CN101164431A - 一种具有抗菌功能的饲料添加剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗菌功能的饲料添加剂及其应用。所述饲料添加剂是由经过修饰的鱼类抗菌肽hepcidin和两栖动物抗菌肽magainin所组成的融合蛋白，其中融合蛋白含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的短肽；或者所述饲料添加剂是基因组中包含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的毕赤酵母、酿酒酵母、假丝酵母之一或其任意比例的组合，其中：所述酵母菌数不少于5×10⁴cfu/g，含水量≤10％。本发明所述饲料添加剂能替代抗生素广泛用于制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料。

Description

一种具有抗菌功能的饲料添加剂及应用

技术领域

本发明涉及一种饲料添加剂及应用，尤其涉及一种用基因工程技术建立的动物抗菌肽基因载体和通过酵母表达系统获得的饲料添加剂及应用。

背景技术

随着我国畜牧和水产养殖集约化养殖模式的迅猛发展和环境污染情况的不断加剧，高密度的养殖使得畜禽和水生生物感染疾病的几率越来越高，病害频繁发生，常造成比较大的经济损失。病害问题已经成为制约养殖业发展的瓶颈。传统上对养殖病害采取的主要对策是使用抗生素及其它类型的化学药物，这样不可避免地带来了细菌抗药性和药物残留的问题。大量施用抗生素，不仅造成病原体对其产生抗药性，使抗生素的使用浓度越来越高和超级抗药性细菌的出现，同时也易造成抗生素在生物体内累积。养殖业广泛和大量使用氯霉素等抗生素，造成抗生素在畜禽和水产品中超标累积，对消费者的健康形成威胁以至造成损害。国际上，欧盟第70、524号令已经规定传统抗生素在限定的时间内将被逐渐禁止饲用，同时禁止我国抗生素超标的农产品出口欧盟国家。为维护广大消费者的身体健康，保证动物源食品的安全，我国农业部也颁发了“食品动物禁用的兽药及其它化合物清单”，传统的抗生素作为饲料添加剂已面临严峻的挑战。开发无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作为饲料添加剂已成为国际上重要的发展趋势。我国是畜禽和水产品的生产大国，发展和应用新型饲料添加剂将无疑是“后抗生素时代”的出路和发展方向。对于用高技术带动畜禽和水产养殖业以及养殖饵料工业的行业技术进步，促进高科技产业的发展无疑将具有巨大的推动作用。

抗菌肽是生物体自身产生的一种能够抵抗外界微生物、病毒等病原体侵染，具有抗菌活性的多肽，是机体非特异性防御系统的重要组成部分，广泛存在于自然界中。由于抗菌肽直接作用于细菌细胞膜表面使其产生相变和形成孔道，从而造成病菌细胞膜的损毁，因此其作用机理有别于抗生素，不需与病菌细胞膜表面受体结合，避免了细菌变异产生抗药性。抗菌肽具有杀菌活力高、作用迅速、不产生耐药性等特点，是免疫防御，杀灭病原菌的有效手段。迄今为止，已经有包括自较为低等的动物至高等哺乳动物和人类来源的上千种抗菌肽被分离、纯化。

尽管抗菌肽抗菌功效显著，应用前景广阔，但天然抗菌肽在生物体内的含量很低，无法大量获取；而化学合成肽价格昂贵，限制了其广泛应用。利用生物工程技术生产基因工程重组的具有高效杀菌效果的抗菌肽并应用于畜禽和水产养殖业，取代日益受到禁用的抗生素就成为必然选择。

Hepcidin是重要的抗菌肽家族β-defensin蛋白家族中的一员(Verga F，et al，Gene.2005，364：37-44)。是一种富含半胱氨酸的抗菌蛋白，其抗菌活性已得到多方的证实(Krause A，et al，FEBS Lett.2000，480：147-150；Park C H，et al，J BiolChem，2001，276：7806-7810)。迄今为止已经有多种hepcidin的同源异构体基因得到克隆。Magainin是源自两栖动物的另一类重要的抗菌肽家族，最初是从蟾蜍的皮肤中分离得到的，这类抗菌肽具有α螺旋结构，通常是山L型两性氨基酸组成，对革兰氏阴性菌、阳性菌、都有杀伤作用(Zasloff M，Proc Natl Acad Sci USA，1987，84：5449-5453；Barrell PJ，et al，Protein Expr Purif，2004，33：153-159)。这两种抗菌肽都有非常明确的抗菌效果。

