JP5778147B2 - 遺伝子導入方法 - Google Patents

Description

本発明は、レトロウイルスベクターによる標的細胞への外来遺伝子の導入方法に関する。

近年、重篤な遺伝子病や癌等の治療のための遺伝子治療法の開発が進められている。これまでにヒトでの臨床応用が研究されてきた遺伝子治療法の多くは、組換えレトロウイルスベクターを用いた細胞への遺伝子導入によるものである。レトロウイルスベクターは、標的細胞の染色体ＤＮＡ中に目的の外来遺伝子を安定に組み込むことが可能である。従って、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入は、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。

レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入の効率は、フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６〔ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）〕のようなレトロウイルスに結合する細胞接着性物質の使用により向上することが報告されている（例えば特許文献１）。また、レトロウイルスベクターを含む溶液を前記ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）でコートした容器に加え、一定時間インキュベートしてウイルスベクターのみをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）上に結合させ、さらに感染阻害物質を含む上清を除去した後、標的細胞を加える方法（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ Ｂｏｕｎｄ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ法；ＲＢＶ法）により、遺伝子導入効率がさらに向上することが報告されている（特許文献２、非特許文献１）。

ＲＢＶ法におけるＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）へのウイルスベクターの結合は、遠心力を利用することにより増強できる（遠心ＲＢＶ法）。しかしながら遠心ＲＢＶ法は、遠心力に耐えうる容器や遠心操作を行うための高価な装置が必要なうえ、操作も多工程となる。また、多量の細胞への遺伝子導入が求められる場合に処理容量のスケールアップが困難であるという問題もある。

国際公開第９５／２６２００号パンフレット 国際公開第００／０１８３６号パンフレット

ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１３０巻、第３３１〜３３４頁（２００１年）

本発明の目的は、簡便でかつ効果的な、レトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入方法を提供することにある。

すなわち本発明は、
［１］レトロウイルスベクターによる標的細胞への外来遺伝子の導入方法であって、工程（ａ）：レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合された培養容器を得る工程、及び工程（ｂ）：工程（ａ）により得られた培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程、を含む方法、
［２］工程（ａ）におけるインキュベーション時間が５時間超〜４８時間である、［１］に記載の方法、
［３］工程（ａ）におけるインキュベーションが、振とうを伴うインキュベーションである、［１］に記載の方法、
［４］［１］に記載の遺伝子の導入方法であって、工程（ａ）：レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合された培養容器を得る工程、工程（ｂ１）：工程（ａ）により得られた培養容器を洗浄する工程、及び工程（ｂ２）：工程（ｂ１）で洗浄された培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程、を含む方法、
［５］レトロウイルス結合性物質が、フィブロネクチン、繊維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、及びこれらのフラグメントから選択された少なくとも１種である、［１］に記載の方法、
［６］レトロウイルス結合性物質が、細胞結合性を併せ持つ物質である、［１］に記載の方法、
［７］レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器が、レトロウイルス結合性物質及び細胞結合性物質が固定化された培養容器である、［１］に記載の方法、並びに
［８］細胞結合性物質が、細胞接着性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物、及び代謝物から選択された少なくとも１種である、［７］に記載の方法、
に関する。

本発明により、簡便でかつ効果的な遺伝子導入方法が提供される。

本発明の遺伝子の導入方法は、工程（ａ）「レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合された培養容器を得る工程」、及び工程（ｂ）「工程（ａ）により得られた培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程」を含む。

本明細書においてレトロウイルスとは、ゲノムがＲＮＡで構成され、感染した細胞内で当該ＲＮＡをＤＮＡに変換する生活環を有するレトロウイルス科に属するＲＮＡウイルスの総称を示し、オンコレトロウイルス及びレンチウイルスを含む。オンコレトロウイルスとしては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）が挙げられる。また、レンチウイルスとしては、例えばヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）やサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。

