CN101380465A - 一种构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建β－防御素2肿瘤疫苗的方法及其用途，所述的β－防御素2用MBD2表示，包括以下步骤：用脂多糖LPS刺激哺乳动物的皮肤，获得表达MBD2的皮肤组织；采用RT－PCR方法将上述获得的皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片断，用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片断相连，构建MBD2分泌表达载体pMBD2；采用脂质体法将空载体及pMBD2分别转染L1210细胞，获得稳定表达细胞系，构建了MBD2肿瘤疫苗。勿需鉴定出肿瘤相关抗原，更适用于在各类肿瘤中占大多数的尚未确定相关抗原的肿瘤，为白血病的免疫治疗提供新策略。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤疫苗的方法及其用途，尤其是构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法及其用途。
背景技术
造血系统恶性肿瘤是危害人类的严重疾病，死亡率很高。目前常规的治疗方法是化疗和干细胞移植，但化疗药物特异性较低，在杀灭病人体内白血病细胞的同时，也杀灭正常血细胞及其祖细胞，抑制患者造血和免疫功能。干细胞移植虽然可以改善白血病患者的预后，但只有部分患者适合移植。而且，无论是化疗还是移植，只有约30％-50％的患者能达到长期无病生存。相当一部分患者残留白血病的复发和耐药问题始终未得到有效解决。
随着分子生物学和肿瘤免疫学等学科的研究进展，白血病的免疫治疗受人瞩目。因为，越来越多的证据表明，免疫系统在控制造血系统恶性肿瘤中起重要作用。最突出的例子是白血病患者异基因干细胞移植后出现的移植物抗白血病效应(GVL)，表明有效的免疫反应可治疗白血病。设想部分白血病在经典治疗的基础上，利用免疫治疗针对微小残留白血病细胞，达到根治目的。在实验研究方面，肿瘤免疫治疗已取得令人鼓舞的结果。美国国立卫生研究院(NIH)已批准包括白血病在内的多种疾患进行免疫治疗的临床试验。
在白血病免疫治疗策略中，细胞因子瘤苗研究是重点之一。因为，到目前为止，只鉴定出少数几个白血病相关肿瘤抗原。有些抗原的临床应用价值尚待确定。细胞因子瘤苗以主动免疫治疗为基础，将细胞因子基因转导肿瘤细胞，这些细胞因子有调控免疫应答，活化效应细胞的功能，可提呈多个白血病相关抗原却无须鉴定出这些抗原，激发机体产生显著的抗肿瘤免疫，达到治疗肿瘤的目的。另外，细胞因子瘤苗只在肿瘤细胞局部产生高浓度的细胞因子，避免了系统给药的副作用。所产生的旁分泌机制与体内生理调节机制极为类似。
目前肿瘤免疫治疗研究较多的细胞因子大多以调节获得性免疫为主。其中白细胞介素-12(IL-12)和GM-CSF是目前以瘤苗方式用于肿瘤免疫治疗的细胞因子中效果最好的，但在治疗黑色素瘤，头颈癌、乳腺癌及各种晚期肿瘤的I期、II期临床试验中，仅约半数病人对治疗有反应，肿瘤消退是暂时性的。因此，如何进一步提高免疫效果，仍面临着许多问题和挑战。
天然免疫在过去的几十年中曾一度被认为只是免疫系统应答外界刺激的一种低等形式，20世纪90年代后期其重要性才逐惭为人所认识。Science和Curr Opinion Immunol相继刊文揭示天然免疫对获得性免疫起直接的激活和导向作用。新近研究发现，天然免疫通过模式识别受体(patternrecognition receptor，PRR)识别肿瘤细胞。1997年Cell等杂志刊文论证就是PRR模式识别作用赋予免疫系统识别“自己”和“非己”的能力(MedzhitovR，Janeway CA Jr.Innate immunity:the virtues of a nonclonal system ofrecognition.Cell 1997 Oct 31；91(3):295-8)，而“自己”与“非己”的识别，是免疫学的根本问题。