上世纪末随着基因工程技术的迅猛发展，具有遗传操作简便，兼备原核生物生长迅速及真核蛋白翻译后加工修饰的特点，酵母已经成为生产真核异源蛋白的重要工具之一。近年来，随着发酵技术的发展和甲醇调节型及其它各类特异性启动子的出现，毕赤酵母以其独特的优势和潜力在生物工程领域得到了广泛应用。它能够以甲醇为碳源，生长速度快，细胞浓度高，是基因工程中外源蛋白的理想表达载体，尤其适合真核生物蛋白的表达。毕赤酵母可以以胞内或胞外形式表达外源蛋白，且具有稳定性高，适应性强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养基中生长的特点。由于毕赤酵母表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产特殊功能的目的蛋白。

目前，在水产养殖的饲料配置上，由于鱼粉的高蛋白含量和优良的营养组成，常作为高蛋白饲料的主要来源，但随着养殖业的快速发展，鱼粉供应紧缺，价格年年上涨，解决蛋白饲料尤其是鱼粉饲料的不足，已经成为世界各国关注的焦点之一。开发利用具有优良营养组成，蛋白质含量高，适用于集约化生产和自动化管理的酵母类饲料添加剂，开发以基因工程构建的新型具有免疫、抗菌功能的饲料添加剂替代鱼粉和抗生素将具有重要的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用基因工程技术建立的动物抗菌肽基因载体和通过酵母表达系统获得的饲料添加剂及应用，以期利用其高蛋白质含量和免疫、抗菌功能替代鱼粉和抗生素。

本发明所述的具有抗菌功能的饲料添加剂，其特征在于：它是由经过修饰的鱼类抗菌肽hepcidin和两栖动物抗菌肽magainin所组成的融合蛋白，所述融合蛋白含有SEQID NO：1所示氨基酸序列的短肽。

或者，本发明的具有抗菌功能的饲料添加剂是基因组中包含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的毕赤酵母、酿酒酵母、假丝酵母之一或其任意比例的组合，其中：所述酵母菌数不少于5×10⁴cfu/g，含水量≤10％。

优选的，上述酵母为毕赤酵母GS115。

上述融合蛋白的基因，即SEQ ID NO：2所示核苷酸序列由编码鱼类hepcidinlprecursor成熟肽的cDNA序列、编码两栖动物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列、限制性内切酶EcroR I位点的cDNA序列以及符合真核生物表达偏好性的基因序列组成。

本发明所述饲料添加剂在制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料中的应用。

其中：所述饲料添加剂直接作为增强免疫、抗菌功能添加剂添加到水生生物或畜禽饲料中，添加比例量为基础饲料重量的5％～25％。

优选的，所述饲料添加剂添加比例量为基础饲料重量的10％～20％。

本发明将鱼类的抗菌肽和两栖动物的抗菌肽组成新型的融合蛋白，使用基因工程的手段构建含融合蛋白cDNA序列的表达载体并整合至酵母基因组进行表达，获得了具有抗菌功能更强的融合蛋白。其表达产物即为本发明的具有抗菌功能的饲料添加剂，可以应用于水生生物或畜禽动物养殖中；也可以通过纯化或浓缩的方法，得到高纯度的融合蛋白，直接作为抗生素的替代品用于生物的病害防治，细菌性甚至病毒性疾病的治疗。