本明細書においてレトロウイルスベクターとは、レトロウイルスに属するオンコレトロウイルス、レンチウイルス等を基に遺伝子組み換え技術により作製されたウイルス粒子を示し、オンコレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、あるいはこれらのシュードタイプベクターを含む。オンコレトロウイルスベクターとしては、例えばＭＭＬＶに基づくベクター等が挙げられる。また、レンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ−１に基づくベクターやＳＩＶに基づくベクター等が挙げられる。シュードタイプベクターとは、Ｇａｇタンパク質やＰｏｌタンパク質とは由来を異にするＥｎｖタンパク質を有する組換えレトロウイルスベクターのことを言う。シュードタイプベクターとしては、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４、マウス白血病ウイルス（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ−ｅｎｖ、ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ−ｅｎｖ、１０Ａ１−ｅｎｖ等）等のＥｎｖタンパク質を有するオンコレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターが例示される。本発明には、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適に使用される。該ベクターは、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳類動物細胞のような宿主細胞に感染し、その染色体ＤＮＡ中にベクターに搭載された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。

工程（ａ）「レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合した培養容器を得る工程」に使用されるレトロウイルスベクターを含有する液体に限定はなく、例えばレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞の培養液上清が例示される。工程（ａ）において、レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、これを凍結して一定期間保存してもよい。この場合、凍結保存したレトロウイルスベクターを含有する液体が入った培養容器は、そのまま２５℃未満の温度で４時間以上のインキュベートに供することができる。すなわち、解凍のための追加の工程を特に必要としない。この場合、工程（ａ）におけるインキュベーションは振とうを伴ったインキュベーションとすることが望ましい。一般的なレトロウイルスベクターの産生方法としては、あらかじめｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子等のレトロウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子が染色体上に組み込まれたレトロウイルスパッケージング細胞に、外来遺伝子とパッケージングシグナルを搭載したトランスファーベクターを導入することによって産生させる方法、及びレトロウイルスの構造タンパク質を有さない細胞に、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子やｅｎｖ遺伝子等のレトロウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子を有するパッケージングプラスミドと同時に、前記のトランスファーベクターをトランスフェクションして産生させる方法が挙げられる。

標的細胞に導入する外来遺伝子は、適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、組換えレトロウイルスベクター内に搭載して使用することができる。また、効率のよい外来遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列、イントロン配列がベクター内に存在していてもよい。標的細胞内に導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。

レトロウイルスベクターに搭載される外来遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の対象となる疾患に関連している酵素やタンパク質をコードするものの他、細胞内抗体（例えば、国際公開第９４／０２６１０号パンフレット参照）、Ｔ細胞レセプター遺伝子、増殖因子、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ、リボザイム、フォルスプライマー（例えば、国際公開第９０／１３６４１号パンフレット参照）等をコードするものを使用することができる。例えば、配列特異的ＲＮＡ分解酵素であるＭａｚＦを発現する遺伝子を外来遺伝子としてＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することにより抗ＨＩＶ効果を示すＣＤ４陽性Ｔ細胞を取得することができる（例えば、国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット及び国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレット）。さらに、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子を細胞に導入して該薬剤に対する感受性を付与することもできる。

本発明に使用されるレトロウイルスベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性や蛍光によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子、細胞表面に局在する細胞表面マーカー遺伝子等が利用できる。マーカー遺伝子としてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いる場合、遺伝子導入された細胞はＧ４１８に対する耐性を指標として確認し、単離、精製することができる。また、細胞表面マーカー遺伝子としてＬｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＮＧＦＲ）の細胞外ドメインをコードする遺伝子を用いる場合、抗ＬＮＧＦＲ抗体を利用することにより遺伝子導入された細胞を単離、精製することができる。

本発明に使用できるレトロウイルスベクターとしては、例えば、ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５４）、α−ＳＧＣベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５５）、ＬＸＳＮベクター［バイオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第７巻、第９８０〜９９０頁（１９８９年）］、タカラバイオ社製のＤＯＮ−５、ＤＯＮ−ＡＩ−２、ＭＥＩ−５レトロウイルスベクターやｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶレンチウイルスベクター、クロンテック社製のＲｅｔｒｏ−Ｘ Ｑベクターシリーズ、Ｌｅｎｔｉ−Ｘベクターシリーズ等のベクターがある。

