de ARNr 16S de las especies bacterianas y Unidades Taxonómicas Operativas (UTO) de las composiciones bacterianas de la presente divulgación. Tabla 3 se proporciona en versión CRF del Listado de Secuencias tal como SEQ ID NOS 1-1.864.

Tabla 4 proporciona estatus taxonométrico, subrogación filogenética de ejemplo y secuencias de 16S de composiciones bacterianas de la presente divulgación. Tabla 4 se proporciona en versión CRF del Listado de Secuencias tal como SEQ ID NOS 1.865-1.915.

Tabla 5 demuestra la eficacia de combinaciones bacterianas de ejemplo de la presente divulgación durante la inhibición de una bacteria patógena.

Tabla 6 demuestra la eficacia de combinaciones bacterianas de ejemplo de la presente divulgación durante la inhibición de una bacteria patógena.

Tabla 7 proporciona patógenos bacterianos representativos.

Tabla 9 proporciona enfermedades, trastornos y condiciones en humanos representativos en los que son útiles las composiciones bacterianas proporcionadas.

DEFINICIONES

[0027] «Microbiota» se refiere a las comunidades de microbios que viven en o sobre el cuerpo de paciente, tanto de manera sostenible como temporal, que incluyen eucariotas, arqueas, bacterias y virus (que incluyen virus bacterianos (es decir, fago)).

[0028] «Disbiosis» se refiere a un estado de microbiota o microbioma del intestino u otra área corporal, que incluye superficies de la mucosa o cutáneas en las que la diversidad y/o función normal de la red ecológica está alterada. Cualquier alteración desde el estado preferido (es decir, ideal) de la microbiota se puede considerar una disbiosis, incluso cuando la disbiosis no lleva a una disminución detectable de salud. Este estado de disbiosis puede ser nocivo, puede ser nocivo solamente bajo ciertas condiciones o puede impedir a un sujeto a ser más sano. La disbiosis puede deberse a una disminución en la diversidad, el sobrecrecimiento de uno o más patógenos o patobiontes, organismos simbióticos capaces de causar enfermedad solamente cuando están presentes determinadas condiciones genéticas y/o ambientales en un paciente, o el cambio a una red ecológica que ya no genera función beneficiosa al huésped y, por consiguiente, ya no fomenta salud.

[0029] Una «espora» o una población de «esporas» incluye bacterias (u otros organismos de célula única) que normalmente son viables, más resistentes a efectos ambientales, tales como calor y agentes bactericidas que formas vegetativas de la misma bacteria, y, típicamente, son capaces de germinar y desarrollarse. «Formadores de esporas» o bacterias «capaces de formar esporas» son aquellas bacterias que contienen los genes y otras habilidades necesarias para generar esporas bajo las condiciones ambientales adecuadas.

[0030] Los términos «patógeno», «patobionte» y «patogénico» con referencia a una bacteria o cualquier otro organismo o entidad incluye cualquier dicho organismo o entidad que es capaz de causar o afectar a una enfermedad, trastorno o condición de un organismo huésped que contiene el organismo o la entidad.

[0031] El término «aislado» abarca una bacteria u otra entidad o sustancia que ha sido (1) separada de como mínimo algunos de los componentes con los cuales se asociaba cuando se generó inicialmente (o en origen o en un entorno experimental), y/o (2) generada, preparada, purificada y/o fabricada por el hombre. Se puede separar las bacterias aisladas a partir de como mínimo aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, o más de otros componentes a los cuales se asociaba inicialmente. En algunas realizaciones, las bacterias aisladas son puras en más de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o en más de aproximadamente 99 %. Tal como se utiliza en el presente documento, una sustancia es «pura», si está libre de otros componentes de manera sustancial. Los términos «purificar», «que purifica» y «purificado» hacen referencia a una bacteria u otro material que ha sido separado de como mínimo algunos de los componentes a los que se asociaba anteriormente o cuando se produjo o se generó inicialmente (por ejemplo, o en origen o en un entorno experimental) o durante cualquier periodo de tiempo después de su producción inicial. Una bacteria o una población de bacterias se puede considerar purificada si se aísla durante o después de la producción, tal como a partir de un material o ambiente que contiene la bacteria o población de bacterias, y una bacteria o población de bacterias purificada puede contener otros materiales hasta aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o superior a aproximadamente 90 % y todavía considerarse «aislada». En algunas realizaciones, las bacterias y poblaciones de bacterias purificadas son puras en más de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o en más de aproximadamente 99 %. En el caso de composiciones bacterianas proporcionadas en el presente documento, uno o más tipos de bacterias presentes en la composición pueden purificarse de manera independiente a partir de una o más otras bacterias producidas y/o presentes en el material o ambiente que contiene el tipo bacteriano. Las composiciones bacterianas y los componentes bacterianos de las mismas se purifican de manera general a partir de productos de hábitat residuales.

[0032] «Inhibición» de un patógeno abarca la inhibición de cualquier función o actividad deseada de las composiciones bacterianas de la presente divulgación. Las demostraciones de la inhibición de patógenos, tal como la disminución del crecimiento de una bacteria patógena o la reducción del nivel de colonización de una bacteria patógena se dan a conocer en el presente documento y en caso contrario se reconocen por el experto en la técnica. La inhibición de un «crecimiento» de bacteria patógena puede incluir la inhibición del aumento en tamaño de la bacteria patógena y/o la inhibición de la proliferación (o multiplicación) de la bacteria patógena. La inhibición de colonización de una bacteria patógena se puede demostrar mediante la medición de la cantidad o carga de un patógeno antes y después de un tratamiento. Una «inhibición» o el acto de «inhibir» incluye la cesión total y la reducción parcial de una o más actividades de un patógeno, tales como crecimiento, proliferación, colonización y función.

[0033] La «colonización» de un organismo huésped incluye la residencia no transitoria de una bacteria u otro organismo microscópico. Tal como se utiliza en el presente documento, «reducción de colonización» de un tracto gastrointestinal de sujeto huésped (o cualquier otro hueco microbiota) mediante una bacteria patógena incluye una reducción del tiempo de residencia del patógeno en el tracto gastrointestinal, así como una reducción del número (o concentración) del patógeno en el tracto gastrointestinal o adherido a la superficie luminal del tracto gastrointestinal. Se puede demostrar la reducción medida de patógenos adheridos, por ejemplo, mediante una muestra de biopsia, o se puede medir las reducción de manera indirecta, por ejemplo, mediante la medición de carga de patógenos en la deposición de un huésped mamífero.

[0034] Una «combinación» de dos o más bacterias incluye la coexistencia física de las dos bacterias, o en el mismo material o producto o en productos conectados físicamente, así como la administración conjunta temporal o la ubicación conjunta de las dos bacterias.

[0035] Una actividad o bacteria «citotóxica» incluye la habilidad de destruir una célula bacteriana, tal como una célula bacteriana patógena. Una actividad o bacteria «citostática» incluye la habilidad de inhibir, parcialmente o completamente, crecimiento, metabolismo y/o proliferación de una célula bacteriana, tal como una célula bacteriana patógena.

[0036] Ser libre de «productos no comestibles» significa que una composición bacteriana u otro material proporcionado en el presente documento no contiene una cantidad sustancial de un producto no comestible, por ejemplo, un producto o un material que es incomestible, dañino o indeseado de algún otro modo en un producto adecuado para la administración, por ejemplo, administración oral, a un sujeto humano. A menudo los productos no comestibles se encuentran en preparaciones de bacterias de la técnica anterior.

[0037] «Microbioma» hace referencia al contenido genético de las comunidades de microbios que viven en y sobre el cuerpo humano, tanto de manera sustancial como temporal, que incluyen eucariotas, aqueas, bacterias y virus (que incluyen virus bacterianos (es decir, fagos)), en donde el «contenido genético» incluye ADN, ARN genómico tales como, micro ARN y ARN ribosómico, el epigenoma, plásmidos y todos otros tipos de información genética.

[0038] Los «productos de hábitat residuales» hacen referencia al material derivado del hábitat de microbiota en o sobre un humano o animal. Por ejemplo, microbiota vive en heces en el tracto gastrointestinal, sobre la piel, en saliva, mucosidad del tracto respiratorio o secreciones del tracto gastrourinario (es decir, materia biológica asociada a la comunidad microbiana). Libre de manera sustancial de productos de hábitat residuales significa que la composición bacteriana ya no contiene más el material biológico asociado al ambiente microbiano sobre o en el sujeto humano o animal y está libre al 100 %, libre al 99 %, libre al 98 %, libre al 97 %, libre al 96 % o libre al 95 % de cualquier material biológico contaminante asociado a la comunidad microbiana. Los productos de hábitat residuales pueden incluir materiales abióticos (que incluyen alimentos no digeridos) o pueden incluir microorganismos no deseados. Libre de manera sustancial de productos de hábitat residuales puede significar también que la composición bacteriana no contiene ninguna célula detectable de un humano o animal y que solamente las células microbianas son detectables. En una realización, libre de manera sustancial de productos de hábitat residuales puede significar también que la composición bacteriana no contiene ningún contaminante vírico (que incluyen virus bacterianos (es decir, fagos)), fúngico, micoplásmal detectable. En otra realización, esto significa que menos de 1x10^-2%, 1x10-3 %, 1x10^-4%, 1x10-5 %, 1x10-6 %, 1x10-7 %, 1x10-8 de las células viables en la composición bacteriana son humanas o animales, en comparación con las células microbianas. Existen múltiples vías de conseguir este grado de pureza, ninguna de las cuales es limitativa. Por consiguiente, se puede reducir la contaminación aislando los constituyentes deseados a través de etapas múltiples de rayado hasta colonias únicas en un medio sólido hasta la reproducción de (tal como, pero no limitada a dos) rayados a partir de colonias únicas que han demostrado solamente una morfología de colonia única. Alternativamente, se puede lograr la reducción de contaminación mediante múltiples rondas de diluciones en serie hasta células únicas deseadas (por ejemplo, una dilución de 10-8 o 10-9), tal como a través de diluciones en serie múltiples de 10-multiplicaciones. Esto se puede confirmar adicionalmente demostrando que las colonias aisladas múltiples tienen formas de células similares y comportamiento con tinción de Gram. Otros procedimientos de confirmación de pureza adecuada incluyen análisis genético (por ejemplo, PCR, secuenciación de ADN), serología y análisis de antígenos, análisis enzimático y metabólico y procedimiento que utilizan instrumentos, tales como citometría de flujo con reactivos que identifican constituyentes deseados entre contaminantes.

[0039] «Árbol filogenético» hace referencia a una representación gráfica de las relaciones de evolución de una secuencia genética en relación con otra que se genera utilizando un conjunto definido de algoritmos de reconstrucción filogenética (por ejemplo, similitud máxima o bayesiana). Los nodos en el árbol representan secuencias ancestrales distintas y la fiabilidad de cualquier nodo se proporcionan mediante un prueba bootstrap o probabilidad a posteriori bayesiana, que mide la incertidumbre de la rama.

[0040] «Unidad taxonómica operativa (UTO, UTOs en plural)» se refiere a un hoja terminal en un árbol filogenético y se define por una secuencia genética específica y todas las secuencias que comparten la identidad de secuencia con esta secuencia al nivel de especies. Un «tipo» o una pluralidad de «tipos» de bacterias incluye una UTO o una pluralidad de diferentes UTOs y abarca también una cepa, especies, género, familia u orden de bacterias. La secuencia genética específica puede ser la secuencia 16S o una parte de la secuencia 16S o puede ser un gen constitutivo conservado de manera funcional que se encuentra ampliamente en el reino de eubacterias. Las UTOs comparten como mínimo 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. A menudo las UTOs se determinan mediante la comparación de secuencias entre organismos. No se considera que las secuencias con identidad de secuencia inferior al 95 % forman parte de la misma UTO.

[0041] «Clado» se refiere al conjunto de UTOs o miembros de un árbol filogenético en dirección 3' de un nodo válido estadísticamente en un árbol filogenético. El clado comprende un conjunto de hojas terminales en el árbol filogenético que es una unidad evolutiva monofilética distinta.

[0042] En microbiología, «secuenciación 16S» o «ARNr 16S» o «16S-ARNr» o «16S» hace referencia a secuencia derivada mediante la caracterización de los nucleótidos que comprenden el(los) gen(es) de ARN ribosómico 16S. El ADNr 16S bacteriano tiene una longitud de aproximadamente 1500 nucleótidos y se utiliza en la reconstrucción de las relaciones evolutivas y la similitud de secuencia de una cepa bacteriana con relación a otra utilizando enfoques filogenéticos. Secuencias 16S se utilizan para la reconstrucción filogenética debido a que son altamente conservadas de manera general, pero contienen regiones hipervariables específicas que albergan diversidad de nucleótidos suficiente para diferenciar los géneros y las especies de la mayoría de las bacterias, así como hongos.

[0043] Las «regiones V1-V9» del ARNr 16S se refieren a la primera entre las nueve regiones hipervariables del gen de ARNr 16S que se utilizan para caracterización genética de muestras bacterianas. Estas regiones en bacterias se definen por los nucleótidos 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435 1465 respectivamente utilizando la numeración basada en el sistema de denominación de E. coli. Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978). En algunas realizaciones, como mínimo una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 se utiliza para caracterizar una UTO. En una realización, las regiones V1, V2 y V3 se utilizan para caracterizar una UTO. En otra realización, las regiones, V3, V4 y V5 se utilizan para caracterizar una UTO. En otra realización, la región V4 se utiliza para caracterizar una UTO. Un experto en la técnica puede identificar las regiones hipervariables específicas de un ARNr 16S candidato (en la Tabla 3) mediante la comparación de la secuencia candidata en cuestión con la secuencia de referencia y la identificación de las regiones hipervariables basándose en la similitud con las regiones hipervariables de referencia.

[0044] Los términos «sujeto» o «paciente» hacen referencia a cualquier sujeto animal que incluye humanos, animales de laboratorio (por ejemplo, primates, ratas, ratones), ganado (por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, cerdos, pavos, pollos) y animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos, roedores, etc.). El sujeto o el paciente puede ser sano o puede padecer una infección debido a un patógeno gastrointestinal o puede estar en riesgo de desarrollar o transmitir a otros una infección debido a un patógeno gastrointestinal.

