CN107988253A - 一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物生物技术领域，具体涉及一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。发现了一种人miRNA序列的新功能，该miRNA序列被命名为miR‑4262，它是人miR‑4262的成熟序列，如SEQ ID NO：1所示。将miR‑4262序列转染Marc‑145细胞，转染24h后采用猪蓝耳病病毒(PRRSV)毒株感染Marc‑145细胞，感染24h后分别收集Marc‑145细胞和细胞培养的上清液，以荧光定量PCR方法分别检测细胞内与细胞外猪蓝耳病病毒病毒含量，表明miR‑4262序列能显著抑制PRRSV在Marc‑145细胞中的增殖与释放过程。本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。

Description

一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用

技术领域

本发明属于动物生物技术领域，具体涉及一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。

背景技术

猪蓝耳病，又称繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。特别是近年来由高致病性PRRSV引起的突发疫情，导致仔猪致死率高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得满意的效果，PRRS防制仍然是养猪业的重大难题之一。

PRRSV有一个典型的生物学特征就是具有严格的宿主和细胞嗜性。它只感染猪，不感染其他物种，且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞，尤其是猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages，PAM)。在体外，PRRSV可在PAM和猴肾细胞系及其衍生细胞系(Marc-145、MA-104等)中增殖。宿主细胞膜上的一些特异性受体的存在与否决定了该细胞对PRRSV的易感性，而CD163就是PRRSV感染宿主细胞的最关键受体之一，它参与介导病毒的内吞和增殖^[1]。例如，在PRRSV非易感细胞系(如BHK-21、PK-15、NLFK)中转染CD163真核表达质粒可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子^[2-3]。采用CD163的抗体处理PAM细胞可以有效阻止PRRSV感染PAM^[2]，且永生化的PAM细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞^[4]。不仅如此，CD163的表达量高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖^[5]。

MicroRNA(miRNA)是一类长约22个碱基、高度保守的内源性非编码RNA分子，能够互补或部分互补的与靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制，作为重要的转录后调节因子调控基因的表达^[6]。miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生，在哺乳动物中它们可能负责调控约50％的编码基因^[7]。在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA也发挥着重要作用，参与病毒与宿主的互作。^[4,8][9-10]。

研究报道miR-181c能靶向抑制PRRSV基因组和受体CD163基因，抑制PRRSV感染增殖。申请人发现一种人miRNA(miR-4262)能靶向CD163基因3’UTR序列，并能抑制PRRSV在细胞中的增殖，本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，合成一个人miR-4262序列，利用该序列作为抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在细胞中的复制与增殖作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，例如可以制备成试剂盒等的应用。

申请人发现了一种人miRNA序列的新功能，申请人将该miRNA序列命名为miR-4262，它是人miR-4262的成熟序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示(即：GACAUUCAGACUACCUG)。将人工合成的miR-4262序列转染Marc-145细胞，转染24h后采用猪蓝耳病病毒(PRRSV)毒株感染Marc-145细胞，感染24h后分别收集Marc-145细胞和细胞培养上清液，用荧光定量PCR方法分别检测细胞内与细胞外猪蓝耳病病毒病毒含量，发现miR-4262序列能显著抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖与释放过程。

本发明的技术方案如下所述：

一种人miR-4262序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，发明要点在于，转染人miR-4262模拟物序列到易感细胞系，使其抑制猪蓝耳病病毒RNA在易感细胞中复制与释放，所述的步骤包括：

(1)将SEQ ID NO：1所示的人工合成的miR-4262序列与包含CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体利用脂质体共同转染到Marc-145细胞，所述的CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，利用双荧光素酶报告系统检测确定人miR-4262序列与猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因的3’UTR区域为靶向结合；

(2)将所述的miR-4262序列通过脂质体转染到Marc-145细胞中，利用荧光定量PCR检测抑制猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因mRNA的表达量；

(3)直接将人工合成的miR-4262成熟序列利用脂质体转染到猪蓝耳病病毒易感细胞系Marc-145中；转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染Marc-145细胞；

(4)猪蓝耳病病毒株感染24h后，分别收集Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液，提取Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液的总RNA；

(5)利用荧光定量PCR分别检测Marc-145细胞内与Marc-145细胞培养的上清液中猪蓝耳病病毒的RNA含量。

本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备体外检测猪蓝耳病病毒(PRRSV)药物或试剂的应用，例如可以制备成试剂盒等的应用。

更详细的技术方案和发明效果如《具体实施方式》和《说明书附图》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是人miR-4262的成熟序列(或称之为人miR-4262序列)。