また、これらのベクターは、公知のパッケージング細胞株、例えば、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４２）やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４１）、［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８年）］に記載のψＣＲＩＰ等の細胞株を使用することにより、調製することができる。また、組換えウイルスの構造タンパクを発現するパッケージングプラスミドとレトロウイルスベクタープラスミドを２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）やＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラバイオ社製）等に一過性にトランスフェクションを行い、その培養上清を回収することによっても調製することができる。

パッケージング細胞にトランスファーベクターを導入して作製されたウイルス産生細胞や標的細胞の培養には、公知の培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコブ改変ダルベッコ培地等が使用でき、これらは、例えば、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社から市販品として入手することができる。これらの培地には、遺伝子導入の標的となる細胞の種類やその他の目的に応じて種々の成分を添加して用いることができる。例えば、標的細胞の生育や分化を促進、あるいは抑制する目的で血清や各種のサイトカイン類、還元剤を添加して使用することができる。血清としては、例えば、仔牛血清（ＣＳ）や牛胎児血清（ＦＣＳ）、ヒト血清等を使用することができ、これらに換えて血清代替物（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）や精製された血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）を使用することもできる。また、サイトカインとしては、インターロイキン類（ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６等）、コロニー刺激因子類（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチンや種々の細胞増殖因子等があり、その多くのものについてヒト由来のものが市販されている。これらのサイトカイン類を使用するにあたっては、目的に応じた作用を有するものを選択し、また必要に応じてこれらを組み合わせて使用すればよい。また、ウイルス回収時に標的細胞の培養に適した培地に置換しても良い。例えば、標的細胞がヒトリンパ球の場合、リンパ球の培養に好適なＧＴ−Ｔ５０３培地、ＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地、ＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩＩＩ培地（いずれもタカラバイオ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ社製）やＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン社製）を用いることができる。

酪酸ナトリウムをウイルス産生細胞の培養時に添加することにより、上清中に産生されるウイルス粒子が増加することが知られているが［ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第６巻、第１１９５〜１２０２頁（１９９５年）］、本発明の遺伝子導入方法には、こうして調製された高いタイターのウイルス上清も問題なく使用することができる。

工程（ａ）に使用されるレトロウイルスベクターを含有する液体のウイルスタイターとしては、本発明を特に限定するものではないが、１０^７コピー／ｍＬ以上が例示され、１０^８〜１０^１２コピー／ｍＬがより好適に例示され、１０^９〜１０^１２コピー／ｍＬが更により好適に例示される。なお、上記に示すウイルスタイターはタカラバイオ社製のＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｓｅｔ（ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いて測定したＲＮＡコピー数を元に算出したウイルスタイターである。これをウイルスの感染性を示す生物学的力価で示すと、ウイルスタイターは上記数値の１／１０^２〜１／１０^３となる。

本発明に使用されるレトロウイルス結合性物質は、レトロウイルスに結合親和性を示す物質であれば特に限定はなく、例えば、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、及びこれらのフラグメントから選択された少なくとも一種の物質が例示される。これらの物質を化学的に修飾することにより、そのウイルスへの結合性を増強することも可能である（例えば特許文献２）。

また、上記のレトロウイルス結合性物質として、細胞結合性を併せ持つものを使用するか、あるいはレトロウイルス結合性物質を細胞結合性物質と組み合わせて使用してもよい。細胞結合性物質としては、細胞への結合親和性を示す物質であれば特に限定はなく、例えば、細胞接着性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物及び代謝物等から選択された物質を使用することができる。標的細胞に特異的に結合する抗体は、特定の細胞に特異的に遺伝子を導入するうえで有用である。本発明に使用できる抗体としては特に限定はなく、遺伝子を導入しようとする標的細胞で発現されている抗原に対する抗体を適宜選択し、使用することができる。標的細胞に発現しているＣＤ抗原を認識する抗体を使用すれば、標的細胞に高い特異性で遺伝子を導入することができる。例えば、抗ＣＤ４抗体を使用した場合にはヘルパーＴ細胞に、抗ＣＤ８抗体を使用した場合にはキラーＴ細胞に、また抗ＣＤ３４抗体を使用した場合には造血幹細胞に、それぞれ遺伝子導入を方向づけることができる。抗体は公知の方法によって作製することができる。現在では多くの抗体が市販されており、これらを使用することもできる。これらの抗体は細胞特異性等の所望の性質を有しているものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよい。また、公知技術により修飾された抗体や抗体の誘導体、例えば、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、一本鎖抗体等を使用してもよい。

