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KR20210008393A - 세균 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

세균 균주를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR20210008393A
KR20210008393A KR1020207035244A KR20207035244A KR20210008393A KR 20210008393 A KR20210008393 A KR 20210008393A KR 1020207035244 A KR1020207035244 A KR 1020207035244A KR 20207035244 A KR20207035244 A KR 20207035244A KR 20210008393 A KR20210008393 A KR 20210008393A
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KR
South Korea
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present
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compositions
ncimb
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Application number
KR1020207035244A
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English (en)
Inventor
임케 엘리자베스 멀더
수아드 아메드
안나 에토레
사라 앤 레이드
테드 디난
존 크라이안
Original Assignee
4디 파마 리서치 리미티드
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Publication date
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Priority claimed from GBGB1813460.1A external-priority patent/GB201813460D0/en
Priority claimed from GBGB1817642.0A external-priority patent/GB201817642D0/en
Priority claimed from GBGB1820264.8A external-priority patent/GB201820264D0/en
Priority claimed from GBGB1820256.4A external-priority patent/GB201820256D0/en
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Abstract

본 발명은 자가면역 또는 염증성 장애 또는 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

세균 균주를 포함하는 조성물
기술 분야
본 발명은 포유류 소화관으로부터 단리된 세균 균주를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서 이런 조성물의 이용의 분야이다.
발명의 배경
인간 장은 자궁내에서 무균인 것으로 생각되지만, 이것은 출생 직후 매우 다양한 모계 미생물 및 환경 미생물에 노출된다. 그 후에, 미생물 집락형성과 천이의 동적 기간이 발생하는데, 이것은 인자, 예컨대 전달 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전자형에 의해 영향을 받고, 이들 모두 특히, 어린 시절 동안 소화관 미생물총의 조성에 영향을 준다. 차후에, 미생물총은 안정되고 성인과 유사해진다 [1]. 인간 소화관 미생물총은 2가지 주요 세균 부문, 박테로이데테스 (Bacteroidetes) 및 피르미쿠테스 (Firmicutes)에 본질적으로 속하는 500-1000개 이상의 상이한 계통형을 내포한다 [2]. 인간 소화관의 세균 집락형성으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 물질대사 기능, 구조 기능, 보호 기능 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락형성된 소화관의 증강된 대사 활동은 만약 그렇지 않으면 비소화성인 식이 성분이 분해되어, 숙주에 대한 중요한 영양소 공급원을 제공하는 부산물이 방출되도록 담보한다. 유사하게, 소화관 미생물총의 면역학적 중요성은 충분히 인식되고, 그리고 공생균의 도입 이후에 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예증된다 [3-5].
미생물총 조성에서 극적인 변화가 위장관 장애, 예컨대 염증성 장 질환 (IBD)에서 문서화되었다. 예를 들면, 클로스트리듐 (Clostridium) 클러스터 XIVa 세균의 수준은 IBD 환자에서 감소되는 반면, 대장균 (E. coli)의 숫자는 증가되는데, 이것은 소화관 내에서 공생체 및 유해균의 균형에서 변동을 암시한다 [6-9]. 흥미롭게도, 이러한 미생물 장내세균불균형은 또한, T 작동체 세포 개체군에서 불균형과 연관된다.
일정한 세균 균주가 동물 소화관에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적인 효과에 비추어, 다양한 질환의 치료에서 이용을 위한 다양한 균주가 제안되었다 (참조: 예를 들면, [10-13]). 또한, 대부분의 락토바실루스 (Lactobacillus) 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 균주를 포함하는 일정한 균주가 장에 직접적으로 연계되지 않는 다양한 염증 질환과 자가면역 질환을 치료하는 데 이용을 위해 제안되었다 (리뷰를 위해 [14] 및 [15]를 참조한다). 하지만, 상이한 질환 및 상이한 세균 균주 사이에 관계, 그리고 소화관에서 및 전신 수준에서 및 질환의 임의의 특정 유형에서 특정 세균 균주의 정확한 효과는 불량하게 특징화된다.
질환을 치료하는 새로운 방법이 당해 분야에서 요구된다. 장내 세균을 이용하는 새로운 요법이 개발될 수 있도록, 장내 세균의 잠재적 효과가 특징화되는 것이 또한 요구된다.
Ahmed et al (Frontiers Cellular Neuroscience에 제출됨)은 장내 미생물총-유래된 세균 균주의 시험관내 특징화를 고려한다.
발명의 요약
본 발명자들은 자가면역과 염증 질환 및 암, 특히 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 활성에 의해 매개되는 자가면역과 염증 질환 및 암을 치료하고 예방하는 데 이용될 수 있는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 세균 균주가 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 감소시키는 데 효과적일 수 있다는 것을 확인하였다. 히스톤 탈아세틸화효소 활성은 이식편 대 숙주 질환 (GVHD) 및 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 자가면역 또는 염증 질환과 장애의 어레이에서 병리학적 증상을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 실시예에서 설명된 바와 같이, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)를 포함하는 조성물의 투여는 질환의 모형에서 히스톤 탈아세틸화효소의 활성을 감소시킨다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 LPS에 의한 친염증성 분자, 예컨대 NFκB 및 IL-6의 활성화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 시험관내에서 지질 과산화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 세포 사멸 및 아폽토시스를 감소시키는 데 도움을 줄 수 있다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 염증 및 산화 스트레스를 약화시킬 수 있는 인돌을 생산할 수 있다는 것을 확인하였다.
HDAC 활성은 다양한 암에서 병리학적 기전과 또한 연관된다. HDAC 활성의 저해는 이런 이유로, 암의 치료에서 치료적으로 유익할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 암, 특히 HDAC 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개된 암의 치료 또는 예방에서 다면발현적 유익성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것인데, 특히 여기서 암은 증가된 HDAC 활성에 의해 매개된다.
본 발명자들은 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 세균 균주로 치료가 HDAC의 활성을 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 HDAC 활성에 의해 매개된 질환의 치료에서 임상적 유익성을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성을 감소시키는 데 특히 유익한 것으로 밝혀졌다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC1, HDAC2 또는 HDAC3 활성을 감소시킬 수 있다. 부류 I HDACs는 편재성으로 발현되고, 그리고 가장 흔하게는 핵에 상주한다. 부류 I HDACs는 히스톤 리신 잔기를 탈아세틸화하여 히스톤에 양성 전하를 복원하고, 따라서 히스톤 및 DNA 사이에 정전 결합을 증가시킨다. HDAC 활성은 이런 이유로, 염색질 밀집을 증가시켜, 근원적인 DNA 서열에서 유전자의 발현의 하향조절을 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이런 이유로, 표적 유전자 발현을 조절하는 데 이용될 수 있다. HDACs는 또한, 비-히스톤 단백질 표적을 변형함으로써 추가 조절 효과를 갖는다. 비-히스톤 단백질 표적의 아세틸화의 저해는 염색질 형태에 의한 유전자 발현의 제어에 직접적으로 관련되지 않은 질환의 다른 양상의 치료 또는 예방에서 유익할 수 있다.
본 발명자들은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물이 세로토닌 전달체 (SERT) 유전자 SLC6A4의 발현을 상향조절한다는 것을 또한 증명하였다. SERT는 장 내층의 상피 세포에 의해 발현되고, 그리고 세포간 공간으로부터 세로토닌을 제거한다. 일부 참고문헌 [16]에서 세로토닌은 일정한 시나리오에서, 예를 들면, 위장관에서 친염증성 효과를 가질 수 있는 것으로 보고되었다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 염증성 장애, 그리고 특히 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염을 치료하는 데 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관에서 세로토닌 수송을 증가시킴으로써, 예를 들면, 세로토닌 전달체 (SERT) 유전자 SLC6A4의 발현을 상향조절함으로써 염증성 장 질환을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염; 또는 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암으로 구성된 군에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. HDAC 활성에 대한 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 세균 균주에 대해 밝혀진 효과는 HDAC 활성에 의해 매개된 질환과 장애, 예컨대 상기 열거된 것들에 대한 치료적 유익성을 제공할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증가된 HDAC 발현을 갖는 질환 또는 장애의 치료에서 치료적 유익성을 제공할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증가된 HDAC 활성을 갖는 질환 또는 장애의 치료에서 치료적 유익성을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 염증 질환 또는 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 염증 질환 또는 자가면역 질환의 증상의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 균주가 HDAC 활성을 저해한다는 것을 확인하였다. 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 유전자 발현의 중요한 후성적 조절인자이다. 히스톤 아세틸화 불균형은 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염의 발병에 연루되었다.
일부 구체예에서 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 염증성 장 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. HDAC 활성의 저해는 위장관에서 친염증성 사이토킨의 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 조성물은 염증 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 증가된 결장 친염증성 사이토킨 발병과 연관된 질환의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 염증 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 대장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속, 바람직하게는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 암에서 아세틸화 경로의 조절장애는 암 세포 생존 및 종양 면역 회피에 연루되었다. 예를 들면, p53의 HDAC 매개된 탈아세틸화는 p53의 안정성과 반감기를 감소시킨다. 아세틸화된 p53은 더욱 큰 효능으로, 세포 주기 조절과 친아폽토시스성 유전자에 결합하고 이들의 발현을 조절하여, 암 세포 성장을 감소시키고 아폽토시스를 증진한다. p53의 탈아세틸화는 이런 이유로, 암 세포에서 아폽토시스를 저해하여, 암 세포 생존을 증가시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비-돌연변이된 p53을 갖는 암의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암 세포에서 아폽토시스를 증가시키는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종양 면역 회피를 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증가된 HDAC-활성을 갖는 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 예를 들면, 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 친아폽토시스성 약제로서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속, 바람직하게는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 암, 예컨대 유방암, 폐암 또는 간암을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 상기 조성물은 암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장을 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 암의 치료에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 상기 조성물은 상승된 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 갖는 환자에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 상기 조성물은 상승된 부류 I HDAC 활성을 갖는 환자에서 이용을 위한 것이다. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 대해 밝혀진, 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 대한 효과는 특히, 이런 환자에게 유익할 수 있다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주이다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주이다. 밀접하게 관련된 균주, 예컨대 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖는 세균 균주 또한 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 1에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여용이다. 본 발명의 균주의 경구 투여는 HDAC 활성에 의해 매개된 질환과 장애를 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 균주의 경구 투여는 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환과 장애를 치료하는 데 효과적일 수 있다. 또한, 경구 투여는 환자 및 의사에게 편의하고, 그리고 장에 전달 및/또는 장의 부분적인 또는 전체 집락형성을 허용한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 운반체를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동결 건조된 세균 균주를 포함한다. 동결 건조는 세균의 전달을 허용하는 안정된 조성물을 제조하기 위한 효과적이고 편의한 기술이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 조성물을 포함하는 식품 산물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
상기 발명을 개발하는 동안, 본 발명자들은 요법에 특히 유용한 세균 균주를 확인하고 특징화하였다. 본 발명의 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주는 본원에서 설명된 질환, 예컨대 염증 질환과 자가면역 질환, 예컨대 GVHD 및 대장염을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진다. 이런 이유로, 다른 양상에서, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 이런 세포를 포함하는 조성물, 또는 이런 세포의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 추가 넘버링된 구체예가 아래에 제공된다:
1. 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염; 또는 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암으로 구성되는 목록에서 선택되는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물.
2. 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
3. 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 구체예 1의 조성물.
4. 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환에서 부류 I HDAC 활성을 저해하는 방법에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
5. 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환의 치료에서 부류 I HDAC 활성을 선별적으로 저해하는 방법에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
6. 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물, 여기서 조성물은 HDAC1, HDAC2 또는 HDAC3 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애에서 HDAC1, HDAC2 또는 HDAC3을 선별적으로 저해하는 데 이용을 위한 것이다.
7. 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물, 여기서 조성물은 HDAC 활성을 저해하는 것이 유익한 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
8. 상승된 HDAC 활성을 갖는 환자에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
9. 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
10. 염증성 장 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
11. 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
12. 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
13. 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
14. 구체예 13에 따른 이용을 위한 조성물, 여기서 암은 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암으로 구성되는 목록에서 선택된다.
15. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
16. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 서열 번호: 14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 여기서 세균 균주는 서열 번호:14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
17. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주이다.
18. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
19. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
20. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 조성물은 경구 투여용이다.
21. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용가능한 부형제 또는 운반체를 포함한다.
22. 임의의 선행하는 구체예의 조성물, 여기서 세균 균주는 동결 건조된다.
23. 항염증성 약제로서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
24. 히스톤 탈아세틸화효소 저해 약제로서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
25. 부류 I 히스톤 탈아세틸화효소 저해 약제로서 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예에 따른 조성물.
26. 임의의 선행하는 구체예의 이용을 위한, 임의의 선행하는 구체예의 조성물을 포함하는 식품 산물.
27. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
28. 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체.
29. 요법에서 이용을 위한, 바람직하게는 구체예 1-14 중에서 한 가지에서 규정된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체.
30. 요법에서 이용을 위한 세균 균주, 여기서 상기 세균 균주는 서열 번호:14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다.
31. 요법에서 이용을 위한, 서열 번호: 14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주.
도면의 간단한 설명
도 1: 전체-세포 히스톤 탈아세틸화효소 활성 및 세포 용해물 히스톤 탈아세틸화효소 활성 (도 1a), 히스톤 탈아세틸화효소 활성에서 산-유도된 변화, MRx0029에서 대사산물 생산의 수준
도 2: 부류 I HDACs의 저해 (도 2a); HDAC1의 저해 (도 2b); HDAC2의 저해 (도 2c); HDAC3의 저해 (도 2d)
도 3: IL-6 분비의 수준
도 4: LPS 유도된 NFκB 프로모터 활성화의 저해
도 5: 항산화능에서 변화
도 6: 지질 산화에서 변화
도 7: 인돌 생산의 수준
도 8은 MRx0029의 투여 이후에 뇌에서 신경전달물질 대사산물의 수준을 도시한다.
도 9는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 트립토판 수산화효소 1과 2의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 24 시간 동안 10% MRx0029 상층액과 함께 배양되었다.
도 10은 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 트립토판 수산화효소 1과 2의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 5% MRx0029 상층액과 함께 72 시간 동안 배양되었다.
도 11은 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 SLC6A4의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 10% MRx0029 상층액과 함께 24 시간 동안 배양되었다.
도 12는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 SLC6A4의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 5% MRx0029 상층액과 함께 72 시간 동안 배양되었다.
도 13은 분화된 Caco2 세포에서 트립토판 수산화효소 1 (TPH1)의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 10% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 24 시간 동안 배양되었다.
도 14는 분화된 Caco2 세포에서 SLC6A4의 발현에서 배수 변화를 도시한다. 세포는 10% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 24 시간 동안 배양되었다.
도 15: 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 NCIMB 42787에 대한 대사산물 분석.
도 16: MRx0029 및 참조 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 대한 상층액에서 발레르산 생산.
도 17: MRx0029 및 참조 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 의한 유기 산 생산과 소비.
도 18: MRx0029에 더하여 (a) 포르볼미리스테이트 처리가 없는 경우 및 (b) 이러한 처리가 있는 경우에, 분화된 Caco-2 세포에서 GPR109a RNA 발현. "YCFA" = YCFA+
도 19: MRx0029에 의한 NSE/에놀라아제 2의 억제. "YCFA" = YCFA+
도 20: NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389에 의한 유기 산 생산과 소비.
도 21: NCIMB 42787 및 다른 기탁된 균주에 의한, LPS 자극된 U373 세포에서 IL-6 분비의 하향조절 (n=3).
도 22: NCIMB 42787 및 다른 기탁된 균주에 의한, 자극된 HEK-TLR4 세포에서 NFκB-AP1 프로모터의 활성화의 억제 (n=3).
도 23: NCIMB 42787, NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387에 의한 에놀라아제 2의 억제.
도 24: NCIMB 42787에 의한 사이토킨 수준 및 NFκB-AP1 프로모터의 조정
도 25: NCIMB 42787의 항산화능의 리뷰.
도 26: NCIMB 42787은 부티르산, 발레르산 및 헥산산을 생산한다.
도 27: NCIMB 42787에 의해 생산된 대사산물의 항염증 활성.
도 28: NCIMB 42787의 항염증 활성에서 대사산물의 역할의 분석.
도 29: NCIMB 42787은 BALB/c 생쥐로부터 단리된 자극된 비장세포에 의한 TNFα의 생산을 조정한다.
도 30: 메가스파에라 (Megasphaera) 표준 균주 NCIMB 43385는 글루코코르티코이드 수용체의 발현에서 증가를 촉발한다.
발명의 개시
세균 균주
본 발명의 조성물은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함한다. 실시예는 이러한 속의 세균이 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용하다는 것을 증명한다. 바람직한 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이다.
본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 실례는 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii), 메가스파에라 세레비지애 (Megasphaera cerevisiae), 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis), 메가스파에라 인디카 (Megasphaera indica), 메가스파에라 파우시보란스 (Megasphaera paucivorans), 메가스파에라 수에시엔시스 (Megasphaera sueciensis) 및 메가스파에라 마이크로누시포르미스 (Megasphaera micronuciformis)를 포함한다. 본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 추가 실례는 메가스파에라 헥사노이카 (Megasphaera hexanoica)이다. 메가스파에라 (Megasphaera)는 인간을 비롯하여, 반추 및 비반추 포유동물의 절대 혐기성, 유산염-발효, 위장관 미생물이다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis)의 표준 균주는 NP3 (=CSUR P245=DSM 26228)이다 [17]. 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NP3의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 수탁 번호는 JX424772.1이다.
실시예에서 검사된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 세균은 본원에서 균주 MRx0029로서 지칭된다. 검사된 MRx0029 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열 번호: 1에서 제공된다.
균주 MRx0029는 2017년 7월 13일자에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 "메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029"로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고, 그리고 수탁 번호 NCIMB 42787이 배정되었다.
실시예에서 검사된 균주에 밀접하게 관련된 세균 균주 또한, 염증 질환 또는 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
균주 MRx0029의 생물형인 세균 균주 또한, 염증성 장애 또는 자가면역 장애를 치료하거나 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일한 또는 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRx0029에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 실제적으로 전체 유전체가 염기서열결정될 수 있고, 그리고 본 발명에서 이용을 위한 생물형 균주는 이의 전체 유전체의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들면, 이의 전체 유전체의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 전역에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 확인하는 데 이용을 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열, 예컨대 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP 또는 [18]을 포함할 수 있다. 생물형 균주는 균주 MRx0029의 상응하는 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
대안으로, 균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRx0029 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 이용함으로써, 예를 들면, 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복성 DNA 요소 (rep)-PCR 지문확인, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23S rDNA 염기서열결정을 이용함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이런 기술은 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 확인하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들면, Sau3AI 제한 효소를 이용할 때 균주 MRx0029와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다 (예시적인 방법 및 보도를 위해, 예를 들면 [19]을 참조한다). 대안으로, 생물형 균주는 균주 MRx0029와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 균주, 예컨대 균주 MRx0029의 생물형은 실시예에서 설명된 검정을 비롯한, 임의의 적합한 방법 또는 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 세포 용해물 또는 전체 세포에 첨가하고, 그리고 전체 또는 부류 I HDAC 활성에 대해 검사함으로써 확인될 수 있다. 특히, 균주 MRx0029와 유사한 성장 패턴, 물질대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 균주 MRx0029에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 HDAC 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 유용한 세균 균주는 세균 균주에 의한 대사산물의 생산과 소비를 일과적으로 프로파일링함으로써 확인될 수 있다. 본 발명자들은 실시예에서 이용된 세균 균주가 부티르산염, 발레르산 및 헥산산을 생산하고 아세트산염 및 프로피온산염을 소비한다는 것을 발견하였다 (참조: 도 15-17). 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 참조 1, 참조 2 및 참조 3 역시 이들 대사산물을 소비하고 생산하는 것으로 밝혀졌다 (참조: 도 15-17). 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 대사산물 부티르산염, 발레르산 및 헥산산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 아세트산염 및 프로피온산염 중에서 한 가지 또는 둘 모두를 소비한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산염, 발레르산 및 헥산산을 생산하고 아세트산염 및 프로피온산염을 소비한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 MRx0029 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 균주의 유도체는 본래 균주로부터 딸 균주 (자손) 또는 배양된 (하위클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않으면서, 예를 들면 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도 균주는 치료적으로 활성이다. 유도 균주는 MRx0029 균주에 필적하는 치료 활성을 가질 것이다. 특히, 유도 균주는 실시예에서 도시된 HDAC 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. MRx0029 균주의 유도체는 일반적으로 MRx0029 균주의 생물형일 것이다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029 균주의 세포에 대한 언급은 균주 MRx0029와 동일한 안전성 및 치료 효능 특징을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 이런 세포는 본 발명에 의해 포괄된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고, 그리고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주가 염증성 사이토킨, 예컨대 IL-6의 활성화를 감소시킨다는 것을 발견하였다. IL-6에 의해 유도된 만성 염증은 세포 사멸을 궁극적으로 야기할 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 세균 균주는 염증성 장애 또는 자가면역 장애의 치료 또는 예방에서 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 이들 세균 균주는 IL-6의 증강된 활성화에 의해 특징화되는 염증성 장애 또는 자가면역 장애의 치료에서 유용하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고, 그리고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 42787의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 균주가 아니다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 균주가 아니다.
실시예는 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용한 다른 세균 균주를 더욱 보여준다. 이들 세균 균주는 2019년 5월 6일자에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) (수탁 번호 NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에) 및 메가스파에라 (Megasphaera) 종 (수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387)으로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었다. 따라서, 대안적 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이들 세균 균주, 또는 이들의 생물형 또는 유도체 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함한다. 의심할 여지를 없애기 위해, 위에서 지칭된 참조 1은 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주이고, 위에서 지칭된 참조 2는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주이고, 그리고 위에서 지칭된 참조 3은 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주이다.
실시예에서 검사된 균주에 밀접하게 관련된 세균 균주 또한, HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주가 아니다.
따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:15와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:15에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:15와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:15에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:16과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:16에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:16과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:16에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 질환 중에서 한 가지에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주의 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는, 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 NCIMB에 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주의 세포를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주가 아니다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주이고, 여기서 상기 세균 균주는 수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주가 아니다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:14와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:17과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:18과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:14, 17 또는 18과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호:14, 17 또는 18과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:14에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:17에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호:18에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 14, 17 또는 18에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 서열 번호: 14, 17 또는 18에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주를 제공한다.