序列表SEQ ID NO：2是PCR扩增猪CD163基因3UTR序列。片段长度为469bp。

序列表SEQ ID NO：3是构建本发明构建的重组载体psi-CHECK2-CD163-3UTR的核苷酸序列。

序列长度为6697bp。

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：是中间载体psi-CHECK2的结构图谱。

图3：是重组载体psi-CHECK2-CD163-3UTR结构图谱。

图4：是miR-4262序列和CD163基因3’UTR双荧光素酶报告载体共转染Marc-145细胞后的相对荧光素酶检测结果。附图标记说明：NC是转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262是转染miR-4262模拟物，**P<0.01。

图5：是Marc-145细胞过表达miR-4262对CD163基因mRNA表达量影响。附图标记说明：Mock表示空白对照，NC-20nM、NC-50nM、NC-100nM表示分别转染20nM、50nM、100nM的阴性对照miRNA模拟物，miR-4262-20nM、miR-4262-50nM、miR-4262-100nM表示分别转染20nM、50nM、100nM的miR-4262模拟物，**P<0.01。

图6：是商用载体pMD-18T的结构图谱。

图7：是Marc-145细胞内PRRSV RNA相对定量检测结果。附图标记说明：Mock表示空白对照，NC表示转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262表示转染miR-4262模拟物，**P<0.01。

图8：是Marc-145细胞培养的上清液PRRSV RNA绝对定量检测结果。附图标记说明：NC表示转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262序列表示转染miR-4262模拟物，NTC表示未接毒处理，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1 miR-4262序列靶向结合猪CD163基因3’UTR序列

1.猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告载体构建

(1)猪CD163基因3’RACE测序

提取湖北白猪(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验猪场)肝脏组织总RNA，使用宝生物工程大连有限公司的3’RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链。反应体系为10μl，反应程序为：42℃，60min；70℃，15min。参考猪CD163基因GenBank的cDNA序列(登录号：NM_213976.1)设计外、内两个上游特异性引物(外引物：5'CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC 3'和内引物：5’TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT 3’)，结合宝生物工程大连有限公司3’RACE试剂盒的外、内两个下游锚定引物(外引物：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’和内引物：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’)，利用槽式降落PCR(TD-PCR)扩增3’UTR区片段。进行第一轮外引物PCR扩增，反应体系为50μl，其中反转录cDNA 2μl，反应程序为：95℃预热4min；95℃变性30s，62℃-52℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸1.5min，共20个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1.5min，共15个循环；72℃延伸10min；4℃保存。第二轮内引物PCR扩增反应体系为50μl，其中第1轮PCR产物1ul，反应程序为：95℃预热4min；95℃变性30s，64℃-54℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸1.5min，共20个循环；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，共15个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，从琼脂糖回收目的DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

(2)猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告载体构建

结合猪CD163基因CDS序列和以上3’RACE测序结果，设计包含猪CD163基因3’UTR区的一对引物，PCR扩增猪CD163基因3’UTR区域(片段长度为469bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)。所用引物为：上游引物5'CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC3'，含有XhoⅠ酶切识别位点(CTCGAG)和保护碱基(CCG)；下游引物5'ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG 3'，含有NotⅠ酶切识别位点(GCGGCCGC)和保护碱基(ATTT)。PCR扩增反应体系为50μl，反应程序为：95℃预热4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，5个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，共25个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，采用过柱离心的方法从琼脂糖回收纯化PCR产物，并送测序验证。

将切胶纯化回收后的PCR产物及psiCHECK-2载体分别用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切，然后采用T4DNA连接酶将线性化psiCHECK-2载体(购自美国Promega公司)与CD163基因3’UTR片段相连，连接体系为10μl：psi-CHECK2载体2μl，CD163基因3’UTR扩增片段6μl，T4连接酶1μl，10×T4DNA连接酶缓冲液1μl。混合体系于4℃连接过夜。取5μl的连接产物连接反应产物转化50μl感受态大肠杆菌DH5α，采用菌液PCR筛选阳性克隆，并将用XhoI和NotI双酶切正确的重组质粒送测序鉴定，测序鉴定正确的重组质粒命名为重组载体psi-CHECK2-CD163-3UTR(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)。

2.双荧光素酶活性检测

在转染前一天，5×10⁴细胞接种在24孔板中，加入无抗生素的DMEM(高糖)培养基(购自HyClone公司)培养细胞。转染当天，细胞更换新鲜培养液，用Opti-MEM无血清培养基(美国Gibico公司)稀释质粒和脂质体，每孔加入200ng重组质粒psi-CHECK2-CD163-3UTR、80nM各miR-4262合成物、2ul LipofectamineTM 2000脂质体(美国Thermo FisherScientific公司)。将细胞培养板放入无菌5％CO2培养箱中，培养5h后，更换为新鲜完全培养基，24h后裂解细胞检测荧光素酶活性。上述实验每组设3个平行孔，以不进行转染的细胞作为空白对照，每组实验重复3次。