また、細胞結合性物質として細胞接着活性を有するタンパク質（フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン等）や細胞結合ドメインを含むそのフラグメント、種々の糖タンパク質やその糖鎖（例えば高マンノース型のＮ−結合型糖鎖）を使用することもできる。さらに、上記の細胞結合性物質をレトロウイルス結合性物質に結合させたものは遺伝子導入に好適に使用できる。

上記のような物質は天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、組換えＤＮＡ技術や化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。また、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載のように、これらの物質を使用して遺伝子導入を実施する場合には、レトロウイルス結合部位を有する物質と細胞結合部位を有する他の物質とを混合して使用するか、あるいはレトロウイルス結合部位と細胞結合部位とを同一分子上に有する物質を使用することができる。なお、これらの物質としては、これらが天然において共存している他のタンパク質を実質的に含有していないものが使用される。

フィブロネクチンやそのフラグメントは、レトロウイルス結合性と細胞結合性とを併せ持つ物質として好適である。フィブロネクチンやそのフラグメントは、例えば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第２５６巻、第７２７７頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．）、第１０２巻、第４４９頁（１９８６年）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー、第１０５巻、第４８９頁（１９８７年）に記載の方法によって、天然起源の材料から実質的に純粋な形態で製造することができる。また、米国特許第５，１９８，４２３号に記載の方法により、組換えＤＮＡ技術を利用して製造することもできる。特に、レトロウイルス結合部位であるヘパリン−ＩＩ領域を含むフィブロネクチンフラグメント、例えば、フィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、及びＣＨ−２７１等の組換えポリペプチド、ならびにこれらを取得する方法は、米国特許第５，１９８，４２３号に詳細に記載されている。なお、上記のフィブロネクチンフラグメントのうちＨ−２９６はＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドを、ＣＨ−２７１はＶＬＡ−５への結合領域ペプチドを、また、ＣＨ−２９６はその両方を有している［ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、第８７６〜８８２頁（１９９６年）］。ＣＨ−２９６はレトロネクチン、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎの登録商標名で市販されている。

本発明に使用される培養容器に特に限定はなく、細胞培養用バッグ、細胞培養用プレート、細胞培養用シャーレ、細胞培養用試験管、及び細胞培養用フラスコが例示される。培養容器の素材にも特に限定はなく、例えばプラスチック製又はガラス製の培養容器を本発明に使用できる。多量の細胞への遺伝子導入が望まれる場合には、細胞培養用バッグ、特にガス透過性の細胞培養用バッグが本発明に好適である。レトロウイルス結合性物質を培養容器の内面に固定化する場合、本発明を特に限定するものではないが、培養容器の素材としては、ポリスチレン、ポリエチレン、シクロオレフィン樹脂、フッ素樹脂が例示される。

レトロウイルス結合性物質の培養容器への固定化の方法は、物質の種類や使用する培養容器の種類によって適宜選択することができる。例えばレトロウイルス結合性物質がポリペプチドの場合は、培養容器表面への物理吸着により固定化することができる。また、架橋剤等を使用した共有結合によって、レトロウイルス結合性物質を培養容器に固定化してもよい。

工程（ａ）におけるインキュベーションの温度条件としては、２５℃未満であれば特に限定はないが、２０℃未満が例示され、１８℃未満が好適に例示され、１℃〜１８℃がより好適に例示され、１℃〜１０℃がさらにより好適に例示される。インキュベーションの時間としては４時間以上であれば特に限定はないが、導入効率の点で、５時間超〜７２時間が例示され、５時間越〜４８時間が好適に例示され、６時間〜４８時間がより好適に例示され、８時間〜４８時間がさらにより好適に例示され、１２時間〜４８時間がさらにより一層好適に例示される。インキュベーションの時間は、例えば、４０時間以下、３５時間以下、３０時間以下、２５時間以下、２０時間以下、または１８時間以下である。また、インキュベーションの時間は、例えば、４時間以上、６時間以上、８時間以上、１２時間以上、１６時間以上、１８時間以上、２０時間以上、または２４時間以上である。工程（ａ）においてインキュベーションするウイルス液の量は、例えば、０．５mＬ〜１０００ｍＬである。