이들 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형인 세균 균주 또한, HDAC 활성에 의해 매개된 암 및 염증과 자가면역 질환과 장애를 치료하거나 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일한 또는 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 세균 균주, 또는 이들의 생물형을 제공한다.
수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 실제적으로 전체 유전체가 염기서열결정될 수 있고, 그리고 본 발명에서 이용을 위한 생물형 균주는 이의 전체 유전체의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들면, 이의 전체 유전체의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 전역에 걸쳐) 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 확인하는 데 이용을 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열, 예컨대 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP를 포함할 수 있다. 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 상응하는 서열에 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
대안으로, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 이용함으로써, 예를 들면, 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복성 DNA 요소 (rep)-PCR 지문확인, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23S rDNA 염기서열결정을 이용함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이런 기술은 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 확인하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들면, Sau3AI 제한 효소를 이용할 때, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안으로, 생물형 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 다른 균주, 예컨대 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형은 실시예에서 설명된 검정을 비롯한, 임의의 적합한 방법 또는 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 세포 용해물 또는 전체 세포에 첨가하고 전체 또는 부류 I HDAC 활성을 검사함으로써 확인될 수 있다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상과 유사한 성장 패턴, 물질대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386 NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 도시된 바와 같은 HDAC 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주이다. 이들은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 예컨대 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 균주의 유도체는 본래 균주로부터 딸 균주 (자손) 또는 배양된 (하위클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않으면서, 예를 들면 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도 균주는 치료적으로 활성이다. 유도 균주는 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상에 필적하는 치료 활성을 가질 것이다. 특히, 유도 균주는 실시예에서 도시된 HDAC 활성에 대한 필적하는 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 일반적으로, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 유도체는 각각, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43386, NCIMB 43387, NCIMB 43388 및/또는 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 중에서 한 가지 또는 그 이상의 생물형일 것이다.
본 발명자들은 실시예에서 이용된 세균 균주가 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다는 것을 발견하였다 (참조: 도 20). 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에 기탁된 균주 또한, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 수탁 번호 NCIMB 43385 및 NCIMB 43388 하에 기탁된 균주는 포름산을 소비하는 것으로 또한 밝혀졌다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 대사산물 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 포름산을 소비한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 부티르산염, 발레르산, 헥산산, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고, 그리고 아세트산염, 프로피온산염 및 포름산을 소비한다.
일정한 구체예에서, 부티르산염의 생산은 IL-6 분비를 저해한다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부티르산염의 생산 시에 IL-6에서 감소에 비추어 염증을 감소시킬 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 발레르산을 생산한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 발레르산을 생산하는 메가스파에라 (Megasphaera) 균주이다. 발레르산은 HDAC 활성을 저해하고, 그리고 이런 이유로, 자가면역과 염증성 장애의 치료에서 유용하다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 발레르산의 생산을 증가시키는 것을 통해 HDAC 활성을 저해한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 발레르산 생산에서 증가 및 발레르산에 의한 HDAC 활성의 저해에 비추어, 본원에서 개시된 염증성, 자가면역 및/또는 장애에서 치료적으로 유익하다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii)를 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 세균 균주는 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii)가 아니다.
치료적 용도
실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 세균 조성물은 HDAC 활성을 감소시키는 데 효과적이다. 특히, 본 발명의 조성물로 치료는 부류 1 HDAC 활성에서 감소를 달성한다. 특히, 본 발명의 조성물로 치료는 HDAC1, 2 및 3 활성에서 감소를 달성한다. 특히, 본 발명의 조성물로 치료는 HDAC1 및 2 활성에서 감소를 달성한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 장애는 질환의 증상일 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 상승된 수준의 HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 감소시키거나 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 상승된 수준의 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 감소시키거나 또는 예방하는 데 유용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조성물은 상승된 수준의 HDAC1, 2 또는 3 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 감소시키거나 또는 예방하는 데 유용할 수 있다.
히스톤 탈아세틸화효소는 단백질 표적으로부터 아세틸 기를 제거하는 한 부류의 효소이다. 가장 풍부한 HDAC 표적은 히스톤이지만, HDACs는 비-히스톤 단백질 표적의 리신 잔기를 탈아세틸화하여 단백질 활성을 일시적으로 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서, HDACs는 때때로 리신 탈아세틸화효소로서 지칭된다. 현재 13가지의 공지된 HDACs가 있는데, 이들은 4가지 주된 부류: 부류 I (HDACs 1, 2, 3 및 8), 부류 IIa (HDACs 4,5,7 및 9) 및 부류 IIb (HDACs 6 및 10), 부류 III (sirt1-sirt7) 및 부류 IV (HDAC 11)로 분류된다 [7]. 각 부류는 일반적으로, 상이한 조직 발현 패턴 및 세포이하 국부화를 갖는다.
단백질 아세틸화/탈아세틸화는 일반적으로, 단백질 활성의 번역후 제어의 기전으로서 이용된다. 히스톤 아세틸화/탈아세틸화는 전사 조절의 충분히 확립된 기전이다. 유전자 조절은 히스톤 꼬리에서 리신 아미노산의 ε-N-아세틸로부터 아세틸 기의 히스톤 탈아세틸화효소-매개된 개열에 의해 유발된다. 아세틸 기의 제거는 히스톤 꼬리에 양성 전하를 복원하여, 음성으로 하전된 포스포디에스테르 DNA 중추에 더욱 우호적인 결합을 야기한다. 향상된 결합은 더욱 단단한 염색체 압밀 및 히스톤 탈아세틸화의 부위에서 유전자 발현에서 전반적인 감소를 야기한다.
히스톤 탈아세틸화효소 활성은 넓은 어레이의 질환과 장애에 연루되었다. 히스톤 탈아세틸화효소 활성의 저해는 이들 질환 또는 장애를 경감하거나 또는 개선하는 데 이용될 수 있다. 히스톤 탈아세틸화효소의 범-저해제는 HDAC-매개된 질환의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 동종형 특이적 HDAC 저해제는 특정한 HDAC 동종형 활성에 의해 매개된 질환의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다.
HDAC 활성의 저해는 확립된 치료 양상이고, 그리고 보리노스탯 (CTCL), 로미뎁신 (CTCL), 치다마이드 (PTCL), 파노비노스탯 (다발성 골수종), 벨리노스탯 (T 세포 림프종)을 비롯한, 다수의 HDAC 저해제가 승인된 약제이고, 그리고 파노비노스탯 (CTCL), 발프로산 (자궁경부암 및 난소암, 척수 근위축증), 모세티노스탯 (여포성 림프종, 호지킨 림프종 및 급성 골수성 백혈병), 아벡시노스탯 (육종), 엔티노스탯 (호지킨 림프종, 폐암 및 유방암), SB939 (재발성 또는 전이성 전립선암), 레스미노스탯 (호지킨 림프종), 지비노스탯 (난치성 백혈병 및 골수종), HBI-800 (흑색종, 신장 세포 암종 (RCC) 및 비소세포 폐암 (NSCLC)을 비롯한 진행된 고형 종양), 케베트린 (난소암), CUDC-101, AR-42 (재발된 또는 치료-내성 다발성 골수종, 만성 림프성 백혈병 또는 림프종), CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202 (진행된 혈액학적 징후), CG200745 (고형 종양), ACY-1215 (다발성 골수종), ME-344 (고형 난치성 종양), 술포라판 및 트리코스타틴 (항염증성)을 비롯한, 많은 저해제가 임상 시험 중이다.
HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 실례는 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 그리고 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암을 포함한다. 일정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 이들 질환 또는 장애 중에서 한 가지를 치료하거나 예방하는 데 이용된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 이들 질환 또는 장애 중에서 한 가지를 치료하거나 예방하는 데 이용된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 이들 질환 또는 장애 중에서 한 가지를 치료하거나 예방하는 데 이용된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC1, 2 또는 3 활성에 의해 매개된 이들 질환 또는 장애 중에서 한 가지를 치료하거나 예방하는 데 이용된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 요법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 HDAC 활성을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성을 저해하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환의 치료 또는 예방에서 부류 I HDAC 활성을 선별적으로 저해하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 본 발명자들은 본 발명의 일정한 조성물이 부류 I HDACs를 선별적으로 저해한다는 것을 확인하였다. 본원에서 이용된 바와 같이 "선별적"은 예를 들면, 다른 부류로부터 HDACs의 저해 효과와 비교하여, 부류 I HDACs에 대해 최대 저해 효과를 갖는 조성물을 지칭한다. HDACs의 선별적 저해는 질환 또는 장애가 환자의 일생 동안 치료되어야 하는 경우와 같은, 치료제의 장기간 투여를 필요로 하는 질환의 치료에 유리하다. 일정한 구체예에서, 부류 I HDAC 선별적 저해제인 본 발명의 조성물은 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 완화 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 선별적 저해제는 다른 부류의 HDACs의 원치 않는 저해와 연관된 부작용을 감소시킴으로써 당해 분야에서 공지된 범-저해제보다 유리하다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC2 선별적 저해제이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC1, 2 또는 3 활성을 선별적으로 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC1, 2 또는 3 활성에 의해 매개된 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GPR109a에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하는 데 이용을 위한 것이 아니다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암이 아닌 질환 또는 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
염증성 장애와 자가면역 장애
실시예는 본 발명의 조성물이 HDAC 저해 활성을 갖는다는 것을 증명한다. HDAC 활성은 많은 염증성 장애와 자가면역 장애의 병리에 중심이 되고, 그리고 HDAC 저해제는 특정한 질환에 관하여 아래에 논의된 바와 같이, 많은 염증성 장애와 자가면역 장애의 치료에서 효능을 보여주었다 (또한 [20] 참조). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 염증성 장애와 자가면역 장애, 특히 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 활성에 의해 매개된 염증성 장애와 자가면역 장애를 치료하는 데 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장애 또는 자가면역 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증 질환 또는 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증 질환 또는 자가면역 질환을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다. 일정한 구체예에서, 환자가 만성 염증 질환 또는 자가면역 질환 또는 장애로 진단될 수 있었거나, 또는 본 발명의 조성물이 만성 염증 질환 또는 자가면역 질환 또는 장애로 발달하는 염증 질환 또는 자가면역 질환 또는 장애를 예방하는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 질환 또는 장애는 TNF-α 저해제로 치료에 반응하지 않을 수 있다.
HDAC는 만성 염증 질환과 자가면역 질환과 연관될 수 있고, 따라서 본 발명의 조성물은 앞서 열거된 바와 같은 만성 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 만성 질환을 앓는 환자에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 만성 질환의 발달을 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 HDAC에 의해 매개된 질환과 장애를 치료하고 HDAC 활성화를 해소하는 데 유용할 수 있고, 따라서 본 발명의 조성물은 만성 질환을 치료하거나 예방하고, 다른 요법 (예컨대 TNF-α 저해제로 치료)에 반응하지 않은 환자에서 질환을 치료하거나 예방하고 및/또는 HDAC와 연관된 조직 손상 및 증상을 치료하거나 예방하는 데 특히 유용할 수 있다.
일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 친염증성 사이토킨 생산 및 염증을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 상태를 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6 생산과 분비를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB 프로모터의 활성화를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 강력한 친염증성 내독소 지질다당류 (LPS)에 의한 IL-6 생산의 활성화를 조정할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경계에 영향을 주지 않거나 또는 침범하지 않는 염증성 장애 또는 자가면역 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 위장관, 근골격계, 호흡계통 또는 피부에 영향을 주는 염증성 장애 또는 자가면역 장애를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애가 아닌 질환을 치료하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진행성 핵상 마비, 진행성 핵상 마비, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 정상압 수두증, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨증 및 약물 유발된 파킨슨증; 벤손 증후군을 비롯한 알츠하이머병; 헌팅턴병; 근위축성 측삭 경화증; 루게릭병; 운동 뉴런 질환; 프리온 질환; 척수소뇌 실조증; 척수 근위축증; 루이체, 혈관 및 전두측두엽 치매를 비롯한 치매; 원발성 진행형 실어증; 경미한 인지 장애; HIV-관련된 인지 장애 또는 피질기저 퇴행을 비롯하여, 파킨슨병이 아닌 질환을 치료하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 건강한 신경계를 갖는 개체를 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다발성 경화증이 아닌 질환을 치료하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 손상이 아닌 질환을 치료하기 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애가 아니고, 다발성 경화증이 아니고, 그리고 뇌 손상이 아닌 질환을 치료하기 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물이 염증을 억제하는 것으로 알려져 있는 GPR109a를 상향조절하는 데 효과적이라는 것을 증명한다 [62]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료에서 GPR109a를 상향조절하는 데 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물이 친염증성 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 에놀라아제를 억제하는 데 효과적이라는 것을 증명한다 [69]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증 질환 또는 자가면역 질환의 치료에서 에놀라아제를 억제하는 데 이용을 위한 것이다.
- 염증성 장 질환
실시예는 본 발명의 조성물이 HDAC 저해 활성을 갖는다는 것을 증명하고, 그리고 따라서 이들은 염증성 장 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 상이한 HDAC 동종형의 과다발현은 대장염을 비롯한 다양한 질환 병리에 연루되었다. 추가적으로, 발프로산이 DSS-대장염 뮤린 모형에서 부류 I HDAC 저해 및 대장염의 개선과 연관되었다 [21]. 본 연구는 IFN-γ, IL-10, IL-1β 및 TNF-α 억제에서 HDAC 부류 I 저해제에 대한 역할을 암시하고, HDAC 저해 및 대장염에서 효능에 기능성을 부여하였다. 이런 이유로, 실시예는 본 발명의 조성물이 염증성 장 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다는 것을 지시한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장 질환을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장 질환을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
염증성 장 질환 (IBD)은 복수의 환경적 및 유전적 인자에 의해 유발될 수 있는 복합적인 질환이다. IBD의 발병에 기여하는 인자는 식이, 미생물총, 장관 투과성, 그리고 소화관 감염에 대한 증가된 염증 반응의 유전적 감수성을 포함한다. 염증성 장 질환의 증상은 복통, 구토, 설사, 직장 출혈, 골반 영역에서 심각한 내부 경련/근육 연축, 체중 감소 및 빈혈을 포함한다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 IBD와 연관된 한 가지 또는 그 이상의 증상을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IBD의 한 가지 또는 그 이상의 증상을 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
IBD는 다른 질환 또는 장애, 예컨대 관절염, 괴저성 화농피부증, 원발성 경화 담관염, 비-갑상선 질환 증후군, 심부 정맥 혈전증, 폐색성 세기관지염 기질화 폐렴을 동반할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IBD에 동반되는 한 가지 또는 그 이상의 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
염증성 장 질환은 일반적으로, 생검 또는 대장내시경검사에 의해 진단된다. 분변 칼프로텍틴의 계측이 IBD의 예비적 진단에 유용하다. IBD의 진단을 위한 다른 실험실 검사는 전체 혈구 계산, 적혈구 침강 속도, 포괄적인 대사 패널, 분변 잠혈 검사 또는 C-반응성 단백질 검사를 포함한다. 전형적으로, 실험실 검사 및 생검/대장내시경검사의 조합이 IBD의 진단을 확증하는 데 이용될 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 IBD로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 염증성 장 질환은 궤양성 대장염이다. 궤양성 대장염은 침윤하는 T 세포에 의해 특징화되는 자가면역 염증성 장 질환이다. HDAC 저해제는 DSS-대장염 뮤린 모형에서 대장염을 개선하는 것으로 이전에 밝혀졌다 [21]. 게다가 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 대장염을 앓는 동물의 회장에서 백혈구 침윤을 감소시킨다는 것을 증명하였다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염을 앓는 개체의 회장에서 백혈구 침윤을 감소시킴으로써, 궤양성 대장염의 치료에서 이용을 위한 것일 수 있다.
UC는 통상적으로, 직장 및 결장에 한정되지만, 때때로 회장을 침범한다. 상기 질환은 위장관의 침범의 정도에 따라서 분류된다. 궤양성 대장염의 분류는 원위 대장염, 예컨대 직장염, 직장구불창자염 및 좌측 대장염, 또는 광범위 대장염, 예컨대 전대장염을 포함한다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 원위 대장염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 직장염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 직장구불창자염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 좌측 대장염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 광범위 대장염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 전대장염의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 궤양성 대장염이 발달할 위험에 처해 있는 개체에서 궤양성 대장염의 예방에서 이용을 위한 것이다.
궤양성 대장염은 실험실 검사 및 수술, 예컨대 내시경검사/대장내시경검사 및 생검의 조합에 의해 진단된다. 궤양성 대장염 진단을 보조하는 예시적인 실험실 검사는 전체 혈구 계산, 포괄적인 대사 패널, 간 기능 검사, 소변 분석, 대변 배양 검사, 적혈구 침강 속도 및 C-반응성 단백질 계측을 포함한다.
궤양성 대장염의 증상의 심각도는 단순한 임상적 대장염 활성 지수 (SCCAI)를 이용하여 결정될 수 있다 [22]. SCCAI는 또한, 궤양성 대장염을 치료하거나 또는 예방하도록 설계된 요법의 효능을 사정하기 위한 수단으로서 이용될 수 있다. SCCAI는 궤양성 대장염 증상의 심각도를 결정하기 위해 설계된 하기의 일련의 문제를 제기한다: 장 움직임의 빈도 (주간에); 장 움직임의 빈도 (야간에); 배변의 급박함; 혈변; 일상의 행복; 장외 특질 (예를 들면, 관절염, 포도막염, 또는 UC에 동반되는 다른 질환). 각 응답은 0 및 19 사이의 점수를 산출하는 슬라이딩 스케일에서 제공된다. 5 초과의 점수는 통상적으로 궤양성 대장염의 존재를 지시한다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 궤양성 대장염으로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 궤양성 대장염의 한 가지 또는 그 이상의 증상을 경감하거나 또는 개선하는 데 이용을 위한 것이다. 예를 들면, 이들 조성물은 SCCAI에 대한 하나 또는 그 이상의 응답의 점수를 향상시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 움직임의 빈도를 감소시키는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 배변의 급박함을 감소시키는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈변을 감소시키는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장외 특질을 감소시키는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 이들 증상의 경감 또는 개선은 본 발명의 조성물의 투여전과 투여후 상응하는 SCCAI 점수에서 향상에 의해 결정될 수 있다.
궤양성 대장염의 추가 증상은 설사, 직장 출혈, 체중 감소 및 빈혈, 복통, 장 움직임을 동반한 복부 경련을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 한 가지 또는 그 이상의 추가 증상의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
일부 사례에서, 궤양성 대장염은 한 가지 또는 그 이상의 장외 특질을 동반한다. 장외 특질은 궤양성 대장염에 동반되고 결장 외부에서 현성하는 장애 또는 질환이다. 궤양성 대장염의 장외 특질의 실례는 아프타성 궤양, 홍채염, 포도막염, 상공막염, 혈청반응음성 관절염, 강직성 척추염, 천장관절염, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 심부 정맥 혈전증 및 폐색전증, 자가면역 용혈성 빈혈, 클러빙, 원발성 경화 담관염을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 한 가지 또는 그 이상의 장외 특질을 치료하거나 또는 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
궤양성 대장염은 다수의 치료제, 예컨대 5-아미노살리실산, 예컨대 술파살라진 및 메살라진, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 면역억제제, 예컨대 아자티오프린, 생물제제, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙 및 골리무맙, 베돌리주맙 및 에트롤리주맙, 니코틴, 또는 철로 치료될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 추가 치료제와 병용으로 궤양성 대장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이고, 여기서 추가 치료제는 궤양성 대장염의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 염증성 장 질환은 크론병이다. 연구에서 여러 HDACs가 크론병을 앓는 환자의 염증성 점막에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, HDAC 활성의 저해는 크론병의 치료에서 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
크론병은 유전적 위험 요인, 식이, 다른 생활양식 인자, 예컨대 흡연 및 알코올 소비, 그리고 마이크로바이옴 조성을 비롯한, 개연적인 원인의 어레이를 갖는 복합적인 질환이다. 크론병은 위장관을 따라서 어딘가에 현성할 수 있다.
크론병의 위장관 증상은 경등도 내지 중증의 범위이고, 그리고 복통, 설사, 혈변, 회장염, 증가된 장 움직임, 증가된 고창, 장 협착증, 구토, 그리고 항문주위 불편함을 포함한다. 본 발명의 조성물은 크론병의 한 가지 또는 그 이상의 위장관 증상의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다.
크론병의 전신 증상은 성장 결함, 예컨대 사춘기 동안 성장을 유지하는 능력이 없음, 감소된 식욕, 열병 및 체중 감소를 포함한다. 크론병의 장외 특질은 포도막염, 포토비아, 상공막염, 담석증, 혈청반응음성 척추관절병증, 관절염, 골부착부위염, 결절성 홍반, 괴저성 화농피부증, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증, 자가면역 용혈성 빈혈, 클러빙 및 골다공증을 포함한다. 장외 특질은 GI 관 외부에서 현성하는 크론병과 연관된 추가 질환이다. 크론병을 앓는 개체는 또한, 신경학적 합병증, 예컨대 발작, 뇌졸중, 근병증, 말초 신경병증, 두통 및 우울증에 대한 증가된 감수성을 전시한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병의 한 가지 또는 그 이상의 전신 증상의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병의 한 가지 또는 그 이상의 장외 특질의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
크론병의 진단은 통상적으로, 복수의 검사 및 외과 시술, 예컨대 위내시경검사 및/또는 대장내시경검사 및 생검 (전형적으로, 회장에서), 방사선학 검사, 전체 혈구 계산, C-반응성 단백질 검사 및 적혈구 침강 속도를 실행하는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병으로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 크론병으로 진단된 개체를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
크론병은 영향을 받는 GI 관의 영역의 정도에 따라서 분류된다 [23]. 회장 및 결장 둘 모두의 질환은 회결장 크론병으로서 분류된다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 회결장 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 회결장 크론병으로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다/만약 단지 회장만 영향을 받으면, 크론 회장염이 분류된다. 만약 단지 결장만 영향을 받으면, 크론 결장염이 분류된다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 크론 회장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 크론 회장염으로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 크론 결장염의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 조성물은 크론 결장염으로 진단된 개체에서 이용을 위한 것이다.
