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CN116640229B - 一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用 - Google Patents

一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用 Download PDF

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CN116640229B
CN116640229B CN202310371232.7A CN202310371232A CN116640229B CN 116640229 B CN116640229 B CN 116640229B CN 202310371232 A CN202310371232 A CN 202310371232A CN 116640229 B CN116640229 B CN 116640229B
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Abstract

本发明提供了一种低pH靶向性CAR‑T细胞的构建及应用，属于免疫靶向治疗技术领域。本发明中CAR‑T细胞的嵌合抗原受体(CAR)包括pHLIP(pH‑low多肽)，主要由CD8信号肽、HiS标签、pHLIP、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、4‑1BB共刺激信号传导区、CD28和CD3ζ的细胞内信号区串联组成。本发明提供的CAR‑T细胞可以实现pHLIP在CAR‑T细胞上的表达，从而靶向性识别实体瘤，避免传统肿瘤标志物靶向治疗的局限。

Description

一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用
技术领域
本发明属于免疫靶向治疗技术领域，尤其涉及一种低pH靶向性CAR-T细胞的构建及应用。
背景技术
CAR-T，全称是chimeric antigen receptorT-cell，即嵌合抗原受体T细胞。CAR-T制备第一步是从患者身上分离T细胞：通过白细胞分离术收集患者的外周血单核细胞(PBMC细胞)，再分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞；第二步是改造T细胞：通过T细胞受体信号和CD28、4-1BB或OX40信号等共刺激信号产生主要的特异性信号，从而激活T细胞，再通过电穿孔、慢病毒或逆转录病毒载体，将CAR基因导入激活的T细胞中进行基因修饰，从而得到可表达CAR基因的CAR-T细胞；第三步是扩增：体外培养，大量扩增CAR-T细胞后回输。CAR-T疗法是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
理想情况下，CAR-T细胞针对的靶点只在肿瘤细胞表面表达(或高度表达)，而在其它正常细胞上不表达(或者表达非常低)。如CD-19CAR作为最为成功的CAR-T治疗方法，它的成功很大一部分在于CD19是一个非常好的未成熟的B细胞的特异性标记物，它只在未成熟的B细胞表面表达，其它体细胞不表达。但是，由于肿瘤细胞都是从正常细胞癌变产生的，实际上是很难找到仅仅存在于肿瘤细胞表面、却不存在于正常细胞表面的特异性标记物。且癌细胞在肿瘤中分裂时获得广泛的遗传改变，包括表观遗传调节位点突变、基因缺失、基因重复和染色体重排等，这些变化在单个肿瘤中分布不均。肿瘤内部和肿瘤之间细胞表面特定生物标记物表达的异质性也显著降低了靶向特定生物标记物的药物的有效性。这均是CAR-T疗法目前在实体瘤里尚未取得突破的原因之一。
pHLIP(pH-low多肽)是一种对pH敏感的多肽，一个典型的pHLIP是一个约40个氨基酸的肽。在酸性条件下，pHLIP可以通过跨膜α-螺旋自发地插入细胞膜，并能将附着在其插入的C端上的极性物质转移到靶细胞的细胞质，这种转变是由于pHLIP膜跨区中天冬氨酸残基在酸性pH下的质子化和电荷中和。pHLIP插入对pH值有依赖性，有研究表明，pHLIP倾向于聚集在酸性病变组织中，具有高特异性。实体肿瘤中，在糖酵解代谢增强(Warburg效应)、碳酸酐酶的作用和继发于血液供应增长的缺氧/缺血的作用下，肿瘤在快速生长的过程中始终呈酸性，肿瘤通常产生的胞外pH值为6.2～6.9，肿瘤细胞表面的pH值酸性更强(pH值为6.0～6.5)，而健康组织的pH值为7.4，因此，肿瘤的酸性微环境为选择性靶向肿瘤而保留健康组织提供了一个可能性。目前，鉴于pHLIP的特性，虽然已有pHLIP在肿瘤细胞靶向治疗中的应用，如将鬼笔环肽(一种细胞不渗透的极性毒素)连接到pHLIP的C端，破坏HeLa、JC和M4A4癌细胞的增殖等，但尚未见将pHLIP连结到T细胞上的治疗手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体，包括pHLIP，可在CAR-T细胞激活过程中发挥靶向识别作用。