[0045] El término «patobionte» hace referencia a especies bacterianas específicas que se encuentran en huéspedes sanos que pueden desencadenar patología y/o enfermedad mediada por el sistema inmune en respuesta a determinados factores genéticos o ambientales. Chow et al., (2011) Curr Op Immunol. Pathobionts of the intestinal microbiota and inflammatory disease. 23: 473-80. Por consiguiente, un patobionte es un patógeno que se distingue de manera mecánica de un organismo infeccioso adquirido. Por consiguiente, el término «patógeno» incluye tanto organismo infecciosos adquiridos como patobiontes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Composiciones Bacterianas

[0046] Se dan a conocer bacterias y combinaciones de bacterias de la microbiota de intestino humano con la capacidad de proporcionar de manera significativa funciones de una microbiota sana o catalizar un aumento de microbiota residente cuando se administra a huéspedes mamíferos. De manera particular, se dan a conocer las combinaciones sinérgicas que tratan, previenen, retrasan o reducen los síntomas de enfermedades, trastornos y condiciones asociados a una disbiosis. Los enfermedades, trastornos y condiciones representativos que potencialmente se asocian a una disbiosis, que es adecuada para el tratamiento con las composiciones y los procedimientos tal como se describen en el presente documento, se proporcionan en las Tablas 8 y 9. Sin que se quede limitado a un mecanismo específico, se considera que tales composiciones inhiben el crecimiento, proliferación y/o colonización de una o una pluralidad de bacterias patógenas en el hueco de microbiota disbiótica, de tal modo que una microbiota sana, diversa y protectora coloniza y pobla el lumen intestinal para establecer o volver a establecer control ecológico sobre patógenos o patógenos potenciales (por ejemplo, algunas bacterias son bacterias patógenas solamente cuando están presentes en un ambiente disbiótico). La inhibición de patógenos incluye aquellos patógenos tales como C. difficile, Salmonella spp., E coli entreropatógena, bacterias resistentes a multifármacos tales como Klebsiella y E.coli, Enterobacterias resistentes a Carbapenem (ERC), Enterococci resistentes a beta-lactama de espectro extendido (BLEE) y Enterococos resistentes a vancomicina (ERV).

[0047] Las composiciones bacterianas divulgadas en el presente documento se generan y la eficacia de las mismas durante la inhibición de bacterias patógenas se demuestra tal como se proporciona con más detalle en el presente documento.

[0048] De manera particular, para caracterizar aquellas relaciones antagonistas entre comensales intestinales que son relevantes para la dinámica del hábitat intestinal de mamífero, se da a conocer un sistema de cribado basado en microplacas que demuestra la eficacia de aquellas composiciones bacterianas, que incluyen la habilidad de inhibir (u oponerse a) el crecimiento de un patógeno bacteriano o patobionte, típicamente un microorganismo gastrointestinal. Estos procedimientos proporcionan combinaciones innovadoras de especies de microbiota intestinal y UTOs que son capaces de restaurar o potenciar control ecológico sobre patógenos intestinales o patobiontes importantes in vivo.

[0049] Las composiciones bacterianas pueden comprender dos tipos de bacterias (denominadas «combinaciones binarias» o «parejas binarias») o más de dos tipos de bacterias. Las composiciones bacterianas que comprenden tres tipos de bacterias se denominan «combinaciones terciarias». Por ejemplo, una composición bacteriana puede comprender como mínimo 2, como mínimo 3, como mínimo 4, como mínimo 5, como mínimo 6, como mínimo 7, como mínimo 8, como mínimo 9, como mínimo 10, como mínimo 11, como mínimo 12, como mínimo 13, como mínimo 14, como mínimo 15, como mínimo 16, como mínimo 17, como mínimo 18, como mínimo 19, como mínimo 20 o como mínimo 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o como mínimo 40, como mínimo 50 o superior a 50 tipos de bacterias, tal como se define por especies o unidad taxonómica operativa (UTO), o de otra manera tal como se proporciona en el presente documento.

[0050] En otra realización, el número de tipos de bacterias presentes en una composición bacteriana se encuentra en un valor conocido o inferior a él. Por ejemplo, en tales realizaciones la composición bacteriana comprende 50 o menos tipos de bacterias, tal como 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 3020, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, o 10 o menos, o 9 o menos tipos de bacterias, 8 o menos tipos de bacterias, 7 o menos tipos de bacterias, 6 o menos tipos de bacterias, 5 o menos tipos de bacterias, 4 o menos tipos de bacterias o 3 o menos tipos de bacterias. En otra realización, una composición bacteriana comprende desde 2 hasta no más de 40, desde 2 hasta no más de 30, desde 2 hasta no más de 20, desde 2hasta no más de 15, desde 2 hasta no más de 10 o desde 2 hasta no más de 5 tipos de bacterias.

[0051] En algunas realizaciones, las composiciones bacterianas se proporcionan con la habilidad de excluir a la bacteria patógena. Se ha demostrado que las composiciones bacterianas de ejemplo reducen la velocidad de crecimiento de un patógeno, C. difficile, tal como se indica en los Ejemplos, en donde la habilidad de las composiciones bacterianas se demuestra mediante la evaluación de la actividad de oposición de una combinación de UTOs o cepas frente a un patógeno dado utilizando ensayos in vitro.

[0052] En algunas realizaciones, las composiciones bacterianas con la capacidad en relación con durabilidad excluyen C. difficile, se desarrollan utilizando una metodología de evaluación de un Factor de Control Ecológico (FCE) para constituyentes en la microbiota humana. El FCE se determina mediante la evaluación de la actividad antagonista de una cepa comensal dada o una combinación de cepas con relación a un patógeno determinado utilizando un ensayo in vitro, que da como resultado niveles observados de control ecológico a diferentes concentraciones de las cepas comensales añadidas. El FCE para una cepa comensal o una combinación de cepas es un tanto analógica con relación a la evaluación de concentración mínima inhibitoria de larga duración (CMI) que se utiliza en la evaluación de antibióticos. El FCE facilita la evaluación y la clasificación de potencias relativas de cepas comensales y combinaciones de cepas según su habilidad de oponerse a patógenos gastrointestinales. El FCE de una cepa comensal o una combinación de cepas se puede calcular mediante la evaluación de la concentración de aquella composición que es capaz de mediar un porcentaje de inhibición determinado (por ejemplo, como mínimo 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %) de un patógeno diana en el ensayo in vitro. En el presente documento se proporcionan combinaciones de cepas o UTOs en la microbiota humana que son capaces de reducir de manera importante la velocidad de reproducción de patógeno gastrointestinal en el ensayo in vitro. Estas composiciones son capaces de proporcionar un medio seguro y eficaz mediante el cual se ve afectado el crecimiento, la reproducción y la gravedad de enfermedad de dichos patógenos bacterianos.

[0053] De manera general, se puede preparar las composiciones bacterianas que comprenden como mínimo dos tipos de bacterias aisladas, en donde un primer tipo y un segundo tipo se seleccionan de manera independiente entre las especies o UTOs enumeradas en la Tabla 1 y la Tabla 3. Determinadas composiciones bacterianas con como mínimo dos tipos de bacterias aisladas que contienen pares binares se reflejan en la Tabla 2. Adicionalmente, se puede preparar una composición bacteriana que comprende como míimo dos tipos de bacterias aisladas, en donde una primera UTO y una segunda UTO se caracterizan de manera independiente mediante, es decir, como mínimo, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso 100 % de identidad de secuencia con relación a secuencias enumeradas en la Tabla 3. De manera general, la primera bacteria y la segunda bacteria no son las mismas UTO. Las secuencias proporcionadas en la Tabla 3 son secuencias 16S completas. Por consiguiente, en un ejemplo, la primera y/o la segunda UTOs pueden caracterizarse mediante las secuencias 16S completas enumeradas en la Tabla 3. En otro ejemplo, la primera y/o la segunda UTOs pueden caracterizarse mediante una o más de las regiones variables de la secuencia 16S (V1-V9). Estas regiones en bacterias se definen por los nucleótidos 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435-1465 respectivamente utilizando la numeración basada en el sistema de denominación de E. coli. (Véanse, por ejemplo, Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)). En algunos ejemplos, como mínimo una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 se utiliza para caracterizar una UTO. En un ejemplo, las regiones V1, V2 y V3 se utilizan para caracterizar una UTO. En otro ejemplo, las regiones, V3, V4 y V5 se utilizan para caracterizar una UTO. En otro ejemplo, la región V4 se utiliza para caracterizar una UTO.

[0054] Procedimientos de Determinación de Secuencia 16S. UTOs pueden definirse o mediante secuenciación 16S completa del gen de ARNr, mediante secuenciación de una región hipervariable específica de este gen (es decir, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 o V9), o mediante secuenciación de cualquiera combinación de regiones hipervariables a partir de este gen (por ejemplo, V1-3 o V3-5). El ADNr 16S bacteriano tiene una longitud de aproximadamente 1500 nucleótidos y se utiliza en la reconstrucción de las relaciones evolutivas y la similitud de secuencia de una cepa bacteriana con relación a otra utilizando enfoques filogenéticos. Las secuencias 16S se utilizan para la reconstrucción filogenética debido a que generalmente son altamente conservadas, pero contienen regiones hipervariables específicas que albergan diversidad de nucleótidos suficiente para diferenciar los géneros y las especies de la mayoría de los microbios. Utilizando las técnicas bien conocidas, para determinar la secuencia 16^scompleta o la secuencia de cualquier región hipervariable de la secuencia 16S, se extrae ADN genómico a partir de una muestra bacteriana, el ADNr 16S (región completa o regiones hipervariables específicas) amplificado utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR), los productos de PCR limpios y secuencias de nucleótidos delineadas para determinar la composición genética del gen 16S o subdominio del gen. Si la secuenciación 16S completa se lleva a cabo, el procedimiento de secuenciación utilizado puede ser, pero no está limitado a, secuenciación de Sanger. Si se utiliza una o más regiones variables, tal como la región V4, la secuenciación puede, pero no está limitada a, llevarse a cabo utilizando el procedimiento de Sanger o utilizando un procedimiento de secuenciación de siguiente generación, tal como un procedimiento de Illumina (secuenciación mediante síntesis) que utiliza cebadores con código de barras para reacciones múltiplex.

[0055] Composiciones Bacterianas excluyentes de determinadas especies o cepas bacterianas. En una realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Enterococcus faecalis (conocida previamente como Streptococcus faecalis), Clostridium innocuum, Clostridium ramosum, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bacteroides thetaoiotaomicron, Escherichia coli (1109 y 1108-1), Clostridum bifermentans y Blautia producta (conocida previamente como Peptostreptococcus productus).

[0056] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Acidaminococcus intestinalis, Bacteroides ovatus, dos especies de Bifidobacterium adolescentis, dos especies de Bifidobacterium longum, Collinsella aerofaciens, dos especies de Dorea longicatena, Escherichia coli, Eubacterium eligens, Eubacterium limosum, cuatro especies de Eubacterium rectale, Eubacterium ventriosumi, Faecalibacterium prausnitzii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Paracateroides distasonis, Raoultella sp., una especie de Roseburia (seleccionada entre Roseburia faecalis o Roseburia faecis), Roseburia intestinalis, dos especies de Ruminococcus torques y Streptococcus mitis.

[0057] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Barnesiella intestinihominis; Lactobacillus reuteri; una especie que se caracteriza como una de Enterococcus hirae, Enterococus faecium, o Enterococcus durans; una especie que se caracteriza como una de Anaerostipes caccae o Clostridium indolis; una especie que se caracteriza como una de Staphylococcus warneri o Staphylococcus pasteuri; y Adlercreutzia equolifaciens.

[0058] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Clostridium absonum, Clostridium argentinense, Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium camis, Clostridium celatum, Clostridium chauvoei, Clostridium clostridioforme, Clostridium cochlearium, Clostridium difficile, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulare, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringens, Clostridium piliforme, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium ramosum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium welchii y Clostridium villosum, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium camis, Clostridium celatum, Clostridium chauvoei, Clostridium clostridioforme, Clostridium cochlearium, Clostridium difficile, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulare, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringens, Clostridium piliforme, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium ramosum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tertium, Clostridium tetani, Clostridium welchii y Clostridium villosum.

[0059] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Clostridium innocuum, Clostridum bifermentans, Clostridium butyricum, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, tres cepas de Escherichia coli, y Lactobacillus sp..

[0060] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Clostridium bifermentans, Clostridium innocuum, Clostridium butyricum, tres cepas de Escherichia coli, tres cepas de Bacteroides, y Blautia producta (previamente conocida como Peptostreptococcus productus).

[0061] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Bacteroides sp., Escherichia coli, y Clostridia no patógena, que incluye Clostridium innocuum, Clostridium bifermentans y Clostridium ramosum.

[0062] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una o más de una de especies de Bacteroides, Escherichia coli y Clostridia no patógena, tales como Clostridium butyricum, Clostridium bifermentans y Clostridium innocuum.

[0063] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Bacteroides caccae, Bacteroides capillosus, Bacteroides coagulans, Bacteroides distasonis, Bacteroides eggerthii, Bacteroides forsythus, Bacteroides fragilis, Bacteroides fragilisryhm, Bacteroides gracilis, Bacteroides levii, Bacteroides macacae, Bacteroides merdae, Bacteroides ovatus, Bacteroides pneumosintes, Bacteroides putredinis, Bacteroides pyogenes, Bacteroides splanchnicus, Bacteroides stercoris, Bacteroides tectum, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides ureolyticus y Bacteroides vulgatus.

[0064] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Bacteroides, Eubacteria, Fusobacteria, Propionibacteria, Lactobacilli, anaerobic cocci, Ruminococcus, Escherichia coli, Gemmiger, Desulfomonas y Peptostreptococcus.

[0065] En otra realización, la composición bacteriana no comprende como mínimo una de Bacteroides fragilis ss. Vulgatus, Eubacterium aerofaciens, Bacteroides fragilis ss. Thetaiotaomicron, Blautia producta (previamente conocida como Peptostreptococcus productus II), Bacteroides fragilis ss. Distasonis, Fusobacterium prausnitzii, Coprococcus eutactus, Eubacterium aerofaciens III, Blautia producta (previamente conocida como Peptostreptococcus productus I), Ruminococcus bromii, Bifidobacterium adolescentis, Gemmiger formicilis, Bifidobacterium longum, Eubacterium siraeum, Ruminococcus torques, Eubacterium rectale III-H, Eubacterium rectale IV, Eubacterium eligens, Bacteroides eggerthii, Clostridium leptum, Bacteroides fragilis ss. A, Eubacterium biforme, Bifidobacterium infantis, Eubacterium rectale III-F, Coprococcus comes, Bacteroides capillosus, Ruminococcus albus, Eubacterium formicigenerans, Eubacterium hallii, Eubacterium ventriosum I, Fusobacterium russii, Ruminococcus obeum, Eubacterium rectale II, Clostridium ramosum I, Lactobacillus leichmanii, Ruminococcus cailidus, Butyrivibrio crossotus, Acidaminococcus fermentans, Eubacterium ventriosum, Bacteroides fragilis ss. fragilis, Bacteroides AR, Coprococcus catus, Eubacterium hadrum, Eubacterium cylindroides, Eubacterium ruminantium, Eubacterium CH-1, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus BL, Eubacterium limosum, Bacteroides praeacutus, Bacteroides L, Fusobacterium mortiferum I, Fusobacterium navi forme, Clostridium innocuum, Clostridium ramosum, Propionibacterium acnes, ^{Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus AT, Peptococcus AU-1, Eubacterium AG,}-A^k, ^{-AL, -AL-1, -AN;}Bacteroides fragilis ss. ovatus, -ss. d, -ss. f; Bacteroides L-1, L-5; Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium mortiferum, Escherichia coli, Streptococcus morbiliorum, Peptococcus magnus, Peptococcus G, AU-2; Streptococcus intermedius, Ruminococcus lactaris, Ruminococcus CO Gemmiger X, Coprococ- cus BH, -CC; Eubacterium tenue, Eubacterium ramulus, Eubacterium AE, - AG-H, -AG-M, -AJ, -BN-1; Bacteroides clostridiiformis ss. clostridliformis, Bacteroides coagulans, Bacteroides orails, Bacteroides ruminicola ss. brevis, -ss. ruminicola, Bacteroides splanchnicus, Desuifomonas pigra, Bacteroides L-4, -N-i; Fusobacterium H, Lactobacillus G y Succinivibrio A.