また、インキュベーションは静置状態で行ってもよいが、振とうを伴ってインキュベートすることによって、レトロウイルスベクターの培養容器への結合効率をより高いものとすることができる。振とうは、例えば培養容器を平面上で横揺れ（往復）もしくは回転させる方法、培養容器に傾斜を与えるシーソー様の揺動、これらの組合せ等で行うことができる。このような振とうを実施するための各種の装置が市販されている。振とうの条件は、使用する培養容器の形状や大きさに応じて培養容器内でレトロウイルスベクターを含有する液体が動くような条件であれば特に本発明を限定するものではないが、例えば傾斜角９度のシーソー様の揺動による振とうの場合、２０ｒｐｍ〜７５ｒｐｍが好適に例示され、３０ｒｐｍ〜７０ｒｐｍがより好適に例示され、３０ｒｐｍ〜６５ｒｐｍがさらにより好適に例示される。振とうの傾斜角は、本発明を特に限定するものではないが、０度〜１５度の範囲で適宜調整すればよい。また、横揺れによる振とうの場合、振とう速度は、例えば３０ｒｐｍ〜３００ｒｐｍ、好ましくは３５ｒｐｍ〜２８０ｒｐｍ、より好ましくは４０ｒｐｍ〜２６０ｒｐｍが例示される。

培養容器として細胞培養用バッグを用い、振とうを伴ったインキュベートにより工程（ａ）を実施する場合、バッグに注入するウイルス液の容量は、バッグを振とうした際のウイルス液の可動性等を考慮して適宜決定することができる。細胞培養用バッグに注入するウイルス液の容量は、例えば、５ｍＬ〜１０００ｍＬ、好適には５０ｍＬ〜７００ｍＬ、より好適には１００ｍＬ〜５００ｍＬである。例えば、振とうした際に溶液の可動性が高い細胞培養用バッグを用いる場合には、バッグの容量に応じた適当量のウイルス液をバッグに注入すれば、バッグを振とうした際のウイルス液の十分な可動性を確保できる。また、振とうした際に溶液の可動性が低い細胞培養用バッグを用いる場合には、実施例６に記載のとおり、ウイルス液と共に無菌の空気をバッグに注入することによって、バッグを振とうした際のウイルス液の可動性を高め、プレローディング効率を向上させることができる。注入するウイルス液と無菌の空気の体積の比率は、例えば、３：１〜２：１である。なお、本発明の遺伝子導入方法は、実施例９に示すとおり、細胞培養用バッグを用いたラージスケールでの遺伝子導入においても高効率な遺伝子導入を実現できることから、大量の遺伝子導入細胞の調製に適している。

本発明を特に限定するものではないが、例えば、培養容器として実施例９に記載のような培養面積が約２００ｃｍ^２以上のラージスケールバッグ用い、振とうを伴ったインキュベートにより工程（ａ）を実施する場合は、傾斜角が０度の横揺れ振とうであれば振とう速度は３０〜７０ｒｐｍ、傾斜角３〜５度（特に４度）のシーソー型振とうであれば振とう速度は２５〜４５ｒｐｍで、いずれも１℃〜１０℃の範囲でインキュベーションを行うことが好ましい。また、インキュベーション時間は８〜２０時間が好ましい。

細胞培養用バッグを用いて本発明を実施した場合、バッグの内面全体にレトロウイルスベクターが結合する。バッグの内面同士を接触させるような操作は結合したレトロウイルスベクターを脱離させる可能性があり、避けた方が良い。例えば、硬質の板状物の間に挟んでバッグを保持することにより、前記のようなレトロウイルスベクターの脱離を回避することができる。