同时，本发明将酵母特别是毕赤酵母作为畜禽和水生生物的饲料添加剂，为饲养生物提供了抗菌肽和丰富的蛋白质、维生素、微量元素和其它生物活性物质。

酵母菌是单细胞真菌，表达抗菌肽的酵母由于其本身很高的营养价值可以直接作为饲料添加剂的主要成分。其干物质中蛋白质含量可高达50％，其中赖氨酸的含量高于大豆，接近动物蛋白；色氨酸的含量比大豆高7倍以上。此外，酵母还含有维生素A、B、C、E、胡罗卜素、生物素、胆碱、叶酸、烟酸、视黄醇以及钙、镁、钾、硒等微量元素以及其它生理活性物质，作为多维高蛋白活性饲料被广泛使用。酵母作为饲料原料不仅可以大幅提高饲料的蛋白质水平，其本身还含有丰富的酶类，如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶等，这些酶类可以通过胞外分泌或细胞壁裂解后产生。因此，作为饲料添加剂的酵母还可以加强畜禽和水生生物对营养物质的消化利用，提高消化率达80％～90％。促进养殖生物的生长，增进其食欲，并增强抵抗疾病和抗应激的能力。占整个细胞干重的20％～30％的酵母细胞壁还含有β-葡聚糖、甘露寡糖、糖蛋白和几丁质等可作为免疫促进剂的活性成分，这些物质在维持细胞形态和细胞与细胞间的识别中起重要作用。如甘露寡糖和β-葡聚糖可以发挥幼龄动物的生长潜力，改善动物健康，激发和增强机体免疫力；甘露寡糖能吸附肠道病原菌及其细菌毒素，调节非特异性免疫防御机制，激活机体体液和细胞免疫机制。此外，酵母的发酵生产工艺比较简单，一般接种1～3h后就可繁殖一代，具有生产速度快，生产周期短的特点，很适合大规模地用于养殖饲料添加剂的生产。

本发明中，由于酵母的基因组含基因工程构建的抗菌肽融合蛋白cDNA序列，可以表达具有良好抗菌活性的由鱼类抗菌肽和两栖动物抗菌肽组成的新型融合蛋白。因此其作为畜禽和水生生物的饲料时，在提供蛋白质和其它丰富的营养物质的同时，还具有良好的抗菌效果，增加了饲养生物的免疫抗病机能，并且还可替代抗生素用于畜禽、水生生物有耐药性的细菌性疾病进行防治。

本发明所述融合蛋白的酵母表达系统，其特征在于：含有外源融合蛋白cDNA的酵母细胞内表达载体pAO815或其它类型的酵母表达载体，以及利用载体使融合蛋白基因在毕赤酵母、酿酒酵母、假丝酵母或其它可食性酵母中进行细胞内或细胞外表达。它的步骤为：

表达载体的构建：人工合成的抗菌融合蛋白cDNA序列上设计有限制性内切酶的酶切位点，融合蛋白cDNA序列和Invitrogen公司的酵母细胞内表达质粒pAO815酶切后链接在一起，通过PCR反应检测融合蛋白基因插入的方向，筛选出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。

酵母表达系统的构建：使用限制性内切酶酶切酵母表达质粒，使其线性化，通过电击转化的方法，将融合蛋白cDNA序列整合到酵母的基因组中。将转化后的菌体悬液涂布于MD平板上，30℃培养，诱导筛选直至单个菌落出现。挑取单菌落，将其作为模板，通过PCR反应确认阳性克隆。

具体的，毕赤酵母表达系统，其特征在于：外源融合蛋白cDNA的酵母细胞内表达载体pAO815(Invitrogen，USA)，以及利用这种载体使融合蛋白基因在毕赤酵母GS115中表达。表达载体通过设计有限制性内切酶的酶切位点，将融合蛋白cDNA序列和pAO815质粒酶切后链接在一起，经筛选出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆，命名为pAO815-antibac质粒。并通过电击转化的方法，将其整合到酵母GS115的基因组中。经挑选含pAO815-antibac的菌落，培养并诱导表达。

融合蛋白的细胞内或细胞外诱导表达及活性检测。

表达产物抗菌活性的检测方法如下：

挑选阳性克隆菌落，于30℃培养，收集菌体，用含有甲醇的培养基重悬菌体，使外源基因能够被诱导表达。如使用细胞内表达载体，收集菌体，破碎细胞后取得蛋白粗提液。如使用细胞外表达载体，收集细胞培养液后通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析纯化，通过聚丙烯酰铵凝胶电泳分离得到电泳纯的融合蛋白。

通过在培养皿上涂布融合蛋白粗提液并同时接种大肠杆菌DH5α、鳗弧菌、溶藻弧菌等种类致病菌，进行抑菌圈实验，或是通过在上述致病菌培养液中添加融合蛋白粗提液，检测A600吸光值来检测其抗菌活性。

