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CN108640999B - 一种靶向表达psma表面抗原的细胞的嵌合抗原受体 - Google Patents

一种靶向表达psma表面抗原的细胞的嵌合抗原受体 Download PDF

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CN108640999B CN201810260430.5A CN201810260430A CN108640999B CN 108640999 B CN108640999 B CN 108640999B CN 201810260430 A CN201810260430 A CN 201810260430A CN 108640999 B CN108640999 B CN 108640999B
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Abstract

本发明涉及一种靶向表达PMSA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，包含PSMA抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述PSMA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸，还涉及表达所述嵌合抗原受体的重组表达载体。通过将本发明的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CAR‑T细胞能够有效并且特异性地靶向表达PMSA表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达PMSA表面抗原的肿瘤，例如前列腺癌等，提供更高效的方法。

Description

一种靶向表达PSMA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向表达PSMA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体及其编码序列和表达载体。
背景技术
前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤并且排在癌症死亡原因的第二位。局限型前列腺癌通常使用手术或放射进行治疗，复发性疾病可使用雄激素撤除暂时控制。然而，几乎所有的前列腺癌最终都会变成激素耐受性，然后迅速发展。激素耐受性或雄激素非依赖性前列腺癌已证明很大程度上抵抗常规化学疗法。除了姑息治疗之外，唯一获批的化学疗法是与泼尼松组合的多西他赛，其提供了有限的(2.4个月)的生存效果。需要新的分子靶向疗法。
PSMA是一种前列腺细胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白，由三个结构域组成，其氨基端位于细胞膜内，共含750个氨基酸，其中胞内段19个，跨膜段24个，胞外段707个，其胞内段和胞外段有多个抗原表位，与多种蛋白有着密切联系。免疫组化显示，PSMA在前列腺的正常组织，良性增生组织，上皮内增生，癌组织中均有表达，且表达强度依次上升，在前列腺癌中表达强度最高；在前列腺癌淋巴结转移灶，骨转移灶中表达呈阳性。同时PSMA在多种非前列腺的恶性肿瘤也有一定的表达，这些肿瘤主要包括肾透明细胞癌，膀胱移行细胞癌，结肠腺癌，胰导管癌，非小细胞肺癌，如组织肉瘤，乳腺癌等。
PSMA具有较高的特异性和位于前列腺上皮细胞膜的特性，其在前列腺癌及其转移灶中表达增高，在前列腺癌的靶向治疗中具有重要意义。
嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor，CAR-T)。在这种治疗方法中，CAR的作用至关重要。嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域。其中，单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的杀伤活性。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明提供了一种靶向表达PSMA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，包含PSMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述PSMA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自CD28、4-1BB、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。更为优选的，所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供了一种编码上述嵌合抗原受体的核酸分子，其核酸序列如SEQ IDNO:4所示。
本发明还提供了一种表达上述嵌合抗原受体的重组表达载体，其包括嵌合抗原受体表达框和复制系统，所述嵌合抗原受体表达框由可在T细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。
本发明还提供了一种组合物，其含有上述所述的嵌合抗原受体、上述所述的核酸分子、上述所述的载体、或者上述所述的宿主细胞、以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
本发明的有益效果在于：通过将本发明的嵌合抗原受体表达于T细胞中可使得到CAR-T细胞能够有效并且特异性地靶向表达PSMA表面抗原的恶性细胞，从而为治疗一些表达PSMA表面抗原的肿瘤，例如前列腺癌等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。
附图说明
图1是本发明的重组表达载体的示意图。
图2是本发明CAR-T细胞对靶细胞的裂解量示意图。
图3是本发明CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后分泌的IFN-γ表达量示意图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-3对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
1.PSMA SCFV嵌合抗原受体表达质粒的构建
通过人工合成SEQ ID NO:4所示DNA片段，其中，第1-732位的核苷酸编码PSMASCFV，第733-939位的核苷酸编码CD8铰链区，第940-1065位的核苷酸编码41BB，第1066-1401位的核苷酸编码CD3zeta。
将上述DNA片段亚克隆至Lenti-EF1a-AT-Free载体中，得到重组表达载体，如图1所示。
2.慢病毒制备
具体实验步骤如下：
S1、准备15cm培养皿，接种5*106个细胞，加入完全培养基(DMEM高糖、10％FBS、双抗)，置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。