後述の実施例２のように、インキュベーションの終了後、レトロウイルスベクターを含有する液体を新鮮なレトロウイルスベクターを含有する液体に置換し、さらに再度インキュベートを行ってもよい。また、インキュベーションの終了後、レトロウイルスベクターを含有する液体に新鮮なレトロウイルスベクターを含有する液体を添加し、さらに再度インキュベートを行ってもよい。工程（ａ）を実施した後、後述の工程（ｂ１）「工程（ａ）により得られた培養容器を洗浄する工程」を行った後、工程（ａ）を再度繰り返してもよい。こうすることによって、遺伝子導入効率をさらに向上させることができる。

なお、後述の実施例１０に示される通り、工程（ａ）のインキュベーションの終了後に培養容器内の液体を回収すると、感染力を維持したレトロウイルスベクターが残存している。この回収液を本発明の遺伝子導入方法に再利用することができる。回収したレトロウイルスベクターを含有する液体をそのまま、若しくは未使用のレトロウイルスベクターを含有する液体と混合して本発明の遺伝子導入方法に使用すれば、ウイルス使用量を低減することができるため、経済的である。

レトロウイルスベクターの培養容器への結合の効率は、例えば本発明の方法により最終的に得られた細胞のうち遺伝子が導入されたものの割合（遺伝子導入効率）や前記細胞におけるプロウイルスのコピー数を測定することにより確認することができる。遺伝子導入効率の測定は公知の方法で行うことができる。例えば細胞に導入する外来遺伝子としてＺｓＧｒｅｅｎ等の蛍光タンパク質をコードするマーカー遺伝子を使用した場合には、当該遺伝子が導入された細胞数をフローサイトメーターで計測することにより遺伝子導入効率を測定できる。また、外来遺伝子として細胞表面に発現される遺伝子産物をコードする遺伝子を用いる場合には、当該遺伝子産物に特異的に結合する標識抗体を利用すれば、上記と同様にフローサイトメーターを用いた遺伝子導入効率の計測を行うことができる。

工程（ｂ）「工程（ａ）により得られた培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程」により、標的細胞にレトロウイルスベクターが感染し、外来遺伝子が導入された細胞を効率良く得ることができる。インキュベーションは、細胞へのレトロウイルスベクターの感染に用いられる通常の方法、例えば、標的細胞に適した培地中、３５℃〜４０℃（例えば、３７℃）、炭酸ガス濃度２〜１０％（例えば、５％）の条件でのインキュベーションによって行うことができる。この条件やインキュベーションの時間は標的細胞や目的に応じて適宜変更できる。例えば、インキュベーションの時間は、４時間〜９６時間である。培養容器として細胞培養用バッグを用いる場合には、工程（ａ）によりバッグ内面の上下両面にレトロウイルスベクターを結合させておき、工程（ｂ）において標的細胞を入れて一定時間インキュベートした後にバッグの上下を反転させ、さらに一定時間インキュベートすることにより、バッグ両面での標的細胞へのレトロウイルスベクターの感染を促し、遺伝子導入効率をさらに向上させることもできる。

レトロウイルスベクターとしてオンコレトロウイルスに基づくベクターを用いる場合、Ｇ_０期の細胞に対しては染色体ＤＮＡへの外来遺伝子の導入を行うことができない。従って、このような場合には、適当な標的細胞増殖因子による予備刺激によって標的細胞を細胞周期に誘導することが好ましい。例えば、骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行う場合の予備刺激には、各種のサイトカイン、例えばインターロイキン−３、インターロイキン−６や幹細胞因子等が使用できる。レンチウイルスベクターを使用する場合には、予備刺激は必ずしも必要ではない。

細胞へのレトロウイルスの感染には、細胞表面に存在するレセプターが関与していることが知られている。例えば、塩基性アミノ酸トランスポーター、リン酸トランスポーターは、それぞれエコトロピックウイルス、アンフォトロピックウイルスのレセプターとして機能することが知られている［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ、第９３巻、第１１４０７〜１１４１３頁（１９９６年）］。これらのトランスポーターの発現や代謝回転を活発にさせるために、塩基性アミノ酸、リン酸、またはこれらの塩もしくは前駆体を低減させた培地中で標的細胞を前処理することによって、当該細胞をウイルスに感染し易い状態とすることができる。

