CN117659213B - 胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胸腺肽α1和IgYFc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了表达胸腺肽α1和IgYFc的融合蛋白，并构建胸腺肽α1和IgYFc片段融合表达载体，相比单纯的胸腺肽α1具有更长的半衰期，并利用乳酸乳球菌表达系统成功表达该融合蛋白，具有纯度高、安全便捷、成本低等优势。本发明还验证所述融合蛋白或重组乳酸乳球菌在动物养殖中作为饲料添加剂应用的可行性，可用于养殖中作为饲料添加剂使用，提高免疫力和成活率，减轻由于细菌等导致的炎症反应和疾病发生率，增加养殖业的经济效益；并且生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。

Description

胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及应用。

背景技术

我国是一个农业大国，养殖业作为我国农业中的一个重要组成部分，其发展对我国农业经济的发展有着重要的影响。养殖在提高全球畜牧业生产的可持续性方面发挥着越来越重要的作用。然而，养殖业的集约化发展增加了养殖物种感染病原菌的风险。抗生素、杀菌剂和化学药物在预防及治疗疾病的同时也降低了肠道菌群中有益微生物的活性，改变了生物的微生态系统，干扰了动物的营养、生理过程和免疫能力，并增加了病原体和有害化合物向消费者传播的风险。因此迫切需要替代的方法来应对养殖中病原体的威胁。

胸腺肽α1是从健康牛、猪胸腺中分离出来的是含等多种分子量低于的活性多肽。主要作用于淋巴细胞分化、发育及成熟的各个阶段，从而调节细胞免疫功能，是一种免疫调节剂，可增强机体防病和抗病能力。

乳酸乳球菌作为全球公认安全的微生物，具有多种益生作用，常被用作基因工程宿主菌。在过去的二十年中，乳酸乳球菌作为载体在递呈病毒、细菌抗原等方面得到了广泛的应用，并且在不同领域发挥着重要作用。乳酸乳球菌具有定植肠道的能力，作为一种益生菌已被验证用于饲料添加剂可以提高动物肠道健康水平；作为基因表达工程菌可以在肠道持续分泌产生基因改造后的功能性多肽，并被动物吸收利用。

胸腺肽α1在猪、牛、羊及禽类的饲料添加应用具有较好的促生长，增加蛋白质合成速率，提高机体代谢水平，增强机体免疫能力。乳酸乳球菌作为饲料添加剂替代抗生素的可行性，何佳等利用表达猪乳铁蛋白的重组L. lactis饲喂断奶仔猪，结果发现，仔猪免疫器官成熟更快，免疫功能增强，生产性能得到改善，平均日增重提高，料重比降低。

综上所述，胸腺肽α1和乳酸乳球菌对动物养殖具有促生长、提高机体免疫、以及改善生产性能的作用。一般应用组织提取法和化学合成法获得胸腺肽α1。但是组织提取法存在成本高、得量小、纯化困难等问题；化学合成法虽然经过工艺优化，得到的纯度高，但是价格昂贵，难以应用于养殖行业。

发明内容

本发明的目的在于提供胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及应用，可用于养殖中作为饲料添加剂使用，提高免疫力，减轻由于细菌等导致的炎症反应，提高成活率；并且生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。

本发明提供了一种表达胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白。

优选的，所述融合蛋白中IgY Fc与胸腺肽α1利用G4S蛋白相连接。

优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种包含上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。

优选的，包括以PNZ8149为骨架质粒。

本发明还提供了一种表达上述融合蛋白或包含上述重组表达载体的重组乳酸乳球菌。

优选的，包括以乳酸乳球菌NZ3900为基础菌株。

本发明还提供了上述重组乳酸乳球菌的培养物作为动物养殖饲料添加剂的应用。

优选的，所述重组乳酸乳球菌的培养物的制备方法，包括：将所述重组乳酸乳球菌在M17液体培养基上培养，并利用Nisin诱导融合蛋白的表达，诱导结束后离心收集菌体，得所述培养物。