[0066] Inhibición de Patógenos Bacterianos. Las composiciones bacterianas descritas en el presente documento ofrecen un efecto protector o terapéutico frente a una infección causada por uno o más patógenos GI de interés. La composición bacteriana de la invención comprende una primera especie y la segunda especie que son capaces de disminuir y/o inhibir el crecimiento y/o la colonización de Clostridium difficile.

[0067] Se proporciona un listado de patógenos bacterianos de ejemplo en la Tabla 7.

[0068] Las bacterias patógenas pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en Yersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium , Bacillus, bacterias resistentes a multifármaco, Enterococci resistentes a beta-lactama de espectro extendido (BLEE), Enterobacterias resistentes a Carbapenem (ERC) y Enterococos resistentes a vancomicina (ERV).

[0069] En algunos ejemplos, estos patógenos pueden incluir, pero no están limitados a, Aeromonas hydrophila, Campylobacter fetus, Plesiomonas shigelloides, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Escherichia coli enteroagregativa, Escherichia coli enterohemorrágica, Escherichia coli enteroinvasiva, Escherichia coli enterotoxigénica (tal como, pero no limitada a, LT y/o ST), Escherichia coli 0157:H7, Helicobacter pylori, Klebsiellia pneumonia, Lysteria monocytogenes, Plesiomonas shigelloides, Salmonella spp., Sal-monella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella spp., Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, enterococcus spp. resistente a vancomicina, Vibrio spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus e Yersinia enterocolitica.

[0070] En un ejemplo, el patógeno puede ser como mínimo un patógeno seleccionado entre Clostridium difficile, Salmonella spp., Escherichia coli patógena, Enterococcus spp. resistente a vancomicina y Enterococci resistente a beta-lactamas de espectro extendido (BLEE).

Ensayos in vitro que corroboran el efecto protector de las composiciones bacterianas.

[0071] En un caso, se describe un ensayo in vitro que utiliza la competición entre las composiciones bacterianas o subconjuntos de las mismas y C. difficile. En el presente documento y en los Ejemplos se proporcionan ejemplos de este Ensayo.

[0072] En otro caso, se describe un ensayo in vitro que utiliza 10 % (peso/volumen) de heces filtradas en condiciones estériles. También se describe un ensayo in vitro para probar el efecto protector de las composiciones bacterianas y para cribar in vitro combinaciones de microbios que inhiben el crecimiento de un patógeno. El ensayo puede funcionar en modo automático de alto rendimiento o manual. En cualquiera de los dos sistemas, las heces humanas o animales pueden resuspenderse en una solución tampón anaeróbica, tal como PBS reducida previamente u otro tampón adecuado, las partículas se extraen por centrifugación y se esterilizan por filtración. Este material de heces filtrado estéril al 10 % sirve como medio base para el ensayo in vitro. Para probar una composición bacteriana, un investigador puede agregarla al material de heces esterilizado por filtración durante un primer período de incubación y a continuación puede inocular la solución microbiana incubada con el patógeno de interés durante un segundo período de incubación. El título resultante del patógeno puede cuantificarse mediante varios métodos, tales como los que se describen a continuación, y el cambio en la cantidad de patógeno se compara con los controles estándar, incluido el patógeno cultivado en ausencia de la composición bacteriana. El ensayo se lleva a cabo utilizando al menos un control. Las heces de un sujeto sano se pueden utilizar como control positivo. Como control negativo, se pueden usar heces tratadas con antibióticos o heces tratadas con calor. Se pueden ensayar varias composiciones bacterianas en este material y las composiciones bacterianas se pueden comparar opcionalmente con los controles positivo y/o negativo. La capacidad para inhibir el crecimiento del patógeno puede medirse sembrando el material incubado en medios selectivos de C. difficile y contando las colonias. Después de la competición entre la composición bacteriana y C. difficile, cada pocillo de la placa de ensayo in vitro se diluye en serie diez veces para seis veces y se coloca en placas en medios selectivos, tales como, pero sin limitación, agar de cicloserina cefoxitina manitol (CCMA) o agar de cicloserina cefoxitina fructosa (CCFA), y se incuba. A continuación, se cuentan las colonias de C. difficile para calcular la concentración de células viables en cada pocillo al final de la competición. Las colonias de C. difficile se confirman por su característica morfología difusa del borde de la colonia, así como por la fluorescencia bajo la luz ultravioleta.

[0073] En otro caso, el ensayo in vitro utiliza heces tratadas con antibióticos. En un caso alternativo, y en lugar de utilizar heces filtradas en condiciones estériles al 10 %, las heces humanas o animales pueden resuspenderse en una solución tampón anaeróbica, tal como PBS prerreducida u otro tampón adecuado. Las heces resuspendidas se tratan con un antibiótico, tal como clindamicina, o un cóctel de varios antibióticos para reducir la capacidad de las heces de un sujeto sano para inhibir el crecimiento de C. difficile; este material se denomina matriz tratada con antibiótico. Si bien no está sujeto a ningún mecanismo, se cree que las bacterias beneficiosas en sujetos sanos los protegen de la infección al competir con C. difficile. El tratamiento de las heces con antibióticos mata o reduce la población de esas bacterias beneficiosas, lo que permite que C. difficile crezca en esta matriz de ensayo. Los antibióticos, además de la clindamicina, que inhiben la flora normal incluyen ceftriaxona y piperacilina-tazobactam y pueden sustituir a la clindamicina. La matriz tratada con antibiótico se centrifuga, se elimina el sobrenadante y el material sedimentado se resuspende en heces diluidas esterilizadas por filtración para eliminar cualquier antibiótico residual. Esta matriz tratada con antibiótico lavada puede usarse en el ensayo in vitro descrito anteriormente en lugar de las heces al 10 % esterilizadas por filtración.

[0074] Alternativamente, la capacidad para inhibir el crecimiento del patógeno puede medirse mediante PCR cuantitativa (qPCR). Pueden seguirse técnicas estándar para generar una curva estándar para el patógeno de interés. El ADN genómico se puede extraer de las muestras utilizando kits disponibles comercialmente, tales como el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil ®-htp 96 Well Soil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil ® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), o el minikit QIAamp DNA Stool (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. La qPCR se puede realizar usando HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD) y cebadores específicos para el patógeno de interés, y se puede realizar en una placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos MicroAmp®con código de barras (0,1 ml) (Life Technologies, Grand Island, NY) y llevarse a cabo en un termociclador BioRad C1000™ equipado con un sistema en tiempo real CFX96™ (BioRad, Hercules, CA), con lecturas fluorescentes de los canales FAM y ROX. El valor de Cq para cada pocillo en el canal FAM se determina mediante el software CFX Manager™ versión 2.1. El log-10 (ufc/ml) de cada muestra experimental se calcula ingresando el valor de Cq de una muestra determinada en el modelo de regresión lineal generado a partir de la curva estándar que compara los valores de Cq de los pocillos de la curva estándar con el log-10 (ufc/ml) conocido de esas muestras. El experto en la materia puede emplear modos alternativos de qPCR.

[0075] También se describen ensayos in vivo que establecen el efecto protector de las composiciones bacterianas. Se divulga un modelo de ratón in vivo para probar el efecto protector de las composiciones bacterianas contra C.

diffidle. En este modelo (basado en Chen, et al., A mouse model of Clostridium difficile associated disease, Gastroenterology 135(6):1984-1992 (2008)), los ratones se vuelven susceptibles a C. difficile mediante un tratamiento de 7 días (días -12 a -5 del experimento) con 5 a 7 antibióticos (incluyendo kanamicina, colistina, gentamicina, metronidazol y vancomicina y opcionalmente incluyendo ampicilina y ciprofloxacina) administrados a través de su agua potable, seguido de una dosis única con clindamicina el día -3, a continuación se estimula tres días después en el día 0 con 104 esporas de C. difficile mediante sonda oral (es decir, lavado orogástrico). Las composiciones bacterianas pueden administrarse antes (tratamiento profiláctico) o después (tratamiento terapéutico) de la sonda de C. difficile. Además, las composiciones bacterianas se pueden administrar después del tratamiento (opcional) con vancomicina (ver más abajo) para evaluar su capacidad para prevenir la recurrencia y así suprimir el patógeno in vivo. Los resultados evaluados cada día desde el día -1 hasta el día 6 (o más allá, para la prevención de la recurrencia) son el peso, los signos clínicos, la mortalidad y la excreción de C. difficile en las heces. La pérdida de peso, los signos clínicos de la enfermedad y la excreción de C. difficile se observan típicamente sin tratamiento. La vancomicina proporcionada por sonda oral en los días -1 a 4 protege contra estos resultados y sirve como control positivo. Los signos clínicos son subjetivos y se puntúan cada día por el mismo observador experimentado. Los animales que pierden más o igual al 25 % de su peso corporal se sacrifican y cuentan como mortalidad relacionada con la infección. Las heces se recogen de las jaulas de los ratones (5 ratones por jaula) cada día, y la eliminación de esporas de C. difficile se detecta en las heces mediante un ensayo de placas selectivas tal como se describe para el ensayo in vitro anterior, o mediante qPCR para el gen de la toxina tal como se describe en este documento. Los efectos de los materiales de prueba, incluida la suspensión al 10 % de heces humanas (como control positivo), las composiciones bacterianas o PBS (como control de vehículo negativo), se determinan introduciendo el artículo de prueba en un volumen de 0,2 ml en los ratones mediante sonda oral el día -1, un día antes de la exposición a C. difficile, los días 1, 2 y 3 como tratamiento o post-tratamiento con vancomicina los días 5, 6, 7 y 8. La vancomicina, como se discutió anteriormente, se administra los días 1 a 4 como otro control positivo. Se pueden emplear pautas de dosificación y vías de administración alternativas (por ejemplo, rectal), incluidas dosis múltiples del artículo de prueba, y se pueden administrar de 103 a 1010 de un organismo o composición determinada..

Procedimientos para preparar una composición bacteriana para la administración a un sujeto.

[0076] Los procedimientos para producir composiciones bacterianas pueden incluir tres etapas de procesamiento principales, combinados con una o más etapas de mezclado. Las etapas son: almacenamiento en bancos de organismos, producción de organismos y preservación.

[0077] Para el almacenamiento, las cepas incluidas en la composición bacteriana pueden (1) aislarse directamente de una muestra o tomarse de un banco de muestras, (2) opcionalmente cultivarse en un caldo o agar nutritivo que apoye el crecimiento para generar biomasa viable, y (3) la biomasa conservada opcionalmente en múltiples alícuotas en almacenamiento a largo plazo.

[0078] Cuando se utiliza una etapa de cultivo, el agar o caldo puede contener nutrientes que proporcionan elementos esenciales y factores específicos que permiten el crecimiento. Un ejemplo sería un medio compuesto por 20 g/l de glucosa, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona de soja, 2 g/l de ácido cítrico, 1,5 g/l de fosfato sódico monobásico, 100 mg/l de citrato férrico amónico, 80 mg/l de sulfato de magnesio, 10 mg/l de cloruro de hemina, 2 mg/l de cloruro de calcio, 1 mg/l de menadiona. Una variedad de medios microbiológicos y variaciones son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, R.M. Atlas, Handbook of Microbiological Media (2010) CRC Press). El medio se puede agregar al cultivo al principio, se puede agregar durante el cultivo o se puede hacer fluir de manera intermitente/continua a través del cultivo. Las cepas en la composición bacteriana se pueden cultivar solas, como un subconjunto de la composición bacteriana, o como una colección completa que comprende la composición bacteriana. Como ejemplo, se puede cultivar una primera cepa junto con una segunda cepa en un cultivo continuo mixto, a una tasa de dilución inferior a la tasa máxima de crecimiento de cualquiera de las células para evitar que el cultivo se elimine por lavado.

[0079] El cultivo inoculado se incuba en condiciones favorables durante un tiempo suficiente para generar biomasa. Para composiciones bacterianas para uso humano, esto es a menudo a 37 °C de temperatura, pH y otros parámetros con valores similares al nicho humano normal. El entorno puede controlarse activamente, controlarse pasivamente (por ejemplo, a través de tampones) o permitir que se desplace. Por ejemplo, para composiciones bacterianas anaerobias (por ejemplo, microbiota intestinal), puede emplearse un entorno anóxico/reductor. Esto se puede lograr mediante la adición de agentes reductores, tales como la cisteína, al caldo y/o despojándolo de oxígeno. Como ejemplo, se puede hacer crecer un cultivo de una composición bacteriana a 37 °C, pH 7, en el medio anterior, prerreducido con 1 g/l de cisteína^HCl.

[0080] Cuando el cultivo ha generado suficiente biomasa, se puede conservar para almacenar. Los organismos pueden colocarse en un medio químico que los proteja de la congelación (agregando “crioprotectores”), el secado (“ lioprotectores”) y/o el choque osmótico (“osmoprotectores”), dispensarse en múltiples recipientes (opcionalmente idénticos) para crear un banco uniforme, y a continuación tratar el cultivo para su conservación. Los recipientes son generalmente impermeables y tienen cierres que aseguran el aislamiento del medio ambiente. El tratamiento de crioconservación se logra congelando un líquido a temperaturas ultrabajas (por ejemplo, a -80 °C o menos). La conservación seca elimina el agua del cultivo por evaporación (en el caso del secado por aspersión o “secado en frío”) o por sublimación (por ejemplo, para la liofilización, la liofilización por aspersión). La eliminación del agua mejora la estabilidad de almacenamiento de la composición bacteriana a largo plazo a temperaturas elevadas por encima de las criogénicas. Si la composición bacteriana comprende especies formadoras de esporas y da como resultado la producción de esporas, la composición final puede purificarse por medios adicionales, tales como centrifugación en gradiente de densidad conservada usando las técnicas descritas anteriormente. El banco de composición bacteriana se puede realizar cultivando y conservando las cepas individualmente, o mezclando las cepas para crear un banco combinado. Como ejemplo de crioconservación, se puede recoger un cultivo de composición bacteriana mediante centrifugación para sedimentar las células del medio de cultivo, decantar el sobrenadante y reemplazarlo con caldo de cultivo fresco que contenga un 15 % de glicerol. A continuación, el cultivo puede dividirse en alícuotas en criotubos de 1 ml, sellarse, y colocarse a -80°C para la retención de viabilidad a largo plazo. Este procedimiento logra una viabilidad aceptable tras la recuperación del almacenamiento congelado.

