CN106978442B - 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法 - Google Patents
一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，首先将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀得到DNA/PEI复合物；将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基培养；然后将DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；然后以此转染T细胞，培养得到嵌合抗原受体T细胞。本发明以慢病毒包装系统为基础，达到60%以上的转染效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，可以明显提高载体对T细胞的转染效率。
背景技术
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时存在MHC限制性，肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面表达下降，破坏抗原加工过程，降低肽段免疫原性，形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击、 肿瘤快速增殖利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体的T细胞治疗技术在体外和临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)由胞外抗原结合区，由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体(scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域免疫受体酪氨酸活化基序在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，目前CAR-T细胞的制备主要通过慢病毒将CAR稳定整合到T细胞的基因组中。
慢病毒属逆转录病毒科下的一个属，以慢病毒为骨架的载体主要是从人免疫缺陷病毒HIV改进获得的，在体内能够感染几种不同组织来源的非分裂细胞和分裂细胞，如大脑、肝脏、肌肉及造血干细胞，在基因治疗领域有着非常广阔的应用前景。目前以慢病毒为基因转导载体的临床实验在一定程度上证明了慢病毒作为基因治疗载体的安全性虽然慢病毒属于逆转录病毒的一个属，但是其具有更为广泛的宿主范围，慢病毒能够感染非周期性和有丝分裂后的细胞，原代T细胞的慢病毒感染一直效率较低，平均不到20%，阻碍了以T细胞为基础的嵌合抗原受体免疫细胞治疗技术的广泛临床应用慢病毒对T细胞转染效率低主要有以下几个方面的原因，一是制备的慢病毒滴度较低；二是原代T细胞自身处于休止状态，导致感染进入细胞的慢病毒无法将外源基因整合至T细胞的基因组中；第三是慢病毒感染原代T细胞的实验方案未经优化。因此需要研发一种方法，以慢病毒包装系统为基础，创新慢病毒的包装制备工艺以及慢病毒的浓缩方法，采用新的慢病毒感染原代T细胞的流程，从而大幅度提高慢病毒对原代T细胞的感染效率，以此方法制备重组嵌合抗原受体T细胞对表达相应抗原的肿瘤细胞具有高效的杀伤作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高转染率的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，可以慢病毒包装系统为基础，达到60%以上的转染效率。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是，一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括以下步骤：
（1）在缓冲液中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀，室温静置得到DNA/PEI复合物；
（2）将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基，置于培养箱中，培养40～60小时；然后将步骤（1）的DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；然后再将培养皿置于培养箱中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续置于培养箱中；培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；
（3）将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；得到含有慢病毒的重悬溶液；