优选的，所述重组乳酸乳球菌的培养物在动物养殖饲料中的添加浓度为1×10⁶~5×10⁷CFU/g。

有益效果：本发明提供了表达胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白，并构建胸腺肽α1和IgY Fc片段融合表达载体，是胸腺肽α1和IgY Fc片段融合表达的首次报道，相比单纯的胸腺肽α1具有更长的半衰期，并利用乳酸乳球菌表达系统成功表达该融合蛋白，相比组织提取法有着纯度更高、更便捷、成本低等优势，相比化学合成法有着更安全、成本更低等优势；利用乳酸乳球菌表达系统相比较一般的大肠杆菌表达系统更安全，不会产生相关其他毒素等，无需进行毒素处理；另外，重组乳酸乳球菌具有肠道定植的优势，可以在动物肠道中定植，源源不断表达分泌融合蛋白；乳酸乳球菌是安全的有益菌，对调节肠道功能具有重要意义。

本发明还在实施例中了验证所述融合蛋白或重组乳酸乳球菌在动物养殖中作为饲料添加剂应用的可行性，可用于养殖中作为饲料添加剂使用，提高免疫力和成活率，减轻由于细菌等导致的炎症反应和疾病发生率，增加养殖业的经济效益；并且生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。

附图说明

图1为PNZ8149-Tα1-Fc菌液PCR验证结果图，目的条带为1000 bp处片段；M为2000bp Marker，1、2、3：三株单克隆；

图2为Tα1-Fc融合蛋白表达Western blot验证结果图，目的条带约为26 kDa；M为180kDa Marker，1、2、3、4、5：Nisin终浓度分别为15 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1ng/mL，6为空质粒PNZ8149诱导表达；

图3为重组乳酸乳球菌用于生猪养殖饲料添加剂试验期内和期末的每组体重对比图；

图4为重组乳酸乳球菌用于生猪养殖饲料添加剂，对其平均日增重、平均日采食量、料重比的影响结果图；

图5为重组乳酸乳球菌用于生猪养殖饲料添加剂，对其血清指数中总蛋白、白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量的影响结果图；

图6为重组乳酸乳球菌用于白羽肉鸡饲料添加剂试验期内和期末的每组体重对比结果图；

图7为重组乳酸乳球菌用于白羽肉鸡饲料添加剂，对其平均日增重和料重比的影响结果图；

图8为重组乳酸乳球菌用于白羽肉鸡饲料添加剂，对其在28日龄时血清指数中IgG和IgA含量的影响结果图；

图9为重组乳酸乳球菌的添加量对于大菱鲆的重量影响图；

图10为重组乳酸乳球菌用于大菱鲆饲料添加剂，对其血清细胞因子的影响结果图；

图11为重组乳酸乳球菌用于大菱鲆饲料添加剂，对其肠道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的影响结果图；

图12为重组乳酸乳球菌用于南美白对虾饲料添加剂，对其成活率的影响结果图；

图13为重组乳酸乳球菌用于南美白对虾饲料添加剂，对其体质量增量和增率的影响结果图；

图14为重组乳酸乳球菌用于南美白对虾饲料添加剂，对其特定生长率和饲料系数的影响结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种表达胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白。

本发明所述胸腺肽α1简称Tα1，其GenBank为770552A，且所述Tα1与IgY Fc片段（X07174）通过（G4S）3蛋白相连接，G4S的氨基酸序列为：GGGGS。本发明所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种包含上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体。

本发明所述重组表达载体优选包括以PNZ8149为骨架质粒，并将所述融合蛋白的编码基因插入在PNZ8149的Pst I和Xba I限制性酶切位点之间。本发明所述编码基因在于所述骨架质粒进行连接前，优选还包括根据后续表达菌株的密码子偏好性进行优化。

本发明还提供了一种表达上述融合蛋白或包含上述重组表达载体的重组乳酸乳球菌。

本发明优选以乳酸乳球菌NZ3900为基础菌株，所述重组乳酸乳球菌的构建方法，优选包括以下步骤：利用上述重组表达载体转化乳酸乳球菌感受态细胞，得到重组乳酸乳球菌。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行转化即可。