크론병은 다수의 치료제, 예컨대 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손, 면역억제제, 예컨대 아자티오프린, 또는 생물제제, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 그리고 골리무맙, 베돌리주맙 및 에트롤리주맙으로 치료될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 추가 치료제와 병용으로 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 추가 치료제는 크론병의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
실시예는 또한, 본 발명의 조성물이 결장 염증을 억제하는 것으로 알려져 있는 GPR109a를 상향조절하는 데 효과적이라는 것을 증명한다 [62]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 장 질환의 치료에서 GPR109a를 상향조절하는 데 이용을 위한 것이다.
- 관절염
관절염은 만성 관절 염증에 의해 특징화되는 질환이다. 류마티스성 관절염은 팽화되고 고통스러운 관절을 전형적으로 유발하는 만성 자가면역 장애이다. HDAC 저해는 사이토킨 생산에 영향을 주고, T-세포 분화를 저해하고, 윤활막 섬유모세포의 증식을 억제하고, 그리고 파골세포 및 조골세포에 영향을 줌으로써 뼈 손실을 감소시키는 것을 비롯한, 다양한 기전에 의해 류마티스성 관절염을 치료하는 것으로 제안되었다 (Vojinov et al., 2011, Mol Med, 17 (5-6) 397-403). HDAC 저해는 관절염의 여러 동물 모형에서 강한 항염증 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Joosten et al., 2011, Mol Med, 17 (5-6), 391-396). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 관절염을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염 (RA)을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 류마티스성 관절염을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 관절의 팽화에서 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 팽화된 관절을 갖는 환자 또는 팽화된 관절의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 RA에서 관절 팽화를 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 연골 손상 또는 뼈 손상에서 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 RA의 치료에서 연골 또는 뼈 손상을 감소시키거나 또는 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 연골 또는 뼈 손상의 위험에 처해 있는 심각한 RA를 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 RA의 치료에서 뼈 부식 또는 연골 손상을 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 뼈 부식 또는 연골 손상을 전시하는 환자, 또는 뼈 부식 또는 연골 손상의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 환자의 면역계를 조정하는 데 유용할 수 있고, 따라서 일정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 RA의 위험에 처해 있는 것으로 확인된, 또는 초기 단계 RA로 진단된 환자에서 RA를 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 RA의 발달을 예방하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 RA를 관리하거나 또는 경감하는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히, 관절 팽화 또는 뼈 파괴와 연관된 증상을 감소시키는데 유용할 수 있다. RA의 치료 또는 예방은 예를 들면, 증상의 심각도의 경감, 또는 환자에게 문제가 되는 악화의 빈도 또는 유발요인의 범위에서 감소를 지칭할 수 있다.
- 천식
천식은 만성 염증성 호흡기 질환이다. HDAC 저해제는 만성 천식의 생쥐 모형에서 기도 염증, 기도 개형 및 기도 과민성을 완화하는 항염증 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (Ren et al., 2016, Inflamm Res, 65, 995-1008). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 천식을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 천식을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 천식을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 천식을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
일정한 구체예에서, 천식은 호산성 또는 알레르기성 천식이다. 호산성 및 알레르기성 천식은 말초혈에서 및 기도 분비물에서 증가된 숫자의 호산구에 의해 특징화되고, 그리고 기저막 구역의 농후화와 병리학적으로 및 코르티코스테로이드 반응성에 의해 약리학적으로 연관된다 [24]. 호산구 모집 또는 활성화를 감소시키거나 또는 저해하는 조성물은 호산성 및 알레르기성 천식을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 호산성 및 알레르기성 천식은 또한, T 보조 유형 2 림프구 (Th2) 과정에 의해 매개된 염증성 사건의 연속에 의해 특징화된다. T 보조 유형 2 림프구 (Th2) 과정을 감소시키거나 또는 저해하는 조성물은 이런 이유로, 호산성 및 알레르기성 천식을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 호중구성 천식 (또는 비호산성 천식)을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 높은 호중구 숫자는 코르티코스테로이드 치료에 둔감할 수 있는 중증 천식과 연관된다. 호중구 모집 또는 활성화를 감소시키거나 또는 저해하는 조성물은 호중구성 천식을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
호산성 천식 (Th2-높은 천식으로서 또한 지칭됨) 및 호중구성 천식 (Th2-낮은 또는 비-Th2 천식으로서 또한 지칭됨)은 상이한 근원적인 병리생리학적 기전을 갖고 상이한 임상적 특질을 나타낸다. 예를 들면, Th2-높은 천식은 일반적으로 조기 발병을 나타내고 증상의 계절적 변이를 전시하는 반면, Th2-낮은 천식은 전형적으로 40세쯤 또는 그 후에, 훨씬 늦은 발병을 갖는다. Th2-높은 천식은 또한, 증가된 면역글로불린 E (IgE) 혈중 농도에 의해 특징화되는 반면, 이러한 특질은 Th2-낮은 천식에서 부재한다. Th2 높은 천식은 또한, 호산구의 높은 객담 수준에 의해 특징화된다. 대조적으로, Th2-낮은 천식은 상승된 수준의 객담 호중구에 의해 특징화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Th2-낮은 또는 비-Th2 천식을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Th2-높은 천식을 치료하는 데 이용을 위한 것이다.
호산성 및 호중구성 천식은 상호간에 배타적 질환이 아니고, 그리고 호산구 및 호중구 반응 중에서 어느 한 가지를 해소하는 데 도움을 주는 치료는 일반적으로 천식을 치료하는 데 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 천식의 치료 또는 예방에서 호산성 염증 반응을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이거나, 또는 천식의 치료 또는 예방에서 호중구성 염증 반응을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 천식에서 높은 수준의 호산구는 기저막 구역의 농후화와 병리학적으로 연관되고, 따라서 천식의 치료 또는 예방에서 호산성 염증 반응을 감소시키는 것은 상기 질환의 이러한 특질을 특이적으로 해소할 수도 있다. 또한, 상승된 호산구와 조합으로 또는 이들의 부재에서, 상승된 호중구는 중증 천식 및 만성 기도 협착과 연관된다. 이런 이유로, 호중구성 염증 반응을 감소시키는 것은 중증 천식을 해소하는 데 특히 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 이들 조성물은 알레르기성 천식에서 세기관지주위 침윤을 감소시키거나, 또는 알레르기성 천식의 치료에서 세기관지주위 침윤을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 호중구성 천식에서 세기관지주위 및/또는 혈관주위 침윤을 감소시키거나, 또는 알레르기성 호중구성 천식의 치료에서 세기관지주위 및/또는 혈관주위 침윤을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 TNF-α 수준에서 감소를 제공하거나 또는 이들 수준에서 상승을 예방한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 호산성 및/또는 호중구성 염증 반응의 감소를 유발하는, 천식을 치료하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 치료되는 환자는 예를 들면, 혈액 표본추출 또는 객담 분석을 통해 확인된 바와 같이, 상승된 호중구 또는 호산구 수준을 갖거나, 또는 갖는 것으로 이전에 확인되었다.
본 발명의 조성물은 신생아, 또는 임산부에게 투여될 때 신생아에서 천식의 발달을 예방하는 데 유용할 수 있다. 이들 조성물은 소아에서 천식의 발달을 예방하는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 성인-발병 천식을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천식을 관리하거나 또는 경감하는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히, 알레르겐, 예컨대 실내 먼지 좀진드기에 의해 악화되는 천식과 연관된 증상을 감소시키는 데 유용할 수 있다.
천식의 치료 또는 예방은 예를 들면, 증상의 심각도의 경감, 또는 환자에게 문제가 되는 악화의 빈도 또는 유발요인의 범위에서 감소를 지칭할 수 있다.
- 건선
건선은 만성 염증성 피부 질환이다. HDAC1의 과다발현이 건선 환자로부터 피부 생검에서 보고되었고 (Tovar-Castillo et al., 2007, Int J Dermatol, 46, 239-46), 그리고 HDAC 저해제가 Foxp3+ Tregs의 Foxp3-RORγt+ IL-17/Tregs로의 전환 (건선 질환 진행과 연관된 변동)을 차단하는 것으로 밝혀졌다 (Bovenschen et al., 2011, J Invest Dermatol, 131, 1853-60). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 건선을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 건선을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 건선을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 건선을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
- 전신성 홍반성 루푸스
전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 자가면역 질환이다. HDAC 저해는 세포 배양액 및 SLE의 생쥐 모형에 대한 연구에 근거하여 SLE를 치료하기 위한 유망한 치료적 접근법인 것으로 생각된다 (Reilly et al., 2011, Mol Med, 17 (5-6), 417-425). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 전신성 홍반성 루푸스를 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 SLE를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 SLE를 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 SLE를 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
- 동종이식 거부반응
동종이식 거부반응은 이식된 조직이 수용자의 면역계에 의해 거부될 때 발생한다. 뮤린 심장 이식조직에 대한 연구는 HDAC 저해가 이식편내 히스톤 3 아세틸화를 증가시키고 Foxp3 단백질 (면역 반응을 제어하는 데 관련된 포크헤드 전사 패밀리 구성원)의 증가된 이식편내 수준, 조직 구조의 유지, 그리고 대조에 비하여 만성 거부반응의 징표의 결여와 연관된다는 것을 보여주었다 (Wang et al., Immunol Cell Biol, 1-8). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 동종이식 거부반응을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동종이식 거부반응을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동종이식 거부반응을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동종이식 거부반응을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
- 당뇨병
진성 당뇨병은 낮은 수준의 인슐린 및/또는 주변 인슐린 저항성이 고혈당증을 야기하는 일군의 질환이다. HDAC 저해는 그 중에서도 특히, Pdx1의 억제해제 (Park et al., 2008, J Clin Invest, 118, 2316-24), 내분비 선조 세포의 풀을 증가시키는 전사 인자 Ngn3의 발현 증강 (Haumaitre et al., 2008, Mol Cell Biol, 28, 6373-83) 및 인슐린 발현 증강 (Molsey et al., 2003, J Biol Chem, 278, 19660-6)을 비롯한, 다양한 기전에 의해 당뇨병을 치료하는 것으로 제안되었다. HDAC 저해는 또한, 후기 당뇨 합병증, 예컨대 당뇨병성 신장병증 및 망막 허혈에 대한 유망한 치료법이다 (Christensen et al., 2011, Mol Med, 17 (5-6), 370-390). 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 개체에서 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 I형 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 II형 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 치료 또는 예방은 HDAC 활성화를 감소시키거나 또는 예방함으로써 달성된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 당뇨병을 앓는 환자를 치료하는 데 이용을 위한 것이고, 여기서 상기 환자는 상승된 HDAC 수준 또는 활성을 갖는다.
- 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)
본 발명의 조성물은 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다. GVHD는 개체 내로 동종이계 조직의 이식 이후에 의학적 합병증이다. GVHD는 통상적으로, 줄기 세포 또는 골수 이식 또는 고형 장기 이식 이후에, 특히 이식편 (다시 말하면, 공여자) 및 숙주 (다시 말하면, 수용자)의 유전적 배경이 상이한 경우에 발생한다.
GVHD의 병태생리는 3가지 구별되는 시기를 포함한다. 먼저, 숙주 항원 제시 세포 (APCs), 예컨대 수지상 세포 (DCs)가 이식된 조직의 외래 물질로서의 인식 이후에 활성화된다. APC 활성화가 작동체 면역 세포, 예컨대 전통적인 세포독성 T 세포의 모집과 활성화에 선행하고, 이러한 모집과 활성화는 외래 조직의 파괴 또는 거부를 야기한다.
HDAC 저해는 GVHD의 치료 또는 예방에서 유용한 강력한 다면발현성 항염증 효과를 매개하는 것으로 밝혀졌다. HDAC 저해는 GVHD 병리생리학적 연쇄 반응의 복수의 포인트에서 저해할 수 있다. 예를 들면, HDAC 저해는 STAT-3 의존성 방식으로 인돌아민 2,3-디옥시게나아제의 발현을 증강함으로써, 생체내에서 동종이계 조직에 대한 항원 제시 세포와 수지상 세포 활성화를 예방한다 [25]. STAT-1 활성의 HDAC 저해 역시 GVHD의 치료 또는 예방에서 유익한 것으로 밝혀졌다 [26]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 APC 활성화를 저해함으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다.
HDAC 저해는 또한, 생체내에서 Treg 세포 개체군 및 활성을 확대하는 것으로 밝혀졌다 [27]. Treg 세포 활성의 HDAC 저해-매개된 상향조절은 전통적인 세포독성 T 세포 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 GVHD 병리생리학적 연쇄 반응의 2번째 시기를 억제함으로써 GVHD의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전통적인 세포독성 T 세포 활성을 감소시킴으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전통적인 세포독성 T 세포 활성을 감소시키는 데 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포 활성을 상향조절함으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다.
공여자 NK 세포는 숙주 APCs를 제거함으로써, GVHD를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. HDAC 저해는 NK 세포 활성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 NK 세포 활성을 증가시키는 데 이용될 수 있는데, 이것은 APCs의 제거를 증가시킴으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 숙주 APCs의 제거를 증강함으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NK 세포 활성을 증강함으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 숙주 APCs의 NK 세포 활성-매개된 제거를 증강함으로써, GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 숙주가 이식조직을 제공받은 후, 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체가 이식조직을 제공받기 전, 숙주에게 투여될 수 있다. 이식조직이 받아들여지기 전, 본 발명의 조성물의 투여는 이식된 조직에 대항하여 염증 반응 또는 자가면역 반응이 유도되지 않도록 개체의 면역계를 초회감작하는 데 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GVHD를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 방지적으로 GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GVHD의 방지에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 이식 조직 거부반응을 예방하는 방법에서 이용을 위한 것일 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 급성 GVHD를 치료하거나, 지연시키거나, 예방하거나 또는 이의 발병을 예방하는 데 유용할 수 있다. 급성 GVHD의 증상은 전형적으로, 이식의 첫 100 일 이내에 현성한다. 급성 GVHD의 지연, 치료 또는 예방은 특히, 이식 수술의 직후에 개체의 회복을 보조하는 데 유익할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 HDAC 활성을 저해함으로써, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 Treg 세포 활성을 상향조절함으로써, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 이들 조성물은 전통적인 세포독성 T 세포 활성을 저해함으로써, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물은 NK 세포 활성을 증강함으로써, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물은 APC 활성화를 저해함으로써, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이식 후 100 일 이내에 개체에게 투여될 때, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 방지적으로 개체에게 투여될 때, 예를 들면, 조성물이 이식 전 개체에게 투여될 때, 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 지속적인, 후발성 또는 재발성 급성 GVHD, 예컨대 이식 후 100 일 이후에 발생하거나 또는 재발하는 급성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 반구진성 피부 발진, 메스꺼움, 식욕부진, 설사, 심각한 복통, 일레우스 및 담즙울체성 고빌리루빈혈증으로 구성되는 목록에서 선택되는 급성 GVHD의 한 가지 또는 그 이상의 증상을 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 만성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방하는 데 유용할 수 있다. 만성 GVHD는 임의의 장기를 침범할 수 있고, 그리고 전형적으로 섬유증에 의해 특징화되는 복합적인, 다계통 장애이다. 만성 GVHD는 급성 GVHD로부터 진전할 수 있거나, 또는 급성 GVHD 이후에 무활동의 기간 후 나타날 수 있거나, 또는 데노보 나타날 수 있다. 만성 GVHD의 증상은 이식 이후에 임의의 시점에서 나타날 수 있다. 일정한 구체예에서, 이들 조성물은 HDAC 활성을 저해함으로써, 만성 GVHD를 치료하거나, 이를 예방하거나, 이의 발병을 예방하거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 유용할 수 있다. 이들 조성물은 Treg 세포 활성을 상향조절함으로써, 만성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 이들 조성물은 전통적인 세포독성 T 세포 활성을 저해함으로써, 만성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물은 NK 세포 활성을 증강함으로써, 만성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다. 본 발명의 조성물은 APC DC 활성화를 저해함으로써, 만성 GVHD를 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 줄기 세포, 골수 또는 고형 장기 이식을 최근에 겪었던 환자에게 투여를 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 줄기 세포, 골수 또는 고형 장기 이식이 필요한 환자에게 투여를 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 색소침착장애, 새로운 발병 탈모증, 다형피부증, 편평 태선-유사 발진 또는 경화성 특질, 손발톱 이영양증 또는 상실, 구강건조증, 입 궤양 (예컨대, 아프타성 구내염), 입에서 태선-유형 특질 (예컨대, 태선 경화증), 건성 각결막염, 건성 증후군, 반흔성 결막염, 근막염, 근염, 관절 경직, 질 경화증, 궤양형성, 식욕부진, 체중 감소, 식도막, 황달, 트랜스아미니티스, 흉막 삼출액, 폐색성 세기관지염, 신증후군, 심낭염, 혈소판감소증, 빈혈, 그리고 호중구감소증으로 구성되는 목록에서 선택되는 만성 GVHD의 한 가지 또는 그 이상의 증상을 치료하거나, 이의 발병을 지연시키거나, 이를 예방하거나 또는 이의 발병을 예방할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GVHD의 치료 또는 예방을 위한 한 가지 또는 그 이상의 약리학적 작용제와 조합으로 이용을 위한 것일 수 있다. 일정한 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 약리학적 작용제는 GVHD의 약리학적 예방 또는 치료를 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 약리학적 작용제 중에서 한 가지 또는 그 이상을 제공받고 있거나, 제공받았거나, 또는 제공받기 직전인 개체에서 GVHD의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 약리학적 작용제는 수베로일아닐리드, 보리스노스탯, ITF2357 시클로스포린, 시클로스포린, 시롤리무스, 펜토스타틴, 리툭시맙, 이마티닙, 미코페놀레이트 모페틸, 타크롤리무스, 프레드니손, 메토트렉사트, 레메스템셀-L 및 프로키말로 구성되는 목록에서 선택되고, 여기서 상기 약리학적 작용제는 GVHD의 치료 또는 예방을 위한 치료 효과량으로 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 체외 광영동을 제공받았거나, 제공받고 있거나, 또는 제공받기 직전인 개체에서 GVHD의 치료에서 이용을 위한 것이다.