（4）将T细胞加入培养容器中，然后加入细胞因子与抗体复合物，培养40～60小时；然后加入步骤（3）的含有慢病毒的重悬溶液；然后加入终浓度为4～8μg/mL的聚凝胺，混匀后，密封培养容器；然后进行首次离心处理；离心结束后，去除密封；然后将培养容器置于培养箱中；培养18～32小时后，进行再次离心处理；然后去除离心上清；然后加入培养基得到混合物；然后将混合物加入新的培养容器中，培养得到嵌合抗原受体T细胞。
上述技术方案中，步骤（1）中，嵌合抗原受体慢病毒表达载体为现有技术，以靶向肿瘤相关抗原分子的抗体序列可变区为基础，设计嵌合抗原受体，该受体包括信号肽、单链抗体序列、跨膜区及胞内共刺激信号区，采用全基因合成的方式合成该嵌合抗原受体序列，并使用EcoRI-BamHI酶切位点，将该嵌合抗原受体片段亚克隆至Lenti-puro慢病毒表达载体中，制备Lenti-puro-靶向肿瘤抗原-CAR慢病毒表达载体，即嵌合抗原受体慢病毒表达载体；缓冲液可以为PBS或者HBSS缓冲液。嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量比为10∶2∶1；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量总和与聚醚酰亚胺的质量比为3∶1。有利于提高载体对T细胞的转染效率。
优选的技术方案中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合为分别将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合得到三份混合物；然后将三份混合物混合；可有利于各个质粒与聚醚酰亚胺形成DNA/脂质体复合物，提高对病毒包装工具细胞293细胞的转染效率。
上述技术方案中，步骤（2）中，293细胞的接种密度为5000～7000个/cm2；完全培养基包括DMEM高糖、10%FBS；条件培养基包括DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）；其中，条件培养通过降低FBS的含量，可以避免在病毒生产过程中，293细胞增殖速度过快，细胞汇合度过高引起的细胞漂浮；通过培养基中添加HEPES，可以避免病毒制备过程中培养基pH值太低，引起病毒感染力下降；通过提添加丙酮酸钠，可以为细胞提供可利用的备用碳源。
上述技术方案中，步骤（2）中，离心处理时的离心力为1100～1300xg，时间为8～12分钟；步骤（3）中，离心处理时的离心力为19000～22000xg，时间为1.5～2.5小时。
上述技术方案中，步骤（3）中，通过添加蔗糖溶液作为缓冲垫，可以将慢病毒离心浓缩过程中非病毒的细胞碎片、杂蛋白等杂质阻滞于蔗糖缓冲垫中。蔗糖溶液与含有慢病毒的培养基上清的体积比为1∶6，蔗糖溶液的质量浓度为15%～30%。
上述技术方案中，步骤（3）中，沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清，可以避免病毒上清对蔗糖缓冲垫的干扰，防止病毒上清与蔗糖缓冲垫混溶。
优选的技术方案中，步骤（3）中，加入缓冲液后于0～5℃静置18～32小时；然后吹打均匀，得到含有慢病毒的重悬溶液；超速离心结束后，病毒沉淀贴合在离心管底部比较牢固，若立即加入缓冲液吹打，容易起泡，且高强度的机械吹打，会损伤慢病毒的感染力；低温静置过夜后，即可防止温度过高造成病毒的不稳定，亦可使病毒沉淀逐步松散，过夜后可轻松将沉淀重悬。
上述技术方案中，步骤（4）中，细胞因子包括白介素2、白介素7、白介素15、白介素21，抗体复合物包括Anti-CD3-OKT3、Anti-CD28；通过使用Anti-CD3-OKT3、Anti-CD28对T细胞激活处理，可以避免体外培养T细胞的无效能；通过综合添加细胞因子复合物，可以提高体外T细胞中的中心记忆T细胞的比例，为基于T细胞的免疫细胞治疗带来益处。
上述技术方案中，步骤（4）中，培养容器为方瓶，细胞培养方瓶可密封，且有适配的离心机转子，在离心处理时，避免形成气溶胶培养方瓶的底面积相对较大，可以一次处理更多的细胞数量。
上述技术方案中，步骤（4）中，首次离心处理时的离心力为600～1000xg，时间为0.5～2.5小时；再次离心处理时的离心力为200～400xg，时间为5～15分钟；通过离心，可使悬浮生长的T细胞暂时贴至培养方瓶的底部，有利于病毒对T细胞的侵染。现有认为，离心处理会导致细胞状态不佳，不利于慢病毒转染效率；本发明密封已激活的细胞体系，采用两次离心处理，既可以提高慢病毒对T细胞的感染效率，对T细胞的生长活力亦无显著影响，转染效率可达60%；取得了意想不到的技术效果；优选的首次离心处理时的离心力为800xg，时间为1.2～2小时；再次离心处理时的离心力为250xg，时间为8～11分钟；限定离心参数，进一步保证T细胞的生长活性，同时提高慢病毒对T细胞的感染效率。
上述技术方案中，步骤（4）中，培养基为常规T细胞培养基添加白介素2、白介素7、白介素15和白介素21得到，首次在T细胞培养中添加白介素，可以提高体外T细胞的生长，使T细胞从G0期进入G1b期，处于G1b期的T细胞，更容易被外源慢病毒侵染，且有利于慢病毒将外援基因稳定整合至T细胞的基因组中。
上述技术方案中，步骤（4）中，将混合物加入新的培养容器中，培养1天以上就可以得到嵌合抗原受体T细胞。上述方法制备的CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性；因此本发明还公开了上述嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。比如白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等。