[0081] La producción de organismos puede llevarse a cabo utilizando etapas de cultivo similares a las del almacenamiento en bancos, incluida la composición del medio y las condiciones de cultivo. Puede llevarse a cabo a mayores escalas de operación, especialmente para desarrollo clínico o producción comercial. A mayor escala, puede haber varios subcultivos de la composición bacteriana antes del cultivo final. Al final del cultivo, el cultivo se recoge para permitir una mayor formulación en una forma de dosificación para la administración. Esto puede implicar la concentración, la eliminación de componentes indeseables del medio y/o la introducción en un medio químico que conserve la composición bacteriana y la haga aceptable para la administración a través de la vía elegida. Por ejemplo, una composición bacteriana se puede cultivar a una concentración de 1010UFC/ml, a continuación concentrarse 20 veces por microfiltración de flujo tangencial; el medio gastado puede intercambiarse mediante diafiltración con un medio conservante que consiste en gelatina al 2 %, trehalosa 100 mM y tampón de fosfato de sodio 10 mM. A continuación, la suspensión puede liofilizarse hasta obtener un polvo y titularse.

[0082] Después del secado, el polvo puede mezclarse a una potencia apropiada y mezclarse con otros cultivos y/o un relleno tal como celulosa microcristalina para lograr consistencia y facilidad de manipulación, y la composición bacteriana se formula tal como se describe en este documento.

[0083] Formulaciones. Se describen formulaciones para administración a seres humanos y otros sujetos que lo necesiten. Generalmente, las composiciones bacterianas se combinan con materiales activos y/o inactivos adicionales para producir un producto final, que puede estar en una unidad de dosificación individual o en un formato multidosis.

[0084] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos un carbohidrato. Un "carbohidrato" se refiere a un azúcar o polímero de azúcares. Los términos "sacárido", "polisacárido", "carbohidrato" y "oligosacárido" pueden usarse indistintamente. La mayoría de los carbohidratos son aldehídos o cetonas con muchos grupos hidroxilo, generalmente uno en cada átomo de carbono de la molécula. Los carbohidratos generalmente tienen la fórmula molecular CnH2nOn. Un carbohidrato puede ser un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un oligosacárido o un polisacárido. El carbohidrato más básico es un monosacárido, tal como glucosa, sacarosa, galactosa, manosa, ribosa, arabinosa, xilosa y fructosa. Los disacáridos son dos monosacáridos unidos. Los ejemplos de disacáridos incluyen sacarosa, maltosa, celobiosa y lactosa. Normalmente, un oligosacárido incluye entre tres y seis unidades de monosacárido (por ejemplo, rafinosa, estaquiosa) y los polisacáridos incluyen seis o más unidades de monosacárido. Los polisacáridos de ejemplo incluyen almidón, glucógeno y celulosa. Los carbohidratos pueden contener unidades de sacárido modificadas, tales como 2'-desoxirribosa, en la que se elimina un grupo hidroxilo, 2'-fluororribosa en la que un grupo hidroxilo se reemplaza con flúor o N-acetilglucosamina, una forma de glucosa que contiene nitrógeno (por ejemplo, 2'-fluororibosa, desoxirribosa y hexosa). Los carbohidratos pueden existir en muchas formas diferentes, por ejemplo, confórmeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisómeros, tautómeros, anómeros e isómeros.

[0085] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos un lípido. Tal como se usa en el presente documento, un "lípido" incluye grasas, aceites, triglicéridos, colesterol, fosfolípidos, ácidos grasos en cualquier forma, incluidos los ácidos grasos libres. Las grasas, aceites y ácidos grasos pueden ser saturados, insaturados (cis o trans) o parcialmente insaturados (cis o trans). En algunas realizaciones, el lípido comprende al menos un ácido graso seleccionado de ácido láurico (12:0), ácido mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido palmitoleico (16:1), ácido margárico (17:0). 0), ácido heptadecenoico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2), ácido linolénico (18:3), ácido octadecatetraenoico (18:4) , ácido araquídico (20:0), ácido eicosenoico (20:1), ácido eicosadienoico (20:2), ácido eicosatetraenoico (20:4), ácido eicosapentaenoico (20:5) (EPA), ácido docosanoico (22:0), ácido docosenoico (22:1), ácido docosapentaenoico (22:5), ácido docosahexaenoico (22:6) (DHA) y ácido tetracosanoico (24:0). En algunas realizaciones, la composición comprende al menos un lípido modificado, por ejemplo, un lípido que ha sido modificado por cocción.

[0086] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos un mineral suplementario o una fuente de minerales. Los ejemplos de minerales incluyen, sin limitación: cloruro, sodio, calcio, hierro, cromo, cobre, yodo, zinc, magnesio, manganeso, molibdeno, fósforo, potasio y selenio. Las formas adecuadas de cualquiera de los minerales anteriores incluyen sales minerales solubles, sales minerales ligeramente solubles, sales minerales insolubles, minerales quelados, complejos minerales, minerales no reactivos, tales como minerales carbonílicos y minerales reducidos y combinaciones de los mismos.

[0087] En algunas realizaciones, la composición comprende al menos una vitamina suplementaria. La al menos una vitamina puede ser una vitamina liposoluble o hidrosoluble. Las vitaminas adecuadas incluyen, pero sin limitación, vitamina C, vitamina A, vitamina E, vitamina B12, vitamina K, riboflavina, niacina, vitamina D, vitamina B6, ácido fólico, piridoxina, tiamina, ácido pantoténico y biotina. Las formas adecuadas de cualquiera de los anteriores son sales de la vitamina, derivados de la vitamina, compuestos que tienen la misma actividad o actividad similar que la vitamina y metabolitos de la vitamina.

[0088] En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente. Los ejemplos no limitativos de excipientes adecuados incluyen un agente tampón, un conservante, un estabilizador, un aglutinante, un agente de compactación, un lubricante, un potenciador de la dispersión, un agente de disgregación, un agente aromatizante, un edulcorante y un agente colorante.

[0089] En algunas realizaciones, el excipiente es un agente tamponador. Los ejemplos no limitativos de agentes tamponadores adecuados incluyen citrato de sodio, carbonato de magnesio, bicarbonato de magnesio, carbonato de calcio y bicarbonato de calcio.

[0090] En algunas realizaciones, el excipiente comprende un conservante. Los ejemplos no limitativos de conservantes adecuados incluyen antioxidantes, tales como alfa-tocoferol y ascorbato, y antimicrobianos, tales como parabenos, clorobutanol y fenol.

[0091] En algunas realizaciones, la composición comprende un aglutinante como excipiente. Los ejemplos no limitativos de aglutinantes adecuados incluyen almidones, almidones pregelatinizados, gelatina, polivinilpirrolidona, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, poliacrilamidas, poliviniloxoazolidona, polivinilalcoholes, alcoholes de ácidos grasos C12-C18, polietilenglicol, polioles, sacáridos, oligosacáridos, y combinaciones de los mismos.

[0092] En algunas realizaciones, la composición comprende un lubricante como excipiente. Los ejemplos no limitativos de lubricantes adecuados incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, aceites vegetales hidrogenados, esterotex, monoestearato de polioxietileno, talco, polietilenglicol, benzoato de sodio, laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio y aceite mineral ligero.

[0093] En algunas realizaciones, la composición comprende un potenciador de la dispersión como excipiente. Los ejemplos no limitativos de dispersantes adecuados incluyen almidón, ácido algínico, polivinilpirrolidonas, goma guar, caolín, bentonita, celulosa de madera purificada, glicolato de almidón sódico, silicato isoamorfo y celulosa microcristalina como tensioactivos emulsionantes de alto HLB.

[0094] En algunas realizaciones, la composición comprende un disgregante como excipiente. En algunas realizaciones, el disgregante es un disgregante no efervescente. Los ejemplos no limitativos de disgregantes no efervescentes adecuados incluyen almidones, tales como almidón de maíz, almidón de patata, almidones pregelatinizados y modificados de los mismos, edulcorantes, arcillas, tales como bentonita, celulosa microcristalina, alginatos, glicolato de almidón sódico, gomas, tales como agar, guar, algarroba, karaya, pecitina y tragacanto. En algunas realizaciones, el disgregante es un disgregante efervescente. Los ejemplos no limitativos de disgregantes efervescentes adecuados incluyen bicarbonato de sodio en combinación con ácido cítrico y bicarbonato de sodio en combinación con ácido tartárico.

[0095] En algunas realizaciones, el excipiente comprende un agente aromatizante. Los agentes aromatizantes se pueden elegir entre aceites aromáticos sintéticos y agentes aromáticos aromatizantes; aceites naturales; extractos de plantas, hojas, flores y frutos; y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente aromatizante se selecciona de aceites de canela; aceite de gaulteria; aceites de menta; aceite de trébol; aceite de heno; aceite de anís; eucalipto; vainilla; aceite de cítricos, tal como aceite de limón, aceite de naranja, uva y aceite de pomelo; y esencias de frutas que incluyen manzana, melocotón, pera, fresa, frambuesa, cereza, ciruela, piña y albaricoque.

[0096] En algunas realizaciones, el excipiente comprende un edulcorante. Los ejemplos no limitativos de edulcorantes adecuados incluyen glucosa (jarabe de maíz), dextrosa, azúcar invertido, fructosa y mezclas de los mismos (cuando no se usan como portador); sacarina y sus diversas sales, tales como la sal de sodio; edulcorantes de dipéptidos, tales como aspartamo; compuestos de dihidrocalcona, glicirricina; Stevia Rebaudiana (Esteviósido); derivados de cloro de sacarosa, tales como sucralosa; y alcoholes de azúcar, tales como sorbitol, manitol, silitol y similares. También se contemplan los hidrolizados de almidón hidrogenado y el edulcorante sintético 3,6-dihidro-6-metil-1,2,3-oxatiazin-4-ona-2,2-dióxido, particularmente la sal de potasio (acesulfame-K) y sodio y sales de calcio de los mismos.

[0097] En algunas realizaciones, la composición comprende un agente colorante. Los ejemplos no limitativos de agentes colorantes adecuados incluyen colorantes para alimentos, fármacos y cosméticos (FD&C), colorantes para fármacos y cosméticos (D&C), y colorantes para fármacos y cosméticos externos (Ext. D&C). Los agentes colorantes se pueden utilizar como colorantes o sus correspondientes lacas.

[0098] La fracción en peso del excipiente o combinación de excipientes en la formulación es normalmente de aproximadamente el 99 % o menos, tal como aproximadamente el 95 % o menos, aproximadamente el 90 % o menos, aproximadamente el 85 % o menos, aproximadamente el 80 % o menos, aproximadamente el 75 % o menos, aproximadamente el 70 % o menos, aproximadamente el 65 % o menos, aproximadamente el 60 % o menos, aproximadamente el 55 % o menos, aproximadamente el 50 % o menos, aproximadamente el 45 % o menos, aproximadamente el 40 % o menos, aproximadamente el 35 % o menos, aproximadamente el 30 % o menos, aproximadamente el 25 % o menos, aproximadamente el 20 % o menos, aproximadamente el 15 % o menos, aproximadamente el 10 % o menos, aproximadamente el 5 % o menos, aproximadamente el 2 % o menos, o aproximadamente el 1 % o menos del peso total de la composición.

[0099] Las composiciones bacterianas descritas en el presente documento pueden formularse en una variedad de formas y administrarse por varios medios diferentes. Las composiciones se pueden administrar por vía oral, rectal o parenteral, en formulaciones que contienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionalmente aceptables, según se desee. El término "parenteral", tal como se usa en el presente documento, incluye subcutánea, intravenosa, intramuscular o técnicas de infusión e inyección o intraesternal. En una realización de ejemplo, la composición bacteriana se administra por vía oral.

[0100] Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, comprimidos oblongos, píldoras, trociscos, pastillas, polvos y gránulos. Una cápsula normalmente comprende un material central que comprende una composición bacteriana y una pared de cubierta que encapsula el material central. En algunas realizaciones, el material del núcleo comprende al menos uno de un sólido, un líquido y una emulsión. En algunas realizaciones, el material de la pared de la cubierta comprende al menos una gelatina blanda, una gelatina dura y un polímero. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a: polímeros celulósicos, tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, acetato trimelitato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica; polímeros y copolímeros de ácido acrílico, tales como los formados a partir de ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo, metilacrilato de amonio, acrilato de etilo, metacrilato de metilo y/o metacrilato de etilo (por ejemplo, los copolímeros vendidos bajo el nombre comercial "Eudragit"); polímeros y copolímeros de vinilo, tales como polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, acetato ftalato de polivinilo, copolímero de ácido crotónico y acetato de vinilo y copolímeros de etileno-acetato de vinilo; y goma laca (laca purificada). En algunas realizaciones, al menos un polímero funciona como agente de enmascaramiento del sabor.

[0101] Los comprimidos, píldoras y similares pueden comprimirse, comprimirse de forma múltiple, estratificarse en capas múltiples y/o recubrirse. El recubrimiento puede ser único o múltiple. En una realización, el material de recubrimiento comprende al menos un sacárido, un polisacárido y glicoproteínas extraídas de al menos una planta, un hongo y un microbio. Los ejemplos no limitativos incluyen almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de patata, almidón de tapioca, celulosa, hemicelulosa, dextranos, maltodextrina, ciclodextrinas, inulinas, pectina, mananos, goma arábiga, goma de algarrobo, goma de mezquite, goma guar, goma karaya, goma ghatti, goma de tragacanto, funori, carragenanos, agar, alginatos, quitosanos o goma gellan. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende una proteína. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende al menos una grasa y un aceite. En algunas realizaciones, el al menos uno de una grasa y un aceite se funde a alta temperatura. En algunas realizaciones, el al menos uno de una grasa y un aceite está hidrogenado o parcialmente hidrogenado. En algunas realizaciones, el al menos uno de una grasa y un aceite se deriva de una planta. En algunas realizaciones, el al menos uno de una grasa y un aceite comprende al menos uno de glicéridos, ácidos grasos libres y ésteres de ácidos grasos. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende al menos una cera comestible. La cera comestible puede derivarse de animales, insectos o plantas. Los ejemplos no limitativos incluyen cera de abejas, lanolina, cera de arándano, cera de carnauba y cera de salvado de arroz. Los comprimidos y las píldoras también se pueden preparar con recubrimientos entéricos.