β-防御素是在微生物感染时机体产生的一类天然免疫抗菌肽。2002年，Biragyn等在Science撰文证实β-防御素2(MBD2)不仅可趋化不成熟DC，趋化效果不亚于其他趋化因子，更为重要的是它通过一类PRR(Toll样受体4)激活DC成熟，产生一系列前炎症细胞因子、趋化因子，上调共刺激分子。Biragyn等进一步将MBD2与无免疫原性的肿瘤抗原基因融合作为DNA疫苗时，发现可以诱导有效的抗淋巴瘤细胞免疫反应，成为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁(Biragyn A，Ruffini PA，Leifer CA，et al.Toll-likereceptor 4-dependent activation of dendritic cells by beta-defensin 2.Science2002 Nov 1；298(5595):1025-9.)。
但是Biragyn等的方法仅适用于已经鉴定出相关抗原的肿瘤，而事实上到目前为止，绝大多数肿瘤均未鉴定出相关抗原。而且Biragyn等仅在淋巴瘤中证实MBD2的抗肿瘤作用，其在白血病等其他恶性肿瘤中的作用尚不明确。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种勿需鉴定出肿瘤相关抗原的构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法及其用途。
为了解决上述问题，本发明构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，所述的β-防御素2用MBD2表示，包括以下步骤：
1)用脂多糖(LPS)刺激哺乳动物的皮肤，获得表达MBD2的皮肤组织；
2)采用RT-PCR方法从步骤1)中获得的皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片断，用overlap PCR法将小鼠Ig κ信号肽与MBD2成熟片断相连，构建MBD2分泌表达载体pMBD2；
3)采用脂质体法将空载体及pMBD2分别转染L1210细胞，获得稳定表达细胞系，构建了MBD2肿瘤疫苗。
首先构建分泌性MBD2质粒载体。采用RT-PCR方法从LPS刺激的小鼠皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片断，用overlap PCR法将小鼠Ig κ信号肽与MBD2成熟片断相连，构建MBD2分泌表达载体(pMBD2)，经测序证实序列正确。
接下来构建白血病细胞疫苗，并对其表达及特征进行鉴定。采用脂质体法将空载体及pMBD2分别转染L1210细胞，获得稳定表达细胞系(分别命名为L1210—p和L1210—MBD2)。Western blot证实转染的肿瘤疫苗细胞可以表达并分泌MBD2。用Transwell检测瘤苗细胞培养上清对不成熟DC迁移的作用，证实瘤苗细胞表达的MBD2有功能活性。生长曲线和细胞周期实验证实与未转染的肿瘤细胞相比，转染空载体和pMBD2对肿瘤细胞生长增殖无明显影响。FACS检测MHCI(H-2Kd，H-2Dd)，MHCII(I-Ad)分子，共刺激分子CD80、CD86表达发现，与未转染的L1210细胞相比，转染空载体或pMBD2后，L1210细胞上述分子的表达亦无明显改变。上述结果表明，不仅成功构建了MBD2白血病细胞疫苗，而且转染的外源基因MBD2对白血病细胞增殖及分子表达无直接影响。
随后进行小鼠体内抗白血病效果评价。体内致瘤性实验和免疫保护实验结果显示，L1210—MBD2瘤苗能显著降低L1210细胞的致瘤性，80％小鼠长期生存；经野生型L1210二次攻击后全部小鼠仍然长期生存。荷瘤小鼠皮下注射MBD2照射瘤苗，观察其治疗效果，结果表明，照射瘤苗治疗能明显延长荷瘤小鼠生存期，50％小鼠达到长期生存。抗肿瘤机制研究显示，接种L1210—MBD2瘤苗能显著增强小鼠脾脏淋巴细胞的NK、CTL杀伤活性，IFN-γ、IL-12水平亦有明显升高。上述结果表明，MBD2肿瘤疫苗具有强大的抗白血病作用，为淋巴细胞白血病的免疫治疗提供了新的策略。
附图说明
图1 小鼠β-防御素2的PCR扩增
图2 pMBD2重组质粒的PCR及酶切鉴定
图3 稳定转染克隆的MBD2及neo基因mRNA表达检测
图4 转染细胞的Western blot检测