本发明公开的嵌合抗原受体T细胞的制备方法中，病毒包装时采用完全培养基与条件培养基依次培养293细胞，避免了293细胞增殖速度过快，细胞汇合度过高引起的细胞漂浮现象，为病毒感染细胞提供有利的环境，病毒浓缩过程添加蔗糖避免细胞碎片对病毒上清的干扰；病毒感染时，通过加入细胞因子以及抗体复合物增加T细胞的激活能力，结合首次使用的两次离心处理，大幅提高了慢病毒对T细胞的感染效率，高达60%，远大于现有技术的20%，取得了意想不到的技术效果。
附图说明
图1为实施例一制备的嵌合抗原受体T细胞的荧光显微镜图；
图2为实施例一制备的嵌合抗原受体T细胞的流式细胞曲线图；
图3为实施例二制备的嵌合抗原受体T细胞的表达水平图；
图4为实施例二制备的嵌合抗原受体T细胞对Raji细胞杀伤结果图；
图5为实施例二制备的嵌合抗原受体T细胞对Raji细胞杀伤率图；
图6为实施例三制备的嵌合抗原受体T细胞对Jeko-1细胞杀伤率图；
图7为实施例四制备的嵌合抗原受体T细胞对HeLa细胞杀伤率图。
具体实施方式
实施例一
准备15cm皿，接种5*106个293细胞，加入完全培养基（DMEM高糖、10%FBS），置于37℃、5% CO2培养箱，过夜培养。从冰箱中取出100μM聚醚酰亚胺（PEI），从冰箱中取出质粒（Lenti- GFP、pGP、pVSVG），室温解冻后，取出PBS缓冲液，温热至室温；取2mL PBS至6孔板的一个孔，共准备3个孔，分别加入15μg Lenti-EF1a-GFP、3μg pGP、1.5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，每孔加入18μL 100μM 聚醚酰亚胺，然后将三组质粒溶液加入到PBS孔中，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟，制备PEI/DNA复合物。将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱，培养5小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的条件培养基（DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES））。
第三天从培养箱中取出细胞，在生物安全柜操作台面上，将培养皿中的培养基上清收集于50mL离心管中，1200 xg离心10分钟；取一个新的无菌离心管，加入5mL 20%sucrose，然后沿着离心管内壁，轻轻加入含有病毒的培养基上清，此步骤操作必须小心缓慢，防止扰动蔗糖和病毒上清的界面。配平后，20000 xg 4℃离心2小时，将培养基中的细胞碎片等去掉。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μL PBS缓冲液，将离心管置于4℃冰箱中过夜（确保沉淀部位浸在缓冲液中），第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬（避免吹起气泡）；得到含有慢病毒的重悬溶液。
调整T细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子（白介素2、白介素7、白介素15、白介素21）及抗体复合物（终浓度为100ng/mL Anti-CD3-OKT3、250ng/mL Anti-CD28），连续培养48小时。
从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为5μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将方瓶密封，800 xg离心1.5小时。离心结束后，撕掉封口膜，将方瓶置于37℃5% CO2的培养箱中，继续培养24小时。250 xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基（X-Vivo 15，添加白介素2、白介素7、白介素15和白介素21）重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中，继续培养3天，得到表达荧光蛋白的T细胞。取部分细胞使用FACS检测T细胞表达绿色荧光蛋白的情况，并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。
图1为上述表达荧光蛋白的T细胞的荧光显微镜图，左图为GFP视野，右图为白光视野，可以看出上述荧光蛋白T细胞表达绿色荧光蛋白的情况。图2为上述表达荧光蛋白的T细胞的流式细胞曲线，红线为对照T细胞，蓝线为上述嵌合荧光蛋白的T细胞。可以看出根据本发明的方法，使用GFP慢病毒可以高效的感染原代T细胞，感染效率达85%。
实施例二
以靶向CD19的抗体序列可变区为基础，设计嵌合抗原受体，该受体包括信号肽、单链抗体序列、跨膜区及胞内共刺激信号区，采用全基因合成的方式合成该嵌合抗原受体序列，并使用EcoRI-BamHI酶切位点，将该嵌合抗原受体片段亚克隆至Lenti-puro慢病毒表达载体中，制备Lenti- CD19-CAR慢病毒表达载体。