[0102] Alternativamente, los polvos o gránulos que incorporan las composiciones bacterianas descritas en este documento se pueden incorporar en un producto alimenticio. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una bebida para administración oral. Los ejemplos no limitativos de una bebida adecuada incluyen zumo de frutas, una bebida de frutas, una bebida aromatizada artificialmente, una bebida endulzada artificialmente, una bebida carbonatada, una bebida deportiva, un producto lácteo líquido, un batido, una bebida alcohólica, una bebida con cafeína, una fórmula infantil y así sucesivamente. Otros medios adecuados para la administración oral incluyen soluciones acuosas y no acuosas, emulsiones, suspensiones y soluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes, que contienen al menos uno de los disolventes, conservantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, diluyentes, edulcorantes, agentes colorantes adecuados y agentes aromatizantes.

[0103] En algunas realizaciones, el producto alimenticio es un alimento sólido. Los ejemplos adecuados de un producto alimenticio sólido incluyen, sin limitación, una barra de comida, una barra de refrigerio, una galleta, un brownie, una magdalena, una galleta salada, una barra de helado, una barra de yogur congelado y similares.

[0104] En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se incorporan a un alimento terapéutico. En algunas realizaciones, el alimento terapéutico es un alimento listo para usar que opcionalmente contiene algunos o todos los macronutrientes y micronutrientes esenciales. En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se incorporan a un alimento complementario que está diseñado para mezclarse con una comida existente. En algunas realizaciones, el alimento suplementario contiene algunos o todos los macronutrientes y micronutrientes esenciales. En algunas realizaciones, las composiciones bacterianas descritas en este documento se mezclan o se agregan a un alimento existente para fortalecer la nutrición proteica del alimento. Los ejemplos incluyen alimentos básicos (cereales, sal, azúcar, aceite de cocina, margarina), bebidas (café, té, refrescos, cerveza, licores, bebidas deportivas), refrigerios, dulces y otros alimentos.

[0105] En una realización, las formulaciones se introducen en cápsulas de gelatina para administración oral. Un ejemplo de una cápsula apropiada es una cápsula de gelatina de 250 mg que contiene de 10 (hasta 100 mg) de polvo liofilizado (de 108 a 1011 bacterias), 160 mg de celulosa microcristalina, 77,5 mg de gelatina y 2,5 mg de estearato de magnesio. En una realización alternativa, se pueden usar de 105 a 1012 bacterias, de 105 a 107, de 106 a 107 o de 108 a 1010, con los consiguientes ajustes de los excipientes si es necesario. En una realización alternativa, se puede usar una cápsula o comprimido con recubrimiento entérico o con una composición tamponadora o protectora.

[0106] En una realización, el número de bacterias de cada tipo puede estar presente en la misma cantidad o en cantidades diferentes. Por ejemplo, en una composición bacteriana con dos tipos de bacterias, las bacterias pueden estar presentes en una proporción de 1:10.000 a una proporción de 1:1, de una proporción de 1:10.000 a una proporción de 1:1.000, de una proporción de 1:1.000 a una proporción de 1:100, de una proporción de 1:100 a una proporción de 1:1.50, de una proporción de 1:50 a una proporción de 1:20, de una proporción de 1:20 a una proporción de 1:10, de una proporción de 1:10 a una proporción de 1:1. Para las composiciones bacterianas que comprenden al menos tres tipos de bacterias, la proporción del tipo de bacterias se puede elegir por parejas entre las proporciones de las composiciones bacterianas con dos tipos de bacterias. Por ejemplo, en una composición bacteriana que comprende las bacterias A, B y C, se puede elegir al menos una de las proporciones entre las bacterias A y B, la proporción entre las bacterias B y C, y la proporción entre las bacterias A y C, independientemente, de las combinaciones por parejas anteriores.

Composiciones para uso en procedimientos de tratamiento de un sujeto.

[0107] En algunos casos, las proteínas y las composiciones descritas en el presente documento se administran a un paciente o usuario (a veces denominados colectivamente "sujeto"). Visto desde este aspecto, la descripción proporciona una composición de la invención para usar en un procedimiento para tratar a un sujeto. Tal como se usa en el presente documento, "administrar" y "administración" abarca casos en los que una persona indica a otra que consuma una composición bacteriana de cierta manera y/o para un determinado propósito, y también situaciones en las que un usuario usa una composición bacteriana de cierta manera y/o para un fin determinado, independientemente de o en contravención de las instrucciones recibidas de una segunda persona. Ejemplos no limitativos de casos en los que una persona ordena a otra que consuma una composición bacteriana de cierta manera y/o para un fin determinado incluyen cuando un médico prescribe un periodo de conducta y/o tratamiento a un paciente, cuando un padre ordena a un usuario menor (tal como un niño) que consuma una composición bacteriana, cuando un entrenador aconseja a un usuario (tal como un atleta) para seguir un periodo particular de conducta y/o tratamiento, y cuando un fabricante, distribuidor o comercializador recomienda condiciones de uso a un usuario final, por ejemplo, a través de anuncios o etiquetas en los envases u otros materiales proporcionados en asociación con la venta o comercialización de un producto.

[0108] Las composiciones bacterianas ofrecen un efecto protector y/o terapéutico contra la infección por uno o más patógenos del GI de interés (por ejemplo, Clostridium difficile) y, por lo tanto, pueden administrarse después de que se haya resuelto un caso agudo de infección para prevenir la recaída, durante un caso agudo de infección como complemento de la terapia con antibióticos si la composición bacteriana no es sensible a los mismos antibióticos que el patógeno del GI, o para prevenir la infección o reducir la transmisión de los portadores de la enfermedad.

[0109] Las presentes composiciones bacterianas pueden ser útiles en una variedad de situaciones clínicas. Por ejemplo, las composiciones bacterianas se pueden administrar como un tratamiento complementario a los antibióticos cuando un paciente sufre una infección aguda, para reducir el riesgo de recurrencia después de que una infección aguda haya remitido, o cuando un paciente estará muy cerca de otros con o en riesgo de infecciones gastrointestinales graves (médicos, enfermeras, trabajadores de hospitales, familiares de enfermos u hospitalizados).

[0110] Las presentes composiciones bacterianas pueden administrarse a animales, incluidos seres humanos, animales de laboratorio (por ejemplo, primates, ratas, ratones), ganado (por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, cerdos, pavos, pollos) y animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos, roedores).

[0111] La composición bacteriana se puede administrar por vía entérica, en otras palabras, por una vía de acceso al tracto gastrointestinal. Esto incluye la administración oral, la administración rectal (incluyendo enema, supositorio o colonoscopia), mediante una sonda oral o nasal (nasogástrica, nasoyeyunal, gástrica oral u yeyunal oral), tal como se detalla más detalladamente en este documento.

Protocolos de pretratamiento

[0112] Antes de la administración de la composición bacteriana, el paciente puede tener opcionalmente un protocolo de pretratamiento para preparar el tracto gastrointestinal para recibir la composición bacteriana. En ciertas realizaciones, se recomienda el protocolo de pretratamiento, tal como cuando un paciente tiene una infección aguda con un patógeno altamente resistente. En otras realizaciones, el protocolo de pretratamiento es completamente opcional, tal como cuando el patógeno que causa la infección no es resistente, o el paciente ha tenido una infección aguda que ha sido tratada con éxito pero cuando al médico le preocupa que la infección pueda reaparecer. En estos casos, el protocolo de pretratamiento puede mejorar la capacidad de la composición bacteriana para afectar el microbioma del paciente.

[0113] Como una forma de preparar al paciente para la administración del ecosistema microbiano, se puede administrar al menos un antibiótico para alterar las bacterias en el paciente. Como otra forma de preparar al paciente para la administración del ecosistema microbiano, se puede administrar al paciente una preparación para la limpieza de colon estándar para vaciar sustancialmente el contenido del colon, tal como se usa para preparar a un paciente para una colonoscopia. Por "vaciar sustancialmente el contenido del colon", esta solicitud significa eliminar al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o aproximadamente el 100 % del contenido del volumen ordinario de contenido del colon. El tratamiento con antibióticos puede preceder al protocolo para la limpieza de colon.

[0114] Si un paciente ha recibido un antibiótico para el tratamiento de una infección, o si un paciente ha recibido un antibiótico como parte de un protocolo de pretratamiento específico, en una realización, el antibiótico debe suspenderse con tiempo suficiente para permitir que el antibiótico se reduzca sustancialmente en concentración en el intestino antes de que se administre la composición bacteriana. En una realización, el antibiótico se puede suspender 1, 2 o 3 días antes de la administración de la composición bacteriana. En una realización, el antibiótico se puede suspender 3, 4, 5, 6 o 7 semividas del antibiótico antes de la administración de la composición bacteriana. En otra realización, el antibiótico se puede elegir de modo que los constituyentes de la composición bacteriana tengan una MIC₅₀que sea mayor que la concentración del antibiótico en el intestino.

[0115] La MIC₅₀de una composición bacteriana o de los elementos de la composición puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Reller et al., Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices, Clinical Infectious Diseases 49(11):1749-1755 (2009).). En dicha realización, el tiempo adicional entre la administración del antibiótico y la administración de la composición bacteriana no es necesario. Si el protocolo de pretratamiento es parte del tratamiento de una infección aguda, el antibiótico puede elegirse de modo que la infección sea sensible al antibiótico, pero que los constituyentes de la composición bacteriana no sean sensibles al antibiótico.

Rutas de administracion

[0116] Las composiciones bacterianas de la divulgación son adecuadas para la administración a mamíferos y animales no mamíferos que las necesiten. En ciertas realizaciones, el sujeto mamífero es un sujeto humano que tiene uno o más síntomas de disbiosis.

[0117] Cuando el sujeto mamífero padece una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por una microbiota aberrante, las composiciones bacterianas descritas en el presente documento son adecuadas para su tratamiento. En algunas realizaciones, el sujeto mamífero no ha recibido antibióticos antes del tratamiento con las composiciones bacterianas. Por ejemplo, al sujeto mamífero no se le han administrado al menos dos dosis de vancomicina, metronidazol y/o un compuesto antibiótico similar dentro de la semana anterior a la administración de la composición terapéutica. En otras realizaciones, el sujeto mamífero no ha recibido previamente un compuesto antibiótico en el mes anterior a la administración de la composición terapéutica. En otras realizaciones, el sujeto mamífero ha recibido uno o más tratamientos con uno o más compuestos antibióticos diferentes y dicho tratamiento o tratamientos no dieron lugar a mejora o empeoramiento de los síntomas.

[0118] En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal es diarrea causada por C. difficile que incluye infección recurrente por C. difficile, colitis ulcerosa, colitis, enfermedad de Crohn o enfermedad del intestino irritable. De manera beneficiosa, la composición terapéutica se administra solo una vez antes de la mejora de la enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, la composición terapéutica se administra a intervalos superiores a dos días, tales como una vez cada tres, cuatro, cinco o seis días, o cada semana o con menos frecuencia que cada semana. O la preparación puede administrarse de forma intermitente según una pauta establecida, por ejemplo, una vez al día, una vez a la semana o una vez al mes, o cuando el sujeto recae de la enfermedad primaria. En otra realización,, la preparación se puede administrar a largo plazo a personas que están en riesgo de infección o que pueden ser portadoras de estos patógenos, incluidas las personas que se someterán a un procedimiento médico invasivo (tal como una cirugía), que estarán hospitalizadas, que viven en un centro de atención o rehabilitación a largo plazo, que están expuestas a patógenos debido a su profesión (trabajadores en el procesamiento de ganado y animales), o que podrían ser portadoras de patógenos (incluyendo trabajadores del hospital, tales como médicos, enfermeras y otros profesionales de la salud).

[0119] En realizaciones, la composición bacteriana se administra por vía entérica. Esto incluye preferentemente la administración oral, o por sonda oral o nasal (incluyendo nasogástrica, nasoyeyunal, gástrica oral u yeyunal oral). En otras realizaciones, la administración incluye la administración rectal (incluyendo enema, supositorio o colonoscopia). La composición bacteriana se puede administrar en al menos una región del tracto gastrointestinal, que incluye la boca, el esófago, el estómago, el intestino delgado, el intestino grueso y el recto. En algunas realizaciones se administra a todas las regiones del tracto gastrointestinal. Las composiciones bacterianas pueden administrarse por vía oral en forma de medicamentos tales como polvos, cápsulas, comprimidos, geles o líquidos. Las composiciones bacterianas también pueden administrarse en forma de gel o líquido por vía oral o a través de un tubo nasogástrico, o por vía rectal en forma de gel o líquido, mediante un enema o instilación a través de un colonoscopio o mediante un supositorio.

[0120] Si la composición se administra por colonoscopia y, opcionalmente, si la composición bacteriana se administra por otras vías rectales (tales como un enema o supositorio) o incluso si el sujeto tiene una administración oral, el sujeto puede tener una preparación para la limpieza de colon. La preparación para la limpieza del colon puede facilitar el uso adecuado del colonoscopio u otros dispositivos de administración, pero incluso cuando no tiene un propósito mecánico, también puede maximizar la proporción de la composición bacteriana en relación con los otros organismos que residían previamente en el tracto gastrointestinal del sujeto. Puede usarse cualquier preparación para la limpieza de colon normalmente aceptable, tal como las que se proporcionan normalmente cuando un sujeto se somete a una colonoscopia.

Dosis y pauta de administración

[0121] En algunas realizaciones, las bacterias y las composiciones bacterianas se proporcionan en una forma de dosificación. En algunas realizaciones, la forma de dosificación está diseñada para la administración de al menos una OTU o combinación de las mismas descritas en el presente documento, donde la cantidad total de composición bacteriana administrada se selecciona entre de 0,1 ng a 10 g, de 10 ng a 1 g, de 100 ng a 0,1 g, de 0,1 mg a 500 mg, de 1 mg a 100 mg, o de 10 a 15 mg. En algunas realizaciones, la composición bacteriana se consume a razón de 0,1 ng a 10 g al día, 10 ng a 1 g al día, 100 ng a 0,1 g al día, 0,1 mg a 500 mg al día, 1 mg a 100 mg al día o de 10 a 15 mg un día, o más.

[0122] En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de al menos 1 día, al menos 2 días, al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses o al menos 1 año. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1 día a 1 semana, de 1 semana a 4 semanas, de 1 mes a 3 meses, de 3 meses a 6 meses, de 6 meses a 1 año o durante más de un año.

[0123] En una realización, se pueden administrar al paciente entre 105 y 1012 microorganismos en total en una forma de dosificación determinada. En un modo, se puede proporcionar una cantidad efectiva de 1 a 500 ml o de 1 a 500 gramos de la composición bacteriana que tiene de 107 a 1011 bacterias por ml o por gramo, o una cápsula, comprimido o supositorio que tiene de 1 mg a 1000 mg de polvo liofilizado que tiene de 107 a 1011 bacterias. Quienes reciben un tratamiento agudo pueden recibir dosis más altas que quienes reciben una administración crónica (tal como los trabajadores de hospitales o los ingresados en centros de atención a largo plazo).