图5 转染细胞培养上清对iDC迁移的作用
图6 转染细胞的体外生长特性
图7 转染细胞的细胞周期分析
图8 MBD2转染对L1210细胞致瘤性的影响
图9 L1210-MBD2照射瘤苗的治疗作用
图10 L1210-MBD2诱导的NK细胞杀伤活性
图11 L1210-MBD2诱导的CTL杀伤活性
图12 L1210-MBD2诱导IFN-γ表达
图13 L1210-MBD2诱导IL-12表达
具体实施方式
一.MBD2肿瘤疫苗的构建及特性鉴定
1.材料与方法
1.1细胞系、主要试剂与质粒小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210购自中国医学科学院细胞库，采用RPMI 1640培养液，10％(V/V)FBS常规培养。脂质体(LipofectamineTM 2000)、OPTI-MEM低血清培养基均为Invitrogen公司产品。RNA酶A购自Sangon公司。PyrobestTM DNA聚合酶、EXTaq酶、限制性内切酶、质粒小量提取试剂盒(MiniBEST Plasmid Purification Kit)购自TaKaRa(大连)公司。T4 DNA连接酶、TRIzol、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。小鼠GM-CSF、IL-4购自Peprotech公司。Transwell迁移板购自美国COSTAR公司(5μm孔径)。山羊抗小鼠β-防御素2多克隆抗体购自Santa CruzBiotechnology公司。辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊单克隆抗体购自北京中山公司。FITC标记的抗小鼠CD86、CD40、CD11c、I-Ad、CD80、H-2Kd、H-2Dd单克隆抗体及其相应的同型抗体购自Biolegend公司。E.coli DH5 α菌株购自TaKaRa(大连)公司。真核表达载体pIRES购自BD公司。
1.2 MBD2真核表达质粒的构建
1.2.1小鼠皮肤细胞制备用10ng/ml LPS涂抹于DBA/2小鼠背部皮肤表面，作用4小时后处死小鼠，剪下处理过的皮肤，冻于液氮。提取RNA前从液氮中取出皮肤组织，在研钵中加液氮研磨碾碎，收集细胞。
1.2.2引物设计及合成 设计β-防御素2成熟部分上游和下游引物，并在下游引物中引入Mlu I酶切位点；def1:5’GAACTTGACCACTGCCACACC3’，def2:5’CCGACGCGTTCATTTCATGTACTTGCAAC3’。在成熟序列前拼接Ig κ信号肽所需上游引物：Ig κ：5’ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGC 3’，在引物中引入Xho I酶切位点。pIRES载体Neo基因表达检测引物neo1：5’GGTGGAGAGGCTATTCGGCT 3’；neo2：5’GATAGAAGGCGATGCGCTGC 3’。所有引物由上海Sangon公司合成，PAGE纯化。
1.2.3 RT-PCR扩增分泌性MBD2基因片段Trizol试剂盒提取小鼠皮肤细胞总RNA，M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA，用def1、def2引物扩增MBD2成熟部分基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min。扩增片段长度129bp。以上述扩增产物为模板，以Ig κ及MBD2成熟序列下游引物def 2为引物，Overlap PCR扩增分泌性MBD2基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min。扩增片段长度195bp。取5μl PCR产物，2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线灯下观察并照相。
1.2.4.PCR产物克隆和MBD2重组质粒的构建回收纯化分泌性MBD2 PCR产物，产物和pIRES质粒用XhoI和Mlu I双酶切，胶回收后用T4 DNA连接酶体外重组。重组MBD2质粒转化E.coli DH5α菌株。用菌液PCR、PCR产物酶切、重组质粒酶切进行鉴定。重组pMBD2质粒由上海博亚公司测序。