准备15cm皿，接种5*106个293细胞，加入完全培养基（DMEM高糖、10%FBS），置于37℃、5% CO2培养箱，过夜培养。从冰箱中取出100μM聚醚酰亚胺，从冰箱中取出质粒（Lenti-CD19-CAR、pGP、pVSVG），室温解冻后，取出HBSS缓冲液，温热至室温；取2mL PBS至6孔板的一个孔，共准备3个孔，分别加入15μg Lenti-CD19-CAR、3μg pGP、1.5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，每孔加入18μL 100μM 聚醚酰亚胺，然后将三组质粒溶液加入到PBS孔中，，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟，制备PEI/DNA复合物。将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱，培养6小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的条件培养基（DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES））。
第三天从培养箱中取出细胞，在生物安全柜操作台面上，将培养皿中的培养基上清收集于50mL离心管中，1200 xg离心10分钟；取一个新的无菌离心管，加入5mL 20%sucrose，然后沿着离心管内壁，轻轻加入含有病毒的培养基上清，此步骤操作必须小心缓慢，防止扰动蔗糖和病毒上清的界面。配平后，20000 xg 4℃离心2小时，将培养基中的细胞碎片等去掉。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μL PBS缓冲液，将离心管置于4℃冰箱中过夜（确保沉淀部位浸在缓冲液中），第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬（避免吹起气泡）；得到含有慢病毒的重悬溶液。
调整T细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子（白介素2、白介素7、白介素15、白介素21）及抗体复合物（终浓度为100ng/mL Anti-CD3-OKT3、250ng/mL Anti-CD28），连续培养46小时。
从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为5μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将方瓶密封，800 xg离心1.5小时。离心结束后，撕掉封口膜，将方瓶置于37℃5% CO2的培养箱中，继续培养24小时。250 xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基（X-Vivo 15，添加白介素2、白介素7、白介素15和白介素21）重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中，继续培养3天，得到CD19嵌合抗原受体的T细胞。取部分细胞使用FACS检测T细胞表面CAR分子的表达情况。
图3为上述嵌合CD19抗体的T细胞的流式细胞术检测嵌合抗原受体分子的表达水平图（左图：对照；右图：CAR-T），可以看出按照本本发明方法，使用嵌合抗原受体慢病毒感染原代T细胞后，采用流式细胞仪检测嵌合抗原受体的表达情况，可以高效的感染原代T细胞，感染效率达88%。
嵌合抗原受体T细胞对靶细胞的裂解
以Raji细胞为靶细胞，使用上述制备的嵌合CD19抗体的T细胞为效应细胞，按照不同的效应细胞/靶细胞比例（0.5:1、1:1、5:1、10:1、20:1）进行共培养，取96孔板，每孔加入50000个Raji细胞，按照上述比例加入嵌合CD19抗体的T细胞，在培养箱中共孵育6小时。将培养板从培养箱中取出，800g离心5分钟，验证孔内壁小心取出50uL上清至另一个新的孔板中，加入LDH检测试剂，检测培养基上清中LDH的含量，以此反映嵌合抗原受体T细胞对靶细胞的裂解能力。
图4为嵌合CD19抗体的T细胞对Raji细胞杀伤结果图（左图：CAR-T与Raji；右图：对照T与Raji）；图5为对Raji细胞杀伤率图。可以看出，按照本发明方法，使用嵌合抗原受体慢病毒感染原代T细胞后，采用CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养的方法检测嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的杀伤，嵌合抗原受体慢病毒可以高效的感染原代T细胞，由此获得的CAR-T细胞在效靶比为0.5:1时即可高效杀伤肿瘤细胞。
实施例三