本发明的目的还在于提供一种低pH靶向性CAR-T细胞，可以靶向性识别实体瘤，促进癌细胞凋亡，避免传统肿瘤标志物靶向治疗的局限。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括pHLIP，所述pHLIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述pHLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HiS标签、pHLIP、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、4-1BB共刺激信号传导区、CD28和CD3ζ的细胞内信号区串联组成。
优选的，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了一种慢病毒表达载体，所述载体包含上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒包含上述慢病毒表达载体。
本发明还提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达上述嵌合抗原受体；或所述CAR-T细胞的基因组中整合有上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明还提供了上述嵌合抗原受体、重组慢病毒或CAR-T细胞在制备用于治疗实体瘤药物中的应用。
优选的，所述实体瘤包括乳腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌。
本发明的有益效果：
本发明首次将pHLIP连结到T细胞上，并构建得到一种低pH靶向性CAR-T细胞。本发明制备得到的CAR-T细胞可以实现pHLIP的表达，并根据肿瘤微环境呈酸性的特点，将CAR-T细胞靶向定位于实体瘤表面，从而靶向杀伤肿瘤细胞，避免了传统肿瘤标志物靶向治疗的局限性。
附图说明
图1：包括pHLIP的嵌合抗原受体结构；
图2：空载嵌合抗原受体结构；
图3：质粒酶切电泳图；
图4：293T细胞包装病毒及转染效率；
图5：CAR-T细胞感染效率；
图6：CAR-T细胞增殖活力；
图7：CAR-T细胞对胃癌细胞系的杀伤能力；
图8：CAR-T细胞对乳腺癌细胞系的杀伤能力；
图9：CAR-T细胞对结直肠癌细胞系的杀伤能力；
图10：CAR-T细胞对肺癌细胞系的杀伤能力；
图11：CAR-T细胞对肝癌细胞系的杀伤能力；
图12：不同肿瘤细胞对CAR-T细胞CD69分子表达比例的影响；
图13：不同肿瘤细胞对CAR-T细胞IFN-r表达的影响；
图14：不同肿瘤细胞对CAR-T细胞IL-2表达的影响；
图15：不同肿瘤细胞对CAR-T细胞增殖倍数的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括pHLIP(pH-low多肽)，所述pHLIP的核苷酸序列为GGATGTACAGGCGAGGAT GCTGATGTGCTGCTGGCCCTGGATCTGCTGCTGCTCCCTACCACCTTTC TGTGGGATGCCTACAGAGCCTGGTACATCCCCAATCAAGAAGCCGCC，如SEQ ID NO:1所示，pHLIP的氨基酸序列为GCTGEDADVLLALDLLLLPT TFLWDAYRAWYIPNQEAA，如SEQ ID NO:2所示。
本发明以含有第三代CAR结构的嵌合抗原受体为基础，在嵌合抗原受体的信号肽和铰链区之间进行工程化改造，连接加入HiS标签和pHLIP，制备得到含有pHLIP的嵌合抗原受体，可在CAR-T细胞上实现pHLIP的表达，使得CAR-T细胞可以靶向定位于微环境呈酸性的实体瘤表面。
本发明所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HiS标签、pHLIP、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、4-1BB共刺激信号传导区、CD28和CD3ζ的细胞内信号区串联组成，详见图1。