1.3.细胞转染及阳性克隆鉴定 采用脂质体(Lipofectamine 2000)法将pMBD2、空载体pIRES各1μg分别转染L1210细胞。方法参照Invitrogen公司Lipofectamine 2000产品说明进行。在G418筛选10代后，TRIzol法提取抗性细胞系总RNA，RT-PCR检测MBD2、载体Neo基因表达。MBD2 PCR反应条件同上，neo基因反应条件：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×1min，30个循环后，72℃延伸10min。扩增片段长度627bp。Western blot测定RT-PCR阳性细胞培养上清MBD2蛋白表达。
1.4转染细胞MBD2的功能测定
1.4.1小鼠骨髓不成熟树突状细胞的制备及表型鉴定 取DBA/2小鼠股骨和胫骨骨髓，用37℃预温的0.83％Tris-NH4Cl融解红细胞，经培养液洗涤两次后用含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的1640培养液将骨髓细胞重悬，以2—3 X 106细胞/3ml/孔的浓度接种于6孔板内。37℃培养3天后吸弃未贴壁细胞，补加3ml/孔含同样浓度的GM-CSF和IL-4的新鲜培养基。第5天收获非贴壁细胞[2]。为证实不成熟树突状细胞表型，用流式细胞术检测小鼠CD40、CD11c、CD86、I-Ad分子表达。
1.4.2趋化实验取对数生长期的转染pMBD2及空载体pIRES的L1210细胞，换液后48小时收集培养上清，即为条件培养液。将条件培养液10、100倍稀释。细胞迁移实验采用迁移孔板，在膜上腔加入50μl不成熟树突状细胞(106cells/ml)，膜下腔加入600μl不同稀释度的转染细胞条件培养基；37℃ 5％CO2培养2小时后收集并计数下腔的细胞数。细胞迁移率的计算：细胞迁移率(％)＝(下腔细胞数/5 x 104)x 100％.。
1.5转染细胞的体外生长特性
1.5.1生长曲线 将稳定表达pMBD2、pIRES的L1210细胞系以及野生型L1210细胞以1×105/ml密度培养(1640培养液含7％FCS)84小时。分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h和84h时间点取样，台盼蓝染色，计活细胞数绘制生长曲线；同时观察细胞形态及生长状态。
1.5.2细胞周期 取5×105稳定转染细胞以及野生型L1210细胞70％乙醇4℃固定24小时，离心弃上清，加RNase酶5μl，室温孵育15min后加200μlPI，避光室温孵育30min，流式细胞术检测细胞周期。
1.6.转染细胞MHC I、II类分子及共刺激分子表达的检测 用流式细胞术分别检测野生型L1210和稳定转染pIRES、pMBD2细胞表面的MHC(H-2Kd、H-2Dd、I-Ad)及共刺激分子(CD80、CD86)的表达。
1.7 统计学处理方法两组均数间比较采用双尾Student’s t检验。
2.结果
2.1 RT-PCR扩增分泌性MBD2基因片段 由于哺乳动物防御素在上皮及粘膜组织中首先被翻译成无活性的前原防御素，需经多次酶解才能加工成有活性的成熟防御素。我们设计将MBD2异位表达于淋巴细胞白血病细胞，首先必须考虑宿主细胞的生物学特性。为保证MBD2的高效分泌，我们首先克隆MBD2成熟部分基因片段，采用overlap PCR法将小鼠Ig κ信号肽与MBD2成熟部分基因融合，构建pMBD2分泌表达载体，具体方法如下。首先，通过RT-PCR方法从LPS刺激的小鼠皮肤细胞中扩增MBD2编码区成熟部分序列，片段大小为129bp(图1)。同时，以β-actin的cDNA扩增产物作为内参照(图1)。为构建分泌性MBD2，采用overlap PCR方法，将小鼠Ig κ信号肽序列拼接于成熟β-防御素2序列前，用第一轮β-防御素2成熟部分基因片段扩增产物为模板，加入含有与成熟片段互补序列的Ig κ信号肽全长序列，及MBD2成熟部分下游引物，扩增片段长度195bp(图1)。