本发明还提供了上述重组乳酸乳球菌的培养物作为动物养殖饲料添加剂的应用。

本发明优选将所述重组乳酸乳球菌在M17液体培养基上培养，并利用Nisin诱导融合蛋白的表达，诱导结束后离心收集菌体，得所述培养物。本发明优选在所述M17液体培养基（pH值为6~7）中，于30℃静置培养至OD₆₀₀值为0.5时，加入终浓度为5~15 ng/mL的Nisin诱导剂，继续静置培养4~6 h。培养完成后，收集菌液，离心收集菌体。

本发明所述重组乳酸乳球菌的培养物在动物养殖饲料中的添加浓度优选为1×10⁶~5×10⁷CFU/g，且针对不同的动物类型，添加浓度略有差异，如在生猪养殖饲料中添加浓度优选为1×10⁶~1×10⁷CFU/g，更优选为1×10⁶CFU/g；在白羽肉鸡养殖饲料中添加浓度优选为1×10⁶~1×10⁷CFU/g，更优选为5×10⁶CFU/g；在大菱鲆养殖饲料添加剂的添加浓度优选为5×10⁶~5×10⁷CFU/g，更优选为1×10⁷CFU/g；在南美白对虾养殖饲料添加剂的添加浓度优选为1×10⁷~5×10⁷CFU/g，更优选为5×10⁷CFU/g。按照上述添加量，本发明制备的重组乳酸乳球菌作为饲料添加剂在生猪养殖、白羽肉鸡养殖、大菱鲆养殖和南美白对虾养殖中，可以促进对应动物的生长速度，以及提高免疫力，相关肠道酶活性等。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白、重组表达载体和工程菌及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所述的条件或厂商提供的条件进行。

1.1 Tα1-Fc密码子优化及合成

按照乳酸乳球菌密码子偏好性优化Tα1-Fc核苷酸序列，加终止密码子，上游酶切位点Pst I和下游酶切位点Xba I。将优化后Tα1-Fc序列由上海生工生物科技有限公司合成pU19-Tα1-Fc质粒。

1.2 PNZ8149-Tα1-Fc的构建

利用Pst I和Xba I对pU19-Tα1-Fc和PNZ8149双酶切，并回收酶切产物，获得目的片段Tα1-Fc和线性载体PNZ8149。

将目的片段Tα1-Fc和线性载体PNZ8149利用T4连接酶进行连接，在在无菌无酶PCR管中分别配制10μL反应体系：Buffer 1 µL，T4连接酶 1µL，PNZ8149载体 1µL和Tα1-Fc目的片段 7µL。混匀后置于4℃孵育12 h。

1.3 乳酸菌感受态的制备

将保存的乳酸乳球菌NZ3900以1:100比例接种于M17液体培养基，置于30℃培养12h；再以1：10比例接种于M17液体培养基，继续在静置培养24 h；再以1：8比例接种于M17液体培养基，置于30℃培养至OD₆₀₀值为0.4；收集菌液，并在冰上预冷30 min；4℃ 3000 g离心15min，收集菌体，利用预冷的缓冲液1（0.5mol·L⁻¹蔗糖，10%甘油，pH为7）重悬后，冰上静置20min；再次离心，沉淀利用预冷的缓冲液2（0.5mol·L⁻¹蔗糖，10%甘油，50mmol·L⁻¹ EDTA，pH为7）重悬，冰上静置20 min；再次离心，利用预冷的缓冲液1重悬后，冰上静置20 min；再次离心，沉淀利用1 mL缓冲液1重悬，即为电转感受态。

1.4 重组载体电转化

取50μL新鲜制备的NZ3900感受态细胞，加入5μL连接产物，混合均匀，迅速加至预冷的电转杯，置于冰上静置5 min；电转仪设置：电压2000 V，脉冲25 μF，电阻200 Ω，5 ms，电转结束后迅速加入37℃预热的M17预热培养基，置于30 ℃静置孵育1 h。