암
HDAC 기능과 발현은 다양한 암에서 섭동되고, 그리고 종종, 불량한 예후를 야기한다. 암에서 HDAC 기능은 세포 증식 및 종양형성 표현형을 증진하는 유전자의 일탈적 발현 또는 기능과 연관된다. 일정한 암에서 HDACs는 암의 발병을 일차적으로 조절하고 종양유전자로서 설명된다. 다른 암에서 종양-융합 단백질은 부류 I HDACs를 모집하여, 세포 분화 또는 세포 주기 제어를 조절하는 유전자의 발현을 억제하고 세포 형질전환을 야기한다. HDAC 발현의 녹다운 또는 저해는 복수의 항암 효과, 예컨대 세포 주기 정지 및 증식의 저해, 아폽토시스, 분화 및 노화, 그리고 혈관형성의 붕괴를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성을 저해함으로써, HDAC 활성에 의해 매개된 암의 치료에서 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HDAC 활성에 의해 매개된 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 종양 크기에서 감소 또는 종양 성장에서 감소를 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종양 크기를 감소시키거나 또는 종양 성장을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 종양 크기 또는 성장을 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 고형 종양을 앓는 환자에서 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료에서 혈관형성을 감소시키거나 또는 예방하는 데 이용을 위한 것이다. HDACs에 의해 조절되는 유전자는 혈관형성에서 중심적인 역할을 갖는다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전이를 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. HDAC2는 위암의 발달 및 결장직장 종양발생에서 기능적 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다 [28,29]. 결장직장암의 생쥐 모형에서, HDAC2의 저해는 감소된 비율의 종양 발달을 유발하였다. 일정한 구체예에서, HDAC2를 선별적으로 저해하는 본 발명의 조성물은 결장직장암, 특히 HDAC2 활성에 의해 매개된 결장직장암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유방암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 유방암을 치료하는 데 효과적일 수 있고, 그리고 HDACs는 유방암에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 [30]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유방암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전립선암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 전립선암을 치료하는 데 효과적일 수 있는데, 그 이유는 HDAC 활성이 전립선암의 발달에서 주요한 역할을 수행하기 때문이다 [31]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전립선암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 암은 호르몬 난치성 전립선암이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 폐암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 폐암을 치료하는 데 효과적일 수 있고, 그리고 HDACs는 폐암에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 [32]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 폐암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 폐 암종이다. 바람직한 구체예에서, 이들 조성물은 HDAC2의 높은 수준의 발현을 갖는 폐암의 치료에서 이용을 위한 것이다. 일정한 폐암 조직은 HDAC2를 풍부하게 발현하는 것으로 밝혀졌다. HDAC2의 비활성화는 폐암 세포 성장을 억제한다. 높은 수준의 HDAC2 활성은 p53 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다 [33]. 활성 p53은 세포 분열을 정지시키고 아폽토시스의 개시를 궁극적으로 야기한다. 일정한 구체예에서, HDAC2를 저해하는 본 발명의 조성물은 높은 수준의 HDAC2 활성을 갖는 폐암의 치료에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 간암을 치료하는 데 효과적일 수 있고, 그리고 HDACs는 간암에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 [34]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 간암의 치료에서 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 또는 혈관형성을 감소시키는 데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서 암은 간암 (간세포 암종)이다. 일정한 구체예에서, 암은 낮은 등급 또는 초기 단계 종양이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 특히, 암종을 치료하는 데 효과적일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 비면역원성 암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 비면역원성 암을 치료하는 데 효과적일 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병, 부신 피질 암종, 기저-세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈 종양, 골육종/악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 유방암, 기관지 선종/카르시노이드, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종, 안구내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질성 종양 (GIST), 생식 세포 종양, 신경교종, 아동기 시각 경로 및 시상하부, 호지킨 림프종, 흑색종, 도세포 암종, 카포시 육종, 신장 세포 암, 후두암, 백혈병, 림프종, 중피종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 인두암, 뇌하수체 선종, 형질 세포 신생물, 전립선암, 신장 세포 암종, 망막모세포종, 육종, 고환암, 갑상선암, 또는 자궁암을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 특히, 추가 치료제와 조합으로 이용될 때 효과적일 수 있다. 본 발명의 조성물의 HDAC 저해 효과는 추가 직접 항암제와 병용될 때 효과적일 수 있다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주 및 항암제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서 항암제는 면역 관문 저해제, 표적화된 항체 면역요법, CAR-T 세포 요법, 암용해 바이러스, 또는 정균성 약물이다. 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 항암제를 포함한다: 예르보이 (이플리무맙, BMS); 키트루다 (펨브로리주맙, Merck); 옵디보 (니볼루맙, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); 트레멜리무맙 (AZ/MedImmune); CT-011 (피딜리주맙, CureTech); BMS-986015 (리릴루맙, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS-663513 (우렐루맙, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (바릴루맙; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK-4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (인독시모드, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); 항-VISTA (JnJ); 에파카드스타트 (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); 에막투주맙 (Roche/Genentech); 갈루니서팁 (Eli Lilly); 울로쿠플루맙 (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); 바비툭시맙 (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW-7197 (Ewha Women's University, Korea); 베무라페닙 (Plexxikon); 다브라페닙 (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); 유니툭신 (디누툭시맙, United Therapeutics Corporation); 블린사이토 (블리나투모맙, Amgen); 시람자 (라무시루맙, Eli Lilly); 가지바 (오비누투주맙, Roche/Biogen); 캐드실라 (아도-트라스투주맙 엠탄신, Roche/Genentech); 퍼제타 (페르투주맙, Roche/Genentech); 애드세트리스 (브렌툭시맙 베도틴, Takeda/Millennium); 아르제라 (오파투무맙, GSK); 벡티빅스 (파니투무맙, Amgen); 아바스틴 (베바시주맙, Roche/Genentech); 어비툭스 (세툭시맙, BMS/Merck); 벡사르 (토시투모맙-I131, GSK); 제발린 (이브리투모맙 티욱세탄, Biogen); 캄패스 (알렘투주맙, Bayer); 밀로타르그 (겜투주맙 오조가미신, Pfizer); 헤르셉틴 (트라스투주맙, Roche/Genentech); 리툭산 (리툭시맙, Genentech/Biogen); 볼로식시맙 (Abbvie); 에나바투주맙 (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); 엘로투주맙 (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); 오자랄리주맙 (Ablynx); 악티맙-C (Actinium); 악티맙-P (Actinium); 밀라투주맙-독스 (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); 나프투모맙 에스타페나톡스 (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS-16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (사말리주맙, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); ALT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (아데카투무맙, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); 릴로투무맙 (Amgen); 데노수맙 (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); 목세투모맙 파수도톡스 (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); 아네투맙 라브탄신 (Bayer); 반틱투맙 (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); 시브로투주맙 (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); 오비누투주맙 (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX-1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); 네시투무맙 (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); 파트리투맙 (Daiichi Sankyo); 티가투주맙 (Daiichi Sankyo); 니모투주맙 (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); 식수투무맙 (Eli Lilly); 플란보투맙 (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); 라무시루맙 (Eli Lilly); 타발루맙 (Eli Lilly); 자놀리무맙 (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); 카투막소맙 (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (뎀시주맙, GSK); 마파투무맙 (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); 밀라투주맙-독스 (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); 에프라투주맙 (Immunomedics); 클리바투주맙 (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); 다라투무맙 (Janssen/Genmab); CNTO-95 (인테투무맙, Janssen); CNTO-328 (실툭시맙, Janssen); KB004 (KaloBios); 모가물리주맙 (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (에크로멕시맙, Life Science); 소네프시주맙 (Lpath); 마게툭시맙 (Macrogenics); 에노블리투주맙 (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (달로투주맙, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (엔시툭시맙, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (루카투무맙, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (뎀시주맙, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); 반틱투맙 (Oncomed/Bayer); CMC-544 (이노투주맙 오조가미신, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (네스바쿠맙, Regeneron/Sanofi); REGN421 (에노티쿠맙, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (파르사투주맙), RG7160 (임가투주맙), RG7159 (오비누투주맙), RG7686, RG3638 (오나르투주맙), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A (린투주맙, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (보르세투주맙 마포도틴, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); 이브리투모맙 티욱세탄 (Spectrum); MLN0264 (Takeda); 가니투맙 (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); 니모투주맙 (YM Biosciences); 카를루맙 (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX-401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR-NKG2D (Celyad); 오닉스-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DNX-2401 (DNAtrix); VCN-01 (VCN Biosciences); 콜로-Ad1 (PsiOxus Therapeutics); 프로스타타크 (Advantagene); 온코스-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); 펙사벡 (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OrienGene Biotechnology); 레올리신 (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); 카바탁 (CVA21, Viralytics); 알림타 (Eli Lilly), 시스플라틴, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 폴리닌산, 메토트렉사트, 시클로포스파미드, 5-플루오로우라실, 지카디아 (Novartis), 타핀라 (GSK), 잴코리 (Pfizer), 이레싸 (AZ), 질로트리프 (Boehringer Ingelheim), 타세바 (Astellas Pharma), 할라벤 (Eisai Pharma), 벨리파립 (Abbvie), AZD9291 (AZ), 알렉티닙 (Chugai), LDK378 (Novartis), 제네테스핍 (Synta Pharma), 테르젠푸마투셀-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), 티반티닙 (ArQule); 사이톡산 (BMS); 온코빈 (Eli Lilly); 아드리아마이신 (Pfizer); 겜자르 (Eli Lilly); 젤로다 (Roche); 익셈프라 (BMS); 아브락산 (Celgene); 트렐스타 (Debiopharm); 탁소테르 (Sanofi); 넥사바르 (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); 써모독스 (Celsion); 코메트리크 (Exellxis); 론서프 (Taiho Pharmaceuticals); 캄프토사르 (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); 및 TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암의 치료 또는 예방에서 GPR109a 유전자 발현을 유도하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 결장직장암, 예컨대 결장직장 선암종을 치료하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 이용된 Caco-2 세포주는 결장직장 선암종 세포주이고, 그리고 본 발명의 조성물은 이런 세포에 대한 유용한 효과를 갖는 것으로 나타났다.
일정한 구체예에서, 이들 조성물은 전이성 흑색종, 소세포 폐암 또는 선편평상피 폐 암종을 치료하거나 예방하는 데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 도시된 NSE에 대한 효과는 본 발명의 조성물이 이들 암에 대항하여 특히 효과적일 수 있다는 것을 암시한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 내재성 항산화능을 전시한다. 실제로, 항산화능은 특히, 암 발달과 연관된 이들 유형의 손상된 유리 라디칼의 회피에 의해 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항산화능을 통해 암을 치료하거나 예방한다.
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주로 장에 전달 및/또는 장의 부분적인 또는 전체 집락형성을 할 수 있게 하기 위해 위장관에 투여될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구 투여되지만, 이들은 직장, 비내, 또는 협측 또는 설하 루트를 통해 투여될 수도 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 거품, 스프레이 또는 겔로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 예를 들면, 테오브로마 오일 (코코아 버터), 합성 경지방 (예를 들면, 수포시르, 위텝솔), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물의 형태에서 좌약, 예컨대 직장 좌약으로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 튜브, 예컨대 비강영양관, 입위관, 위관, 공장조루술 튜브 (J 튜브), 경피적 내시경 위조루술 (PEG), 또는 포트, 예컨대 위, 공장 및 다른 적합한 접근 포트에 접근을 제공하는 흉벽 포트를 통해 위장관에 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 또는 이들은 치료 섭생의 일부로서 순차적으로 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여될 것이다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 본 발명에 따른 치료는 환자의 소화관 미생물총의 사정을 동반한다. 만약 본 발명의 균주의 전달 및/또는 이것으로 부분적인 또는 전체 집락형성이 효능이 관찰되는 정도로 달성되지 않으면 치료는 반복될 수 있고, 또는 만약 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성이 성공적이고 효능이 관찰되면 치료는 중단될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 소아에서 및/또는 소아가 출생한 후 염증 질환 또는 자가면역 질환이 발달하는 것을 예방하기 위해 임신 동물, 예를 들면, 포유동물, 예컨대 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애로 진단되었거나, 또는 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 이들 조성물은 또한, 건강한 환자에서 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 발달을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비정상적인 소화관 미생물총을 갖는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 환자는 메가스파에라 (Megasphaera), 그리고 특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)에 의한 감소된 집락형성을 갖거나 또는 집락형성이 부재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 산물, 예컨대 영양 보충제로서 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 비록 이들이 단위 포유동물, 예컨대 가금류, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼를 비롯한 동물을 치료하는 데 이용될 수 있긴 하지만, 인간의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 성과를 증강하는 데 유용할 수 있다. 만약 동물에게 투여되면, 경구 위관영양이 이용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 세균을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 동결 건조된 형태에서 조제된다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들면, 경성 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결 건조된 세균을 포함한다. 세균의 동결 건조는 충분히 확립된 절차이고, 그리고 유관한 보도가 예를 들면, 참고문헌 [35,,37]에서 가용하다.
대안으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활성 세균 배양액을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장에 세균 균주의 전달을 가능하게 하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는 예를 들면, 화학적 또는 물리적 자극, 예컨대 압력, 효소 활성, 또는 pH에서 변화에 의해 촉발될 수 있는 물리적 붕괴로 파열하는 것을 통해, 목표 위치에서 전달 때까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적합한 캡슐화 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술은 다공성 매트릭스 내에 포획, 고체 운반체 표면상에 부착 또는 흡착, 면상반응에 의한 또는 교차연결 작용제로 자가-응집, 그리고 미소다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤에서 기계적 봉쇄를 포함한다. 본 발명의 조성물을 제조하는 데 유용할 수 있는 캡슐화에 관한 보도는 예를 들면, 참고문헌 [38] 및 [39]에서 가용하다.
조성물은 경구 투여될 수 있고, 그리고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 메가스파에라 (Megasphaera)가 혐기균이기 때문에, 캡슐화된 산물이 선호된다. 다른 성분 (예컨대, 예를 들면, 비타민 C)이 생체내에서 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성과 생존을 향상시키기 위한 산소 스캐빈저 및 프리바이오틱 기질로서 포함될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 식품 또는 영양적 산물, 예컨대 우유 또는 유장 기초된 발효된 유제품으로서, 또는 제약학적 산물로서 경구 투여될 수 있다.
조성물은 프로바이오틱으로서 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주의 치료 효과량을 포함한다. 세균 균주의 치료 효과량은 환자에게 유익한 효과를 발휘하는 데 충분하다. 세균 균주의 치료 효과량은 환자의 장에 전달 및/또는 이것의 부분적인 또는 전체 집락형성을 유발하는 데 충분할 수 있다.
예를 들면, 성인에 대한 세균의 적합한 일일량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU); 예를 들면, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011 CFU일 수 있다.
일정한 구체예에서, 세균의 용량은 적어도 하루에 109개 세포, 예컨대 하루에 적어도 1010, 적어도 1011, 또는 적어도 1012개 세포이다.
일정한 구체예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대하여 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 예를 들면, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 세균 균주를 내포한다. 용량은 예를 들면, 1 g, 3g, 5g 및 10g일 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주의 양이 조성물의 중량에 대하여 그램당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위인 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 제약학적 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 500mg 및 1000mg 사이, 600mg 및 900mg 사이, 700mg 및 800mg 사이, 500mg 및 750mg 사이, 또는 750mg 및 1000mg 사이의 용량으로 투여된다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 제약학적 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 제약학적 조성물에서 동결 건조된 세균은 500mg 및 1000mg 사이, 600mg 및 900mg 사이, 700mg 및 800mg 사이, 500mg 및 750mg 사이, 또는 750mg 및 1000mg 사이의 용량으로 투여된다.
전형적으로, 프로바이오틱, 예컨대 본 발명의 조성물은 임의적으로, 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 통상적으로, 비소화성 탄수화물, 예컨대 올리고당류 또는 다당류, 또는 당 알코올인데, 이것은 상부 소화관에서 분해되거나 또는 흡수되지 않는다. 공지된 프리바이오틱스는 상업적인 산물, 예컨대 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당류를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 총 중량 조성물에 대하여 중량으로 약 1 내지 약 30% (예를 들면, 중량으로 5 내지 20%)의 양으로 프리바이오틱 화합물을 포함한다. 탄수화물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: 프럭토- 올리고당류 (또는 FOS), 짧은 사슬 프럭토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로-올리고당류 (또는 XOS), 키토산-올리고당류 (또는 COS), 베타-글루칸, 경작가능 검 변형된 및 난소화성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토오스, 아카시아 섬유, 캐럽, 귀리, 그리고 감귤류 섬유. 한 양상에서, 프리바이오틱스는 짧은 사슬 프럭토-올리고당류 (단순함을 위해 본원에서 FOSs-c.c로서 아래에 도시됨)이다; 상기 FOSs-c.c는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 획득되고, 그리고 3개의 글루코오스 분자가 결합되는 사카로오스 분자를 포함하는 가소화성 탄수화물이 아니다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 운반체를 포함할 수 있다. 이런 적합한 부형제의 실례는 참고문헌 [40]에서 발견될 수 있다. 치료적 용도를 위한 허용되는 운반체 또는 희석제는 제약 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면, 참고문헌 [41]에서 설명된다. 적합한 운반체의 실례는 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 희석제의 실례는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다. 제약학적 운반체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 루트 및 표준 제약학적 관례에 대하여 선별될 수 있다. 제약학적 조성물은 운반체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 이것에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 실례는 전분, 젤라틴, 천연당, 예컨대 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 천연과 합성 검, 예컨대 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 실례는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 보존제, 안정제, 염료 및 심지어 풍미제가 제약학적 조성물에서 제공될 수 있다. 보존제의 실례는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 산물로서 조제될 수 있다. 예를 들면, 식품 산물은 예컨대, 영양 보충제에서 본 발명의 치료 효과에 더하여 영양적 유익성을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품 산물은 본 발명의 조성물의 맛을 증강하거나, 또는 상기 조성물이 제약학적 조성물보다는 통상적인 식품과 더욱 유사함으로써 소비하기에 더욱 매력적으로 만들어지도록 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기초된 산물로서 조제된다. 용어 "우유-기초된 산물"은 변하는 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기초된 산물을 의미한다. 우유-기초된 산물은 예를 들면, 우유, 산양유, 양유, 탈지된 우유, 전유, 어떤 처리도 없이 분말화된 우유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 가공된 산물, 예컨대 요구르트, 응유, 응유, 신 우유, 신 전유, 버터 우유 및 다른 신 우유 산물일 수 있다. 다른 중요한 군은 우유 음료, 예컨대 유장 음료, 발효유, 연유, 영아 또는 유아용 우유; 가미유, 아이스크림; 우유-내포 식품, 예컨대 사탕을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단일 세균 균주 또는 종을 내포하고 임의의 다른 세균 균주 또는 종을 내포하지 않는다. 이런 조성물은 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 세균 균주 또는 종을 포함할 수 있다. 이런 조성물은 다른 종의 생물체가 실제적으로 없는 배양액일 수 있다.
본 발명에 따른 용도를 위한 조성물은 시판 승인을 필요로 하거나 또는 필요로 하지 않을 수도 있다.
일부 경우에, 동결 건조된 세균 균주는 투여에 앞서 재구성된다. 일부 경우에, 재구성은 본원에서 설명된 희석제의 이용에 의한다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 운반체를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때 장애를 치료하는 데 충분한 양으로 있고; 그리고 여기서 상기 장애는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 운반체 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고; 여기서 상기 세균 균주는 HDAC에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환 또는 장애는 염증 질환 또는 자가면역 질환, 예컨대 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 또는 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 또는 암, 예컨대 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주의 양이 조성물의 중량에 대하여 그램당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위인 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량에서 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 경구, 직장, 피하, 코, 협측 및 설하로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군에서 선택되는 운반체를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성된 군에서 선택되는 희석제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 아카시아, 트래거캔스, 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 부형제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정제 중에서 적어도 한 가지를 더욱 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르로 구성된 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 세균 균주가 동결 건조되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 밀봉된 용기에서 약 4℃ 또는 약 25℃에서 보관되고 상기 용기가 50% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치될 때, 집락 형성 단위에서 계측에서 세균 균주 중에서 적어도 80%가 적어도 약: 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년의 기간 후 남아있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
배양하는 방법
본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 예를 들면, 참고문헌 [42,,44]에서 상술된 바와 같은 표준 미생물학 기술을 이용하여 배양될 수 있다.
배양에 이용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지는 하기를 포함할 수 있다 (100ml마다, 근사 값): 카시톤 (1.0 g), 효모 추출물 (0.25 g), NaHCO3 (0.4 g), 시스테인 (0.1 g), K2HPO4 (0.045 g), KH2PO4 (0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4 (0.09 g), MgSO4 ㆍ 7H2O (0.009 g), CaCl2 (0.009 g), 레자주린 (0.1 mg), 헤민 (1 mg), 비오틴 (1 μg), 코발라민 (1 μg), p-아미노벤조산 (3 μg), 엽산 (5 μg), 그리고 피리독사민 (15 μg).
백신 조성물에서 이용을 위한 세균 균주
본 발명자들은 본 발명의 세균 균주가 HDAC에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용하다는 것을 확인하였다. 이것은 본 발명의 세균 균주가 숙주 면역계에 대해 갖는 효과의 결과일 가능성이 높다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 또한, 백신 조성물로서 투여될 때, HDAC에 의해 매개된 질환 또는 장애를 예방하는 데 유용할 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 사멸되거나, 비활성화되거나 또는 약독화될 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 조성물은 백신 어쥬번트를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조성물은 주사에 의한, 예컨대 피하 주사에 의한 투여를 위한 것이다.
일반적
본 발명의 실시는 별도로 지시되지 않으면, 당해 분야의 기술 내에 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약리학의 전통적인 방법을 이용할 것이다. 이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 설명된다. 참조: 예를 들면, 참고문헌 [45] 및 [46,52] 등.
용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄한다, 예를 들면, X를 "포함하는" 조성물은 X로 배타적으로 구성될 수 있거나, 또는 추가로 무언가, 예를 들면, X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 임의적이고 예를 들면, x +10%를 의미한다.
단어 "실제적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예를 들면, Y가 "실제적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우에, 단어 "실제적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 서열 동일성 백분율에 대한 언급은 정렬될 때, 뉴클레오티드들의 상기 백분율이 이들 두 서열의 비교에서 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 퍼센트는 당해 분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 참고문헌 [53]의 섹션 7.7.18에서 설명된 것들을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 12의 갭 개방 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스에서 아핀 갭 검색을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌 [54]에서 개시된다.
특정적으로 언급되지 않으면, 다양한 단계를 포함하는 과정 또는 방법은 상기 방법의 시작 또는 종결 시점에서 추가 단계를 포함할 수 있거나, 또는 추가 개재성 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계는 적절하면, 조합되거나, 제외되거나, 또는 대안적 순서에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예가 본원에서 설명된다. 각 구체예에서 특정된 특질은 추가 구체예를 제공하기 위해 다른 특정된 특질과 조합될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 특히, 본원에서 적합한, 전형적인 또는 바람직한 것으로 부각된 구체예는 서로 조합될 수 있다 (이들이 상호간에 배타적일 때를 제외하고).
발명을 실행하기 위한 방식
실시예 1 - 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 대한 세균의 효능
요약
히스톤 탈아세틸화효소 활성을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다. 히스톤 탈아세틸화효소의 조절장애는 염증성 장애와 자가면역 장애 및 암과 연관된 발병에 연루되었다.
재료와 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
히스톤 탈아세틸화효소가 존재하기 때문에, 세포주 HT-29가 이용되었다.
방법
정지기 세균 배양액의 세포-없는 상층액이 원심분리 및 0.22 uM 필터에서 여과에 의해 단리되었다. HT-29 세포가 합류후 3 일에 이용되고, 그리고 실험의 시작보다 24 시간 앞서 1 mL DTS에서 점감되었다. HT-29 세포는 DTS에서 희석된 10 % 세포-없는 상층액으로 공격되었고, 그리고 48 시간 동안 배양되도록 방치되었다. 이후, 뉴클레아제 단백질이 Sigma Aldrich 뉴클레아제 추출 키트를 이용하여 추출되었고, 그리고 표본은 HDAC 활성 계측에 앞서 즉시 동결되었다. HDAC 활성은 Sigma Aldrich (UK) 키트를 이용하여 형광분석적으로 사정되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 1a에서 도시된다. 도 1a는 MRX0029가 히스톤 탈아세틸화효소 활성의 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 2 - 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 대한 세균의 효능의 추가 분석
도입
본 발명자들은 HDAC 저해에 대한 MRX0029 및 이의 대사산물의 유용성을 조사하는 것을 모색하였다.
재료와 방법
세균 배양 및 세포-없는 상층액 수집
MRX0029 세균의 순수한 배양액은 이들이 그들의 정체 성장기에 도달할 때까지, YCFA 액상배지에서 혐기성으로 성장되었다. 배양액은 5 분 동안 5,000 x g에서 원심분리되었고, 그리고 세포-없는 상층액 (CFS)은 0.2 μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과되었다. CFS의 1 mL 분취량이 이용 때까지 -80 ℃에서 보관되었다. 부티르산나트륨, 헥산산 및 발레르산은 Sigma Aldrich (UK)로부터 획득되었고, 그리고 현탁액은 YCFA 액상배지에서 제조되었다.
세균 상층액의 SCFA 및 MCFA 정량
세균 상층액으로부터 짧은 사슬 지방산 (SCFAs) 및 중간 사슬 지방산 (MCFAs)은 하기와 같이 분석되고 MS Omics APS에 의해 정량되었다. 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 Johnsen, 2017, J Chromatogr A, 1503, 57-64에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
특정한 HDAC 활성 분석
특정한 HDAC 저해 활성은 각 유형의 HDAC에 대한 형광원 검정 키트 (BPS Bioscience, CA)를 이용하여 HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9에 대해 분석되었다. 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라서 수행되었고, 그리고 각 표본은 반복 검증으로 수행되었다. 세포-없는 상층액은 방법 사이에 일관성을 유지하기 위해 10분의 1로 희석되고 키트에 담겨 제공된 특정한 HDAC 단백질에 노출되었다.
결과
MRx0029는 HDAC 저해 대사산물 부티르산염 및 발레르산을 생산한다
MRx0029 상층액은 강한 HDAC 저해를 보여주었고, 그리고 각각, 5.08 mM 및 1.60 mM의 평균 농도에서 발레르산 및 헥산산을 생산하는 것으로 밝혀졌다 (도 16a와 c) (도 1c).