准备15cm皿，接种5*106个293细胞，加入完全培养基（DMEM高糖、10%FBS），置于37℃、5% CO2培养箱，过夜培养。从冰箱中取出100μM聚醚酰亚胺，从冰箱中取出质粒（Lenti-CD20-CAR、pGP、pVSVG），室温解冻后，取出PBS缓冲液，温热至室温；取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入15μg Lenti-CD20-CAR、3μg pGP、1.5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL 100μM 聚醚酰亚胺，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟，制备PEI/DNA复合物。将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱，培养10小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的条件培养基（DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES））。
第三天从培养箱中取出细胞，在生物安全柜操作台面上，将培养皿中的培养基上清收集于50mL离心管中，1300 xg离心10分钟；取一个新的无菌离心管，加入5mL 20%sucrose，然后沿着离心管内壁，轻轻加入含有病毒的培养基上清，此步骤操作必须小心缓慢，防止扰动蔗糖和病毒上清的界面。配平后，22000 xg 4℃离心2小时，将培养基中的细胞碎片等去掉。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μL PBS缓冲液，将离心管置于4℃冰箱中过夜（确保沉淀部位浸在缓冲液中），第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬（避免吹起气泡）；得到含有慢病毒的重悬溶液。
调整T细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子（白介素2、白介素7、白介素15、白介素21）及抗体复合物（终浓度为100ng/mL Anti-CD3-OKT3、250ng/mL Anti-CD28），连续培养44小时。
从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为5μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将方瓶密封，800 xg离心1.5小时。离心结束后，撕掉封口膜，将方瓶置于37℃5% CO2的培养箱中，继续培养24小时。250 xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基（X-Vivo 15，添加白介素2、白介素7、白介素15和白介素21）重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中，继续培养3天，得到CD20嵌合抗原受体的T细胞，嵌合抗原受体慢病毒对原代T细胞的感染效率达到65%。采用CAR-T细胞与Jeko-1肿瘤细胞共培养的方法检测嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的杀伤，嵌合抗原受体慢病毒可以高效的感染原代T细胞，图6为对Jeko-1细胞杀伤率图，可以看出，由此获得的CAR-T细胞在效靶比为0.5:1时即可高效杀伤肿瘤细胞，杀伤率达到30%。
实施例四
准备15cm皿，接种5*106个293细胞，加入完全培养基（DMEM高糖、10%FBS），置于37℃、5% CO2培养箱，过夜培养。从冰箱中取出100μM聚醚酰亚胺，从冰箱中取出质粒（Lenti-Mesothelin-CAR、pGP、pVSVG），室温解冻后，取出PBS缓冲液，温热至室温；取2mL PBS至6孔板的一个孔，共准备3个孔，分别加入15μg Lenti-Mesothelin-CAR、3μg pGP、1.5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，每孔加入18μL 100μM 聚醚酰亚胺，然后将三组质粒溶液加入到PBS孔中，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟，制备PEI/DNA复合物。将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱，培养6小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的条件培养基（DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES））。
第三天从培养箱中取出细胞，在生物安全柜操作台面上，将培养皿中的培养基上清收集于50mL离心管中，1100 xg离心12分钟；取一个新的无菌离心管，加入5mL 20%sucrose，然后沿着离心管内壁，轻轻加入含有病毒的培养基上清，此步骤操作必须小心缓慢，防止扰动蔗糖和病毒上清的界面。配平后，19000 xg 4℃离心1.6小时，将培养基中的细胞碎片等去掉。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入300μL PBS缓冲液，将离心管置于4℃冰箱中过夜（确保沉淀部位浸在缓冲液中），第二天用移液器反复吹打，将沉淀重悬（避免吹起气泡）；得到含有慢病毒的重悬溶液。