用冷PBS清洗细胞2次，加入120ul细胞裂解液1×PLB，室温摇晃15min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中，按照Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay)说明书提供的方法，采用PerkinElmer公司的VICTORTM X2Multilabel Plate Reader仪器检测双荧光素酶活性。以萤火虫荧光值(M1)为内参荧光值，海肾荧光值(M2)为报告基因检测值，结果以M2/M1比值计算，利用SPSS 17.0对检测结果进行统计分析，结果如图4所示。NC对照组荧光比值均值(M2/M1)为42.07±0.54，miR-4262组荧光比值均值(M2/M1)为24.56±1.41，miR-4262可显著(P<0.001)降低相对荧光活性，其活性仅为NC对照组的54％，说明miR-4262能靶向结合CD163基因3’UTR序列。

实施例2利用miR-4262序列抑制CD163基因mRNA表达

1.miR-4262模拟物转染

转染前一天，消化Marc-145细胞，并通过细胞计数板对细胞悬液进行计数，以每孔l×l0⁵个细胞进行均匆地铺板，细胞长满80％时开始转染。miR-4262模拟物按不同浓度(20nM、50nM、100nM)稀释好后与脂质体Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)共孵育制备混合液，将混合液加入细胞培养板中，然后在5％CO₂、37℃条件下培养24h后收集细胞。

2.RNA提取及RT-PCR反应

利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA。用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit(购自美国Thermo Scientific公司)进行反转录，采用Select Master Mix for CFX(购自美国Applied Biosystems公司)染料进行荧光定量PCR，相对定量PCR采用GAPDH基因(基因登陆号NC_027903.1)做内参。每个试验至少重复3次。定量PCR所用引物和退火温度见表1。

表1定量PCR所用引物

结果发现与转染空白对照组(Mock)相比，转染不同浓度梯度(20nM、50nM和100nM)的miR-4262均可极显著抑制CD163mRNA表达量(P<0.01)，转染各浓度梯度的阴性对照miR-NC组的CD163mRNA表达水平与空白对照Mock组无明显差异(P>0.05)(图5)。由此看出，本发明的miR-4262序列可靶向作用CD163抑制其mRNA的表达。

实施例3利用miR-4262序列抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在细胞中的增殖

1.miR-4262模拟物转染

转染前一天，消化Marc-145细胞，并通过细胞计数板对细胞悬液进行计数，以每孔l×l0⁵个细胞进行均匆地铺板，细胞长满80％时开始转染。miR-4262模拟物按60nM浓度稀释好后与脂质体Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen公司)共孵育制备混合液，将混合液加入细胞培养基中，然后在5％CO₂、37℃条件下培养24h后收集细胞。

2.PRRSV感染

接种病毒前，先将PRRSV病毒原液放置冰上慢慢融化。Marc-145转染24h后，用MO10.1的PRRSV感染细胞，感染24h后收集细胞或细胞上清液。

3.RNA提取及RT-PCR反应

利用Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)提取细胞总RNA。反转录采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(购自美国Thermo Scientific公司)，荧光定量PCR采用Select Master Mix for CFX(购自美国Applied Biosystems公司)染料，相对定量PCR采用GAPDH基因(基因登陆号NC_027903.1)做内参。猪蓝耳病病毒RNA的绝对定量，采用含有猪蓝耳病病毒基因组(HM853673.2)片段的商用载体pMD-18T(购自宝生物工程大连有限公司，载体图普见图6)作为标准品制作标准曲线。每个试验至少重复3次。定量PCR所用引物和退火温度见表1。

用PRRSV感染过表达miRNA的细胞，分别检测了细胞内和细胞培养上清液中PRRSVRNA含量。结果发现与转染阴性对照NC组相比较，转染miR-4262能极显著地抑制细胞内(见图7)和细胞培养的上清液中的PRRSV RNA含量(见图8)(P<0.01)，可使细胞内PRRSV病毒含量下降87％，说明miR-4262具有良好的抗病毒效果。

本发明为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备体外检测猪蓝耳病病毒(PRRSV)药物或试剂或标识物的应用，例如可以制备成试剂盒等的应用(例如参考：朱立平主编《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社；北京；2000版；或参考本领域公开报道的其他技术文献)。

主要参考文献：

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[11]朱立平主编：《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社，北京，2000版。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用

<130>

<141> 2016-11-07

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 猪 (Sus scrofa)

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<222> (1)..(17)

<223>

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(469)

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ctcaggagga gagaattctg tccatcaaat tcaataccgg gagatgaatt cttgcctgaa 180

agcagatgaa acggatatgc taaatccctc aggagaccac tctgaagtac aatgaaaagg 240

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tattgaatga gcaagaatct gcctcttaca ctgaagatta caatacagtc ctctgtctcc 360