本发明的有益效果是：

(1)提供一种蛋白质含量高、营养丰富、富含动物抗菌肽的酵母饲料添加剂。

(2)在养殖中用动物自身的抗菌肽取代抗生素，彻底解决禽畜水产品抗生素累积超标的问题。

(3)用高技术带动养殖业以及养殖饵料工业的行业技术进步。

(4)向社会提供健康的绿色水产品和禽畜产品。

附图说明

图1.鱼类hepcidinl precursor基因的克隆。

图2.表达融合蛋白cDNA的载体pAO815-antibac质粒。

图3.pAO815-antibac阳性克隆的检测。

图4.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对大肠杆菌的抑菌效果。

图5.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对鳗弧菌的抑菌效果。

图6.毕赤酵母表达系统表达的抗菌融合蛋白对溶藻弧菌的抑菌效果。

其中：图4～6中1×、2×、3×为不同浓度的抗菌融合蛋白表达系统蛋白粗体液，0为对照(表达β-Gal的酵母表达系统蛋白粗体液)。

具体实施方式

下面以实施例并结合附图对本发明内容做进一步说明：

1.大菱鲆肝脏cDNA的制备：大鲮鲆注射鳗弧菌感染24h后，取出肝脏，速速放于液氮中，将硬的组织块置于-80℃冷冻保藏。参照TRIZOL^试剂操作说明，取大鲮鲆组织约100mg，加入到1ml TRIZOL试剂中，置室温下匀化5分钟之后，加入200μl氯仿剧烈振荡15秒，室温下温育3min。4℃条件下以12,600rpm转速离心15min。获取界面上层液体加入250μl以0.8M乙酸钠和1.2M氯化钠组成的高浓度盐溶液，混匀后再加入250μl异丙醇混匀，于室温下沉淀10min，再在4℃以12,600rpm转速离心10min。移去上清后用1ml 70％乙醇漂洗沉淀，以11,000rpm转速4℃离心5min。以20μlDEPC处理过的双蒸水(无RNase)55℃溶解RNA沉淀10min后，取2.0ug总RNA，加入1μl50pM的随机引物，以DEPC水稀释至17.1μl。70℃ 5min破坏RNA二级结构后置冰上骤冷。依次加入5μl M-MLV 5×转录缓冲液，1.3μl 10mM dNTP，24U rRNA酶抑制剂和200UM-MLV逆转录酶。于42℃反应1h后在94℃维持5min终止反应，于4℃保藏。

2.大菱鲆hepcidinl precursor抗菌肽基因的克隆和序列分析：以大菱鲆肝脏cDNA为模板，使用引物WBHsp(5`-CAAACCCTCCTAAGATGAAG-3 )，WBHap(5`-AATCCTCAGAACCTACAGCA-3`)进行PCR反应。反应退火温度为52℃，30个循环得到大约300bp的PCR条带(见图1)。得到的PCR产物使用凝胶电泳试剂盒回收，经测序证实，该序列全长293bp，包括完整的编码区，其中开放阅读框长273bp，编码90个氨基酸，详见GenBank序列号AM113708。。通过NCBI的Blastn服务器对核酸序列进行同源相似性比对。同源相似性较高的序列多为Hepcidin家族的基因序列，其中与牙鲆的同源相似性为90％[Pseudosciaena crocea(DQ307050)]，与白鲈的同源相似性为84％[Morone chrysops(AF394246)]，与黑鲷的同源相似性为83％[Acanthopagrusschlegelii(AY669380)]。确定该序列为大菱鲆hepcidinl precursor基因。使用signalP服务器预测hepcidinl precursor蛋白序列的信号肽区域，hepcidinl precursor蛋白序列中C端24个氨基酸为信号肽。使用软件Omiga2.0预测hepcidinl precursor蛋白序列的二级结构，hepcidinl precursor的蛋白序列中N端21个氨基酸为β-折叠结构，而这部分序列包含八个半胱氨酸。Hepcidin蛋白家族成熟肽的最显著的特征就是由这八个半胱氨酸形成的β-折叠结构，这符合hepcidin蛋白家族的特征。比较鲈鱼、斑马鱼Hepcidin成熟肽，从而得出大菱鲆hepcidinl precursor的成熟肽具有21个氨基酸。