2.2 pMBD2真核表达质粒的构建及鉴定 胶回收纯化分泌性MBD2片段，经Xho I和Mlu I双酶切，克隆到真核表达质粒pIRES，构建pMBD2重组质粒。重组质粒转化感受态DH5α，得到阳性菌株，经菌液PCR扩增得到195bp片段，与预期一致(图2)。对菌液PCR产物用限制性内切酶Alu I酶切，获得146bp和49bp片段，与预期一致(图2)。提取质粒以限制性内切酶Xho I、Mul I双酶切，证实插入片段大小正确(图2)。对pMBD2进行插入片段全长测序，结果证实克隆至pIRES载体中的与GeneBank中公布的序列完全一致。
2.3稳定表达pIRES、pMBD2细胞系的建立 重组载体pMBD2及空载体pIRES分别转染L1210细胞后48h，450μg/ml G418加压筛选至第7天未转染细胞全部死亡，筛选后第14天，极限稀释细胞克隆化培养获得4株稳定表达MBD2(L1210—MBD2)，2株稳定表达空载体pIRES(L1210—p)的L1210细胞系。
2.4 转染细胞的表达鉴定
2.4.1RNA水平 RT-PCR检测野生型L1210细胞，发现无MBD2表达。RT-PCR筛选上述稳定转染的L1210细胞，表达空载体pIRES neo基因(pIRES-1~2)及表达MBD2(pMBD2-1~4)检测结果如图3所示。
2.4.2 蛋白水平 Western blot结果显示稳定转染MBD2的L1210细胞培养上清可与MBD2抗体特异结合，分子量与预计相符，证实所构建的pMBD2重组子能够在L1210细胞表达并分泌(图4)。
2.5 转染细胞培养上清MBD2功能鉴定
2.5.1 小鼠骨髓不成熟树突状细胞的制备 文献报道MBD2能趋化表达CCR6的小鼠骨髓不成熟树突状细胞，为测定转染细胞分泌的MBD2的功能活性，首先制备小鼠骨髓不成熟树突状细胞。细胞免疫表型的FACS检测显示，培养的树突状细胞表达CD11c(57.21±3.56％)，表达低水平的CD40(11.52±2.48％)，B7.2(14.83±2.67％)和I-Ad(22.78±3.11％)，证实其不成熟DC表型特点。
2.5.2 趋化实验 体外趋化实验证实转染MBD2的L1210细胞培养上清可以剂量依赖方式趋化不成熟树突状细胞，而转染空载体或野生型L1210细胞不具备此能力。表明转染细胞表达的MBD2具有生物学活性(图5)。
2.6 稳定转染细胞系的体外生长特性
2.6.1生长曲线 作为瘤苗，如果转染的质粒或基因本身可改变肿瘤细胞的生长增殖，会直接影响其体内抗肿瘤作用的评价。因此，我们观察了各转染细胞系的体外生长特性。选取转染基因表达水平最高的细胞绘制生长曲线，结果发现，L1210-MBD2、L1210-p细胞系与未转染的L1210细胞相比，细胞形态无明显差别，细胞倍增时间相近，各取样时间点细胞数无显著差异(p>0.05)(图6)。
2.6.2 细胞周期 FACS检测转染细胞的细胞周期，结果显示，未转染的L1210细胞系G0-G1 30.75％，G2-M 16.9％，S 52.35％；L1210-p G0-G130.91％，G2-M 17.01％，S 52.08％；L1210-MBD2 G0-G1 32.68％，G2-M15.99％，S 50.89％。各细胞系间S期、G2-M期及G0-G1期比例均无明显差别(p>0.05)(图7)。
生长曲线和细胞周期实验均表明异位表达于白血病细胞系L1210的MBD2和空载体不会影响细胞的增殖能力。
2.7 稳定转染细胞系的MHC分子及共刺激分子的表达 肿瘤免疫逃逸的机制之一是下调MHC分子及共刺激分子表达，为探索MBD2转染对MHCI类(H—2Kd、H—2Dd)、MHC II类分子(I—Ad)、共刺激分子(B7.1，B7.2)表达的影响，我们直接免疫荧光标记稳定转染pMBD2、空载体pIRES的细胞系与未转染的L1210细胞，流式细胞仪检测MHC I类分子H—2Kd、H—2Dd，MHCII类分子I-Ad及共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)的表达，结果如表1所示。与L1210、L1210—p相比，L1210—MBD2细胞表面MHC I、MHCII类及共刺激分子表达无明显变化。为体内抗肿瘤实验的结果评价和机制探讨奠定了基础。