本发明所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。在所述核苷酸序列中，第1～63位为CD8信号肽序列，第64～81位为HiS标签序列，第82～195位为pHLIP序列，第196～330位为CD8铰链区序列，第331～402位为CD8跨膜结构区序列，第403～528位为4-1BB共刺激信号传导区，第529～651位为CD28细胞内信号区序列，第652～987位为CD3ζ细胞内信号区序列。
本发明所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。在所述氨基酸序列中，第1～21位为CD8信号肽序列，第22～27位为HiS标签，第28～65位为pHLIP序列，第66～110位为CD8铰链区序列，第111～134位为CD8跨膜结构区序列，第135～176位为4-1BB共刺激信号传导区，第177～217位为CD28细胞内信号区序列，第218～329位为CD3ζ细胞内信号区序列。
本发明还提供了一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包含上述嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。作为可选的实施方式，本发明通过对嵌合抗原受体的碱基序列和慢病毒表达载体进行双酶切、酶切产物连接，可得到含所述嵌合抗原受体的慢病毒载体质粒。
本发明还提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒包含上述慢病毒表达载体。本发明所述重组慢病毒采用上述慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒共转染细胞制备得到，本发明优选的采用三质粒病毒包装系统。
本发明还提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达上述嵌合抗原受体；或所述CAR-T细胞的基因组中整合有上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明对于CAR-T细胞的具体制备方法没有特殊限定，采用本领域常规CAR-T细胞的制备方法均可。作为一种可选的实施方式，本发明所述制备方法包括如下步骤：将所述嵌合抗原受体基因片段克隆至px330载体，然后通过慢病毒转染将嵌合抗原受体基因导入激活的T细胞中，得到表达pHLIP的CAR-T细胞。
本发明还提供了上述嵌合抗原受体、上述重组慢病毒或上述CAR-T细胞在制备药物中的应用。在本发明中，所述药物优选的包括实体瘤免疫治疗的药物，所述药物治疗的实体瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、肠癌、胃癌、肝癌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
低pH靶向性CAR-T细胞的制备方法：
1、载体构建
将px330用BbsⅠ、EcoRI酶切，将插入片段(SEQ ID NO：3)插入BbsⅠ、EcoRI酶切位点之间，得到连接产物；将连接产物转化，挑取克隆测序鉴定。
2、质粒的制备
感受态细胞的制备
(1)划线涂板：用灭菌的接种环蘸取少量E.coli DH5α菌液，在不含抗生素的LB琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释。倒置放于37℃细菌培养箱，过夜培养12～14h。
(2)挑取单菌落，接种到5ml不含抗生素的LB培养基中。37℃，250rpm过夜。
(3)取2ml浑浊的菌液接种到200ml不含抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养2～3h。每半小时测一次OD600，使其达到0.4～0.6。
(4)将该菌液冰浴20min。将冰浴后的菌液转移至预冷的50ml离心管中。4℃，4000rpm，10min离心。
(5)弃上清。用20ml预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀。4℃，4000rpm，10min离心。
(6)弃上清。按每50ml菌液加入2ml预冷的含20％无菌甘油的0.1MCaCl2溶液重悬细胞沉淀。
(7)分装(50μl/管)，快速放于液氮中冷冻，再放入-80℃保存。
质粒的快速热激活转化
(1)将50μlE.coli DH5α感受态细胞放到冰上融化，加入1～10ng质粒，轻柔混匀。