어떤 대사산물이 균주-유도된 HDAC 저해에 대한 책임이 있는 지를 조사하기 위해, 상이한 농도의 헥산산, 발레르산 및 부티르산나트륨이 전체 HT-29 세포 및 HT-29 세포 용해물에 대한 그들의 HDAC 저해에 대해 계측되었다. 도 1b에서 결과는 전체 세포에서뿐만 아니라 세포 용해물에서 부티르산나트륨에 의한 HDAC 활성의 유의미한 (P<0.05) 저해를 보여주고, 반면 헥산산은 유의미한 저해 활성을 보여주었다. 발레르산은 전체 HDAC 활성을 저해하였다 (* (p<0.05), ** (p<0.005), *** (P<0.001), **** (p<0.0001)).
조사된 강력한 전체 HDAC 저해제는 부류 I HDACs를 표적으로 한다.
검사 세균 균주의 특정한 HDAC 저해 프로필이 조사되었다. 특정한 HDAC 저해 검정 (BPS Bioscience, CA)이 부류 I HDACs에 대해 실행되었다. HDAC 효소를 저해하는 상기 세균 균주의 능력이 분석되었다. 결과 (도 2)는 MRX0029가 부류 1 HDAC 효소 (HDAC1, 2 및 3), 특히 HDAC2의 강력한 저해제라는 것을 증명한다.
논의
HDAC 저해 활성을 갖는 균주는 유의미한 양의 발레르산 및 헥산산뿐만 아니라 유의미한 양의 부티르산나트륨을 생산하였다 (도 1c). 순수한 물질로서 검사될 때, 발레르산 및 부티르산나트륨은 유의미한 HDAC 저해 (도 1b 및 2) (p<0.0001)를 유발하였다.
흥미롭게도, 특정한 HDAC 활성에 대한 결과는 검사된 균주가 부류 I HDACs, 그리고 특히 HDAC2의 강력한 저해제이라는 것을 보여준다 (도 2). 부류 I HDACs (HDAC1, 2, 3 및 8)는 핵 안에 있고, 그리고 여러 인간 세포 유형에서 편재성으로 발현된다. HDACs 1-3은 50% 이상의 상동성을 공유하지만, 상이한 구조 및 세포 기능을 갖는다 [55]. 이들은 세포 생존, 증식 및 분화에 일차적으로 관련되고, 그리고 따라서, 이들의 저해는 질환의 넓은 어레이에서 유용할 수 있다 [56,57,58,59,60]. 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 HDAC에 의해 매개된 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 3 - IL-6 분비를 감소시키는 세균 접종물의 효능.
요약
친염증성 사이토킨의 활성화는 염증 질환에서 손상과 연관되었다. 지질다당류 (LPS)는 친염증성 사이토킨 IL-6의 공지된 자극기이다. 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 IL-6의 수준을 조정하는 능력을 관찰하기 위해 LPS와 조합으로 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물로 처리되었다.
재료와 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
MG U373은 악성 종양으로부터 유래된 인간 교모세포종 성상세포종이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 08061901-1VL)로부터 구입되었다. MG U373 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액 및 1X 피루브산나트륨으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M-2279)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, MG U373 세포는 24-웰 평판에서 100,000개 세포/웰로 도말되었다. 이들 세포는 단독으로 또는 MRx0029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (1ug/mL)로 24 시간 동안 처리되었다. 대조 또한 수행되었는데, 여기서 이들 세포는 처리되지 않은 배지에서 배양되었다. 그 후에, 세포-없는 상층액이 수집되고, 4℃에서 3분 동안 10,000g에서 원심분리되었다. IL-6은 제조업체 사용설명서에 따라서 Peprotech로부터 인간 IL-6 ELISA 키트 (카탈로그 번호 #900-K16)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 3에서 도시된다. LPS 및 상기 세균 균주로 세포의 처리는 분비된 IL-6의 수준에서 감소를 야기하였다.
실시예 4 - NF-κB 활성화를 감소시키는 세균 접종물의 효능
요약
NF-κB 프로모터의 활성화는 IL-1β, IL-1α, IL-18, TNFα 및 IL-6을 비롯한 친염증성 사이토킨의 생산을 야기한다. NF-κB 프로모터는 TLR4 리간드를 자극함으로써 α-시누클레인 및 LPS에 의해 활성화될 수 있다. NF-κB 프로모터의 활성화를 저해하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다.
재료와 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
세포주
인간 HEK blue TLR4는 InvivoGen (카탈로그 번호 hkb-htlr4)으로부터 구입되었다. 인간 HEK blue TLR4는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 노르모신 및 1X HEK Blue 선별 용액으로 보충된 DMEM 높은 글루코오스 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 D-6171)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, 인간 HEK blue 세포는 4회 반복 검증에서 96 웰 평판에서 25,000개 세포/웰로 도말되었다. 세포는 단독으로 또는 MRx0029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (10 ng/mL, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 (Salmonella enterica serotype Typhimurium)으로부터, Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 L6143)로 22 시간 동안 처리되었다. 이들 세포는 차후에 스핀다운되었고, 그리고 20ul의 상층액이 200ul의 Quanti Blue 시약 (InvivoGen, 카탈로그 번호 rep-qb2)와 혼합되고, 2 시간 동안 배양되고, 그리고 흡광도가 655nm에서 판독되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 4에서 도시된다. 도 4는 LPS에 의한 NFκB 프로모터의 활성화가 MRx0029에 의해 저해된다는 것을 보여준다.
실시예 5 - 항산화능을 변경하는 세균 접종물의 효능
요약
항산화능을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력. 상기 세균 균주의 항산화능은 널리 알려진 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)) 검정을 이용하여 확립되었다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
세균 세포 (106개 또는 그 이상)가 수집되고 원심분리되었다. 이들은 검정 완충액에서 재현탁되었다 (3배의 펠렛 용적을 이용하여). 현탁액은 얼음 위에서 5 분 동안 초음파처리되고, 그리고 이후, 10 분 동안 12,000 x g에서 스핀다운되었다. 상층액은 제거되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서, Sigma Aldrich에 의해 생산된 ABTS 검정 키트 (코드 CS0790)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 6에서 도시된다. 도 6은 MRx0029가 트롤록스와 비교하여 대략 2mM의 항산화능을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 6 - 지질 과산화 수준을 변경하는 세균 접종물의 효능
요약
지질 과산화 수준을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다. 티오바르비툴산 반응성 물질 검정 (TBARs)이 지질 과산화의 부산물을 계측하는 데 이용되었다.
재료와 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
방법
세균 세포 (106개 또는 그 이상)가 수집되고 원심분리되었고, 세척 단계가 등장성 식염수로 수행되었고, 이후 펠렛이 염화칼륨 검정 완충액에서 재현탁되었다. 현탁액은 얼음 위에서 10 분 동안 초음파처리되고, 그리고 이후, 10 분 동안 10,000 x g에서 스핀다운되었다. 상층액은 제거되었고, 그리고 지질 과산화의 수준이 티오바르비툴산 반응성 물질 검정을 이용하여 평가되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 6에서 도시된다. 도 6은 MRx029가 지질 과산화를 대략 20 % 저해할 수 있다는 것을 보여주는데, 이것은 양성 대조, 부틸화된 히드록시톨루엔 (1% w/v)보다 높은 항산화능이다.
실시예 7 - 세균에서 인돌 생산의 수준
요약
인돌을 생산하는 본 발명의 세균의 능력이 조사되었다. 인돌은 염증 및 산화 스트레스를 약화시키는 데 연루되었다.
재료와 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029
ATCC 11775는 인돌을 생산하는 것으로 알려져 있는 세균 표준 균주이다.
방법
정지기에서 무손상 세균 세포가 6mM 트립토판과 함께 48 시간 동안 배양되었다. 효소 트립토판분해효소를 소유하는 세균 종은 트립토판을 기질로서 활용하여 인돌을 생산할 것이다. 48 시간 배양 기간 이후에, 상층액이 제거되고 인돌의 정량을 위해 코바크 시약에 첨가되었다. 표준, 원액 및 시약은 인-하우스 검증된 표준화된 방법을 이용하여 제조되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 7에서 도시된다. 도 7은 MRx0029가 대략 0.2mM의 농도에서, 트립토판으로부터 인돌을 생산하는 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 8 - 회장에서 백혈구 침윤을 감소시키는데 있어서 MRx0029의 효능
1. 연구 목적
본 연구의 목적은 반복된 경구 투여 시에, DSS-유도된 대장염 생쥐 모형에서 MRX029의 방지 효능을 결정하는 것이었다.
2. 재료와 방법
2.1. 검사 물질
- 2.1.1 검사 물질
YCFA는 사전 감소된 YCFA를 내포하는 쉽게 제조된 Hungate 튜브이었다
MRx0029는 동결된 글리세롤 스톡의 형태에서 제조되었다.
- 2.1. 2 참조 물질
타크롤리무스 - (Sigma PHR-1809 - 로트 LRAA8723)
발프로산 (Arrow Generiques - 200 mg/mL - 배치 10.15 - 유효 기간 11/2020)
- 2.1.3 추가 시약
MP Biomedicals로부터 DSS (36,000-50,000 Da), 카탈로그 번호: 0216011090
Gibco로부터 PBS (Ca/Mg 없음), 카탈로그 번호: 14190-094
Sigma로부터 Tween 80, 카탈로그 번호: P4780-100ML
o Lavoisier로부터 무균 0.9% NaCl, 카탈로그 번호: CIP 3400 963 340 763
o Aguettant로부터 무균 증류수, 카탈로그 번호: 600499
- 2.1. 4 참조 물질 제조
타크롤리무스는 무균 1% Tween 80, 0.9% NaCl에서 0.1 mg/mL의 농도로 매일 제조되었다.
발프로산은 무균 증류수에서 20 mg/mL (희석 1/ 10)의 농도로 매일 제조되었다.
- 2.1. 5 세균 전배양
세균 전배양액은 무균 기술을 이용한 하기의 프로토콜을 이용하여 제조되었다. -80 ℃에서 보관된 균주마다 1개의 글리세롤 스톡이 완전히 해동되고 짧게 와동 혼합되었다. 배지의 컬러가 밝은 갈색/황색인 해동된 스톡만 이용되었다. 만약 해동된 배지의 컬러가 더욱 어둡거나 또는 푸르스름하면, 글리세롤 스톡은 폐기되었다.
전배양액은 0.8x40 mm 바늘이 달린 1 mL 주사기를 이용하여 Hungate 튜브의 중격을 통해 400 μL의 글리세롤 스톡을 주입함으로써 제조되었다. 상기 튜브는 뒤집음에 의해 혼합되었고, 그리고 두 번째 Hungate 튜브가 이중으로 제조되었다. t= 0에서 접종된 Hungate 튜브 둘 모두의 OD6oo이 계측되었다 (비-접종된 Hungate 튜브가 블랭크로서 이용되었다). 이들 Hungate 튜브는 이후, 37℃에서 24 시간 동안 배양되었고, 그리고 OD가 주기적으로 계측되었다.
- 2.1.6 생쥐 투여를 위한 세균 본 배양
더욱 높은 OD6oo를 갖는 1 ml의 전배양액이 새로운 Hungate 튜브를 접종하는 데 이용되었다. 상기 튜브는 뒤집음에 의해 혼합되었다. 복제 접종물이 전술된 바와 같이 제조되고 배양되었다. OD600이 전술된 바와 같이 계측되고, 그리고 16 시간의 코스에 걸쳐 주기적으로 계측되었다. 종결 시점에서, 더욱 높은 OD6oo를 갖는 Hungate 튜브가 투약에 이용되었다.
2.2. 치료 용량
타크롤리무스는 1 mg/kg/일에서 투약되었다
발프로산은 200 mg/kg/일에서 투약되었다
PBS, YCFA 및 세균 배양액은 200 μL/일에서 투약되었다
2.3. 투여 루트
PBS, YCFA 및 살아있는 세균은 200 μL/생쥐의 고정된 용적 하에 매일 경구 (PO) 투여되었다
타크롤리무스는 10 mL/kg의 용적 하에 매일 피하 (SC) 투여될 것이다
발프로산은 10 mL/kg의 용적 하에 매일 경구 (PO) 투여될 것이다
2.4. 동물
63마리의 6 주령 건강한 수컷 C57BL/6J 생쥐는 각각 Charles River (France)로부터 획득되었고, 그리고 개별적으로 확인되고 특정한 코드로 표지화되었다. 각 치료군 (9마리 동물/군)은 3개의 상이한 케이지에서 수용되었다.
동물은 FELASA 지침에 따라서 SPF 건강 상태에서 유지되었고, 그리고 동물 하우징 및 실험 절차는 프랑스와 유럽 규정 및 NRC Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라서 시행되었다. ㆍ 동물의 생존력과 거동이 매일 기록되었다.
- 2.4.1. 하우징 조건
동물은 제어된 환경 조건 하에 하우징 룸에서 유지되었다: 온도: 22 ± 2℃; 습도 55 ± 10%; F9 여과된 공기; 광주기 (12 시간 밝음/12 시간 어둠); 재순환 없이, 시간당 15회 이상의 공기 교환.
동물 인클로저는 설명된 바와 같은 깔개, 사료와 물, 환경적 및 사회적 풍부화를 갖는 적절한 공간 (그룹 하우징)이 제공되었다:
· 폴리카보네이트 Eurostandard 유형 IIL 또는 Ill 여과된 탑 케이지
· 포플러 깔개 (TOPLIT SELECT FINE, JRS®, Germany),
· A04 제어된 표준 유지 식이 (Safe®, France),
· 수돗물,
· 환경적 풍부화*
· BioServices - Netherlands로부터 시즐네스트 및 작은 목재 스틱
· Plexx - Netherlands로부터 생쥐 이글루.
3. 실험 설계 및 치료
3.1. 생체내 연구
체중에 근거된 치료군 할당 전, 동물 무작위배정이 수행되었다. 교차 오염을 예방하기 위한 특별한 조치가 연구 내내 취해졌다. 예를 들면, 동물을 취급할 때, 임의의 오염 위험을 최소화하기 위해 장갑이 교체되었고 각 치료 케이지 사이에 70% 에탄올 용액이 분무되었다. 조직 수확 또한, 무균 조건 하에 수행되었다. 간단히 말하면, 표본 수확에 앞서, 모든 도구, 물질 및 수확 구역에 70% 에탄올이 분무되었다.
하루 주기 효과를 예방하고, 군 무작위배정을 최적화하고, 가양성 I 가음성을 방지하기 위해, 하기의 특별한 조치가 또한 취해졌다:
· 동일한 군이 매일 동일한 시점에 치료되는 것을 예방하기 위해, 치료가 무작위로 투여되고 매일 교대되었다
· 동일한 동물이 동일한 시점에서 취급되는 것을 예방하기 위해, 동물 조작과 취급이 무작위로 실행되고 매일 교대되었다
· 표본을 획득하는 각 시점에서, 군이 무작위배정되었다
3.2. 세균 본 배양액으로 동물의 투약
동물은 주사기 및 0.8x40 mm 바늘을 이용하여 Hungate 튜브로부터 투약 분취량을 추출하고 중격을 통해 주사함으로써 투약되었다. 투약 분취량이 추출되기 전, 상기 Hungate 튜브는 뒤집음에 의해 혼합되었다. 위관영양 바늘을 통해 첫 50-100 μL가 경구 위관영양에 의해 200 μL의 배양액과 함께 각 생쥐에 투약되었다
3.3. 생체내 연구
하기의 표는 연구 군을 지시한다.
Figure pct00001
치료는 하기와 같이 실행되었다:
-7 일자 내지 -1 일자: 상기 치료 표에 따른 세균 및 참조 물질로 치료
· 생쥐마다 PBS, YCF A 또는 세균 - 200 μL의 하루 1 회 경구 투여
· 10 mL/kg의 용적 하에 200 mg/kg/일에서 발프로산의 하루 1 회 경구 투여
0 일자로부터 +7 일자까지: DSS 투여
· 식수에서 3% DSS의 투여
0 일자부터 +6 일자까지: 세균 및 참조 물질로 치료
· 생쥐마다 PBS, YCFA 또는 세균 - 200 μL의 하루 1 회 경구 투여
· 무균 증류수 - 10mL/kg에서 발프로산-200 mg/kg의 하루 1 회 경구 투여
· 무균 1% Tween80, 0.9% NaCl - 10 mL/kg에서 타크롤리무스 - 1 mg/kg의 하루 1 회 SC 투여
+7 일자 : 모든 군의 희생 및 조직 수확
· 동물의 안락사는 가스 마취 (이소플루란), 그 이후에 방혈 및 경부 탈구 하에 수행되었다. 이용된 안락사 방법은 유럽 지침 20 I 0/63/CE에 의해 생쥐와 쥐에 대해 권장된 것들이고, 그리고 안락사 방법을 설명하는 절차는 IACUC에 의해 승인되었다.
· 맹장의 바로 상류에 (0.5 cm로부터 계속) 개복술 및 회장 수확 - 모든 조직은 모든 생쥐 사이에서 정확하게 동일한 부위로부터 수확됨:
· 조직학을 위해, 맹장에 가장 가깝게 1.5 cm 스위스 롤 회장이 수확되었다
3.4. 조직학
회장 스위스 롤 검체가 파라핀에서 포매되었고, 그리고 5 μm 두께의 절편이 절단되고 SuperFrost Ultra 플러스 유리 슬라이드 위에 적재되었다. 조직형태학적 변화를 가시화하기 위해, HP (헤마톡실린-플록신) 염색 & AB-PAS (알시안 블루 - 과요오드산 쉬프) 염색이 수행되었다. 하기의 표에서 기준을 이용하여, 부종, 부식, 크립트/배상 세포의 상실 및 침윤물에 근거된 채점이 각 동물에서 확립되었다:
Figure pct00002
4. 결과
7개 치료군 각각에서 동물 각각의 회장 조직학 점수는 아래의 표에서 도시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
치료군 중에서 어느 것도 배상 세포의 숫자에서 감소 또는 부종을 보여주지 않았다. 어떤 유의미한 상피 세포 손상/부식도 검출되지 않았다.
운반제 단독 대조 DSS 군 (군 3 및 4)에서 대다수의 동물은 비-병든 군 1 및 2와 비교하여 백혈구 침윤에서 경미한 증가를 보여주었다. 공지된 면역억제제인 타크롤리무스로 치료된 DSS 동물은 대조와 비교하여 백혈구 침윤이 감소하였다. 유사한 감소가 발프로산 및 세균 치료군 5 및 6에서 관찰되었다. 이것은 상기 세균이 회장에서 백혈구 침윤을 감소시키는데 있어서, 공지된 치료제 타크롤리무스에 필적할 정도로 효과적이라는 것을 지시한다.
실시예 9 - 안정성 검사
본원에서 설명된 적어도 하나의 세균 균주를 내포하는 본원에서 설명된 조성물은 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에서 보관되고, 그리고 상기 용기는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치된다. 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년 후, 세균 균주 중에서 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표준 프로토콜에 의해 결정된 집락 형성 단위에서 계측될 때 남아있을 것이다.
실시예 10 - 신경화학적 생산 - 뇌에서 대사산물
배경
신경학적 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 신경화학 인자, 신경펩티드 및 신경전달물질의 수준이 MRx0029가 급이된 생쥐의 뇌 조직에서 탈체 선별검사 동안 계측되었다.
방법
동물
BALBc (Envigo, UK) 성체 수컷 생쥐는 12 시간 명암 주기 하에 집단 수용되었다; 표준 설치류 사료 및 물이 무제한으로 가용하였다. 모든 실험은 University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee에 의한 승인 이후에 유럽 지침에 따라서 수행되었다. 동물은 실험의 시작 시점에서 8 주령이었다.
연구 설계
동물은 동물 단위 내로 도착 후 1 주 동안 그들의 홀딩 룸에 순치하도록 허용되었다. 이들은 6 연일 동안 15:00 및 17:00 사이에 1 X 109 CFU의 용량에서 살아있는 생체치료제의 경구 위관영양 (200μL 용량)을 제공받는다. 7 일자에서, 이들 동물은 머리가 제거되고, 그리고 실험을 위해 조직이 수확되었다.
조직 수집
동물은 치료 및 검사 조건에 관하여 무작위 방식으로 희생되었다; 표본추출은 9.00 a.m. 및 1:00 p.m 사이에 일어났다. 체간 혈액이 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에서 수집되고 4000 g에서 15 분 동안 회전되었다. 혈장이 단리되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 뇌가 빠르게 절제되고, 절개되고, 그리고 각 뇌 영역이 드라이아이스에서 즉시 동결되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다.
분석
신경화학 인자, 신경펩티드 및 신경전달물질 농도가 뇌간으로부터 표본에서 HPLC에 의해 분석되었다. 간단히 말하면, 뇌간 조직이 내부 표준으로서 4 ng/40 μl의 N-메틸 5-HT (Sigma Chemical Co., UK)로 스파이킹된 500 μl의 냉각된 이동상에서 초음파처리되었다. 이동상은 0.1 M 구연산, 5.6 mM 옥탄-1-술폰산 (Sigma), 0.1 M 인산이수소나트륨, 0.01 mM EDTA (Alkem/Reagecon, Cork) 및 9% (v/v) 메탄올 (Alkem/Reagecon)을 내포하고, 그리고 4 N 수산화나트륨 (Alkem/Reagecon)을 이용하여 pH 2.8로 조정되었다. 균질액은 이후, 4 ℃에서 15 분 동안 22,000 x g로 원심분리되었고, 그리고 40 μl의 상층액이 SCL 10-Avp 시스템 제어장치, LECD 6A 전기화학적 검출기 (Shimadzu), LC-10AS 펌프, CTO-10A 오븐, SIL-10A 자기주입기 (표본 냉각기가 40 C에서 유지됨) 및 온라인 Gastorr 디개서 (ISS, UK)로 구성되는 HPLC 시스템 위에 주입되었다. 30 ℃에서 유지된 역상 칼럼 (Kinetex 2.6 u C18 100 x 4.6 mm, Phenomenex)이 분리 (유속 0.9 ml/분)에서 이용되었다. 유리질 탄소 작업 전극이 +0.8 V에서 작동된 Ag/AgCl 기준 전극 (Shimdazu)과 조합되었고, 그리고 산출된 크로마토그램이 Class-VP 5 소프트웨어 (Shimadzu)를 이용하여 분석되었다. 신경전달물질은 표본 분석 동안 규칙적인 간격에서 이행되는 표준 주입에 의해 결정될 때 그들의 특징적인 체류 시간에 의해 확인되었다. 피분석물 대 내부 표준의 피크 높이의 비율이 계측되고 표준 주입과 비교되었다. 결과는 조직의 생중량 g당 ng의 신경전달물질로서 표현되었다.