S2、从冰箱中取出100μM PEI及慢病毒包装质粒(Lenti-EF1a-CAR、pGP、pVSVG)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-EF1a-CAR、4μg pGP、2μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL 100μM PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
S3、将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，配平后，20000xg 4℃离心2小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。
3.原代T细胞的分离
具体实验步骤如下：
S1、将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀Lymphoprep试剂。
S2、在生物安全柜中，向50mL离心管(或15mL离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mL Lymphoprep试剂，备用。
S3、将血样使用等体积的PBS+2％FBS进行稀释。
S4、使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。
S5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心20分钟。
S6、离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，贮存于-80℃。
S7、轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。
S8、将细胞密度调整至1*108细胞/mL(总体积不超过2.5mL)，重悬于5mL的圆底管中。
S9、加入100μl/mL的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育15分钟。
S10、取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。
S11、吸取50μl磁珠/mL至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。
S12、添加完全培养基至管内总体积为2.5mL，将管子(开盖)插入磁极中，室温静置5分钟。
S13、孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。
S14、将细胞重悬于X-vivo 15培养基中，并添加10％FBS，300U/mL IL-2,5ng/mLIL-15和10ng/mL IL-7。
4.原代T细胞的激活与慢病毒感染
具体实验步骤如下：
S1、调整细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度为300U/mL的IL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3(OKT3)、2ug/mL Anti-CD28)，连续培养48小时。
S2、按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度
S3、从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/mL的polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg离心1小时。
S4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％CO2的培养箱中，继续培养24小时。
S5、250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。
5.CAR-T细胞对靶细胞裂解
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
S2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；Maxi lysis和Mini lysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加CAR-T细胞。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向Maxi lysis孔加入LDH检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL至另一个新的96孔板中，加入LDH检测试剂后，使用酶标仪读取OD值。
靶细胞裂解百分数计算公式：
Figure BDA0001610143750000061
S5、将上述处理后的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达PSMA的前列腺癌细胞株为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，检测培养基上清中LDH的释放量，以此反映CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力。实验结果如图2所示，结果显示CAR-T细胞可以有效的裂解靶细胞，并杀伤靶细胞；在效靶比为1：1时即可高效的介导T细胞对肿瘤细胞或重组细胞的杀伤；随着效靶比的升高，CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用也随之升高，在效靶比为10:1时达到最高。
6.CAR-T细胞因子分泌水平检测
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；
S2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。同时设置对照T细胞组。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL培养基上清，使用ELISA kit检测IL-2的表达，使用酶标仪读取OD值。
S5、将上述获取的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达PSMA的前列腺癌细胞株为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30微升上清，用ELISA的方法检测培养基上清中由CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后分泌的IFN-γ的表达量。实验结果如图3所示，结果显示肿瘤细胞可以有效的激活原代T细胞，并引起细胞因子分泌表达量的升高；在效靶比为1:1时，CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后，即可分泌大量的IFN-γ,显著高于对照T细胞；在效靶比为10:1时分泌量达到最高值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