[0124] Cualquiera de las preparaciones descritas en este documento se puede administrar una vez en una sola ocasión o en múltiples ocasiones, tal como una vez al día durante varios días o más de una vez al día el día de la administración (incluidas dos veces al día, tres veces al día o hasta cinco veces al día). O la preparación puede administrarse de forma intermitente según una pauta establecida, por ejemplo, una vez a la semana, una vez al mes, o cuando el paciente recae de la enfermedad primaria. En otra realización, la preparación se puede administrar a largo plazo a personas que están en riesgo de infección o que pueden ser portadoras de estos patógenos, incluidas las personas que se someterán a un procedimiento médico invasivo (tal como una cirugía), que estarán hospitalizadas, que viven en un centro de atención o rehabilitación a largo plazo, que están expuestas a patógenos debido a su profesión (trabajadores en el procesamiento de ganado y animales), o que podrían ser portadoras de patógenos (incluyendo trabajadores del hospital, tales como médicos, enfermeras y otros profesionales de la salud).

Selección de pacientes

[0125] Se pueden seleccionar composiciones bacterianas particulares para pacientes individuales o para pacientes con perfiles particulares. Por ejemplo, la secuenciación de 16S se puede realizar para un paciente determinado para identificar las bacterias presentes en su microbiota. La secuenciación puede perfilar todo el microbioma del paciente usando la secuenciación de 16S (a nivel de familia, género o especie), una porción del microbioma del paciente usando secuenciación de 16S, o puede usarse para detectar la presencia o ausencia de bacterias candidatas específicas que son biomarcadores para la salud o un estado patológico particular, tales como marcadores de organismos resistentes a múltiples fármacos o géneros específicos de preocupación, tales como Escherichia. En base a los datos de biomarcadores, se puede seleccionar una composición particular para la administración a un paciente para suplementar o complementar la microbiota de un paciente con el fin de restaurar la salud o tratar o prevenir una enfermedad. En otra realización, los pacientes pueden cribarse para determinar la composición de su microbiota para determinar la probabilidad de un tratamiento exitoso.

Terapia de combinación

[0126] Las composiciones bacterianas pueden administrarse con otros agentes en un modo de terapia de combinación, incluidos agentes antimicrobianos y prebióticos. La administración puede ser secuencial, durante un período de horas o días, o simultánea.

[0127] En una realización, las composiciones bacterianas se incluyen en terapia de combinación con uno o más agentes antimicrobianos, que incluyen agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales y agentes antiparasitarios.

[0128] Los agentes antibacterianos incluyen antibióticos de cefalosporina (cefalexina, cefuroxima, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil y ceftobiprol); antibióticos de fluoroquinolona (cipro, levaquin, floxin, tequin, avelox y norflox); antibióticos de tetraciclina (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos de penicilina (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina); y antibióticos carbapenem (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem).

[0129] Los agentes antivirales incluyen abacavir, aciclovir, adefovir, amprenavir, atazanavir, cidofovir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, efavirenz, elvitegravir, emtricitabina, enfuvirtida, etravirina, famciclovir, foscarnet, fomivirsen, ganciclovir, indinavir, idoxuridina, Lamivudina, Lopinavir Maraviroc, MK-2048, Nelfinavir, Nevirapina, Penciclovir, Raltegravir, Rilpivirina, Ritonavir, Saquinavir, Estavudina, Tenofovir Trifluridina, Valaciclovir, Valganciclovir, Vidarabina, Ibacitabina, Amantadina, Oseltamivir, Rimantidina, Tipranavir, Zalcitabina, Zanamivir y Zidovudina.

[0130] Los ejemplos de compuestos antifúngicos incluyen, pero sin limitación, antifúngicos de polieno, tales como natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candicina y hamicina; antifúngicos de imidazol, tales como miconazol, ketoconazol, clotrimazol, econazol, omoconazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol y tioconazol; antifúngicos de triazol, tales como fluconazol, itraconazol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, terconazol y albaconazol; antifúngicos de tiazol, tales como abafungina; antifúngicos de alilamina, tales como terbinafina, naftifina y butenafina; y antifúngicos de equinocandina, tales como anidulafungina, caspofungina y micafungina. Otros compuestos que tienen propiedades antifúngicas incluyen, pero sin limitación, poligodio, ácido benzoico, ciclopirox, tolnaftato, ácido undecilénico, flucitosina o 5-fluorocitosina, griseofulvina y haloprogina.

[0131] En una realización, las composiciones bacterianas se incluyen en terapia de combinación con uno o más corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatiopurina, prednisona, metotrexato, antihistamínicos, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromolín sódico, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestionantes anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos monoclonales anti-IgE, vacunas y combinaciones de los mismos.

[0132] Un prebiótico es un ingrediente fermentado selectivamente que permite cambios específicos, en la composición y/o la actividad en la microbiota gastrointestinal que confiere beneficios sobre el bienestar y la salud del huésped. Los prebióticos pueden incluir carbohidratos complejos, aminoácidos, péptidos u otros componentes nutricionales esenciales para la supervivencia de la composición bacteriana. Los prebióticos incluyen, pero sin limitación, aminoácidos, biotina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, inulina, lactulosa, mananooligosacáridos, inulina enriquecida con oligofructosa, oligofructosa, oligodextrosa, tagatosa, transgalactooligosacáridos y xilooligosacáridos.

Procedimientos para la Caracterización de Composiciones Bacterianas

[0133] Los procedimientos para probar ciertas características de las composiciones bacterianas se describen en este documento. Por ejemplo, se puede determinar la sensibilidad de las composiciones bacterianas a ciertas variables ambientales, por ejemplo, para seleccionar características deseables particulares en una composición, formulación y/o uso determinados. Por ejemplo, los constituyentes de la composición bacteriana pueden analizarse para determinar la resistencia al pH, la resistencia a los ácidos biliares y/o la sensibilidad a los antibióticos, ya sea individualmente constituyente por constituyente o colectivamente como una composición bacteriana formada por múltiples constituyentes bacterianos (denominados colectivamente en este apartado como composición bacteriana).

[0134] Pruebas de sensibilidad al pH. Si una composición bacteriana se administrará a un lugar diferente al colon o al recto (es decir, a través de, por ejemplo, pero sin limitarse a, una vía oral), la prueba opcional de resistencia al pH mejora la selección de composiciones bacterianas que sobrevivirán con el mayor rendimiento posible a través de los entornos de pH variable de las distintas regiones del tracto GI. Comprender cómo reaccionan las composiciones bacterianas al pH del tracto GI también ayuda en la formulación, de modo que la cantidad de bacterias en una forma de dosificación pueda aumentarse si es beneficiosa y/o para que la composición pueda administrarse en una cápsula con recubrimiento entérico o comprimido o con una composición amortiguadora o protectora. Como el pH del estómago puede caer a un pH de 1 a 2 después de una comida alta en proteínas durante un corto tiempo antes de que los mecanismos fisiológicos lo ajusten a un pH de 3 a 4 y a menudo reside en un pH de reposo de 4 a 5, y como el pH del intestino delgado puede oscilar entre un pH de 6 y 7,4, se pueden preparar composiciones bacterianas que sobrevivan a estos intervalos de pH variables (específicamente en las que al menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % , 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o hasta el 100 % de las bacterias pueden sobrevivir tiempos de tránsito intestinal a través de varios intervalos de pH). Esto puede probarse exponiendo la composición bacteriana a intervalos de pH variables para los tiempos de tránsito intestinal esperados a lo largo de esos intervalos de pH. Por lo tanto, solo como un ejemplo no limitativo, los cultivos de 18 horas de composiciones bacterianas se pueden cultivar en medios estándar, tales como el medio de microbiota intestinal ("GMM", véase Goodman et al., Extensive personal human gut microbiota culture collections characterized and manipulated in gnotobiotic mice, PNAS 108(15):6252-6257 (2011)) u otro medio libre de productos animales, con la adición de agentes de ajuste de pH para un pH de 1 a 2 durante 30 minutos, un pH de 3 a 4 durante 1 hora, un pH de 4 a 5 durante 1 a 2 horas y un pH de 6 a 7,4 durante 2,5 a 3 horas. Un método alternativo para probar la estabilidad al ácido se describe en la Patente de EE.UU. No. 4.839.281. La supervivencia de las bacterias puede determinarse cultivando las bacterias y contando las colonias en medios selectivos o no selectivos apropiados.

[0135] Prueba de sensibilidad a los ácidos biliares. Además, las pruebas de resistencia a los ácidos biliares pueden mejorar la selección de composiciones bacterianas que sobrevivirán a la exposición a los ácidos biliares durante el tránsito por el tracto gastrointestinal. Los ácidos biliares se secretan en el intestino delgado y pueden, como el pH, afectar la supervivencia de las composiciones bacterianas. Esto puede analizarse exponiendo las composiciones bacterianas a los ácidos biliares durante el tiempo esperado de exposición del intestino a los ácidos biliares. Por ejemplo, las soluciones de ácidos biliares se pueden preparar a las concentraciones deseadas utilizando Tris 0,05 mM a pH 9 como disolvente. Después de disolver el ácido biliar, el pH de la solución se puede ajustar a 7,2 con HCl al 10 %. Las composiciones bacterianas se pueden cultivar en 2,2 ml de una composición de ácido biliar que imite la concentración y el tipo de ácidos biliares del paciente, 1,0 ml de medio de heces filtradas estériles al 10 % y 0,1 ml de un cultivo de 18 horas de la cepa de bacterias determinada. Las incubaciones pueden llevarse a cabo durante 2,5 a 3 horas o más. Un método alternativo para probar la estabilidad a los ácidos biliares se describe en la Patente de EE.UU. No. 4.839.281. La supervivencia de las bacterias puede determinarse cultivando las bacterias y contando las colonias en medios selectivos o no selectivos apropiados.

[0136] Prueba de sensibilidad a antibióticos. Como prueba de sensibilidad opcional adicional, las composiciones bacterianas pueden probarse para determinar la sensibilidad a los antibióticos. En una realización, las composiciones bacterianas pueden elegirse de modo que los constituyentes bacterianos sean sensibles a los antibióticos de modo que, si es necesario, puedan eliminarse o reducirse sustancialmente del tracto gastrointestinal del paciente mediante al menos un antibiótico que reconozca la composición bacteriana.

[0137] Adherencia a células gastrointestinales. Las composiciones bacterianas pueden probarse opcionalmente en cuanto a la capacidad de adherirse a las células gastrointestinales. En la Patente de EE.UU. N° 4.839.281 se describe un procedimiento para probar la adherencia a las células gastrointestinales.

[0138] La memoria descriptiva se entiende mejor a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la memoria descriptiva. Las realizaciones dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de las realizaciones y no deben interpretarse como una limitación del alcance. El experto en la materia reconocerá fácilmente que se abarcan muchas otras realizaciones. En la medida en que cualquier material de las publicaciones y patentes citadas en este documento contradiga o sea inconsistente con esta memoria descriptiva, la memoria descriptiva prevalecerá sobre dicho material. La cita de cualquier referencia en este documento no es una admisión de que dichas referencias sean estado de la técnica.

[0139] A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc. utilizados en la memoria descriptiva, incluidas las reivindicaciones, deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se buscan obtener. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse a la luz del número de dígitos significativos y enfoques de redondeo habituales.

[0140] A menos que se indique lo contrario, el término "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie.

EJEMPLOS

[0141] A continuación, se muestran ejemplos de casos específicos para llevar a cabo la presente divulgación. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. Los ejemplos de las técnicas y protocolos descritos en este documento con respecto a las composiciones terapéuticas se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. (ed), 1980.

[0142] Ejemplo 1. Construcción de pares binarios en un formato de 96 pocilios de alto rendimiento. Para permitir el cribado de alto rendimiento de pares binarios, se descongelaron viales de bancos de almacenamiento de glicerol a -80 °C y se diluyeron a 1e8 UFC/ml. A continuación, cada cepa se diluyó 10x (hasta una concentración final de 1e7 UFC/ml de cada cepa) en 200 ul de PBS 15 % de glicerol en los pocillos de una placa de 96 pocillos. A continuación, las placas se congelaron a -80 °C. Cuando fue necesario, las placas se retiraron de -80 °C y se descongelaron a temperatura ambiente en condiciones anaeróbicas al realizar pruebas en un CivSim con Clostridium difficile.

[0143] Ejemplo 2. Construcción de combinaciones ternarias en un formato de 96 pocillos de alto rendimiento. Para permitir un cribado de alto rendimiento de combinaciones ternarias, los viales de bancos de reserva de glicerol a -80 °C se descongelaron y diluyeron a 1e8 UFC/ml. A continuación, cada cepa se diluyó 10x (hasta una concentración final de 1e7 UFC/ml de cada cepa) en 200 ul de PBS 15 % de glicerol en los pocillos de una placa de 96 pocillos. A continuación, las placas se congelaron a -80 °C. Cuando fue necesario para el ensayo, las placas se retiraron de -80 °C y se descongelaron a temperatura ambiente en condiciones anaerobias al realizar la prueba en un CivSim con Clostridium difficile.

[0144] Ejemplo 3. Construcción de un ensayo CivSim para detectar composiciones inhibidoras Ecobiotic™ del crecimiento de Clostridium difficile. Se desarrolló un cultivo durante la noche de Clostridium difficile en condiciones anaerobias en SweetB-FosIn u otro medio adecuado para el crecimiento de C. difficile. SweetB-FosIn es un medio complejo compuesto por infusión de cerebro y corazón, extracto de levadura, cisteína, celobiosa, maltosa, almidón soluble y fructooligosacáridos/inulina y hemina, y está tamponado con MOP. Después de 24 horas de crecimiento, el cultivo se diluyó 100.000 veces en un medio complejo, tal como SweetB-FosIn, que es adecuado para el crecimiento de una amplia variedad de especies de bacterias anaerobias. A continuación, la mezcla diluida de C. difficile se alicuotó en pocillos de una placa de 96 pocillos (180 ul para cada pocillo). A continuación, se añadieron a cada pocillo 20 ul de un par binario único de especies inhibidoras potenciales a una concentración final de 1e6 UFC/ml de cada especie. Como alternativa, el ensayo se puede probar con pares binarios a diferentes concentraciones iniciales (1e9 UFC/ml, 1e8 UFC/ml, 1e7 UFC/ml, 1e5 UFC/ml, 1e4 UFC/ml, 1e3 UFC/ml, 1e2 UFC/ml). Se incluyeron pocilos de control inoculados únicamente con C. difficile para una comparación con el crecimiento de C. difficile sin inhibición. Se usaron pocillos adicionales para controles que inhiben o no inhiben el crecimiento de C. difficile. Un ejemplo de un control positivo que inhibe el crecimiento fue una combinación de Blautia producta, Clostridium bifermentans y Escherichia coli. Un ejemplo de un control que muestra una inhibición reducida del crecimiento de C. difficile fue una combinación de Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides ovatus y Bacteroides vulgatus. Las placas se envolvieron con parafilm y se incubaron durante 24 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Después de 24 horas, los pocillos que contenían C. difficile solo se diluyeron en serie y se colocaron en placas para determinar el título. A continuación, la placa de 96 pocillos se congeló a -80 °C antes de cuantificar C. difficile mediante un ensayo qPCR.