(2)将感受态细胞与质粒的混合液放到冰上，静置30min。
(3)将上述混合液在42℃水浴中进行热激活(90s)，热激后迅速放到冰上，静置2min。
(4)取适量热激后的感受态细胞均匀涂到有抗生素的LB琼脂平板上。
(5)将LB平板倒置放于37℃细菌培养箱，培养12～16h。可以见到许多独立的细菌菌落。
质粒的小提
(1)挑取转化后的单菌落，接种到3～5ml含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养过夜。
(2)12000rpm，1min离心，收集细菌沉淀。加入250μl P1 buffer(50mM Tris Cl，10mM EDTA，100μg/ml RNaseA)，振荡混匀。
(3)加入250μl P2 buffer(200mM NaOH，1％SDS)，轻柔颠倒混匀。
(4)加入350μl N3 buffer(3.0M NaAC，pH5.5)，轻柔颠倒混匀。
(5)13000rpm，10min离心。
(6)小心吸取上清，加入到QIAprep离心柱中。12000rpm，1min离心，弃废液。
(7)加入0.75ml PE buffer(1.0M NaCl，50mM MOPS，15％异丙醇)漂洗，12000rpm，1min离心，弃废液。
(8)12000rpm，2min离心，以去除残留的漂洗液。
(9)加入50μl EB buffer(10mM Tris Cl，pH8.5)，室温放置1min。12000rpm，1min离心洗脱质粒。
质粒的中提或大提
(1)挑取转化后的单菌落，接种到3～5ml含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养8h。
(2)按1/500到1/1000的比例将菌液接种到含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇下培养12～16h。
(3)4℃，6000g，15min离心，收集菌体。
(4)用4ml(中提)或10ml(大提)P1 buffer(50mM Tris Cl，10mM EDTA，100μg/mlRNaseA)重悬细菌沉淀。
(5)加入4ml(中提)或10ml(大提)P2 buffer(200mM NaOH，1％SDS)，轻柔混匀，室温放置5min。
(6)加入4ml(中提)或10ml(大提)预冷的P3 buffer(3.0M NaAC，pH5.5)，轻柔混匀，冰上放置20min。
(7)4℃，20000g，30min离心。重复一次。
(8)将4ml(中提)或10ml(大提)QBTbuffer(750mM NaCl，50mM MOPS，15％异丙醇，0.15％Triton X-100)加到QIAGEN-tip进行柱平衡。
(9)将离心后的上清液加入到平衡好的QIAGEN-tip柱子中。液体在重力的作用下流出。
(10)用10ml(中提)或30ml(大提)QC buffer(1.0MNaCl，50mM MOPS，15％异丙醇)漂洗QIAGEN-tip柱子。重复一次。
(11)用5ml(中提)或15ml(大提)QF buffer(1.25M NaCl，50mM Tris Cl，15％异丙醇)洗脱质粒。
(12)向洗脱后的质粒中加入3.5ml(中提)或10.5ml(大提)异丙醇。混匀后，4℃，8000g，40min离心。管底部可以见到DNA沉淀。
(13)弃上清。加入2ml(中提)或5ml(大提)70％乙醇漂洗沉淀。4℃，6000g，60min离心。
(14)弃上清。室温干燥5～10min。加入TE buffer(10mM Tris Cl，pH8.0)溶解质粒。
3、质粒的鉴定
质粒的质量检测
使用NanoPhotometerTM Pearl(IMPLEN)超微量紫外可见分光光度计测定质粒浓度及纯度。记录质粒浓度、OD260/280、OD260/230比值，OD260/280达到1.8～2，OD260/230>2。
琼脂糖凝胶电泳检测
(1)用1×TAE电泳缓冲液配制0.9～1.5％的琼脂糖凝胶，微波加热溶解。待冷却至55～60℃左右，以1/20000的比例加入EtBr(溴化乙锭)。短期可放于55℃水浴中备用。
(2)将配制好的琼脂糖凝胶倒入插有合适大小的梳子的制胶模具，室温待其凝固。
(3)拔掉梳子，取100～500ng质粒与6×loadingbuffer混匀后，加样。
(4)使用5～7V/cm的电压进行电泳。
(5)电泳结束后，使用LHR凝胶成像系统(Syngene)扫胶，拍照。
质粒的酶切鉴定
根据质粒的酶切图谱，选择限制性内切酶(BbsⅠ、EcoRI)进行切割。借助酶切后产生的特异性酶切片段的大小来确定所提取的质粒是否正确，酶切后电泳图见图3。