调整T细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子（白介素2、白介素7、白介素15、白介素21）及抗体复合物（终浓度为100ng/mL Anti-CD3 (OKT3)、250ng/mL Anti-CD28），连续培养48小时。
从-80℃冰箱取出含有慢病毒的重悬溶液后，迅速在37℃水浴锅中融化。在方瓶中加入含有慢病毒的重悬溶液，添加终浓度为5μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将方瓶密封，800 xg离心1.5小时。离心结束后，撕掉封口膜，将方瓶置于37℃5% CO2的培养箱中，继续培养24小时。250 xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基（X-Vivo 15，添加白介素2、白介素7、白介素15和白介素21）重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的方瓶中，继续培养3天，得到Mesothelin嵌合抗原受体T细胞，嵌合抗原受体慢病毒对原代T细胞的感染效率达到70%。采用CAR-T细胞与HeLa共培养的方法检测嵌合抗原受体T细胞对肿瘤细胞的杀伤，嵌合抗原受体慢病毒可以高效的感染原代T细胞，图7为对HeLa细胞杀伤率图，可以看出，由此获得的CAR-T细胞在效靶比为10:1时即可高效杀伤肿瘤细胞，杀伤率达到50%。
Claims (6)
1.一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在缓冲液中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合，吹打均匀，室温静置得到DNA/PEI复合物；
（2）将293细胞接种于培养皿，然后加入完全培养基，置于培养箱中，培养40～60小时；然后将步骤（1）的DNA/PEI复合物滴加入培养皿中；然后再将培养皿置于培养箱中；培养4～10小时后，去除培养基；然后加入条件培养基，继续置于培养箱中；培养8～32小时后，收集培养基；然后离心处理，得到含有慢病毒的培养基上清；
（3）将蔗糖溶液加入离心管中，然后沿着离心管壁加入步骤（2）的含有慢病毒的培养基上清；然后离心处理，去除离心上清后，加入缓冲液；得到含有慢病毒的重悬溶液；
（4）将T细胞加入培养容器中，然后加入细胞因子与抗体复合物，培养40～60小时；然后加入步骤（3）的含有慢病毒的重悬溶液；然后加入终浓度为4～8μg/mL的聚凝胺，混匀后，密封培养容器；然后进行首次离心处理；离心结束后，去除密封；然后将培养容器置于培养箱中；培养18～32小时后，进行再次离心处理；然后去除离心上清；然后加入培养基得到混合物；然后将混合物加入新的培养容器中，培养得到嵌合抗原受体T细胞；细胞因子包括白介素2、白介素7、白介素15、白介素21，抗体复合物包括Anti-CD3-OKT3、Anti-CD28；培养容器为方瓶；培养基包括白介素2、白介素7、白介素15和白介素21。
2.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，缓冲液为PBS或者HBSS缓冲液；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量比为10∶2∶1；嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒的质量总和与聚醚酰亚胺的质量比为3∶1。
3.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合为分别将将嵌合抗原受体慢病毒表达载体、pGP质粒、pVSVG质粒与聚醚酰亚胺混合得到三份混合物；然后将三份混合物混合。
4.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，293细胞的接种密度为5000～7000个/cm2；完全培养基包括DMEM高糖、10%FBS；条件培养基包括DMEM高糖、5%FBS、丙酮酸钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸；离心处理时的离心力为1100～1300xg，时间为8～12分钟。
5.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，蔗糖溶液与含有慢病毒的培养基上清的体积比为1∶6，蔗糖溶液的质量浓度为15%～30%；加入缓冲液后于0～5℃静置18～32小时；然后吹打均匀，得到含有慢病毒的重悬溶液；离心处理时的离心力为19000～22000xg，时间为1.5～2.5小时。
6.根据权利要求1所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，首次离心处理时的离心力为600～1000xg，时间为0.5～2.5小时；再次离心处理时的离心力为200～400xg，时间为5～15分钟。
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