<110> 广东万海细胞生物科技有限公司
<120> 一种靶向表达PSMA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体
<160> 4
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYWIGWARQM PGKGLEWMGI IYPGDSDTRY 60
SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCSAAN SSHWYFDLWG RGTLVTVSSG 120
GGGSGGGGSG GGGSEIVLTQ SPATLSLSPG ERATLSCRAS QSVSSYLAWF QQKPGQAPRL 180
LIYDASNRAT GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQRSNWLM YTFGQGTKLE 240
IK 242
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD 45
<210> 3
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYCKRGRKK LLYIFKQPFM RPVQTTQEED GCSCRFPEEE 60
EGGCELRVKF SRSADAPAYK QGQNQLYNEL NLGRREEYDV LDKRRGRDPE MGGKPRRKNP 120
QEGLYNELQK DKMAEAYSEI GMKGERRRGK GHDGLYQGLS TATKDTYDAL HMQALPPR 178
<210> 4
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ATGGAGGTGC AGCTGGTGCA GAGCGGCGCC GAGGTGAAGA AGCCCGGCGA GAGCCTGAAG 60
ATCAGCTGCA AGGGCAGCGG CTACAGCTTC ACCAGCTACT GGATCGGCTG GGCCCGCCAG 120
ATGCCCGGCA AGGGCCTGGA GTGGATGGGC ATCATCTACC CCGGCGACAG CGACACCCGC 180
TACAGCCCCA GCTTCCAGGG CCAGGTGACC ATCAGCGCCG ACAAGAGCAT CAGCACCGCC 240
TACCTGCAGT GGAGCAGCCT GAAGGCCAGC GACACCGCCA TGTACTACTG CAGCGCCGCC 300
AACAGCAGCC ACTGGTACTT CGACCTGTGG GGCCGCGGCA CCCTGGTGAC CGTGAGCAGC 360
GGCGGCGGCG GCAGCGGCGG CGGCGGCAGC GGCGGCGGCG GCAGCGAGAT CGTGCTGACC 420
CAGAGCCCCG CCACCCTGAG CCTGAGCCCC GGCGAGCGCG CCACCCTGAG CTGCCGCGCC 480
AGCCAGAGCG TGAGCAGCTA CCTGGCCTGG TTCCAGCAGA AGCCCGGCCA GGCCCCCCGC 540
CTGCTGATCT ACGACGCCAG CAACCGCGCC ACCGGCATCC CCGCCCGCTT CAGCGGCAGC 600
GGCAGCGGCA CCGACTTCAC CCTGACCATC AGCAGCCTGG AGCCCGAGGA CTTCGCCGTG 660
TACTACTGCC AGCAGCGCAG CAACTGGCTG ATGTACACCT TCGGCCAGGG CACCAAGCTG 720
GAGATCAAGA CCACCACCCC CGCCCCCCGC CCCCCCACCC CCGCCCCCAC CATCGCCAGC 780
CAGCCCCTGA GCCTGCGCCC CGAGGCCTGC CGCCCCGCCG CCGGCGGCGC CGTGCACACC 840
CGCGGCCTGG ACTTCGCCTG CGACATCTAC ATCTGGGCCC CCCTGGCCGG CACCTGCGGC 900
GTGCTGCTGC TGAGCCTGGT GATCACCCTG TACTGCAAGC GCGGCCGCAA GAAGCTGCTG 960
TACATCTTCA AGCAGCCCTT CATGCGCCCC GTGCAGACCA CCCAGGAGGA GGACGGCTGC 1020
AGCTGCCGCT TCCCCGAGGA GGAGGAGGGC GGCTGCGAGC TGCGCGTGAA GTTCAGCCGC 1080
AGCGCCGACG CCCCCGCCTA CAAGCAGGGC CAGAACCAGC TGTACAACGA GCTGAACCTG 1140
GGCCGCCGCG AGGAGTACGA CGTGCTGGAC AAGCGCCGCG GCCGCGACCC CGAGATGGGC 1200
GGCAAGCCCC GCCGCAAGAA CCCCCAGGAG GGCCTGTACA ACGAGCTGCA GAAGGACAAG 1260
ATGGCCGAGG CCTACAGCGA GATCGGCATG AAGGGCGAGC GCCGCCGCGG CAAGGGCCAC 1320
GACGGCCTGT ACCAGGGCCT GAGCACCGCC ACCAAGGACA CCTACGACGC CCTGCACATG 1380
CAGGCCCTGC CCCCCCGCTA A 1401

Claims (6)

1.一种靶向表达PSMA表面抗原的细胞的嵌合抗原受体，其特征在于：包含PSMA结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域，所述PMSA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述细胞内信号结构域由CD28、4-1BB和CD3组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜结构域为CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种核酸分子，其特征在于：包含能够编码权利要求1所述的嵌合抗原受体，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种载体，其特征在于：其含有权利要求3所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求3所述的核酸分子或权利要求4的载体。
6.一种组合物，其特征在于：其含有权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、以及可接受的载体或赋形剂。
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