1.5 阳性克隆筛选

孵育完成后，取100 μL涂布于Elliker培养基平板，置于30℃培养24 h，观察平板颜色变化。挑取黄色菌落接种于M17培养基，置于30℃培养24 h，进行菌液PCR鉴定阳性克隆大小，引物F1（SEQ ID No.2）：5’-TCTGAAGTTTGTTAGATACAAT-3’；F2（SEQ ID No.3）：5’-AAGCAACACGTGCTGTAATTTG-3’。扩增体系为：KOD OneTM PCR Master Mix 12.5 µL；F1（10 µM） 1 µL；R1（10 µM） 1 µL；菌液 1 µL；ddH₂O 9.5 µL；总计 25 µL；扩增程序为：98 ℃ 10sec；55 ℃ 5 sec；68 ℃ 10 sec；30循环。应用2%的电泳凝胶进行鉴定单克隆，结果显示在1000 bp处有目标条带，说明重组表达载体构建成功（图1）。

2.1 重组菌株的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆重组乳酸乳球菌菌株按1:100接种于M17液体培养基，置于30℃静置培养至OD₆₀₀值为0.5时，加入终浓度为10 ng/mL的Nisin诱导剂，继续静置培养6h。培养完成后，收集菌液，5000 g离心10 min，弃上清，收集菌体，菌体用预冷的PBS缓冲液重悬，再次离心；弃上清，沉淀用预冷的PBS再次重悬，重悬后再次离心；弃上清，菌体沉淀用预冷的PBS重悬，按20:1体积比加入裂解液，再利用超声波破碎仪对菌液破碎；破碎完成后再次离心，收集上清。

2.2 Tα1-Fc融合重组蛋白的鉴定

利用Western-Blot实验对Tα1-Fc融合重组蛋白进行鉴定。制备10%的SDS-PAGE电泳凝胶；按1:3比例把蛋白样品和4×上样Buffer混匀，100℃孵育5 min；将孵育完成的样本每孔添加15 μL；设置浓缩胶为80 V电压，30 min；分离胶为120V电压，60 min；裁取PVDF膜于甲醇中浸泡完全，转移到转膜夹，将电泳凝胶覆于PVDF膜，将其转移至电泳槽；电泳槽外加冰水混合物降温，设置200 mA 60 min；转膜结束后，用PBST清洗PVDF膜，转移至5%脱脂奶粉的封闭液中，置于37℃孵育2 h；封闭完成后，用PBST清洗PVDF膜，将其置于1000倍稀释的兔抗胸腺肽α1多克隆抗体中，置于4℃孵育12 h；孵育完成后，用PBST清洗PVDF膜三次，每次10 min，转速60 rpm，将其置于5000倍稀释的山羊抗兔多克隆抗体，室温孵育1 h；孵育完成后用PBST清洗PVDF膜三次，每次10 min，转速60 rpm，利用化学发光液对其处理后，通过化学发光仪进行观察。结果如图2所示，在26 kDa处出现目标条带，说明重组乳酸乳球菌表达Tα1-Fc融合重组蛋白成功。

3.1 重组乳酸乳球菌的制备

按“实施例2”的诱导方法，对重组乳酸乳球菌诱导表达；诱导完成后，3000 g离心10 min，收集菌体，并用生理盐水重悬，清洗两遍，收集菌液备用。

3.2 分组与饲料配置

实验用商品化三元保育猪购自标准化猪场（平均30 kg/头），实验前两周进行驯服饲喂，饲喂饲料为标准无抗育肥猪专用饲料，共分为6组，每组10头（1栏），其中空白对照为1组；添加转化有PNZ8149空质粒的乳酸乳球菌NZ3900为2组，添加量为5×10⁷CFU/g饲料；添加有本发明重组乳酸乳球菌为3、4、5、6组，添加量分别为1×10⁶CFU/g、5×10⁶CFU/g，1×10⁷CFU/g，5×10⁷CFU/g饲料。以标准化养殖的环境，以及饲喂方式。