3.融合蛋白cDNA的设计与制备：融合蛋白cDNA序列由编码鱼类hepcidinlprecursor成熟肽的基因序列、编码两栖动物抗菌肽Magainin成熟肽的基因序列、限制性内切酶EcroR I位点的序列以及符合真核生物表达偏好性，同时符合Kozak规则的基因序列组成。进行基因工程修饰的位点描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。所以融合蛋白基因序列编码的蛋白序列是由hepcidinl precursor和Magainin的两段成熟肽序列经基因工程方法优化设计修饰组成。使用固相亚磷酸酰胺法人工合成这段基因序列，序列长151bp(见SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)，编码39个氨基酸，后续构建的酵母表达系统所表达的蛋白就是这个含有39个氨基酸的短肽(见SEQ ID NO：1所示氨基酸序列)。

4.酵母表达系统的构建及抗菌活性检测：人工合成的抗菌融合蛋白基因序列上设计有限制性内切酶EcroR I的酶切位点，酵母细胞内表达质粒载体pAO815同样具有EcroR I的单酶切位点，融合蛋白基因和pAO815质粒酶切后具有同样的粘性末端。使用EcroR I分别酶切融合蛋白基因和pAO815质粒，使用凝胶电泳回收试剂盒分别回收酶切后的产物。使用DNA Ligation Kit试剂盒进行连接，取融合蛋白基因11μl加入pAO815载体2μl连接缓冲液2.5μl、连接酶4.5μl，16℃连接过夜。使其链接在一起，并导入到大肠杆菌DH5α中。使用引物HMsp(5`-GGACAGCCACATCTCCCTTT-3`)和HMap(5`-GTGCGAATTCTCAGAACTTC-3`)，以转化后大肠杆菌DH5α菌悬液为模板，进行PCR反应，退火温度53℃，进行30个循环。连接产物检测融合蛋白基因插入的方向。如果融合蛋白基因正向插入到质粒pAO815中则会出现大约130bp的PCR条带，如果融合蛋白基因反向插入则不会出现PCR条带。筛选出含有正向插入的融合蛋白基因的克隆。将得到的表达载体命名为pAO815-antibac质粒(图2)。将该质粒导入到大肠杆菌中，使其形成多克隆。制备pAO815-antibac质粒，使用限制性内切酶Sal I酶切质粒，使其线性化。将约20μg的线性化pAO815-antibac质粒溶液与80μl的GS115感受态细胞混匀，转至0.2ml冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min后使用电转化仪进行转化。条件为：电压1.5kV，电击10msec，使外源基因整合到酵母GS115的基因组中。转化后将菌体加入1ml冰预冷的1mol山梨醇溶液混匀，转至1.5ml的EP管中。转化后的菌体悬液随后均匀涂布于MD平板上于30℃培养，直至单个菌落出现。挑取单菌落，将其作为模板，使用引物5`AOX(5`-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3`)和3`AOX(5`-GCAAATGGCCATTCTGACATCC-3`)，通过PCR反应筛选具有pAO815-antibac的阳性克隆。整合融合蛋白cDNA序列的阳性克隆出现600bp左右的PCR条带(图3)。挑选含pAO815-antibac的菌落，置于装有25ml BMGY培养基的摇瓶中，于30℃培养至菌液的OD₆₀₀＝2.0。收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀＝1.0左右。所得的菌液置于1L的摇瓶中，放置于30℃培养，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为0.5％培养至OD₆₀₀＝3.0。

收集菌体，破碎细胞后取得蛋白粗提液，其中富含融合蛋白。也可以将蛋白粗提液用梯度硫酸铵沉淀，然后将沉淀收集溶于磷酸缓冲液后，分别经离子交换层析和凝胶层析处理，得到电泳纯的融合蛋白。

同时，以同样条件下培养的，可以表达β-Gal的酵母表达系统蛋白粗体液作为对照。

5.抑菌试验：在涂布有大肠杆菌、鳗弧菌或溶藻弧菌的平板培养皿上滴加不同浓度的酵母蛋白粗提液或经过纯化的融合蛋白。将培养皿至于37℃过夜培养，次日观察并记录抑菌效果。