4、慢病毒包装
采用2代包装系统，即三质粒系统，该系统包括1个包装质粒(psPAX2)、1个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell)。
Day1：汇合度90％的10cm dishs HEK293T细胞(6×107/dish)按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90～95％(1.5×108/dish)，培养基为Gibico高糖DMEM培养基(含10％FBS)。
Day2：
转染前2-3个小时更换培养基(含10％FBS)；按照以下比例配制转染试剂：
Mix 1体积μl，Mix 2量，DMEM(无FBS)1000μl，DMEM(无FBS)1000μl，目的基因质粒25μg，VGF190μl(1μg/μl)，PMD2G7.5μg，PSPAX215μg。
Mix 1和Mix 2分别混合后，室温5～10min后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
Day3：6～24h内更换新鲜培养基(含10％FBS)。
Day5：72h观察细胞状态并拍照。收取上清培养基，过0.45μm滤膜，上清培养基加入超速离心管中，配平后离心，25000rpm，4℃离心1.5h。弃上清，用适当病毒保存液回溶混匀溶解过夜。
Day6：收集病毒分装，进行病毒滴度测定。
重组慢病毒滴度测定：整合数法标定不带荧光的重组慢病毒滴度
病毒感染细胞
感染前6h在24孔细胞培养板中以2.5×105个细胞/孔均匀接种HEK293细胞。
将慢病毒进行梯度稀释，共做3个梯度，即每孔(500μl无双抗、无血清的DMEM培养基)中含10μl、1μl、0.1μl病毒，振荡混匀后加至接种好细胞的24孔板中，加病毒之前将培养板中的培养基吸净。
感染18～20h后，将培养板中的培养基更换为新鲜的DMEM完全培养基。
感染64～68h后收集细胞并进行基因组DNA的提取。
测定时，设置一组带荧光的已知TU的慢病毒作为对照，以校验检测出的数值。
5、G-CSF动员外周血造血干细胞单个核细胞分离(采用ficoll细胞分离液)
(1)用无菌稀释液将血样稀释2～4倍。
(2)在50ml锥底离心管中先加入15～20ml分离液，然后缓慢加入20～30ml经稀释的全血至分离液液面之上。
(3)室温400g离心15-30min，保证转子速度平稳下降。
(4)将离心管小心的从离心机中取出，缓慢的吸去最上层，避免接触单个核细胞层。
(5)将单个核细胞层缓慢转移至另一只50ml锥底离心管中。
(6)加入无菌洗涤液并混匀后，室温下300g离心10min，小心弃掉上清得细胞悬液。
(7)台盼蓝染液计数活细胞数，并用50μm细胞筛过滤细胞悬液，得到G-CSF动员外周血造血干细胞单个核细胞。
达到以下标准后进行下一步实验：分离所得的细胞中95±5％为单个核细胞；分离所得的细胞存活细胞率>90％；可回收原始的血液样本中60±20％的单个核细胞；3±2％的粒细胞；5±2％的红细胞
6、G-CSF动员外周血造血干细胞来源单个核细胞中T细胞分离及激活
(1)确定单个核细胞细胞数，将细胞浓度调整为1×108个细胞/ml。
(2)将100μl细胞悬浮液(1×107个细胞)放入新试管中，加入10μL阴性分选抗体，搅拌均匀，避光，在冰上孵育15分钟。
(3)加入20μl阴性分选磁珠，搅拌均匀，避光，在4℃孵育15min。
(4)在5ml(12×75mm)聚丙烯管中加入4ml缓冲液后，将试管放入磁铁中5min，倒出上清液于另一只15ml离心管中。
注：重复磁选可提高收率，对纯度无强烈影响。第二次分离后，产率会增加8～10％，每次分离可使纯度降低1～2％。
(5)将CD3/CD28激活磁珠按3:1比例加入获得的T淋巴细胞，放置37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
7、慢病毒感染T细胞
(1)T细胞激活24～72小时后，在室温下融化慢病毒颗粒，轻轻混匀，将慢病毒颗粒加入，放置37℃、5％CO2培养箱中培养4～6小时。
(2)去掉大部分含慢病毒颗粒的上清培养液，加入新的培养液，扩增T细胞。3天后转移至细胞培养袋中培养。293T细胞包装病毒及转染效率见图4，由图4可知，慢病毒转染效率在90％以上。
实施例2
实验组：采用实施例1的方法构建低pH靶向性CAR-T细胞；
对照组：将实施例1步骤1中的插入片段(SEQ ID NO：3)替换为空载插入片段(SEQID NO：5)，其余方法同实施例1构建空载的CAR-T细胞，嵌合抗原受体结构详见图2。