결과 - 신경전달물질 생산
결과는 도 8에서 도시되는데, 이것은 MRx0029가 급이된 생쥐의 뇌에서, 노르아드레날린 (p=0.0507), 세로토닌 및 5-HIAA 수준이 증가되었다는 것을 보여준다.
실시예 11 - 트립토판 수산화효소 발현
배경
트립토판 수산화효소는 세로토닌의 생산에 관련된 효소이다. 본 발명자들은 따라서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029가 뉴런-유사 세포에서 트립토판 수산화효소 유전자 TPH1 및 TPH2의 상향조절된 발현을 유도할 수 있는 지를 조사하는 것을 모색하였다. 이것은 MRx0029가 생체내에서 세로토닌의 수준을 어떻게 증가시키는 지를 설명할 수 있다.
재료와 방법
신경모세포종 SH-SY5Y 세포는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50% MEM 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. 세포는 10cm 접시에서 2x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 안정 후, 세포는 10% MRx0029 상층액 또는 YCFA+를 포함하는 성장 배지 (1% FBS를 내포)에서 24 시간 동안 처리되었다. 세포가 그 다음 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 프라이머 서열은 표 1에서 도시된다: 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. Β-액틴이 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2^(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다.
세포가 6-웰 접시에서 0.5x106개 세포/웰의 밀도로 도말된 점을 제외하고, 유사한 실험의 두 번째 세트가 수행되었다. 24 시간 안정 후, 세포는 5% 세균 상층액 또는 YCFA+를 포함하는 성장 배지 (1% FBS를 내포)에서 72 시간 동안 처리되었다. 전체 RNA은 전술된 바와 같이 분석되었다.
세포가 처리되지 않은 상태로 남아있거나 또는 YCFA+ 배지에서 동등한 시간 동안 배양된 대조가 나란히 수행되었다. YCFA+ 배지는 하기의 조성을 갖는다:
박토 카시톤 1.0 g
효모 추출물 0.25 g
나트륨 탄산수소염 0.4 g
글루코오스 0.2 g
셀로비오스 0.2 g
가용성 전분 0.2 g
무기물 용액 1 15 ml
무기물 용액 2 15 ml
SCFA 용액 0.31 ml
헤민 용액 1 ml
비타민 용액 1 100 μl
비타민 용액 2 100 μl
레자주린 용액 0.1 ml
시스테인 0.1 g
총 용적까지 d. H2O: 100 m
무기물 용액 1: K2HPO4 -3.0 g; 1 l의 총 용적까지 d.H2O
무기물 용액 2: KH2PO4 -3.0 g; (NH4)2SO4 - 6.0 g; NaCl-6.0 g; MgSO4 - 0.6 g; CaCl2 - 0.6 g; 1 l의 총 용적까지 d. H2O
레자주린 용액: 100 ml 증류수에서 0.1% 분말화된 레자주린.
짧은 사슬 지방산 용액: 아세트산 -17 ml; 프로피온산-6 ml; n-발레르산-1 ml; 이소발레르산-1 ml; 이소부티르산- 1 ml
헤민 용액: KOH-0.28 g 에탄올 95%-25 ml; 헤민-100 mg; 100 ml의 총 용적까지 d. H2O
비타민 용액 1: 비오틴-1 mg; 코발라민-1 mg; p-아미노벤조산-3 mg; 엽산-5 mg; 피리독사민-15 mg; 100 ml의 총 용적까지 d. H2O
비타민 용액 2: 티아민-5 mg; 리보플라빈-5 mg; 100 ml의 총 용적까지 d. H2O
결과
도 9에서 전시된 결과는 세포가 10% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 24 시간 동안 배양될 때, TPH1의 발현 수준이 처리되지 않은 또는 YCFA+-처리된 대조에 비하여 5-배 증가한다는 것을 증명한다. TPH2의 발현 수준 또한, 처리되지 않은 대조에 비하여 30-배 증가한다.
도 10에서 전시된 결과는 세포가 5% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 72 시간 동안 배양될 때, TPH1의 발현 수준이 처리되지 않은 또는 YCFA+-처리된 대조에 비하여 5-배 증가한다는 것을 증명한다. TPH2의 발현 수준 또한, 처리되지 않은 대조에 비하여 30-배 증가한다.
실시예 12 - 세로토닌 전달체 발현
배경
SLC6A4 유전자는 세로토닌 전달체를 인코딩한다. 세로토닌 전달체는 분화된 세로토닌성 뉴런의 생물마커이다. 세로토닌 전달체는 또한, 장 내층의 상피 세포에 의해 발현되고, 그리고 세포간 공간으로부터 세로토닌을 제거한다. 본 발명자들은 따라서, 메가스파에라 마스일리엔시스 (M.massilensis) 종의 세균 균주가 뉴런-유사 세포에서 세로토닌성 마커를 상향조절할 수 있는 지를 결정하는 것을 모색하였다.
재료와 방법
실시예 2에서 설명된 바와 동일한 세트의 실험이 실행되었다. SLC6A4 유전자에 대한 프라이머 서열은 표 2에서 도시된다.
표 2 - SLC6A4 및 β-액틴에 대한 프라이머 서열
Figure pct00005
결과
도 11에서 전시된 결과는 세포가 10% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 24 시간 동안 배양될 때, SLC6A4의 발현이 처리되지 않은 대조에 비하여 3-배 상향조절되지만, YCFA+ 처리된 세포에서는 차이가 없었다는 것을 증명한다. 도 12에서 전시된 결과는 세포가 5% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 72 시간 동안 배양될 때, SLC6A4의 발현이 처리되지 않은 대조에 비하여 3-배 및 YCFA+ 처리된 세포에 비하여 약 2-배 상향조절된다는 것을 증명한다. 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 세로토닌 전달체 발현을 증가시키고 위장관으로부터 세로토닌을 제거함으로써, 염증성 장 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있다는 것을 지시한다.
실시예 13 - Caco2 세포에서 트립토판 수산화효소 및 세로토닌 전달체 발현 분석
도입
대다수의 세로토닌은 소화관에서 생산된다. 소화관 세로토닌은 소화관 및 뇌 사이에 중요한 소통 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 이런 이유로, 본 발명자들은 MRx0029가 소화관-유사 세포에서 TPH1 및 SLC6A4의 발현을 증가시킬 수 있는 지를 결정하는 것을 모색하였다.
이를 위해, 본 발명자들은 분화된 Caco2 세포를 MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 배양하였다. 분화된 Caco2 세포는 불투과성이고 소장의 상피 세포와 구조적으로 및 기능적으로 유사한 양극화된 정점/점막 및 기저/장막 막을 형성한다.
재료와 방법
Caco2 세포가 12 웰 평판에서 파종되고 10 일 동안 분화되었다; 이후, 이들은 12 시간 동안 혈청 결핍되고, 그리고 차후에, 정지기 MRx0029로부터 유래된 10% 상층액에 24 시간 동안 노출되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. β-액틴이 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2^(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다. 프라이머 서열은 아래에 전시된다.
결과
도 13에서 전시된 결과는 분화된 Caco2 세포가 10% MRx0029 세균 세포-없는 상층액과 함께 24 시간 동안 배양될 때, TPH1의 발현이 처리되지 않은 대조 및 YCFA+-처리된 대조에 비하여, 거의 3-배 상향조절된다는 것을 증명한다. 도 14에서 전시된 결과는 배양이 처리되지 않은 대조에 비하여, SLC6A4의 발현을 3-배 이상 증가시킨다는 것을 증명한다. 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 세로토닌 전달체 발현을 증가시키고 위장관으로부터 세로토닌을 제거함으로써, 염증성 장 질환을 치료하는 데 효과적일 수 있다는 것을 지시한다.
실시예 14 - 분화된 Caco-2 세포에서 GPR109a RNA 발현
GPR109a는 결장과 장관 상피 세포의 내강-대면 정단막에서 발현되는 G-단백질 연계된 수용체이다. GPR109a 발현 침묵이 결장암 세포주에서 발견되고, 그리고 이의 발현의 유도는 세균 발효 산물, 예컨대 부티르산염의 존재에서 종양 세포 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다 [61]. GPR109a는 또한, 염증, 그리고 특히 결장 염증을 억제할 수 있다 [62].
HT29mtx 세포가 12 웰 평판에서 파종되고 10 일 동안 분화되었다; 이후, 이들은 12 시간 동안 혈청 결핍되고, 그리고 차후에, 정지기 세균으로부터 유래된 10% 상층액에 24 시간 동안 노출되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. β액틴이 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2^(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다 [63]. 이용된 정방향과 역방향 프라이머의 서열은 각각, 서열 번호: 2 및 3으로서 제공된다.
분화된 Caco2는 불투과성이고 소장의 상피 세포와 구조적으로 및 기능적으로 유사한 양극화된 정점/점막 및 기저/장막 막을 형성한다. MRx0029로 Caco-2 세포의 처리는 GPR109a의 증가된 발현을 유도하였다 (도 18a). 또한, 포르볼-12-미리스트산염-13-아세트산염 (PMA) 상층액으로 처리된 Caco-2는 PMA 단독 (또는 YCFA 배지에서 PMA)으로 처리보다, GPR109a RNA의 더욱 큰 발현을 전시하였다 - 참조: 도 18b. 이런 이유로, 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 암, 특히 전이성 암, 특히 전이성 결장직장암 또는 소장암, 예컨대 소장 선암종의 치료에서 유용할 수 있다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 또한, 본 발명의 조성물이 GPR109a 발현의 결과로서, 아폽토시스를 유도하는 기전을 통해 이런 치료를 달성할 수 있다는 것을 암시한다. 이들 데이터는 또한, MRx0029가 항염증 활성을 갖고, 그리고 염증성 장애, 그리고 특히 염증성 장 질환의 치료에 유용할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 15 - 대사산물 분석
도입
소화관 미생물총은 이의 막대한 다양성 및 물질대사 능력으로 인해, 방대한 다양한 분자의 생산을 위한 거대한 물질대사 보관소를 나타낸다. 본 발명자들은 어떤 짧은 사슬 지방산 및 중간 사슬 지방산이 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787, 그리고 본원에서 참조 1, 참조 2 및 참조 3으로서 확인된 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주에 의해 생산되고 소비되는 지를 결정하는 것을 모색하였다.
재료와 방법
세균 배양 및 세포-없는 상층액 수집
세균의 순수한 배양액은 이들이 그들의 정체 성장기에 도달할 때까지, YCFA 액상배지에서 혐기성으로 성장되었다. 배양액은 5 분 동안 5,000 x g에서 원심분리되었고, 그리고 세포-없는 상층액 (CFS)은 0.2 μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과되었다. CFS의 1 mL 분취량이 이용 때까지 -80 ℃에서 보관되었다. 부티르산나트륨, 헥산산 및 발레르산은 Sigma Aldrich (UK)로부터 획득되었고, 그리고 현탁액은 YCFA 액상배지에서 제조되었다.
세균 상층액의 SCFA 및 MCFA 정량
세균 상층액으로부터 짧은 사슬 지방산 (SCFAs) 및 중간 사슬 지방산 (MCFAs)은 하기와 같이 분석되고 MS Omics APS에 의해 정량되었다. 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [64]에서 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
결과
도 15-17에서 도시된 바와 같이, 균주 42787은 발레르산, 부티르산염 및 헥산산을 생산하고 프로피온산염 및 아세트산염을 소비한다. 본 발명자들은 또한, 필적하는 수준의 발레르산, 헥산산 및 부티르산염을 생산하고 유사한 양의 아세트산염 및 프로피온산염을 소비하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 종의 다른 균주를 발견하였다.
실시예 16 - 에놀라아제 2의 억제
도 19는 MRx0029가 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE)/에놀라아제 2를 억제하는 통계학적으로 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. NSE는 증가된 종양 세포 대사 요구량을 뒷받침하고, 종양 세포를 스트레스성 조건으로부터 보호하고, 이들의 침습과 이주를 증진하는 것으로 생각된다 [65]. 이것은 또한, 전이성 흑색종의 진행 [66], 소세포 폐암에서 생존과 진행 [67], 그리고 선편평상피 폐 암종의 예후 [68]에 연루된다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 암, 특히, 전이성 흑색종, 소세포 폐암 및 선편평상피 폐 암종을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
이에 더하여, 에놀라아제는 친염증성 효과를 가질 수 있고 [69], 따라서 이들 데이터 또한, 본 발명의 조성물이 자가면역 장애와 염증성 장애의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다는 것을 지시한다.
실시예 17 - 대사산물 분석
실시예 17에서 제공된 데이터에 더하여, 도 20은 어떤 다른 짧은 사슬 지방산이 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787, 그리고 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388 및 NCIMB 43389 하에 기탁된 다른 균주에 의해 생산되고 소비되는 지를 보여준다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787은 포름산을 감소시키지만, 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산의 수준을 증가시킨다 (도 20). 이런 이유로, 균주 NCIMB 42787은 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 포름산을 소비한다. 본 발명자들은 또한, 기탁된 다른 균주가 필적하는 수준의 2-메틸-프로판산 및 3-메틸-프로판산을 생산하고 유사한 양의 포름산을 소비한다는 것을 발견하였다.
실시예 18 - IL-6의 하향조절
도입
세균 균주는 면역자극성 LPS의 존재에서 성상세포종 세포주 U373에 의한 IL-6의 분비를 감소시키는 능력에 대해 조사되었다.
재료와 방법
인간 교모세포종 성상세포종 세포주 (U373)는 10% 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 5 μg/ml 플라스모신, 1% 비필수적인 아미노산, 1% 피루브산나트륨으로 보충된 25ml MEME 4.5 g/L D-글루코오스 (완전 성장 배지로서 지칭됨)에서 유지되었다.
세포는 24-웰 평판에서 1ml의 완전 성장 배지에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 도말되고, 그리고 37 ℃/5% CO2에서 72 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 처리 당일에, 배지가 각 웰로부터 제거되었고, 세포가 0.5 ml 세척 배지 (혈청 없는 MEME)로 헹굼되었고, 1 μg/ml LPS를 내포하는 0.9ml 자극 배지 (2% FBS를 내포하는 MEME 배지)가 적합한 웰에 첨가되고 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 1 시간 전배양 후, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 100 μl 세균 상층액으로 처리되었다. YCFA+ 배지가 대조로서 이용되었다. 세포는 이후, 37 ℃/5% CO2에서 추가 24 시간 동안 배양되었고, 그 후 세포-없는 상층액이 수집되고 4 ℃에서 3 분 동안 10,000g에서 스핀다운되었다. 표본이 hIL-6 ELISA를 위해 1.5 ml 마이크로튜브에서 분취되고 -80℃에서 보관되었다.
결과 및 결론
도 21은 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787이 LPS 및 LPS 배지 대조와 비교하여, U373 세포에서 IL-6 분비의 유의미한 억제를 유발한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 또한, 모든 기탁된 균주가 IL-6 분비에서 유의미한 감소를 촉발한다는 것을 확인하였다.
실시예 19 - NFκB 활성화의 억제
도입
세균 균주는 HEK-TLR4 세포에서 NFκB-AP1 프로모터의 활성화를 감소시키는 능력에 대해 조사되었다.
재료와 방법
인간 TLR4를 안정되게 발현하는 HEK293-Blue 리포터 세포 (HEK-TLR4)가 제조업체의 사용설명서에 따라서 배양되었다. 간단히 말하면, HEK-TLR4 세포는 10% (v/v) 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μg/ml 노르모신, 1x HEK-Blue 선별 배지로 보충된 DMEM 4.5g/L D-글루코오스에서 유지되었다.
실험을 위해, 세포가 PBS로 세척되고, PBS에서 해리되고, 성장 배지에서 수집되었다. 세포가 96 웰 평판에서 HEK-TLR4에 대해 25,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 반응성을 평가하기 위해, 세포가 10% (V/V) 세균 상층액의 존재 또는 부재에서 10 ng/ml LPS로 처리되고 CO2 배양기에서 배양되었다. 처리는 37 ℃/5% CO2에서 22 시간 동안 진행되었고, 그 후 세포 배양 상층액으로부터 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제 (SEAP) 활성의 검출이 제조업체의 사용설명서에 따라서 QUANTI-blue 용액을 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 20 μl의 세포-없는 상층액이 수집되었고, 그리고 200 μl QUANTI-Blue 검출 배지와 혼합함으로써 SEAP의 존재에 대해 분석되었다. 37 ℃에서 2 시간 배양 후, 흡광도가 마이크로평판 판독기 (iMark 마이크로평판, Bio-Rad) 상에서 655nm에서 계측되었다.
결과
도 22는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787이 LPS 배지 대조와 비교하여, LPS의 존재에서 NFκB 프로모터의 활성화를 감소시킨다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 본 발명자들은 다른 기탁된 균주가 NFκB 프로모터의 활성화에서 감소를 향한 유사한 추세를 보여준다는 것을 확인하였다.
실시예 20 - 에놀라아제 2의 억제
재료와 방법
신경모세포종 세포주 SH-SY5Y는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50% MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. SH-SY5Y는 6 웰 평판에서 0.5x106 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+를 포함하는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 세포가 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNA가 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현이 qPCR에 의해 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화가 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다. 이용된 프라이머 세트는 서열 번호: 19, 20, 21 및 22로서 열거된다.
결과
도 23은 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787이 뉴런 특이적 에놀라아제(NSE)/에놀라아제 2를 억제하는 통계학적으로 유의한 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 이에 더하여, 본 발명자들은 또한, 기탁된 균주가 YCFA 배양액 대조와 비교하여, 에놀라아제 2의 통계학적으로 유의한 감소를 촉발한다는 것을 발견하였다. 특히, 수탁 번호 NCIMB 43385, NCIMB 43388, NCIMB 43389, NCIMB 43386 및 NCIMB 43387 하에 기탁된 균주는 에놀라아제 2의 유의미한 억제를 유발하였다.
결론
따라서, 상기 실시예 16에서 발언과 일관하게, 본 발명의 조성물은 예시적인 기탁된 균주를 포함하는 일정한 구체예에서, 암, 특히, 전이성 흑색종, 소세포 폐암 및 선편평상피 폐 암종을 치료하고 예방하는 데 효과적일 것으로 예상된다.
실시예 21 - U373 교모세포종 성상세포종 세포에서 IL-6 생산의 감소
도입
수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주의 정지기 세균 세포-없는 상층액은 지질다당류 (LPS)로 처리 후, U373 교모세포종 성상세포종 세포주에서 항염증 반응을 유도하는 능력에 대해 선별검사되었다.
재료와 방법
U373은 인간 교모세포종 성상세포종 세포주이다. 세포 (20번째-37번째 계대)는 10% 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 5μg/ml 플라스모신, 1% 비필수적인 아미노산, 1% 피루브산나트륨으로 보충된 25ml MEME (본 명세서의 전역에서 완전 성장 배지로 지칭됨)에서 유지되었다. 세포가 24-웰 평판에서 1ml의 완전 성장 배지에서 100,000개 세포/웰의 밀도로 도말되고, 그리고 37 ℃ 및 5% CO2에서 72 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다.
BCFS의 단리
세균 세포-없는 상층액 (BCFS)이 10 ml의 배양액을 5000xg에서 5 분 동안 원심분리하고 0.2μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과함으로써, 정지기 배양액 (스트리킹된 냉동 원액으로부터 교체된 집락의 하룻밤 배양액으로부터 접종됨)으로부터 획득되었다. 세균 세포-없는 상층액의 1ml 분취량이 이용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
세포의 처리
처리 당일에, 배지가 각 웰로부터 제거되었고, 세포가 0.5ml 세척 배지 (혈청 없는 MEME)로 헹굼되었고, 1μg/ml LPS를 내포하는 0.9ml 자극 배지 (2% FBS를 내포하는 MEME 배지)가 적합한 웰에 첨가되고 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 세포가 LPS로 1 시간 동안 사전 처리되었다. 그 후에, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고, 그리고 NCIMB 42787의 100μl (다시 말하면, 10%)의 정지기 세균 세포-없는 상층액으로 처리되었다.
각 처리 이후에, 세포가 37 ℃ 및 5% CO2에서 24 시간 배양 동안 배양되었다. 그 후에 세포-없는 상층액이 수집되고 4 ℃에서 3 분 동안 10,000xg에서 원심분리되었다. 표본이 hIL-6 ELISA를 위해 1.5ml 마이크로튜브에서 분취되고 -80℃에서 보관되었다.
전술된 바와 같이 처리된 U373 세포로부터 세포-없는 상층액에서 제조업체의 프로토콜에 따라서 hIL-6 표준 ELISA 키트를 이용하여 IL-6의 분비가 분석되었다. 표본이 405nm에서 계측되었는데, 교정 파장은 마이크로평판 판독기 (iMark, Bio-Rad)에서 655nm로 설정되었다. 미가공 데이터는 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용하여 플롯팅되고 분석되었다.
결과
NCIMB 42787은 LPS로 처리 후 U373 세포에서 IL-6 분비의 강한 감소를 전시하였다 (양성 대조에 비하여 약 50% 감소) (참조: 도 24a). 도 24b는 LPS의 존재에서, NCIMB 42787이 배지 대조와 비교하여, U373 세포에서 IL-6의 분비에서 유의미한 감소를 유발한다는 것을 보여준다. NCIMB 42787은 배지 대조와 비교하여, IL-6의 기저 수준을 유의미하게 증가시키지 않았다.
실시예 22 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NCIMB 42787로 처리 시에 TNFα에 노출된 HMC3 세포에서 사이토킨 분비의 조정
도입
HMC3 세포는 TNFα로 처리되었고, 그리고 NCIMB 42787의 정지기 세균 세포-없는 상층액으로 처리 시에 IL-6의 분비가 계측되었다.