表1 转染细胞MHC分子、共刺激分子表达
二.MBD2肿瘤疫苗的体内抗白血病效果
1.材料与方法
1.1 实验动物 DBA/2纯系小鼠：6-8周龄，雌性，18-20g，购自中国医学科学院肿瘤研究所实验动物中心。
1.2 细胞系与主要试剂 转染MBD2的L1210(L1210-MBD2)、转染空载体的L1210(L1210-p)以及野生型L1210细胞系，YAC-1细胞系由本室保存。小鼠肥大细胞瘤细胞系P815购自中国医学科学院细胞库。细胞培养基：RPMI 1640购自GIBCO公司；优质胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司。乳酸脱氢酶活性测定试剂盒(CytoTox 96 Non-Radioactive CytotoxicityAssay)为Promega公司产品。Murine IFN-γ、IL-12ELISA试剂盒购自R&D公司。
1.3细胞培养 L1210、YAC-1、P815细胞系均采用RPMI 1640培养液，10％(V/V)FBS，100U/ml青霉素，100g/ml链霉素，37℃、5％CO2饱和湿度下培养。挑选对数生长期细胞进行实验。
1.4致瘤性实验 常规传代培养稳定表达MBD2、空载体以及野生型L1210细胞系，用生理盐水调整细胞浓度，小鼠腹腔接种每种细胞系1×105细胞，200μl/只，每组10只，观察其存活时间及生存率。
1.5 瘤苗免疫保护实验 致瘤性实验中接种瘤苗后长期存活的小鼠用1×105野生型L1210细胞进行二次攻击，以未接种过瘤苗的小鼠为对照，接种相同剂量的L1210细胞，每组8只，比较肿瘤细胞攻击后小鼠的生存时间及生存率。
1.6 治疗实验 DBA/2小鼠腹腔注射1×104 L1210细胞，同一天皮下注射1×106经过铯(Cs137)源照射后的(经预实验确定为10Gy)L1210-MBD2细胞进行治疗，每周两次，共进行8次。以生理盐水或等量的照射L1210-p或野生型L1210细胞做治疗对照。每组6只，观察存活时间及生存率。
1.7 小鼠脾细胞制备 DBA/2小鼠拉颈处死。超静台内分离脾脏，放置于盛有5毫升生理盐水的平皿中，用1ml无菌注射器针尖轻轻挑破脾脏被膜。折弯针头轻轻挤压脾脏，直至组织完全分离出来。经4号针头过滤成脾单细胞悬液。1000rpm离心10min，弃上清，加入含氯化铵的红细胞裂解液[0.83％(W/V)氯化铵，0.2M Tris·HCl]，37℃孵育5min，每隔1min取出摇匀使红细胞充分裂解。PBS洗涤细胞两次，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液计数。
1.8 CTL活性测定 效应细胞制备：无菌条件下取DBA/2小鼠的脾细胞，用1640培养液(含10％FBS)调整细胞浓度至5×106/5ml/孔，接种至6孔板。同时接种经100Gy铯源照射后的L1210细胞，1×106/孔。培养基中加入重组人IL-2 20u/ml(每三天补充一次)。培养5天后，1000rpm离心5min，收集细胞，并计数，即为效应细胞。靶细胞制备：收集对数生长期L1210及无关同系肿瘤对照P815细胞，1000rpm离心10min，1640培养液洗涤2次，用含5％ FCS的1640培养液调整靶细胞浓度至1×105/ml。效/靶细胞共培养：按不同效:靶比例(50:1，25:1，12.5:1和6.25:1)加效应细胞和靶细胞各50μl于96孔培养板(3孔重复)，置37℃，5％ CO2培养4h。乳酸脱氢酶活性测定：方法参考Promega公司产品(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)说明书。CTL活性计算：计算各组(3孔重复)平均吸光度(A492)，按下列公式计算CTL裂解靶细胞的百分率。
1.9 NK细胞毒活性测定 无菌条件下取DBA/2小鼠脾细胞即为效应细胞。收集对数生长期细胞YAC-1，1640培养液洗涤2次，用含5％FCS的1640培养液调整细胞浓度至4×105/ml，即为靶细胞。其余同CTL活性测定。