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cctctggagg atggcaccgc tggcgagcag ctgcacaagg ccatgaagag gtatgccctg 3060

gtgcctggca ccattgcctt caccgatgcc cacattgagg tggacatcac ctatgccgag 3120

tacttcgaga tgtctgtgcg cctggccgag gccatgaaga ggtacggcct gaacaccaac 3180

caccgcatcg tggtgtgctc tgagaactct ctgcagttct tcatgccagt gctgggcgcc 3240

ctgttcatcg gagtggccgt ggcccctgct aacgacattt acaacgagcg cgagctgctg 3300

aacagcatgg gcatttctca gcctaccgtg gtgttcgtgt ctaagaaggg cctgcagaag 3360

atcctgaacg tgcagaagaa gctgcctatc atccagaaga tcatcatcat ggactctaag 3420

accgactacc agggcttcca gagcatgtac acattcgtga catctcatct gcctcctggc 3480

ttcaacgagt acgacttcgt gccagagtct ttcgacaggg acaaaaccat tgccctgatc 3540

atgaacagct ctgggtctac cggcctgcct aagggcgtgg ccctgcctca tcgcaccgcc 3600

tgtgtgcgct tctctcacgc ccgcgaccct attttcggca accagatcat ccccgacacc 3660

gctattctga gcgtggtgcc attccaccac ggcttcggca tgttcaccac cctgggctac 3720

ctgatttgcg gctttcgggt ggtgctgatg taccgcttcg aggaggagct gttcctgcgc 3780

agcctgcaag actacaaaat tcagtctgcc ctgctggtgc caaccctgtt cagcttcttc 3840

gctaagagca ccctgatcga caagtacgac ctgtctaacc tgcacgagat tgcctctggc 3900

ggcgccccac tgtctaagga ggtgggcgaa gccgtggcca agcgctttca tctgccaggc 3960

atccgccagg gctacggcct gaccgagaca accagcgcca ttctgattac cccagagggc 4020

gacgacaagc ctggcgccgt gggcaaggtg gtgccattct tcgaggccaa ggtggtggac 4080

ctggacaccg gcaagaccct gggagtgaac cagcgcggcg agctgtgtgt gcgcggccct 4140

atgattatgt ccggctacgt gaataaccct gaggccacaa acgccctgat cgacaaggac 4200

ggctggctgc actctggcga cattgcctac tgggacgagg acgagcactt cttcatcgtg 4260

gaccgcctga agtctctgat caagtacaag ggctaccagg tggccccagc cgagctggag 4320

tctatcctgc tgcagcaccc taacattttc gacgccggag tggccggcct gcccgacgac 4380

gatgccggcg agctgcctgc cgccgtcgtc gtgctggaac acggcaagac catgaccgag 4440

aaggagatcg tggactatgt ggccagccag gtgacaaccg ccaagaagct gcgcggcgga 4500

gtggtgttcg tggacgaggt gcccaagggc ctgaccggca agctggacgc ccgcaagatc 4560

cgcgagatcc tgatcaaggc taagaaaggc ggcaagatcg ccgtgtaata attctagagt 4620

cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 4680

acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 4740

tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 4800

tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 4860

ggtaaaatcg ataaggatcc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 4920

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 4980

atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 5040

attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 5100

gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 5160

agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 5220

aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 5280

cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 5340

cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 5400

actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 5460

cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 5520

ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 5580

ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 5640

gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 5700

gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 5760

ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 5820

cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 5880

caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 5940

taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 6000

cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 6060

cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 6120

gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 6180

aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 6240

cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 6300

tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 6360

acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 6420

ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 6480

ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 6540

tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 6600

tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 6660

ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg gctcgac 6697

Claims (1)

1.一个人miR-4262序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，其特征在于，转染人miR-4262模拟物序列到易感细胞系，使其抑制猪蓝耳病病毒RNA在易感细胞中复制与释放，步骤包括：

(1)将SEQ ID NO：1所示的人工合成的miR-4262序列与包含CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体利用脂质体共同转染到Marc-145细胞，所述的CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，利用双荧光素酶报告系统检测确定人miR-4262序列与猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因的3’UTR区域为靶向结合；

(2)将所述的miR-4262序列通过脂质体转染到Marc-145细胞中，利用荧光定量PCR检测抑制猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因mRNA的表达量；

(3)直接将人工合成的miR-4262成熟序列利用脂质体转染到猪蓝耳病病毒易感细胞系Marc-145中；转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染Marc-145细胞；

(4)猪蓝耳病病毒株感染24h后，分别收集Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液，提取Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液的总RNA；

(5)利用荧光定量PCR分别检测Marc-145细胞内与Marc-145细胞培养的上清液中猪蓝耳病病毒的RNA含量。