재료와 방법
인간 소교세포 HMC3 세포는 15% 열 비활성화 FBS 및 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신을 내포하는 글루타민-보충된 EMEM 배지에서 성장되었다. HMC3 세포는 24 웰 평판에서 50,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포가 CO2 배양기에서 48 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 이들 세포는 이후, 블랭크 EMEM에서 세척되고, 그리고 10ng/ml TNF-α를 포함하는 2% FBS 성장 배지에서 1 시간 동안 사전 처리되었다. 그 후에, NCIMB 42787 정지기 성장 배양액 (전술된 바와 같이 단리됨)에 대한 10% 세포-없는 세균 상층액이 TNF-α-처리된 웰 및 처리되지 않은 웰에 첨가되고 CO2 배양기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 세포-없는 상층액이 수집되고 4℃에서 3 분 동안 10,000xg에서 원심분리되었다. 표본이 hIL-6 ELISA (상기 개설된 바와 같이 수행됨)를 위해 1.5ml 마이크로튜브에서 분취되고 -80℃에서 보관되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
NCIMB 42787은 TNF-α-처리된 HMC3 세포에서 IL-6 분비를 유의미하게 감소시킨다 (도 24c). 흥미롭게도, 상기 균주는 자극의 부재에서 이들 세포에 의한 IL-6 분비를 유도하지 않았다 (도 24c).
따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인간 소교세포 세포에서 IL-6의 분비를 감소시킨다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 염증 및 뇌 염증성 장애의 치료에서 유용하다.
실시예 23 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) NCIMB 42787에 의한 HEK-TLR4 세포에서 NF-κB 프로모터 활성화의 저해
도입
NCIMB 42787로 처리가 TLR4의 참여에 의해 유도된 NF-κB-Ap1 프로모터 활성을 간섭할 수 있을 지를 실증하기 위해, HEK-TLR4 세포가 단독으로 또는 LPS와 조합으로, NCIMB 42787에 대한 세포-없는 세균 상층액으로 처리되었다.
재료와 방법
인간 TLR4를 안정되게 발현하는 HEK293-Blue 리포터 세포 (HEK-TLR4)가 제조업체의 사용설명서에 따라서 배양되었다. 간단히 말하면, HEK-TLR4 세포는 10% (v/v) 열 비활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 100μg/ml 노르모신, 1X HEK-Blue 선별 배지로 보충된 DMEM 4.5g/L D-글루코오스에서 유지되었다.
간단히 말하면, 세포가 PBS로 세척되고, PBS에서 해리되고, 성장 배지에서 수집되었다. 세포가 96 웰 평판에서 25,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. LPS 유도 NF-κB 프로모터 활성화에 대한 세균 균주의 효과를 평가하기 위해, 세포가 10% 상층액 (전술된 바와 같이 단리됨)의 존재 또는 부재에서 10 ng/ml LPS로 처리되고 CO2 배양기에서 배양되었다. 처리는 37 ℃ 및 5% CO2에서 22 시간 동안 진행되었고, 그 후 세포 배양 상층액으로부터 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제 (SEAP) 활성의 검출이 제조업체의 사용설명서에 따라서 QUANTI-blue 용액을 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 20 μl의 세포-없는 상층액이 수집되었고, 그리고 200μl의 무균 여과된 QUANTI-Blue 검출 배지와 혼합함으로써 SEAP의 존재에 대해 분석되었다. 37 ℃에서 2 시간 배양 후, 흡광도가 마이크로평판 판독기 (iMark 마이크로평판, Bio-Rad) 상에서 655nm에서 계측되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과 및 결론
NCIMB 42787은 LPS에 의해 유도된 NF-κB-Ap1 프로모터 활성화를 유의미하게 저해하였다 (도 24d). 상기 균주는 스스로 NF-κB-Ap1 프로모터 활성화를 유도하였다.
어쥬번트의 존재에서 NF-κB 프로모터 활성화에서 감소는 NF-κB 연쇄 반응에 의해 촉발된 염증 반응을 감소시킬 것이다.
실시예 24 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주는 내재성 항산화능을 전시한다
도입
NCIMB 42787 상층액 내에 존재하는 상이한 분자들 사이에서 상승적 및 산화환원 상호작용을 포착하기 위해, 이러한 균주 항산화 잠재력을 특징화하는 것을 목표로 하는 3가지 생화학적 검정이 이용되었다: 인돌 생산 검정, 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH) 검정을 이용한 총 라디칼-포획 항산화 파라미터 (TRAP), 그리고 트롤록스 당량 항산화능 (TEAC) 검정.
인돌 유도체는 항산화와 세포보호 활성을 갖는다. 인돌 검사는 아미노산 트립토판을 전환하여 인돌을 형성하는 생물체의 능력을 결정하는 데 이용된다. 항산화제의 자유-라디칼 스캐빈징 능력은 컬러 변화를 통해 산화제를 감소시키는 항산화제의 능력을 평가함으로써, 표준 1-전자 전위로부터 예측될 수 있다. TEAC 검정은 화합물 또는 화합물의 혼합물의 항산화능을 계측한다.
재료와 방법
세균 균주 NCIMB42787은 정지기까지 성장되었다. BCFS는 상기 개설된 바와 같이 준비되었다.
L-트립토판으로부터 세균 인돌 생산의 정량
세균 인돌 생산은 기존 문헌70에서 설명된 검정을 이용하여 정량되었다. 세균은 성장의 정지기까지 배양되었다. YCFA+ 배지에서 0.5mM 인돌이 이러한 검정에서 양성 화학적 대조로서 이용되었다. 인돌 검정은 24-웰 (비처리됨) 검정 평판을 이용하여 수행되었다. 6mM의 최종 농도를 제공하기 위해, HCl에서 100mM 트립토판 용액이 각 웰 내로 분여되었다. 1ml 정지기 세균 배양액이 각 웰에 첨가되고 추가로 48 시간 동안 배양되었다. 검정 평판은 실온에서 10 분 동안 3,500xg에서 원심분리되었다. 상층액은 유지되었고, 그리고 펠렛은 폐기되었다. 96 웰 평판에서 140μl 상층액이 삼중으로 분여되었다. 140μl Kovac 시약이 첨가되었고, 그리고 흡광도가 BioRad iMark 마이크로평판 흡광도 판독기를 이용하여 540nm에서 판독되었다. 흡광도를 최종 인돌 농도 (mM)의 함수로서 플롯팅함으로써 표준 곡선이 준비되었다. 표준 곡선의 선형 회귀로부터 외삽된 방정식을 이용하여, 검사 표본의 인돌 농도가 계산되었다.
2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 (DPPH) 자유-라디칼 검정
BCFS가 이용에 앞서 대략 2 시간 동안 4℃에서 해동되었다. 모든 표본이 무균 5mM PBS pH7을 이용하여 1.5ml 마이크로퓨즈 튜브에서 1:2 희석되어, 1ml의 최종 용적이 산출되었다. 표준 곡선을 만들기 위해, 5mM PBS, pH7에서 500μM 트롤록스의 원액이 제조되었다. 라자로이드 항산화제 U83836E가 양성 대조로서 포함되었다 (100% 메탄올에서 200μM). DPPH 검정은 약간 변경된 점을 제외하고, 기존 문헌71에서 설명된 바와 같이 96 웰 평판에서 수행되었다. 간단히 말하면, 10μl 표본/표준/대조가 96 웰 평판의 상응하는 웰에 삼중으로 첨가되었다. 200μl의 200μmol/L DPPH 용액이 3개의 비어 있는 웰에 대조로서 첨가되었다. 190μl의 200μmol/L DPPH가 표본/표준/대조 웰에 첨가되었고, 그리고 평판이 실온에서 30 분 동안 어둠 하에 배양되었다. BioRad iMark 마이크로평판 흡광도 판독기를 이용하여, 515nm에서 흡광도가 판독되었다. DPPH 라디칼 스캐빈징 활성은 하기와 같이 계산되었다:
DPPH 라디칼 스캐빈징 활성 (%) = [1-(A표본 - A블랭크)/A대조)]*희석 인자*100
여기서 A표본은 표본 + 200μmol/L DPPH의 평균 흡광도이었고, A대조는 표본이 없는 메탄올 DPPH의 평균 흡광도이었고, 그리고 A블랭크는 YCFA 배지 블랭크의 평균 흡광도이다.
2,2'-아지노-비스-3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산 (ABTS) 검정
총 항산화능 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라서 항산화 검정 키트를 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 모든 표본이 1X 검정 완충액에서 1:4 희석되었다. 96 웰 평판에서, 10μl 표준/대조/표본이 삼중으로 첨가되었다. 20μl 미오글로빈 작업 용액이 모든 표준/대조/표본 웰에 첨가되었다. 150μl ABTS 기질 용액이 각 웰에 첨가되었고, 그리고 흡광도가 BioRad iMark 마이크로평판 흡광도 판독기를 이용하여 405nm에서 계측되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
NCIMB 42787은 명백한 인돌-형성 능력을 전시하였다 (도 25a). 이에 더하여, NCIMB 42787은 DPPH 검정에서 라디칼 제거제로서 행동하고, 그리고 비타민 E의 수용성 항산화 유도체인 트롤록스의 표준 용액과 비교할 때, 높은 총 항산화능을 갖는다 (도 25b).
실시예 25 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주는 산화 스트레스로부터 SH-SY5Y 세포의 보호를 전시한다
도입
Tert-부틸 과산화수소 (TBHP)로 처리에 의해 산출된 반응성 산소 종 (ROS)으로부터 U373, HMC3 및 레티노산 (RA)-분화된 SH-SY5Y 세포를 보호하는 NCIMB 42787의 세균 세포-없는 상층액의 능력이 평가되었다.
재료와 방법
ROS 생산을 평가하기 위해, U373 세포 및 HMC3이 흑색 96 웰 평판에서 10,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. U373 세포는 72 시간 동안 안정 상태로 남겨진 반면, HMC3은 48 시간 동안 안정 상태로 남겨졌다. 세포가 미리 가온된 PBS로 세척되고, 그리고 2% FBS를 내포하는 성장 배지에서 20 분 동안 10μM DCFDA 분자 프로브로 염색되었다. 그 후에, 이들 세포는 미리 가온된 PBS로 한 번 더 세척되고, 그리고 10% BCFS의 존재 또는 부재에서 2 시간 동안 100μM TBHP로 처리되었다.
신경모세포종 SH-SY5Y 세포는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화 FBS, 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50% MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. 세포는 흑색 96 웰 평판에서 성장 배지에서 5,000개 세포/웰로 도말되고 CO2 배양기에서 배치되었다. 24 시간 후, 배지가 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지) 및 10μM 레티노산 (RA)으로 대체되었다. 분화 배지가 2 일마다 교체되었고, 그리고 세포가 10 일의 분화 후 이용되었다. 10 일자에, 세포가 미리 가온된 PBS로 세척되고, 그리고 1% FBS를 내포하는 성장 배지에서 20 분 동안 10μM DCFDA 분자 프로브로 염색되었다. 이후, 세포가 미리 가온된 PBS로 한 번 더 세척되고, 그리고 10% BCFS의 존재 또는 부재에서 2 시간 동안 100μM TBHP로 처리되었다.
여기 485nm/방출 530nm에서 TECAN 평판 판독기를 이용하여 형광 강도가 계측되었다. 미가공 데이터는 GraphPad Prism 7 소프트웨어를 이용하여 플롯팅되고 분석되었다.
결과
분화된 SH-SY5Y 세포에서, NCIMB 42787 처리는 TBHP에 의해 유도된 ROS로부터 유의미한 보호를 유발하였다 (도 25f).
실시예 26 - 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주는 부티르산, 발레르산 및 헥산산을 생산한다
재료와 방법
YCFA+ 및 SCFAs의 표준 혼합물 (40 mM 아세트산 및 20 mM 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산)로 스파이킹된 YCFA+로부터 SCFA 추출이 De Baere et al.72의 방법에 따라서 수행되었다.
SCFAs의 HPLC 분석
SCFAs의 HPLC 검출과 정량은 약간 변경된 점을 제외하고, De Baere et al.72의 방법에 따라서 수행되었다. 간단히 말하면, HPLC 분석은 Waters 광다이오드 어레이 (PDA) 검출기 2998이 구비된 Waters e2695 HPLC 시스템 (Waters Limited, Elstree, UK)을 이용하여 수행되었다. SCFAs 표준, MRx0005와 MRx0029 BCFS 및 MRx0005와 MRx0029 헥산으로부터 추출된 SCFAs, 디에틸 에테르, 에틸 아세트산염, 아세토니트릴 및 메탄올 추출물의 HPLC 분석은 Xselect® HSS T3 3.5 μm 4.6x150mm LC 칼럼 (Waters Limited, Elstree, UK)을 이용하여 수행되었다. LC 분석은 200-800nm의 파장을 분석하도록 설정된 광다이오드 어레이 검출기 (PDA)를 이용하여 수행되었다. SCFA 검출과 정량은 210nm에서 수행되었다. 이동상은 HPLC 물에서 25mM 인산나트륨 완충액으로 구성되었다 (인산 (A) 및 아세토니트릴 (B)을 이용하여 pH가 3.0으로 조정됨. SCFA 검출과 정량을 위한 LC 방법은 하기의 구배를 갖는 용매 시스템을 이용하여 실행되었다: t0′ A=95%, B=5%; t10′ A=95%, B=5%; t30′ A=30%, B=70%; t31′ A=0%, B=100%; t36′ A=0%, B=100%; t38′ A=5%, B=95%; t60′ A=5%, B=95%; 유속=1ml/분.
SCFA (40mM 아세트산 및 20mM 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산)의 20μl의 2 배 연속 희석액을 주입함으로써, 각 SCFA에 대한 7-포인트 교정 곡선이 준비되었다. 정량-추출 효율은 아래의 공식을 이용하여 계산되었다:
[스파이킹되고 추출된 YCFA+에서 SCFA]/[스파이킹되지만 추출되지 않은 YCFA+에서 SCFA]
추출 효율은 각 표본에서 개별 SCFAs의 농도를 결정하는 데 이용되었다. 특정한 SCFAs의 생산은 스파이킹되지 않은 배지 대조 내에 존재하는 상응하는 SCFA의 양을 감산함으로써 계산되었다.
표적화된 대사체학: 세균 대사산물 및 지방산 분석
표본 분석은 MS-Omics (Copenhagen, Denmark)에 의해 실행되었다. 각 표본으로부터 분취량을 취함으로써, 혼합된 한데 모아진 표본 (QC 표본)이 창출되었다. 이러한 표본은 순서 내내 규칙적인 간격에서 분석되었다. QC 표본을 최소한 2가지 수준에서 스파이킹함으로써, 정량된 화합물에 대한 매트릭스 효과가 검사되었다.
GC-대사산물 분석을 위해, 표본은 Smart et al.73에 의해 설명된 프로토콜의 약간 변형된 버전을 이용하여, 메틸 클로로포름산염으로 유도체화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)를 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 그 후 상기 데이터는 Johnsen et al.74에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
SCFA 분석을 위해, 표본은 염화수소산을 이용하여 산성화되었고, 그리고 중수소-표지화된 내부 표준이 첨가되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은-극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30mX0.25mmX0.25μm)을 이용하여 수행되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 그 후 상기 데이터는 Johnsen et al.74에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
결과
표적화된 대사체학을 이용한 지방산 분석은 NCIMB 42787이 부탄산 (부티르산), 펜탄산 (발레르산) 및 헥산산 (카프로산)을 선형 및 분지된 형태 (C4-C6) 둘 모두로 생산한다는 것을 증명하였다 (도 26a). 게다가, 4-히드록시-페닐아세트산:배지의 비율이 NCIMB 42787 세포-없는 상층액에서 증가되었다. 세포-없는 상층액의 HPLC 분석이 NCIMB 42787에 의한 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산 및 헥산산의 생산을 모니터링하는 데 이용되었다 (유관한 SCFAs의 체류 시간 및 흡광도 스펙트럼에 근거됨). SCFAs에 대한 추출된 NCIMB 42787 세포-없는 상층액에 덧씌워진 SCFA 표준에 대한 대표적인 크로마토그램은 도 26c에서 보고된다. HPLC 분석은 NCIMB 42787에 의한 부티르산, 발레르산 및 헥산산의 생산을 확증하였다.
실시예 27 - 부티르산염을 내포하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 메탄올성 분획물은 U373 세포에서 항염증 활성을 보여준다
IL-6의 분비를 감소시키는데 있어서 SCFAs의 역할을 조사하기 위해, U373 세포는 증가하는 농도의 부티르산나트륨 (SB), 나트륨 발레르산염 (SV) 및 헥산산 (HA)으로 처리되었다.
방법
U373 세포는 앞서 설명된 바와 같이 준비되었다. 세포는 상기 지시된 1μg/ml LPS로 1 시간 동안 사전 처리되고 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었다. 1 시간 전배양 후, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 증가하는 농도의 갓 제조된 부티르산나트륨 (SB), 나트륨 발레르산염 (SV) 및 헥산산 (HA)으로 처리되었다.
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과 및 결론
검사된 농도는 상이한 지방산에 대한 세포-없는 상층액에서 계측된 농도의 범위를 커버하였고, 그리고 전술된 상층액의 단지 10%만 세포-기초된 검정에서 이용된다는 사실을 고려하였다. 단지 SB만 U373 세포에서 IL-6의 LPS-유도된 분비를 농도 의존성 방식으로 저해하였다 (도 27a). HA는 LPS로 공격접종 후, IL-6 분비를 저해하지 않았다. 검사된 SFCAs 중에서 어느 것도 그 자체로는 IL-6의 분비를 기저 수준 (처리되지 않은 세포 대조)을 초과하여 유도하지 않았다. 단지 SB (검사된 가장 높은 농도에서)만 IL-6의 기저 수준을 감소시켰다 (도 27a 및 b). 이들 3가지 SCFAs의 재구성된 혼합물은 LPS의 존재와 부재 둘 모두에서, NCIMB 42787 세포-없는 상층액의 생물학적 활성을 재현하였다.
따라서, 일정한 구체예에서, 부티르산의 생산은 IL-6 분비에서 감소를 주동한다. 이러한 방식으로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 IL-6 분비의 감소를 주동하는 부티르산의 생산을 통해, 염증성 장애 또는 자가면역 장애의 치료에서 유용하다.
실시예 28 - NCIMB 42787에 의해 산출된 SCFAs는 항염증 활성을 적어도 부분적으로 책임진다
도입
NCIMB 42787의 항염증 활성이 SCFAs에 적어도 부분적으로 기인하는 지를 더욱 확증하기 위해, 세포-없는 세균 상층액이 증가하는 극성의 상이한 용매로 분획되었다. NCIMB 42787의 정지기 세포-없는 상층액의 생화학적 복잡성을 분석할 뿐만 아니라 극성 및 용해도에 기초하여 화합물을 소분획하기 위해, 이러한 균주 상층액의 탈단백분해된 미가공 추출물 (헥산, F5; 디에틸 에테르, F4; 에틸 아세트산염, F3; 아세토니트릴, F4; 메탄올, F1)의 HPLC 분석이 수행되었다.
방법
순차적 용매 추출- 미가공 추출물의 준비
NCIMB 42787 균주 BCFSs 및 YCFA+ (배지 대조)의 3가지 생물학적 복제물이 HPLC-등급 헥산 (HEX), 디에틸 에테르 (DE), 에틸 아세트산염 (EtOAc), 아세토니트릴 (ACN) 및 메탄올 (MeOH)로 순차적으로 추출되었다. 간단히 말하면, 20ml의 BCFS가 유리 바이알에 배치되고, 그리고 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 HEX에서 실온 (RT)에서 30 분 동안 추출되었다. 총 3회 추출이 각 BCFS 및 YCFA+ 배지 대조에서 수행되었다. 남아있는 수성 층은 이후, MX-RD-Pro 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 DE, EtOAc에서 실온에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. 각 표본의 조합된 추출물은 30℃를 초과하지 않는 온도에서 V-300 진공 펌프 (B
Figure pct00006
chi, Flawil, Switzerland)가 구비된 R-300 회전 증발기에서 감소된 압력 하에 건조되었다. 결과의 추출물은 2ml의 상응하는 용매에서 재용해되고 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (500μl 각각이 5ml의 본래 표본에 상응)에 분취되었다. 남아있는 수성 층은 이후, MX-RD-Pro 회전 진탕기 (70rpm) 상에서 20ml의 DE, EtOAc에서 실온에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. 각 표본의 조합된 추출물은 30℃를 초과하지 않는 온도에서 V-300 진공 펌프 (B
Figure pct00007
chi, Flawil, Switzerland)가 구비된 R-300 회전 증발기에서 감소된 압력 하에 건조되었다. 결과의 추출물은 2ml의 상응하는 용매에서 재용해되고 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (500μl 각각이 5ml의 본래 표본에 상응)에 분취되었다.
남아있는 수성 층은 R-300 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되었다. 결과의 건성 추출물은 20ml의 ACN에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. ACN 추출물은 조합되고, 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되고, 2ml의 ACN에서 재용해되고, 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (각각 500μl)에 분취되었다. 남아있는 건성 추출물 (추출물의 ACN 불용성 부분)은 이후, 20ml의 MeOH에서 30 분 동안 총 3회 추출되었다. MeOH 추출물은 조합되고, R-300 회전 증발기를 이용하여 증발 건조되고, 2ml의 MeOH에서 재용해되고, 4개의 1.5ml 에펜도르프 튜브 (각각 500μl)에 분취되었다.
미가공 추출물의 분취량은 -20 ℃에서 하룻밤 동안 유지하여, 단백질성 성분의 침전을 유도하였다. 하룻밤 침전 이후에, 각 분취량은 6 분 동안 10,000xg에서 원심분리되고 새로운 2ml 튜브로 이전되었다. 하룻밤 침전은 3회 반복되었고, 그 후 추출물은 RVC 2-18 CDPlus speedvac (Christ, Osterode am Harz, Germany)에서 건조되고 계량되었다. 각 추출물의 모든 건조된 분취량은 추가 이용 때까지 -80℃에서 보관되었다.
처리
U373 세포는 앞서 설명된 바와 같이 준비되었다. 세포는 상기 지시된 바와 같이 1μg/ml LPS로 1 시간 동안 사전 처리되었다. 그 후에, 세포가 CO2 배양기로부터 이전되고 100μl의 상이한 분획물로 처리되었다. 배지로부터 분획물은 대조로서 이용되었다. 처리 후 24 시간 시점에, 세포-없는 상층액이 수집되고, 그리고 IL-6 분비에 대해 ELISA에 의해 분석되었다 (상기 개설된 바와 같음).