1、包装病毒后，感染T细胞，48h后用流式的方式对T细胞进行检测：
(1)将培养后的细胞用PBS缓冲液稀释置于离心管中，350g离心5min后弃去上清液，重复洗涤细胞一次，用PBS缓冲液重悬细胞后计数，稀释细胞为(5～10)×106个细胞/ml，然后每支流式检测管中加入100μl细胞悬液((5～10)×105个细胞/管)。
(2)在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗；在空白管/孔中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴孵育15～20min。Car-T抗体染色时在4℃冰箱中孵育50min。
(3)加入2ml PBS缓冲液，然后350g离心5min后弃去上清液，重复洗涤过程两次。
(4)用300μl PBS缓冲液或300μl 2％的多聚甲醛固定液重悬细胞。
(5)上机检测并分析结果。
对照组流式检测管中阳性率分别为3％、4％、5％、2％、5％，实验组流式检测管中阳性率分别为36％、44％、39％、47％、56％，图5说明pHLIP相关基因可以在T细胞表面正常表达，得到CAR-T细胞。
2、将对照组细胞与实验组细胞分别在培养体系中培养，每隔一天计数结果，结果详见表1和图6。
表1细胞增殖倍数
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
0D 1 1 1 1
2D 0.8 0.9 0.6 0.5
4D 1.2 1.3 1 1.1
6D 2.4 2.6 2.2 2.1
8D 5 5.2 4.8 5.8
10D 15 18 14 17
表1和图6表明，CAR-T细胞改造后不改变T细胞的增殖活力。
3、CAR-T杀伤能力检测
(1)靶细胞Cfse染液标记染色
1)将靶细胞用PBS缓冲液稀释置于离心管中，300g离心5min后弃去上清液，重复洗涤细胞一次。
2)用PBS缓冲液重悬细胞后计数，稀释细胞为1×107个细胞/ml，然后加入Cfse染液至终浓度2～5μM，放置37℃、5％CO2培养箱中孵育15min。
3)加入10ml PBS缓冲液，然后300g离心5min后弃去上清液，重复洗涤过程两次。
(2)cfse+靶细胞与效应细胞共培养
将洗涤后的靶细胞和CAR-T细胞分别用无血清1640培养基重悬计数，以效靶比(靶细胞：效应细胞)1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:5加入96孔圆底细胞培养板放置37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。
(3)样品染色
1)吸取各培养孔细胞于流式检测管中，300g离心5min收集细胞。
2)用PBS缓冲液洗涤细胞1次，300g离心5min。收集(1～5)×105细胞/管。
3)吸弃PBS，加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。
4)每管加入5μlAnnexinV-APC和10μl 7-AAD，轻轻混匀。
5)避光、室温反应10～15min。
6)加入200μl 1×Binding Buffer，混匀后样品在1小时内用流式细胞仪检测。
(4)样品流式细胞仪分析：
AnnexinV-APC为横坐标，7-ADD为纵坐标，检测细胞凋亡率(活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的蓝色荧光，晚期凋亡细胞有蓝色和红色荧光双重染色)。
CAR-T细胞对胃癌细胞系的杀伤能力见表2和图7。
表2胃癌细胞系的细胞凋亡率(％)
CAR-T细胞对乳腺癌细胞系的杀伤能力见表3和图8。
表3乳腺癌细胞系的细胞凋亡率(％)
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
1:0.25 5 4 10 12
1:0.5 8 7 21 18
1:1 12 14 34 38
1:2 16 15 52 56
1:5 20 17 70 72
CAR-T细胞对结直肠癌细胞系的杀伤能力见表4和图9。
表4结直肠癌细胞系的细胞凋亡率(％)
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
1:0.25 4 4 12 11
1:0.5 3 5 21 20
1:1 5 6 31 32
1:2 8 10 43 44
1:5 11 12 57 59
CAR-T细胞对肺癌细胞系的杀伤能力见表5和图10。
表5肺癌细胞系的细胞凋亡率(％)