3.3 样品收集

实验饲养时长为5周（35天），分别在每周第7天称量体重，记录每天消耗饲粮情况，并由此计算平均日增重、平均日采食和料重比。试验结束时，每组随机选择2头，前腔静脉采血5 mL，分离血清采用自动生化分析仪测定血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白与谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。

3.4 结果分析

添加本发明重组乳酸乳球菌的3~6组试验期体重均高于1组和2组，且差异明显，特别是随着饲喂时间的延长，重量差别越明显（图3）；通过分析平均日增重、平均采食量和料重比结果显示（图4），3~6组试验期平均采食量和平均日增重均高于1组和2组，料重比均低于1组和2组，且差异明显。对分离的血清进行总蛋白、白蛋白、球蛋白与谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定，结果显示（图5），3~6组的总蛋白、白蛋白、球蛋白含量均高于1组和2组，且差异显著，说明可以提高猪的免疫力；3~6组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量均低于1组和2组，且差异显著，说明说明在减少动物应激、促进动物健康方面具有积极作用。在饲料中添加重组乳酸乳球菌可以明显的促进生猪生长，提高免疫力，增加肠道消化酶，提高饲料利用率；比较结果来看在饲料中添加量喂1×10⁶CFU/g时更经济。

重组乳酸乳球菌的制备同“实施例3”。

4.1 分组与饲料配置

实验用白羽肉鸡购自标准化种鸡场，实验前一周进行驯服饲喂，饲喂饲料为标准无抗白羽肉鸡用饲料，共分为6组，每组100只，其中空白对照为A组；添加转化有PNZ8149空质粒的乳酸乳球菌NZ3900为B组，添加量为5×10⁷CFU/g饲料；添加有本发明重组乳酸乳球菌为C、D、E、F组，添加量分别为1×10⁶CFU/g、5×10⁶CFU/g，1×10⁷CFU/g，5×10⁷CFU/g饲料。模拟标准化养殖密度与环境，以及饲喂方式，每周根据每组总重量调整1次投喂量。

4.2 样品收集

实验饲养时长为33天，每周记录肉鸡采食量及体重，用于计算平均日增重、平均日采食量以及料肉比来判定对白羽肉鸡鸡生长性能的影响。于第28日龄，每组随机选取3只接近平均体重的健康鸡颈静脉采血2 mL，制备血清，采用鸡IgA/IgG间接酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定其含量。

4.3 结果分析

分别在第7、14、21、28、35、40日龄对每组鸡体重称量，结果显示，3~6组均高于1组和2组（图6）；通过计算平均日增重和料肉比分析，结果显示，3~6组平均日增重均高于1组和2组，料重比均低于1组和2组（图7）。测定28日龄的鸡血清中IgG和IgA含量，结果显示，3~6组平均日增重均高于1组和2组，说明添加重组乳酸乳球菌可以提高免疫力。在饲料中添加重组乳酸乳球菌可以明显的促进白羽肉鸡生长，以及提高免疫力；比较结果来看在饲料中添加量喂5×10⁶CFU/g时效果更明显。

5.1 重组乳酸乳球菌的制备

按“实施例2”的诱导方法，对重组乳酸乳球菌诱导表达；诱导完成后，3000 g离心10 min，收集菌体，并用生理盐水重悬，清洗两遍，收集菌液备用。

5.2 分组与饲料配置

实验用大菱鲆购自标准化种鱼场，实验前两周进行驯服饲喂，饲喂饲料为标准无抗大菱鲆用饲料，共分为6组，每组100尾，其中空白对照为1组；添加转化有PNZ8149空质粒的乳酸乳球菌NZ3900为2组，添加量为5×10⁷CFU/g饲料；添加有本发明重组乳酸乳球菌为3、4、5、6组，添加量分别为1×10⁶CFU/g、5×10⁶CFU/g，1×10⁷CFU/g，5×10⁷CFU/g饲料。模拟标准化养殖密度与环境，以及饲喂方式，每天饲料投喂量为体重3%，并且每2周根据每组总重量调整1次投喂量。