[0145] Ejemplo 4. Construcción de un ensayo CivSim para cribar composiciones bacterianas que producen productos difusibles que inhiben el crecimiento de Clostridium difficile usando un inserto de filtro. El ensayo CivSim descrito anteriormente se modificó utilizando un inserto de filtro de 0,22 uM (Placas de ensayo de 96 pocillos Millipore™ MultiScreen™- Artículo MAGVS2210) en formato de 96 pocillos para separar físicamente C. difficile de las composiciones bacterianas. La C. difficile se dividió en alícuotas en la placa de 96 pocillos, mientras que las composiciones bacterianas se dividieron en alícuotas en medios sobre la capa de filtro. Los medios nutrientes están en contacto a ambos lados del filtro de 0,22 uM, lo que permite el intercambio de nutrientes, moléculas pequeñas y muchas macromoléculas (por ejemplo, bacteriocinas, proteínas de la superficie celular o polisacáridos) por difusión. En esta realización, después de 24 horas de incubación, se extrajo el inserto de filtro que contenía las composiciones bacterianas. A continuación, la placa que contenía C. difficile se transfirió a un lector de placas de 96 pocillos adecuado para medir la densidad óptica (DO) a 600 nm. Se comparó el crecimiento de C. difficile en presencia de diferentes composiciones bacterianas en base a la medición de la DO.

[0146] Ejemplo 5. Construcción de un ensayo CivSim para cribar composiciones bacterianas inhibidoras del crecimiento de Clostridium difficile utilizando medios selectivos de Clostridium difficile para la cuantificación. El ensayo CivSim descrito anteriormente se puede modificar para determinar el título final de C. difficile diluyendo en serie y sembrando en placas con medios selectivos de C. difficile (Bloedt et al 2009) tales como CCFA (agar de cicloserina cefoxitina fructosa, Anaerobe Systems), CDSA (agar selectivo de Clostridium difficile, que es agar de cicloserina cefoxitina manitol, Becton Dickinson).

Ejemplo 6. Cuantificación de C. d iffic ile mediante PCR cuantitativa (qPCR)

A. Preparación de la curva estándar

[0147] La curva estándar se generó a partir de un pocillo en cada placa de ensayo que contenía solo C. difficile patógena cultivada en medio SweetB Fosln como se proporciona en el presente documento y se cuantificó mediante placas de puntos selectivos. Se realizaron diluciones en serie del cultivo en solución salina tamponada con fosfato estéril. El ADN genómico se extrajo de las muestras de la curva estándar junto con los demás pocillos.

B. Extracción de ADN genómico

[0148] El ADN genómico se extrajo de 5 |jl de cada muestra utilizando un protocolo de dilución, congelación/descongelación y lisis por calor. Se agregaron 5 j l de muestras descongeladas a 45 j l de agua UltraPure (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se mezclaron mediante pipeteo. Las placas con muestras diluidas se congelaron a -20 °C hasta su uso para qPCR, que incluye una etapa de lisis calentada antes de la amplificación. Alternativamente, el ADN genómico podría aislarse utilizando el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil ® -htp 96 Well Soil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil ® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) o el mini kit de QlAamp DNA Stool (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

C. Composición y condiciones de qPCR

[0149] La mezcla de reacción de qPCR contenía 1x SsoAdvanced Universal Probes Supermix, 900 nM de cebador Wr-tcdB-F (AGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTG, IDT, Coralville, IA), 900 nM de cebador Wr-tcdB-R (CATGCTTTTTTAGTTTCTGGATTGAA, IDT, Coralville, IA), 250 nM de la sonda Wr-tcdB-P (6FAM-CATCCAGTCTCAATTGTATATGTTTCTCCA-MGB, Life Technologies, Grand Island, NY) y agua de calidad para biología molecular (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) hasta 18 j l (cebadores adaptados de: Wroblewski, D. et al., Rapid Molecular Characterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficile in Stool Specimens, Journal of Clinical Microbiology 47: 2142-2148 (2009)). Esta mezcla de reacción se dividió en alícuotas en pocillos de una placa de PCR con faldón de 96 pocillos de pared fina, perfil bajo y cubierta dura (BioRad, Hercules, CA). A esta mezcla de reacción, se añadieron 2 j l de agua diluida, congelada, y muestras descongeladas y la placa se selló con un sello adhesivo Microseal 'B' (BioRad, Hercules, CA). La qPCR se realizó en un termociclador BioRad C1000™ equipado con un sistema en tiempo real CFX96™ (BioRad, Hercules, CA). Las condiciones de termociclado fueron 95 °C durante 15 minutos seguidos de 45 ciclos de 95°C durante 5 segundos, 60°C durante 30 segundos y lecturas fluorescentes del canal FAM. Como alternativa, la qPCR podría realizarse con otros métodos estándar conocidos por los expertos en la materia.

D. Análisis de datos

[0150] El valor de Cq para cada pocillo en el canal FAM fue determinado por el software CFX Manager™ 3.0. El log-10 (ufc/ml) de C. difficile de cada muestra experimental se calculó ingresando el valor Cq de una muestra determinada en un modelo de regresión lineal generado a partir de la curva estándar que compara los valores Cq de los pocillos de la curva estándar con el log-10 (ufc/ml) conocido de estas muestras. El log de inhibición se calculó para cada muestra restando el log-10 (ufc/ml) de C. difficile en la muestra del log-i0(ufc/ml) de C. difficile en la muestra en cada placa de ensayo utilizada para la generación de la curva estándar que no tiene bacterias adicionales añadidas. Se calculó la inhibición logarítmica media para todas las réplicas para cada composición.

[0151] Se trazó un histograma del intervalo y la desviación estándar de cada composición. Los intervalos o las desviaciones estándar de las inhibiciones logarítmicas que eran distintas de la distribución global se examinaron como posibles valores atípicos. Si la eliminación de un solo dato de inhibición logarítmica de uno de los pares binarios que se identificaron en los histogramas alineaba el intervalo o la desviación estándar con los de la mayoría de las muestras, ese dato se eliminaba como un valor atípico y la media de la inhibición logarítmica se volvía a calcular.

[0152] La varianza agrupada de todas las muestras evaluadas en el ensayo se estimó como el promedio de las varianzas de la muestra ponderadas por los grados de libertad de la muestra. A continuación, se calculó el error estándar combinado como la raíz cuadrada de la varianza combinada dividida por la raíz cuadrada del número de muestras. Los intervalos de confianza para la hipótesis nula se determinaron multiplicando el error estándar agrupado por la puntuación z correspondiente a un umbral de porcentaje determinado. Las inhibiciones logarítmicas medias fuera del intervalo de confianza se consideraron inhibitorias si eran positivas o estimuladoras si eran negativas con el porcentaje de confianza correspondiente al intervalo utilizado. Las muestras con una inhibición logarítmica media superior al intervalo de confianza (IC) del 99 % de la hipótesis nula se notifican como +++, aquellas con un IC del 95 % < IC <99 % como ++, aquellas con un IC del 90 % < IC < 95 % como +, aquellas con un IC del 80 % < IC < 90 % como , mientras que las muestras con una inhibición logarítmica media menor al intervalo de confianza (IC) del 99 % de la hipótesis nula se notifican como — , aquellas con un IC del 95 % < IC < 99 % como —, aquellas con un IC del 90 % < IC < 95 % como --, aquellas con un IC del 80 % < IC < 90 % como -.

[0153] Muchos pares binarios inhiben C. difficile Tabla 5. 622 de 989 combinaciones muestran inhibición con un intervalo de confianza > 80 %; 545 de 989 con IC > 90 %; 507 de 989 con IC > 95 %; 430 de 989 con un IC > 99 %. Los pares binarios no limitativos pero de ejemplo incluyen aquellos con una reducción logarítmica media superior a 0,366, por ejemplo, Allistipes shahii emparejado con Blautia producta, Clostridium hathaweyi o Colinsella aerofaciens, o Clostidium mayombei emparejado con C. innocuum, C. tertium, Colinsella aerofaciens o cualquiera de las otras 424 combinaciones que se muestran en la Tabla 5. Igualmente importante, el ensayo CivSim describe pares binarios que no inhiben de manera efectiva a C. difficile. 188 de 989 combinaciones promueven el crecimiento con > 80 % de confianza; 52 de 989 muestran una falta de inhibición con >90 % de confianza; 22 de 989 muestran una falta de inhibición con >95 % de confianza; 3 de 989, incluyendo B. producta combinado con Coprococcus catus, Alistipes shahii combinado con Dorea formicigenerans y Eubacterium rectale combinado con Roseburia intestinalis, muestran una falta de inhibición con >99 % de confianza. 249 de 989 combinaciones son neutrales en el ensayo, lo que significa que ni promueven ni inhiben el crecimiento de C. diffiále hasta el límite de medición.

[0154] Las combinaciones ternarias con una inhibición logarítmica media superior a 0,312 se notifican como +++ (intervalo de confianza (IC) > 99 % de la hipótesis nula), aquellas con una inhibición logarítmica media entre 0,221 y 0,312 como ++ (95 % < iC < 99 %), aquellas con inhibición logarítmica media entre 0,171 y 0,221 como + (90 % < IC < 95 %), aquellas con inhibición logarítmica media entre 0,113 y 0,171 como (80 % < IC <90 %), aquellas con inhibición logarítmica media entre -0,113 y -0,171 como -(80 % < IC <90 %), aquellas con inhibición logarítmica media entre -0,171 y -0,221 como --(90 % < IC <95 %), aquellas con inhibición logarítmica media entre -0,221 y -0,312 como — (95 % < IC <99 %), y aquellas con una inhibición logarítmica media inferior a -0,312 como — (99 % <IC).

[0155] El CivSim muestra que muchas combinaciones ternarias inhiben C. diffiále. 39 de 56 combinaciones muestran inhibición con un intervalo de confianza > 80 %; 36 de 56 con IC > 90 %; 36 de 56 con IC > 95 %; 29 de 56 con un IC > 99 %. Las combinaciones ternarias no limitativas pero de ejemplo incluyen aquellas con una reducción logarítmica media superior a 0,171, por ejemplo, cualquier combinación mostrada en la Tabla 6 con una puntuación de +++, tal como Colinsella aerofaciens, Coprococcus comes y Blautia producta. Igualmente importante, el ensayo CivSim describe combinaciones ternarias que no inhiben de manera efectiva a C. diffiále. 5 de 56 combinaciones promueven el crecimiento con > 80 % de confianza; 2 de 56 promueven el crecimiento con > 90 % de confianza; 1 de 56, Coprococcus comes, Clostridium symbiosum y Eubacterium rectale, promueven el crecimiento con > 95 % de confianza. 12 de 56 combinaciones son neutrales en el ensayo, lo que significa que ni promueven ni inhiben el crecimiento de C. diffiále hasta el límite de medición.

Ejemplo P1. Secuenciación de 16S completa para determinar la unidad taxonómica operativa (OTU)

A. Extracción de ADN genómico

[0156] El ADN genómico se extrae de cultivos microbianos puros utilizando un método de lisis alcalina en caliente. Se añaden 2 μl de cultivo microbiano a 18 μl de tampón de lisis (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) y la mezcla se incuba a 95 °C durante 30 minutos. Posteriormente, las muestras se enfrían hasta 4 °C y se neutralizan mediante la adición de 20 μl de tampón de neutralización (Tris-HCl 40 mM) y a continuación se diluyen 10 veces en tampón de elución (Tris-HCl 10 mM). Alternativamente, el ADN genómico se extrae de cultivos microbianos puros usando kits comercialmente disponibles tales como el kit de aislamiento de ADN microbiano Mo Bio Ultraclean® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) o mediante métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

B. PCR

[0157] Para amplificar el ADNr 16S bacteriano, se añaden 2 μl de ADNg extraído a una reacción de PCR de volumen final de 20 μl. La reacción de PCR también contiene 1x HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD), 250 nM de cebador 27f (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG, IDT, Coralville, IA) y 250 nM de cebador 1492r (TACGGYTACCTTGTTAYGACTT, IDT, Coralville, IA), con agua de grado de biología molecular (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) para el equilibrio del volumen. Alternativamente, se utilizan otros cebadores bacterianos universales o polimerasas termoestables conocidas por los expertos en la técnica.

[0158] La PCR se realizó en termocicladores disponibles en el mercado, tal como un termociclador BioRad MyCycler™ (BioRad, Hercules, CA). Las reacciones se realizan a 94 °C durante 2 minutos, seguidas de 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 51 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 minuto y 30 segundos, seguidos de una extensión de 7 minutos a 72 °C y un mantenimiento indefinido a 4 °C. Después de la PCR, se utiliza la electroforesis en gel de una parte de los productos de reacción para confirmar la amplificación satisfactoria de un producto de ~1,5 kb.

C. Limpieza de PCR

[0159] Para eliminar nucleótidos y oligonucleótidos de los productos de PCR, se añade 1 μl de HT ExoSap-IT (Affymetrix, Santa Clara, CA) a 2,5 μl de producto de PCR seguido de una incubación de 15 minutos a 37 °C y a continuación una inactivación de 15 minutos a 80°C.

D. Secuenciación de Sanger

[0160] Para cada muestra, se realizan dos reacciones de secuenciación, una usando cada cebador: 27f y 1492r. Se mezclan 40 ng de productos de PCR depurados con ExoSap-IT con 25 pmol de cebador de secuenciación y agua de grado para biología molecular (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) hasta un volumen total de 15 μl. Esta reacción se envía a una organización de secuenciación comercial tal como Genewiz (South Plainfield, NJ) para la secuenciación de Sanger.

Ejemplo P2. Secuenciación V416S para determinar la unidad taxonómica operativa (OTU)

A. Extracción de ADN genómico

[0161] El ADN genómico se extrae de cultivos microbianos puros utilizando un método de lisis alcalina en caliente. Se añaden 2 j l de cultivo microbiano a 18 j l de tampón de lisis (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) y la mezcla se incuba a 95 °C durante 30 minutos. Posteriormente, las muestras se enfrían hasta 4 °C y se neutralizan mediante la adición de 20 j l de tampón de neutralización (Tris-HCl 40 mM) y a continuación se diluyen 10 veces en tampón de elución (Tris-HCl 10 mM). Alternativamente, el ADN genómico se extrae de cultivos microbianos puros usando kits comercialmente disponibles tales como el kit de aislamiento de ADN microbiano Mo Bio Ultraclean® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) o mediante métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica.