1.10 小鼠脾细胞培养上清IFN-γ含量的检测 无菌条件下取DBA/2小鼠脾脏，调整细胞浓度至2×106cells/ml，接种至6孔板。同时接种经100Gy铯源照射后的L1210细胞(4×105cells/ml)。培养基中加入重组人IL-2100u/ml，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养48h，收集上清。采用小鼠IFN-γ ELISA试剂盒测定IFN-γ含量，方法参照说明书。
1.11 小鼠脾细胞培养上清IL-12含量的检测 无菌条件下取DBA/2小鼠脾脏，调整细胞浓度至5×106cells/ml，饱和湿度条件下培养24h，收集上清。采用小鼠IL-12 ELISA试剂盒测定IL-12含量，方法参照说明书。
1.12 统计学处理方法 两组均数间比较采用双尾Student’s t检验，生存分析采用Kapaplan-Maier plots和Log-Rank检验。
2.结果
2.1 MBD2瘤苗的致瘤性实验 为了探讨MBD2瘤苗在L1210淋巴细胞白血病模型中的抗白血病作用，我们将1×105转染MBD2的L1210细胞(L1210-MBD2)腹腔接种同系DBA/2小鼠，观察其致瘤性变化，同时设转染空载体(L1210-p)和野生型L1210对照。发现，L1210-p和野生型L1210对照组全部于接种的第16天内死亡；接种L1210-MBD2瘤苗接种能够明显延长小鼠的存活时间和增加长生存小鼠比率(p<0.05)，80％小鼠达到长期生存(>50天)(图8)。表明MBD2瘤苗有显著抗小鼠L1210淋巴细胞白血病作用。
2.2 MBD2瘤苗的免疫保护作用 为了进一步评价MBD2瘤苗的免疫保护作用，在接种MBD2瘤苗50天后，对长期存活的小鼠用1×105野生型L1210肿瘤细胞二次攻击，观察其生存时间。结果显示，100％小鼠仍可长期存活至六个月以上，而所有接种相同剂量L1210细胞的未接种过瘤苗的小鼠均在16天内死亡。证明MBD2瘤苗不仅能诱导抗肿瘤免疫应答，而且能诱导长期免疫记忆对抗再次的肿瘤攻击。
2.3 L1210-MBD2照射瘤苗的治疗效果 瘤苗照射剂量预实验结果表明，采用10Gy照射L1210-MBD2可使细胞在至少4天内细胞数无明显变化，并能持续表达MBD2(资料未出示)。
为评价L1210-MBD2瘤苗的治疗效果，小鼠腹腔注射104野生型L1210细胞，同一天开始皮下注射1×106照射L1210-MBD2(10Gy)细胞，共治疗8次，每周两次。采用等量照射L1210-p和野生型L1210细胞以及生理盐水为对照。结果显示照射L1210-MBD2瘤苗具有显著的治疗效果，50％小鼠达到长生存(p<0.001，logrank test)，而对照组均未发现长生存小鼠。此外，我们还发现，与生理盐水相比，照射L1210-p和野生型L1210细胞可延长部分小鼠的生存时间，但无显著性差异(图9)。表明L1210-MBD2瘤苗具有明显的治疗效果。
2.4 MBD2瘤苗诱导的NK杀伤活性 为探讨MBD2瘤苗的抗白血病作用机制，DBA/2小鼠腹腔接种1×105 L1210-MBD2或L1210-p或野生型L1210细胞，七天后分离脾脏，以NK敏感细胞系YAC-1为靶细胞，应用LDH释放实验，测定不同接种组小鼠脾脏淋巴细胞的NK杀伤活性。结果发现，L1210-MBD2组对YAC-1细胞的杀伤活性显著高于L1210-p组和L1210对照组(p<0.05)(图10)。提示MBD2瘤苗能够显著增强NK细胞杀伤活性。
2.5 MBD2瘤苗诱导的CTL反应DBA/2小鼠腹腔接种1×105 L1210-MBD2或L1210-p或野生型L1210细胞，七天后分离脾脏，与照射L1210细胞(100Gy)共同培养5天后，以L1210及无关同系对照细胞P815为靶细胞，应用LDH释放实验，测定不同接种组小鼠脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性。结果表明L1210-MBD2组对L1210肿瘤细胞的杀伤活性显著高于L1210-p组和L1210对照组(p<0.05)(图11)。而在任何效靶比下，对无关同系对照P815细胞的裂解率均小于10％。提示MBD2瘤苗能够显著增强抗L1210细胞特异性CTL反应。