上述富含融合蛋白的粗提液和经过纯化的融合蛋白，均表现有抗菌活性(结果见图4～6)。

6.饲料免疫添加剂的制备与应用：使用100L发酵罐，于30℃下扩大培养基因组中包含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的毕赤酵母GS115，通过发酵液中添加0.5％甲醇诱导抗菌融合蛋白基因的表达，经3-5天培养，经过滤后，得到大量具有表达抗菌活性融合蛋白的GS115酵母，所述酵母菌数不少于5×10⁴cfu/g，含水量≤10％。

以常规方式选择玉米粉、糠、麸皮、豆饼、鱼粉、骨粉为水生生物或养殖畜禽的基础饲料，将上述获得的酵母菌作为饲料添加剂，直接添加于上述水生生物或养殖畜禽的基础饲料中混合，所述饲料添加剂添加比例量为基础饲料重量的20％(可相应减少鱼粉或其它蛋白质饲料的用量)，使混有添加剂的基础饲料的最终营养成分中粗蛋白≥35％、粗脂肪≥3％、粗纤维≥3％、粗灰分≥15％、钙≥2％、磷≥1％、赖氨酸≥1.8％，制得具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料。

或者，以基础饲料重量5％～25％的添加比例量直接将上述所得发酵全液用于畜禽和水产养殖生物的喂养。

7.融合蛋白作为饲料添加剂的应用：以上述方法将含融合蛋白分泌型表达载体的酵母，经常规培养后收集培养液，再经常规沉淀、离心、脱盐、层析等步骤得到兽药级的含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的融合蛋白。

以常规方式选择玉米粉、糠、麸皮、豆饼、鱼粉、骨粉为水生生物或养殖畜禽的基础饲料，将上述获得的融合蛋白作为饲料添加剂，直接添加于上述水生生物或养殖畜禽的基础饲料中混合，所述饲料添加剂添加比例量为基础饲料重量的10％，使混有添加剂的基础饲料的最终营养成分中粗蛋白≥35％、粗脂肪≥3％、粗纤维≥3％、粗灰分≥15％、钙≥2％、磷≥1％、赖氨酸≥1.8％，制得具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料。

或者，将上述获得的融合蛋白直接作为抗菌药物，以常规用药量应用于水生生物或其它养殖禽畜疾病的防治。

序列表

<110>国家海洋局第一海洋研究所

<120>一种具有抗菌功能的饲料添加剂及应用

<141>2007-9-11

<160>2

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Asp Ser His Ile Ser Leu Cys Arg Trp Cys Cys Asn Cys Cys

                5                   10                  15

Lys Ala Tyr Lys Gly Cys Gly Phe Cys Cys Arg Phe Gly Ile Gly

                20                  25                  30

Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe

                35

<210>2

<211>151

<212>cDNA

<213>鱼类hepcidinl precursor成熟肽的cDNA序列&编码两栖动物抗菌肽magainin成熟肽的cDNA序列

<400>2

ccctcgaatt cgccgccacc atggacagcc acatctccct ttgccgctgg tgctgcaact  60

gctgcaaggc ctacaagggc tgtggcttct gctgtaggtt cggcattggc aagttcctgc  120

actctgccaa gaagttctga gaattcgcac c                                 151

Claims (6)

1.一种具有抗菌功能的饲料添加剂，其特征在于：它是由经过修饰的鱼类抗菌肽hepcidin和两栖动物抗菌肽magainin所组成的融合蛋白，所述融合蛋白含有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的短肽。

2.一种具有抗菌功能的饲料添加剂，其特征在于：它是基因组中包含有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的毕赤酵母、酿酒酵母、假丝酵母之一或其任意比例的组合，其中：所述酵母菌数不少于5×10⁴cfu/g，含水量≤10％。

3.如权利要求3所述具有抗菌功能的饲料添加剂，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母GS115。

4.权利要求1或2所述饲料添加剂在制备具有病害防治功能的水生生物或养殖畜禽饲料中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述饲料添加剂直接作为增强免疫、抗菌功能添加剂添加到水生生物或畜禽饲料中，添加比例量为基础饲料重量的5％～25％。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述饲料添加剂添加比例量为基础饲料重量的10％～20％。

Images