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
1:0.25 3 5 16 19
1:0.5 6 7 25 28
1:1 9 7 54 51
1:2 13 11 67 70
1:5 17 14 88 85
CAR-T细胞对肝癌细胞系的杀伤能力见表6和图11。
表6肝癌细胞系的细胞凋亡率(％)
由表2～6和图7～11可知，低pH靶向性CAR-T细胞可以剂量依赖性的杀死不同来源的肿瘤细胞系细胞，而对照组T细胞几乎不能杀死肿瘤细胞。
4、肿瘤细胞对CAR-T细胞的激活能力
(1)体外以1:1效靶比将对照组T细胞以及实验组T细胞分别与不同肿瘤细胞共培养4h，然后对细胞进行流式检测，探究CD69分子的表达比例，结果见表7和图12。
表7不同肿瘤细胞对CAR-T细胞CD69分子表达比例的影响(％)
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
结直肠癌 5 7 55 70
胃癌 8 9 67 77
肺癌 12 14 45 48
乳腺癌 11 14 37 46
肝癌 6 8 71 83
表7和图12说明，不同肿瘤细胞均可以刺激低pH靶向性CAR-T细胞表达CD69分子，而不能刺激对照组T细胞表达CD69分子。CD69分子是T细胞被激活后表达的分子，说明不同肿瘤细胞都可以激活低pH靶向性CAR-T细胞。
(2)体外以1:1效靶比将对照组T细胞以及实验组T细胞分别与不同肿瘤细胞共培养4h，对培养上清中细胞因子进行检测，结果见表8～9和图13～14。
表8不同肿瘤细胞对CAR-T细胞IFN-r表达的影响(pg/ml)
表9不同肿瘤细胞对CAR-T细胞IL-2表达的影响(pg/ml)
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
结直肠癌 10 12 550 540
胃癌 11 14 640 660
肺癌 14 18 760 770
乳腺癌 14 16 450 460
肝癌 14 15 890 980
表8～9和图13～14表明，不同肿瘤细胞均可以刺激低pH靶向性CAR-T细胞分泌细胞因子，而不能刺激对照组T细胞分泌细胞因子。说明不同肿瘤细胞都可以激活低pH靶向性CAR-T细胞，促进其细胞因子IFN-r和IL-2的释放。
(3)体外以1:1效靶比将对照组T细胞以及实验组T细胞分别与不同肿瘤细胞共培养48h，然后对T细胞数量进行检测，结果见表10和图15。
表10不同肿瘤细胞对CAR-T细胞增殖倍数的影响
组别 对照组1 对照组2 实验组1 实验组2
结直肠癌 1.8 1.9 2.4 2.6
胃癌 1.4 1.5 3.3 3.5
肺癌 1.6 1.6 3.4 3.1
乳腺癌 1.8 1.5 2.8 2.6
肝癌 2.1 2.2 3 3.2
表10和图15表明，不同肿瘤细胞均可以刺激低pH靶向性CAR-T细胞增殖，而不能刺激对照组T细胞增殖。说明不同肿瘤细胞都可以激活低pH靶向性CAR-T细胞，促进其增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括pHLIP，所述pHLIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述嵌合抗原受体由CD8信号肽、HiS标签、pHLIP、CD8铰链区、CD8跨膜结构区、4-1BB共刺激信号传导区、CD28和CD3ζ的细胞内信号区串联组成。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种慢病毒表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
5.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒包含权利要求4所述慢病毒表达载体。
6.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原受体；或所述CAR-T细胞的基因组中整合有权利要求2所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
7.权利要求1～3任意一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的重组慢病毒或权利要求6所述的CAR-T细胞在制备用于治疗实体瘤药物中的应用，其特征在于，所述实体瘤为乳腺癌、肺癌、肠癌、胃癌或肝癌。
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