5.3 样品收集

实验饲养时长为60天，分别在第10、20、30、40、60天清晨测量每组鱼整体重量，计算平均值；实验结束时，每组均禁食1天后，由尾静脉采集血液，分离血清；解剖鱼体观察鱼胰腺、肠道等形态以及健康度，采集肠道组织，用液氮速冻后保存。

5.4 结果分析

添加本发明重组乳酸乳球菌的3~6组平均重量均高于1组和2组，且差异明显，特别是随着饲喂时间的延长，重量差别越明显（图9）；对分离的血清利用细胞因子测定试剂盒，测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10细胞因子的含量，结果显示3~6组在促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12）和抗炎细胞因子（IL-10）数值上均高于1组和2组，且差异显著（图10）；对肠道组织研磨后，取上清，利用消化酶活力测定试剂盒，对蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性进行检测，结果显示3~6组在蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶数值上均高于1组和2组，且差异显著（图11）；通过对解剖后肠道以及胰腺的观察，实验组肠道相比对照组更健康。在饲料中添加重组乳酸乳球菌可以明显的促进大菱鲆生长，提高免疫力，增加肠道消化酶，提高饲料利用率；比较结果来看在饲料中添加量喂1×10⁷CFU/g时更经济。

重组乳酸乳球菌的制备同“实施例3”。

6.1 分组与饲料配置

实验用南美白对虾购自标准化种虾场，实验前两周进行驯服饲喂，饲喂饲料为标准无抗南美白对虾用饲料，共分为6组，每组200尾，其中空白对照为A组；添加转化有PNZ8149空质粒的乳酸乳球菌NZ3900为B组，添加量为5×10⁷CFU/g饲料；添加有本发明重组乳酸乳球菌为C、D、E、F组，添加量分别为1×10⁶CFU/g、5×10⁶CFU/g，1×10⁷CFU/g，5×10⁷CFU/g饲料。模拟标准化养殖密度与环境，以及饲喂方式，每天饲料投喂量为体重3%，并且每2周根据每组总重量调整1次投喂量。

6.2 样品收集

实验饲养时长为60天，实验结束时，每组均禁食1天后，每小组随机抽取40尾对虾，测量全长和称量重量。计算各组实验对虾的存活率、增重率、特定生长率和饲料系数。存活率（%）=（实验结束时存活实验对虾总数/实验开始时对虾总数）×100；增重率（%）=（FBW－W0）/W0×100；特定生长率（%/d）=100×（ln FBW－ln W0）/T；饲料系数（%）=饲料投喂量（g）/体质量增加量（g）；式中，W0代表每组对虾的初始总体质量；FBW代表实验结束时每组存活对虾的终体质量（据成活率转换成实验开始时数量的体质量）；T代表实验的持续天数60天。

6.3 结果分析

通过实验结束后对每组对虾成活率进行计算，结果显示，C~F组均高于A、B组，且F组成活率最高（图12）；称量虾平均体重和体长，计算最终体质量、体质量增量和增率，结果显示，C~F组体质量增量均高于A、B组（图13）；计算特定生长率及饲料系数，同样C~F组均好于A、B组（图14）。在饲料中添加重组乳酸乳球菌可以明显的促进南美白对虾生长，提高饲料利用率；比较结果来看在饲料中添加量喂5×10⁷CFU/g时效果更明显。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.表达胸腺肽α1和IgY Fc的融合蛋白的重组乳酸乳球菌的培养物作为动物养殖饲料添加剂的应用，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌的培养物的制备方法，包括：将所述重组乳酸乳球菌在M17液体培养基上培养，并利用Nisin诱导融合蛋白的表达，诱导结束后离心收集菌体，得所述培养物；

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌的培养物在动物养殖饲料中的添加浓度为1×10⁶~5×10⁷CFU/g。