B. PCR

[0162] Para amplificar la región V4 del ADNr 16S bacteriano, se añaden 2 j l de ADNg extraído a una reacción de PCR de volumen final de 20 jl. La reacción de PCR también contiene 1x HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD), 200 nM de V4_515f_adapt (AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCC GCGGTAA, IDT, Coralville, IA) y 200 nM de 806rbc con código de barras (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT_12bpGolayBarcode_ AGTCAGTCAGCCGG ACTACHVGGGTWTCTAAT, IDT, Coralville, IA), con agua de grado de biología molecular (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) para el equilibrio del volumen. Estos cebadores incorporan adaptadores para la secuenciación por síntesis de Illumina. Opcionalmente, se pueden realizar reacciones idénticas por duplicado, por triplicado o por cuadruplicado. Alternativamente, se utilizan otros cebadores bacterianos universales o polimerasas termoestables conocidas por los expertos en la técnica.

[0163] La PCR se realizó en termocicladores disponibles en el mercado, tales como un termociclador BioRad MyCycler ™ (BioRad, Hercules, CA). Las reacciones se llevan a cabo a 94 °C durante 3 minutos, seguido de 25 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 50 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto y 30 segundos, seguido de una extensión de 10 minutos a 72 °C y un mantenimiento indefinido a 4°C. Después de la PCR, se utiliza la electroforesis en gel de una parte de los productos de reacción para confirmar la amplificación exitosa de un producto de ~0,4 kb.

C. Limpieza de PCR

[0164] Para eliminar nucleótidos y oligonucleótidos de los productos de PCR, todo el volumen restante de la PCR, o de las PCR múltiples, se limpia utilizando el kit de limpieza de PCR de 96 pocillos Mo Bio Ultraclean® -htp (Mo Bio Laboratories , Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante u otros kits disponibles en el mercado, tales como el kit de purificación de PCR QIAquick 96 (QIAGEN, Valencia, CA).

D. Cuantificación y agrupamiento de ADN

[0165] Los productos de PCR limpios se cuantifican utilizando el kit de ensayo de ADNds Quant-iT™ PicoGreen®(Life Technologies, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la cuantificación, los productos de PCR limpios con código de barras se combinan, de manera que cada producto de PCR distinto tenga una proporción equimolar para crear una biblioteca de Illumina preparada.

E. Secuenciación Illumina

[0166] La biblioteca preparada se secuencia en secuenciadores Illumina HiSeq o MiSeq (Illumina, San Diego, CA) con generación de grupos, hibridación de plantilla, amplificación isotérmica, linealización, bloqueo y desnaturalización e hibridación de los cebadores de secuenciación realizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. instrucciones. 16SV4SeqFw (TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA), 16SV4SeqRev (AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT) y 16SV4lndex (ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT) (IDT, Coralville, IA) se utilizan para la secuenciación. Esta secuenciación puede realizarla opcionalmente una organización de investigación por contrato, tal como Metanome (Houston, TX), Ambry Genetics (Aliso Viejo, CA), Edge Bio (Gaithersburg, MD) o Covance (Princeton, NJ).

J. Asignación taxonómica a datos de lectura de secuencia

[0167] Las secuencias de ácido nucleico se analizan y se realizan las asignaciones taxonómicas y filogenéticas de las OTU específicas utilizando métodos de similitud de secuencia y filogenéticos que son bien conocidos por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, la reconstrucción filogenética de probabilidad máxima (véase, por ejemplo, Liu K, Linder CR, and Warnow T. 2011. RAxML and FastTree: Comparing Two Methods for Large-Scale Maximum Likelihood Phylogeny Estimation. PLoS ONE 6: e27731.McGuire G, Denham MC, and Balding DJ. 2001. Models of sequence evolution for DNA sequences containing gaps. Mol. Biol. Evol 18: 481-490. Wróbel B. 2008. Statistical measures of uncertainty for branches in phylogenetic trees inferred from molecular sequences by using model-based methods. J. Appl. Genet. 49: 49-67.) A partir de estas asignaciones taxonómicas, se definen las OUT en el conjunto de datos. La certeza de la indagación de OTU se define en base a la similitud de la secuencia de la OTU con una secuencia de ácido nucleico de referencia y la proximidad de la secuencia de la OTU con respecto a una o más secuencias de referencia en la filogenia. La especificidad de la asignación taxonómica y filogenética de una OTU determina si la coincidencia se asigna a nivel de Familia, Género, Especie o Cepa, y la confianza de esta asignación se determina en función de la posición de las ramas compatibles con “bootstrap” en el árbol filogenético de referencia relativo a la ubicación de la secuencia de OTU que se está indagando.

Ejemplo P3. Construcción de un ensayo in vitro para cribar combinaciones de m icrobios inhibidores del crecim iento de E. co li patógena

[0168] El ensayo in vitro se usa para cribar combinaciones de bacterias que inhiben el crecimiento de E. coli modificando los medios usados para el crecimiento del inóculo del patógeno. Se utiliza una de varias opciones de medios para el crecimiento del patógeno, tal como Medios Clostridiales Reforzados (RCM), Caldo de Infusión de Cerebro y Corazón (BHI) o Caldo Luria Bertani (LB) (también conocido como Caldo de Lisogenia). La E. coli se cuantifica mediante el uso de medios selectivos alternativos específicos para E. coli o mediante el uso de sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el crecimiento aeróbico en medio de lactosa MacConkey selecciona Gram negativos entéricos, incluida E. coli. La qPCR se realiza utilizando sondas específicas para la toxina shiga de E. coli patógena.

EJEMPLO P4. Construcción de un ensayo in vitro para cribar combinaciones de m icrobios inhibidores del crecim iento de enterococos resistentes a la vancomicina (VRE)

[0169] El ensayo in vitro se usa para cribar combinaciones de bacterias inhibidoras del crecimiento de Enterococcus spp. resistente a la vancomicina (VRE) modificando los medios utilizados para el crecimiento del inóculo del patógeno. Se utilizan varias opciones de medios para el crecimiento del patógeno, tales como Medios Clostridiales Reforzados (RCM), Caldo de Infusión de Cerebro y Corazón (BHI) o Caldo Luria Bertani (LB). El VRE se cuantifica mediante el uso de medios selectivos alternativos específicos para VRE o mediante el uso de sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el agar m-Enterococcus que contiene azida de sodio es selectivo para Enterococcus spp. y un pequeño número de otras especies. En la qPCR se utilizan sondas específicas de los genes van que confieren resistencia a la vancomicina.

EJEMPLO P5. Prueba de composición bacteriana contra Salmonella

[0170] El ensayo in vitro se usa para cribar combinaciones de bacterias que inhiben el crecimiento de Salmonella spp. modificando los medios utilizados para el crecimiento del inóculo del patógeno. Se utilizan varias opciones de medios para el crecimiento del patógeno, tales como Medios Clostridiales Reforzados (RCM), Caldo de Infusión de Cerebro y Corazón (BHI) o Caldo Luria Bertani (LB). Salmonella spp. se cuantifican utilizando medios selectivos alternativos específicos para Salmonella spp. o utilizando sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el agar MacConkey se usa para seleccionar Salmonella spp. y el gen invA se dirige con sondas de qPCR; este gen codifica una proteína de invasión portada por muchas Salmonella spp patógenas y se utiliza en células eucariotas invasoras.

EJEMPLO P6. Procedimiento de preparación de la composición bacteriana para administración a un sujeto

[0171] Dos cepas para la composición bacteriana se cultivan de forma independiente y se mezclan juntas antes de la administración. Ambas cepas se cultivan de forma independiente a 37 °C, pH 7, en un medio GMM u otro medio libre de productos animales, prerreducidas con 1 g/L de cisteína^HCl. Una vez que cada cepa alcanza una biomasa suficiente, se conserva para almacenarla mediante la adición de glicerol al 15 % y a continuación se congela a -80 °C en criotubos de 1 ml.

[0172] A continuación, cada cepa se cultiva hasta una concentración de 1010 UFC/ml, a continuación se concentra 20 veces mediante microfiltración de flujo tangencial; el medio gastado se intercambia mediante diafiltración con un medio conservante que consiste en gelatina al 2 %, trehalosa 100 mM y tampón de fosfato sódico 10 mM, u otro medio conservante adecuado. La suspensión se liofiliza hasta obtener un polvo y se titula.

[0173] Después del secado, el polvo se mezcla con celulosa microcristalina y estearato de magnesio y se formula en una cápsula de gelatina de 250 mg que contiene 10 mg de polvo liofilizado (108 a 1011 bacterias), 160 mg de celulosa microcristalina, 77,5 mg de gelatina y 2,5 mg de estearato de magnesio.

EJEMPLO P7. Procedimiento de tratamiento de un sujeto con una composición bacteriana

[0174] Un paciente ha sufrido episodios recurrentes de C. difficile. En la fase aguda más reciente de la enfermedad, se trata al paciente con un antibiótico suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad. Con el fin de prevenir otra recaída de C. difficile, se administra al paciente una de las presentes composiciones bacterianas. En concreto, al paciente se le administra Bacillus circulans y Roseburia inulinivorans a una dosis de 108 bacterias totales en forma liofilizada, específicamente en una cápsula de gelatina de 250 mg que contiene 10 mg de bacterias liofilizadas, 160 mg de celulosa microcristalina, 77,5 mg de gelatina y 2,5 mg de estearato de magnesio. El paciente toma la cápsula por vía oral y reanuda una dieta normal después de 4, 8, 12 o 24 horas. En otra realización, el paciente puede tomar la cápsula por vía oral antes, durante o inmediatamente después de una comida.

[0175] Las heces se recogen antes y 1 día, 3 días, 1 semana y 1 mes después de la administración. La presencia de C. difficile se encuentra en las heces antes de la administración de la composición bacteriana, pero las recogidas de heces después de la administración muestran una reducción (tal como al menos un 50 % menos, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 % o un 95 %) hasta niveles no detectables de C. difficile, medidos por qPCR, tal como se describió anteriormente. También se pueden utilizar ELISA para proteínas de toxina o técnicas tradicionales de identificación microbiológica.

[0176] Como otra medida del éxito del paciente, una respuesta positiva puede definirse como la ausencia de diarrea, que a su vez se define como 3 o más deposiciones blandas o acuosas por día durante al menos 2 días consecutivos u 8 o más deposiciones blandas o acuosas en 48 horas, o diarrea persistente (debido a otras causas) con pruebas de heces negativas repetidas (tres veces) para toxinas de C. difficile.

[0177] El fracaso del tratamiento se define como diarrea persistente con una prueba de heces de toxina C. difficile positiva o sin reducción en los niveles de C. difficile, medido por secuenciación qPCR. También se pueden utilizar ELISA o técnicas tradicionales de identificación microbiológica.

EJEMPLO P8. Procedimiento de tratamiento de un sujeto con una composición bacteriana

[0178] Un paciente ha sufrido episodios recurrentes de C. difficile. En la fase aguda más reciente de la enfermedad, se trata al paciente con un antibiótico suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad. Con el fin de prevenir otra recaída de C. difficile, se administra al paciente una de las presentes composiciones bacterianas. En concreto, se administra al paciente una composición bacteriana que contiene dos tipos bacterianos de la Tabla 1 o la Tabla 3, o una combinación de la Tabla 2, a una dosis de 108 de bacterias totales en forma liofilizada formulada en una cápsula con cubierta entérica. Se espera que el ejemplo del paciente o las muestras derivadas del paciente demuestren al menos una medida de éxito tal como se describe en este documento (reducción de los niveles de C. difficile medidos por qPCR, ELISA o identificación microbiológica tradicional; ausencia de diarrea; diarrea persistente con repetición (tres veces) de pruebas de heces negativas para toxinas de C. difficile.

[0179] Otras realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de los casos y realizaciones descritas en el mismo. Se deben considerar la memoria descriptiva y los ejemplos solo como ejemplos, con un alcance y un espíritu reales indicados por las reivindicaciones adjuntas.

TABLA 1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende al menos una primera especie de bacteria aislada capaz de formar una espora y una segunda especie de bacteria aislada capaz de formar una espora,

en la que:

(i) la primera especie comprende un Clostridium innocuum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 534, y la segunda especie comprende un (a) Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 548, (b) Clostridium bolteae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 501, (c) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 379, (d) Clostridium butyricum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 502, (e) Clostridium hylemonae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 532, (f) Clostridium mayombei que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 544, (g) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 591, (h) Coprococcus comes que una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 613, (i) Eubacterium rectale que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 786, (j) Faecalibacterium prausnitzii que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 810, (k) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la s Eq ID NO: 979, (l) Ruminococcus bromii que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 1534, o (m) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 1538;

(ii) la primera especie comprende un Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 548, y la segunda especie comprende (a) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 379, (b) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 591, (c) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 979, o (d) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 1538; o

(iii) la primera especie comprende un Clostridium bolteae que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 501, y la segunda especie comprende un (a) Blautia producta que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 379, (b) Clostridium orbiscindens que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 548, (c) Clostridium symbiosum que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 591, (d) Lachnospiraceae bacterium_5_1_57FAA que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 979, o (e) Ruminococcus gnavus que tiene una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 95 % idéntica a la la SEQ ID NO: 1538; y

2. Composición de la reivindicación 1, que comprende al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más especies de bacterias aisladas.

3. Composición de la reivindicación 1 o 2, en la que la primera especie y/o la segunda especie están en forma de esporas.

4. Composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la primera especie y la segunda especie disminuyen y/o inhiben de manera sinérgica el crecimiento y/o colonización de Clostridium difficile en un ensayo CivSim con un intervalo de confianza de >99 % (++++).

5. Composición de la reivindicación 4, en la que el ensayo CivSim comprende:

(i) cuantificar Clostridium difficile mediante un ensayo qPCR; o

(ii) cuantificar el crecimiento de Clostridium difficile midiendo la densidad óptica (DO).

6. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición está encapsulada en un recubrimiento entérico.

7. Composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la primera especie y la segunda especie están liofilizadas.

8. Unidad monodosis que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Kit que comprende en uno o más recipientes la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Producto comestible que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y que comprende además una cantidad eficaz de un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente antiviral y/o un agente antiparasitario.

12. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usar en un método de poblamiento funcional del tracto gastrointestinal de un sujeto humano.

13. Composición para usar, según la reivindicación 12, en la que el poblamiento funcional del tracto gastrointestinal comprende prevenir, tratar, reducir la gravedad y/o reducir uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal.

14. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usar en un procedimiento para inhibir el crecimiento de Clostridium difficile en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano.

15. Composición para usar, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la que la composición es adecuada para la administración al sujeto humano en combinación con un antibiótico, opcionalmente en la que el antibiótico se administra al sujeto antes de la administración de la composición.