2.6 小鼠脾细胞培养上清的IFN-γ、IL-12水平DBA/2小鼠腹腔接种1×105 L1210-MBD2或L1210-p或野生型L1210细胞或生理盐水，七天后分离脾脏，培养后收集上清，ELISA法检测IFN-γ、IL-12含量。结果显示L1210-MBD2接种组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清平均IFN-γ及IL-12水平均显著高于L1210-p和L1210对照组(p<0.05)(图12，图13)。表明，MBD2瘤苗能诱导Th-1免疫反应，激活强大的T细胞免疫。
综上所述，本发明通过构建β-防御素2(MBD2)质粒载体，转染白血病细胞，制备细胞瘤苗，在小鼠体内证实MBD2在白血病免疫治疗中的有效性。与文献报道相比，这种方法勿需鉴定出肿瘤相关抗原，更适用于在各类肿瘤中占大多数的尚未确定相关抗原的肿瘤。此外，文献中尚无MBD2抗白血病的证据，本发明证实其抗白血病效果，为白血病的免疫治疗提供新策略。
综上所述，本发明的内容并不局限在的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (4)
1、一种构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，所述的β-防御素2用MBD2表示，包括以下步骤：
1)用脂多糖LPS刺激哺乳动物的皮肤，获得表达MBD2的皮肤组织；
2)采用RT-PCR方法从步骤1)中获得的皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片断，用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片断相连，构建MBD2分泌表达载体pMBD2；
3)采用脂质体法将空载体及pMBD2分别转染L1210细胞，获得稳定表达细胞系，构建了MBD2肿瘤疫苗。
2、根据权利要求1所述的构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤2)包括：
1)引物设计及合成：设计β-防御素2成熟部分上游和下游引物，并在下游引物中引入MluI酶切位点；def1:5’GAACTTGACCACTGCCACACC3’，def2:5’CCGACGCGTTCATTTCATGTACTTGCAAC3’；在成熟序列前拼接Igκ信号肽所需上游引物：IgK：5’ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGC3’，在引物中引入Xho I酶切位点；pIRES载体Neo基因表达检测引物neo1：5’GGTGGAGAGGCTATTCGGCT3’；neo2：5’GATAGAAGGCGATGCGCTGC3’；
2)RT-PCR扩增分泌性MBD2基因片段：Trizol试剂盒提取小鼠皮肤细胞总RNA，M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA，用def1、def2引物扩增MBD2成熟部分基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min，扩增片段长度129bp，上述扩增产物为模板，以Igκ及MBD2成熟序列下游引物def 2为引物，Overlap PCR扩增分泌性MBD2基因片段，扩增条件为：94℃预变性2min；94℃×1min，55℃×1min，72℃×40S，30个循环后，72℃延伸10min。扩增片段长度195bp；
3)PCR产物克隆和MBD2重组质粒的构建：回收纯化分泌性MBD2 PCR产物，产物和pIRES质粒用XhoI和Mlu I双酶切，胶回收后用T4DNA连接酶体外重组。
3、根据权利要求1所述的构建β-防御素2肿瘤疫苗的方法，其特征在于，所述的步骤1)为用10ng/ml LPS涂抹于DBA/2小鼠背部皮肤表面，作用4小时后处死小鼠，剪下处理过的皮肤，冻于液氮；取RNA前从液氮中取出皮肤组织，在研钵中加液氮研磨碾碎，收集细胞。
4、权利要求1构建β-防御素2肿瘤疫苗在制备白血病免疫药物中的应用。
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