통계학적 분석
정상적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 일원 변량분석 (Anova) (Sidak의 다중 비교 검정)이 본 페이퍼에서 제시된 데이터를 분석하는 데 이용되었다. p 값 <0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과
HPLC 분석은 탈단백분해된 상층액 내에 존재하는 화합물의 선별적 추출 및 미가공 분획을 확증하였다. NCIMB 42787의 메탄올성 분획물 F1은 IL-6 생산을 감소시켰고 미분획된 상층액의 활성을 개괄하는 것처럼 보였는데, 이것은 부티르산염의 존재가 이러한 균주의 항염증 활성과 연관된다는 것을 더욱 지시한다 (참조: 도 28a).
LPS의 부재에서, 단지 미분획된 NCIMB 42787만 IL-6을 유도하는 능력을 유지하였다 (도 28b).
실시예 29 - NCIMB 42787은 자극된 비장세포에 의한 TNFα의 생산을 유의미하게 감소시킨다
살아있는 생물치료 균주가 BALB/c 생쥐로부터 단리되고 LPS 또는 ConA로 자극된 비장세포에서 면역 마커 생산의 효능에 대해 탈체에서 선별검사되었다.
도 29는 친염증성 사이토킨 TNFα의 생산을 유의미하게 감소시키는 본 발명의 조성물의 능력을 도시한다. TNFα는 유의미한 염증 반응을 촉발하고, 그리고 따라서 이러한 사이토킨의 생산을 감소시키는 능력은 염증을 감소시킬 것이다.
따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNFα 수준의 감소를 주동한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TNFα의 감소에 비추어 치료적으로 유익하다.
실시예 30 - 수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주는 해마 및 편도에서 글루코코르티코이드 수용체의 발현을 유의미하게 증가시킨다
BALB/c 생쥐는 살아있는 생물치료제가 투여되었고, 그리고 qPCR을 이용한 유전자 발현의 분석을 위해 조직이 단리되었다.
도 30은 NCIMB 43385가 해마 및 편도 둘 모두에서 글루코코르티코이드 수용체 (Nr3c1)의 발현에서 증가를 촉발한다는 것을 보여준다.
만성 염증성 상태의 치료에서 글루코코르티코이드의 이용은 특히, 친염증성 사이토킨을 억제함에 있어서 그들의 역할에 비추어 널리 알려져 있다. 이에 더하여, 글루코코르티코이드 경로는 암에서 치료적으로 활용되었는데, 그 이유는 이것이 항증식 및 항혈관신생 반응을 촉발할 수 있기 때문이다. 이런 이유로, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 글루코코르티코이드 수용체의 발현에서 증가를 촉발한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 글루코코르티코이드 수용체의 증가된 발현으로 인해, 염증성 장애를 치료하는 데 치료적으로 유익하다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 항증식 및/또는 항혈관신생 반응을 증진하는 글루코코르티코이드 수용체의 발현에서 증가로 인해, 암을 치료하는 데 치료적으로 유익하다.
서열
서열 번호: 1 (메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRx0029에 대한 공통 16S rRNA 서열)
TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGGCTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTTATATGGGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCATCGCAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACCTCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCGGAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAGGCAACCGCAAG
qPCR에 이용된 프라이머
Figure pct00008
TPH1 및 β-액틴에 대한 프라이머 서열
Figure pct00009
SLC6A4 및 β-액틴에 대한 프라이머 서열
Figure pct00010
서열 번호: 14 (수탁 번호 NCIMB 43385 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATC
서열 번호: 15 (수탁 번호 NCIMB 43388 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
GGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGTCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCT
서열 번호: 16 (수탁 번호 NCIMB 43389 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massilliensis) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCGAGGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAAAGACACCGGGTATTAACCGATGCCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACCAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCTTCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTAGAATCGATAAGAAGCAAGCTTCTCATGTCTTCTCGTTCGACTTGCAT
서열 번호: 17 (수탁 번호 NCIMB 43386 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
CGACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTGCA
서열 번호: 18 (수탁 번호 NCIMB 43387 하에 기탁된 메가스파에라 (Megasphaera) 균주에 대한 공통 16S rRNA 서열)
TCGAACGGCTGGTTCCTTGCGGTTGCCTCACCGGCTTCGGGTGTGAATGACTTTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGGGACTCTGTTTTTGGGGTTTGCTCCGGATCGCTCCTTCGCTTCCCTCTATTAAGAGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAAGCCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGCATTGTCTGCGGCAGTCTCTTCTGAGTCCCCACCCTTAGTGCTGGCAACAGAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCGTGCACCACCTGTTTTCTTGTCTTCCGAAGAAGAACCGGAAATCTCTTTCCGTAGCAATCAATGTCAAGGCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATACTTATTGCGTTAACTCCGGCACAGAAGGAGTCGATACCTCCTACACCTAGTATCCATCGTTTACGGCCAGGACTACCGGGGTATCTAATCCCGTTTGCTCCCCTGGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTGTCGTCCAGAAAGCCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCTAATATCTACGCATTTCACCGCTACACTAGGAATTCCGCTTTCCTCTCCGACACTCGAGCTTCACAGTTTCGGTCCCCTCACGGGGTTAAGCCCCGCACTTTTAAGACCGACTTGCGATGCCGCCTGCGCGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCTTACGGTACCGTCAGGGATAACGGGTATTGACCGCTATCCTGTTCGTCCCATATAACAGAACTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGTTCATCCTCTCAGACCGGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGGGCCGTTACCCCTCCAACTAGCTAATCAGACGCAAGCCCCTCCTCCAGCGAAAGCCCGAAGGCCTCCCTTTCTTCATCCCGTCATGCGGCGGAAAGAACGTATTCGGTATTAGCAGCCGTTTCCAGCTGTTGTCCCCATCTGAAGGGCAGGTTGCTTACGCGTTACTCACCCGTTTGCCACTCGAATTGATAAGAAGCAAGCTTCTCATCTCTTCTCGTTCGACTTGCA
qPCR에 이용된 프라이머
Figure pct00011
참고문헌
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQUENCE LISTING <110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED <120> COMPOSITIONS COMPRISING BACTERIAL STRAINS <130> P073037WO <141> 2019-05-13 <150> 18171893.3 <151> 2018-05-11 <150> 18178136 <151> 2018-06-15 <150> 1810386.1 <151> 2018-06-25 <150> 1813460.1 <151> 2018-08-17 <150> 1817642.0 <151> 2018-10-29 <150> 1820264.8 <151> 2018-12-12 <150> 1820256.4 <151> 2018-12-12 <160> 22 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 1398 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for Megasphaera massiliensis strain MRx0029 <400> 1 tgagaagctt gcttcttatc gattctagtg gcaaacgggt gagtaacgcg taagcaacct 60 gcccttcaga tggggacaac agctggaaac ggctgctaat accgaatacg ttctttccgc 120 cgcatgacgg gaagaagaaa gggaggcctt cgggctttcg ctggaggagg ggcttgcgtc 180 tgattagcta gttggagggg taacggccca ccaaggcgac gatcagtagc cggtctgaga 240 ggatgaacgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaacg atgacggcct 360 tcgggttgta aagttctgtt atatgggacg aacaggacat cggttaatac ccggtgtctt 420 tgacggtacc gtaagagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480 ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggcg cgcaggcggc atcgcaagtc 540 ggtcttaaaa gtgcggggct taaccccgtg aggggaccga aactgtgaag ctcgagtgtc 600 ggagaggaaa gcggaattcc tagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattag gaggaacacc 660 agtggcgaaa gcggctttct ggacgacaac tgacgctgag gcgcgaaagc caggggagca 720 aacgggatta gataccccgg tagtcctggc cgtaaacgat ggatactagg tgtaggaggt 780 atcgactcct tctgtgccgg agttaacgca ataagtatcc cgcctgggga gtacggccgc 840 aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagta tgtggtttaa 900 ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagc cttgacattg attgctacgg aaagagattt 960 ccggttcttc ttcggaagac aagaaaacag gtggtgcacg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tcttctgttg ccagcacctc 1080 gggtggggac tcagaagaga ctgccgcaga caatgcggag gaaggcgggg atgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatggc ttgggctaca cacgtactac aatggctctt aatagaggga 1200 agcgaaggag cgatccggag caaaccccaa aaacagagtc ccagttcgga ttgcaggctg 1260 caactcgcct gcatgaagca ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagcatac tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga aagtcattca cacccgaagc 1380 cggtgaggca accgcaag 1398 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> GPR109a qPCR forward primer <400> 2 atgttggcta tgaaccgcca g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> GPR109a qPCR reverse primer <400> 3 gctgctgtcc gattggaga 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> TPH1 forward primer <400> 4 aaagagcgta caggtttttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> TPH1 reverse primer <400> 5 gtctcacata ttgagtgcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> TPH2 forward primer <400> 6 cactattgtg acgctgaatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> TPH2 reverse primer <400> 7 agctcagaac catacatgag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Beta-actin forward primer <400> 8 gatcaagatc attgctcctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Beta-actin reverse primer <400> 9 ttgtcaagaa agggtgtaac 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> SLC6A4 forward primer <400> 10 aatctgccga ttttcaaag 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> SLC6A4 reverse primer <400> 11 gtgttgtagt aggaagcaat g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Beta-actin forward primer <400> 12 gatcaagatc attgctcctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Beta-actin reverse primer <400> 13 ttgtcaagaa agggtgtaac 20 <210> 14 <211> 1409 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession number NCIMB 43385 <400> 14 ggctggttcc ttgcggttgc ctcaccggct tcgggtgtga atgactttcg tggtgtgacg 60 ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagta tgctgacctg cgattactag 120 cgattcctgc ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgggac tctgtttttg 180 gggtttgctc cggatcgctc cttcgcttcc ctctattaag agccattgta gtacgtgtgt 240 agcccaagcc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc cgccttcctc cgcattgtct 300 gcggcagtct cttctgagtc cccaccctta gtgctggcaa cagaagatag gggttgcgct 360 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccgt gcaccacctg 420 ttttcttgtc ttccgaagaa gaaccggaaa tctctttccg tagcaatcaa tgtcaaggct 480 tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta aaccacatac tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tacttattgc 600 gttaactccg gcacagaagg agtcgatacc tcctacacct agtatccatc gtttacggcc 660 aggactaccg gggtatctaa tcccgtttgc tcccctggct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720 gtcgtccaga aagccgcttt cgccactggt gttcctccta atatctacgc atttcaccgc 780 tacactagga attccgcttt cctctccgac actcgagctt cacagtttcg gtcccctcac 840 ggggttaagc cccgcacttt taagaccgac ttgcgatgcc gcctgcgcgc cctttacgcc 900 caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960 ccgtggcttt ctcttacggt accgtcaggg ataacgggta ttgaccgcta tcctgttcgt 1020 cccatataac agaactttac aacccgaagg ccgtcatcgt tcacgcggcg ttgctccgtc 1080 agactttcgt ccattgcgga agattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140 tctcagtccc aatgtggccg ttcatcctct cagaccggct actgatcgtc gccttggtgg 1200 gccgttaccc ctccaactag ctaatcagac gcaagcccct cctccagcga aagcccgaag 1260 gcctcccttt cttcatcccg tcatgcggcg gaaagaacgt attcggtatt agcagccgtt 1320 tccagctgtt gtccccatct gaagggcagg ttgcttacgc gttactcacc cgtttgccac 1380 tcgaattgat aagaagcaag cttctcatc 1409 <210> 15 <211> 1415 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera massiliensis strain deposited under accession number NCIMB 43388 <400> 15 ggctggttcc ttgcggttgc ctcaccggct tcgggtgtga atgactttcg tggtgtgacg 60 ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagta tgctgacctg cgattactag 120 cgattcctgc ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgggac tctgtttttg 180 gggtttgctc cggatcgctc cttcgcttcc ctctattaag agccattgta gtacgtgtgt 240 agcccaagcc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc cgccttcctc cgcattgtct 300 gcggcagtct cttctgagtc cccacccgag gtgctggcaa cagaagatag gggttgcgct 360 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccgt gcaccacctg 420 ttttcttgtc ttccgaagaa gaaccggaaa tctctttccg tagcaatcaa tgtcaaggct 480 tggtaaggtt cttcgcgttg cgtcgaatta aaccacatac tccaccgctt gtgcgggccc 540 ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggga tacttattgc 600 gttaactccg gcacagaagg agtcgatacc tcctacacct agtatccatc gtttacggcc 660 aggactaccg gggtatctaa tcccgtttgc tcccctggct ttcgcgcctc agcgtcagtt 720 gtcgtccaga aagccgcttt cgccactggt gttcctccta atatctacgc atttcaccgc 780 tacactagga attccgcttt cctctccgac actcgagctt cacagtttcg gtcccctcac 840 ggggttaagc cccgcacttt taagaccgac ttgcgatgcc gcctgcgcgc cctttacgcc 900 caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960 ccgtggcttt ctcttacggt accgtcaaag acaccgggta ttaaccgatg tcctgttcgt 1020 cccatataac agaactttac aacccgaagg ccgtcatcgt tcacgcggcg ttgctccgtc 1080 agactttcgt ccattgcgga agattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140 tctcagtccc aatgtggccg ttcatcctct cagaccggct actgatcgtc gccttggtgg 1200 gccgttaccc ctccaactag ctaatcagac gcaagcccct cctccagcga aagcccgaag 1260 gcctcccttt cttcttcccg tcatgcggcg gaaagaacgt attcggtatt agcagccgtt 1320 tccagctgtt gtccccatct gaagggcagg ttgcttacgc gttactcacc cgtttgccac 1380 tagaatcgat aagaagcaag cttctcatgt cttct 1415 <210> 16 <211> 1433 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera massilliensis strain deposited under accession number NCIMB 43389 <400> 16 cgacggctgg ttccttgcgg ttgcctcacc ggcttcgggt gtgaatgact ttcgtggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtatgctga cctgcgatta 120 ctagcgattc ctgcttcatg caggcgagtt gcagcctgca atccgaactg ggactctgtt 180 tttggggttt gctccggatc gctccttcgc ttccctctat taagagccat tgtagtacgt 240 gtgtagccca agccataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccgcctt cctccgcatt 300 gtctgcggca gtctcttctg agtccccacc cgaggtgctg gcaacagaag ataggggttg 360 cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccgtgcacca 420 cctgttttct tgtcttccga agaagaaccg gaaatctctt tccgtagcaa tcaatgtcaa 480 ggcttggtaa ggttcttcgc gttgcgtcga attaaaccac atactccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc gggatactta 600 ttgcgttaac tccggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatc catcgtttac 660 ggccaggact accggggtat ctaatcccgt ttgctcccct ggctttcgcg cctcagcgtc 720 agttgtcgtc cagaaagccg ctttcgccac tggtgttcct cctaatatct acgcatttca 780 ccgctacact aggaattccg ctttcctctc cgacactcga gcttcacagt ttcggtcccc 840 tcacggggtt aagccccgca cttttaagac cgacttgcga tgccgcctgc gcgcccttta 900 cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960 ttagccgtgg ctttctctta cggtaccgtc aaagacaccg ggtattaacc gatgccctgt 1020 tcgtcccata taacagaact ttacaacccg aaggccgtca tcgttcacgc ggcgttgctc 1080 cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140 cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcatc ctctcagacc ggctactgat cgtcgccttg 1200 gtgggccgtt acccctccaa ccagctaatc agacgcaagc ccctcctcca gcgaaagccc 1260 gaaggcctcc ctttcttctt cccgtcatgc ggcggaaaga acgtattcgg tattagcagc 1320 cgtttccagc tgttgtcccc atctgaaggg caggttgctt acgcgttact cacccgtttg 1380 ccactagaat cgataagaag caagcttctc atgtcttctc gttcgacttg cat 1433 <210> 17 <211> 1431 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession number NCIMB 43386 <400> 17 cgacggctgg ttccttgcgg ttgcctcacc ggcttcgggt gtgaatgact ttcgtggtgt 60 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtatgctga cctgcgatta 120 ctagcgattc ctgcttcatg caggcgagtt gcagcctgca atccgaactg ggactctgtt 180 tttggggttt gctccggatc gctccttcgc ttccctctat taagagccat tgtagtacgt 240 gtgtagccca agccataagg ggcatgatga cttgacgtca tccccgcctt cctccgcatt 300 gtctgcggca gtctcttctg agtccccacc cttagtgctg gcaacagaag ataggggttg 360 cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccgtgcacca 420 cctgttttct tgtcttccga agaagaaccg gaaatctctt tccgtagcaa tcaatgtcaa 480 ggcttggtaa ggttcttcgc gttgcgtcga attaaaccac atactccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc gggatactta 600 ttgcgttaac tccggcacag aaggagtcga tacctcctac acctagtatc catcgtttac 660 ggccaggact accggggtat ctaatcccgt ttgctcccct ggctttcgcg cctcagcgtc 720 agttgtcgtc cagaaagccg ctttcgccac tggtgttcct cctaatatct acgcatttca 780 ccgctacact aggaattccg ctttcctctc cgacactcga gcttcacagt ttcggtcccc 840 tcacggggtt aagccccgca cttttaagac cgacttgcga tgccgcctgc gcgcccttta 900 cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960 ttagccgtgg ctttctctta cggtaccgtc agggataacg ggtattgacc gctatcctgt 1020 tcgtcccata taacagaact ttacaacccg aaggccgtca tcgttcacgc ggcgttgctc 1080 cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140 cgtgtctcag tcccaatgtg gccgttcatc ctctcagacc ggctactgat cgtcgccttg 1200 gtgggccgtt acccctccaa ctagctaatc agacgcaagc ccctcctcca gcgaaagccc 1260 gaaggcctcc ctttcttcat cccgtcatgc ggcggaaaga acgtattcgg tattagcagc 1320 cgtttccagc tgttgtcccc atctgaaggg caggttgctt acgcgttact cacccgtttg 1380 ccactcgaat tgataagaag caagcttctc atctcttctc gttcgactgc a 1431 <210> 18 <211> 1434 <212> DNA <213> consensus 16S rRNA sequence for the Megasphaera strain deposited under accession number NCIMB 43387 <400> 18 tcgaacggct ggttccttgc ggttgcctca ccggcttcgg gtgtgaatga ctttcgtggt 60 gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcagtatgct gacctgcgat 120 tactagcgat tcctgcttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac tgggactctg 180 tttttggggt ttgctccgga tcgctccttc gcttccctct attaagagcc attgtagtac 240 gtgtgtagcc caagccataa ggggcatgat gacttgacgt catccccgcc ttcctccgca 300 ttgtctgcgg cagtctcttc tgagtcccca cccttagtgc tggcaacaga agataggggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccgtgcac 420 cacctgtttt cttgtcttcc gaagaagaac cggaaatctc tttccgtagc aatcaatgtc 480 aaggcttggt aaggttcttc gcgttgcgtc gaattaaacc acatactcca ccgcttgtgc 540 gggcccccgt caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcgggatact 600 tattgcgtta actccggcac agaaggagtc gatacctcct acacctagta tccatcgttt 660 acggccagga ctaccggggt atctaatccc gtttgctccc ctggctttcg cgcctcagcg 720 tcagttgtcg tccagaaagc cgctttcgcc actggtgttc ctcctaatat ctacgcattt 780 caccgctaca ctaggaattc cgctttcctc tccgacactc gagcttcaca gtttcggtcc 840 cctcacgggg ttaagccccg cacttttaag accgacttgc gatgccgcct gcgcgccctt 900 tacgcccaat aattccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt 960 agttagccgt ggctttctct tacggtaccg tcagggataa cgggtattga ccgctatcct 1020 gttcgtccca tataacagaa ctttacaacc cgaaggccgt catcgttcac gcggcgttgc 1080 tccgtcagac tttcgtccat tgcggaagat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg 1140 gccgtgtctc agtcccaatg tggccgttca tcctctcaga ccggctactg atcgtcgcct 1200 tggtgggccg ttacccctcc aactagctaa tcagacgcaa gcccctcctc cagcgaaagc 1260 ccgaaggcct ccctttcttc atcccgtcat gcggcggaaa gaacgtattc ggtattagca 1320 gccgtttcca gctgttgtcc ccatctgaag ggcaggttgc ttacgcgtta ctcacccgtt 1380 tgccactcga attgataaga agcaagcttc tcatctcttc tcgttcgact tgca 1434 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> NSE forward primer <400> 19 ccctgtatcg taagaacggt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> NSE reverse primer <400> 20 gccaccattg atcacgttga 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> GAPDH forward primer <400> 21 ggtatcgtgg aaggactcat g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> GAPDH reverse primer <400> 22 atgccagtga gcttcccgtt c 21

Claims (19)

  1. 자가면역 또는 염증성 장애 또는 암의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물.
  2. 청구항 제 1항에 있어서, 천식, 관절염, 건선, 당뇨병, 동종이식 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 또는 전립선암, 결장직장암, 유방암, 폐암, 간암 또는 위암의 치료에서 이용을 위한, 조성물.
  3. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 조성물.
  4. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 부류 I HDAC 활성에 의해 매개된 질환의 치료에서 부류 I HDAC 활성을 선별적으로 저해하는 방법에서 이용을 위한, 조성물.
  5. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 조성물은 HDAC1, HDAC2 또는 HDAC3 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애에서 HDAC1, HDAC2 또는 HDAC3을 선별적으로 저해하는 데 이용을 위한, 조성물.
  6. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 상승된 HDAC 활성을 갖는 환자에서 이용을 위한, 조성물.
  7. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는, 조성물.
  8. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호:14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 세균 균주는 서열 번호:14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 조성물.
  9. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주인, 조성물.
  10. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호:1과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나, 또는 세균 균주는 서열 번호:1에 의해 대표되는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 조성물.
  11. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 조성물은 경구 투여용인, 조성물.
  12. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 운반체를 포함하는, 조성물.
  13. 임의의 전술한 청구항에 있어서, 세균 균주는 동결 건조되는, 조성물.
  14. 임의의 전술한 청구항의 이용을 위한, 임의의 전술한 청구항의 조성물을 포함하는 식품 산물.
  15. 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하거나 또는 예방하는 방법에 있어서, 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체.
  17. 요법에서 이용을 위한, 바람직하게는 청구항 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체.
  18. 요법에서 이용을 위한 세균 균주에 있어서, 상기 세균 균주는 서열 번호:14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는, 세균 균주.
  19. 요법에서 이용을 위한, 서열 번호: 14, 15, 16, 17 또는 18 중에서 한 가지에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주.
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