本発明の方法による遺伝子導入の標的となる細胞も特に制限はない。例えば、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞等）、造血細胞、単核細胞（末梢血単核細胞、臍帯血単核細胞等）、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞等を使用することができる。血液や骨髄より得られる造血系の細胞は入手が比較的容易であり、またその培養や維持の手法が確立されていることから、本発明の方法を利用するのに好適である。特に導入された遺伝子の生体内での長期にわたる発現が目的の場合には、多能性を有する幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞等）や種々の前駆細胞が標的細胞として適している。また、遺伝子治療法をＡＩＤＳの治療に適用する場合には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞等の免疫系細胞やその前駆細胞が標的細胞として好適である。

例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を標的細胞とした遺伝子治療法は以下のような操作によって実施することができる。まず、ドナーよりＣＤ４陽性Ｔ細胞を含有する材料、例えば、骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これらの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能であるが、通常は、密度勾配遠心分離等の方法により単核細胞画分を調製する。さらにＣＤ４分子を指標とした細胞の精製、ＣＤ８陽性Ｔ細胞および／または単球の除去、ならびにＣＤ４陽性Ｔ細胞数を拡大する培養操作を行ってもよい。これらの細胞集団について、必要に応じて適当な予備刺激（例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、またはＩＬ−２による刺激）を行った後、本発明の方法により目的とする遺伝子が搭載された組換えレトロウイルスベクターを感染させる。こうして得られた遺伝子導入された細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能である。

造血幹細胞を標的とした遺伝子治療法としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療法がこれにあたる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがある。

また、癌の遺伝子治療法としては、腫瘍抗原を認識するＴ細胞レセプターをコードする遺伝子を導入することにより、リンパ球に当該抗原を発現する癌細胞に対する特異的な細胞傷害活性を付与する方法が研究されている［ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１５巻、第６９５〜６９９頁（２００８年）］。さらに、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶが感染するＣＤ４陽性Ｔ細胞等のＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（一本鎖特異的エンドリボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、リボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている（例えば、国際公開第２００７／０２０８７３号パンフレット、ヒューマン・ジーン・セラピー、第２２巻、第３５〜４３頁（２０１１年））。

工程（ｂ）において、レトロウイルスベクター溶液中に遺伝子導入や細胞培養に好ましくない物質が含まれている場合には、細胞を入れる前に、「レトロウイルスベクターが結合された培養容器を洗浄する工程」を施し、遺伝子導入や細胞培養に好ましくない物質を除去しても良い。すなわち、工程（ａ）「レトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合された培養容器を得る工程」、工程（ｂ１）「工程（ａ）により得られた培養容器を洗浄する工程」、及び工程（ｂ２）「工程（ｂ１）で洗浄された培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程」を含む遺伝子導入方法も、本発明の一態様である。

工程（ｂ１）「レトロウイルスベクターが結合された培養容器を洗浄する工程」には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水やハンクスの生理食塩水の他、標的細胞の培養に使用する液体培地等を使用することができる。さらにこれらの溶液に適宜ヒト血清アルブミン等を添加することもできる。この工程により、遺伝子導入に好ましくない物質を除去することができる。本工程により除去される物質としては、例えば、ウイルス上清に含まれているパッケージング細胞由来のレトロウイルス感染阻害物質［ヒューマン・ジーン・セラピー、第８巻、第１４５９〜１４６７頁（１９９７年）、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．）第７０巻、第６４６８〜６４７３頁（１９９６年）］や、レトロウイルス産生細胞の培養時にレトロウイルスの産生の促進を目的として添加される物質、例えば、ホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＴＰＡ）やデキサメサゾン［ジーン・セラピー、第２巻、第５４７〜５５１頁（１９９５年）］の他、細胞の老廃物や前記の酪酸ナトリウム等が挙げられる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 各種ウイルスプレローディング法によるＳｕｐＴ１細胞への遺伝子導入

（１）ＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎレトロウイルスベクターの調製
ｐＺｓＧｒｅｅｎ Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）を制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎをコードする配列を含む約０．７ｋｂｐのフラグメントを回収した。回収したフラグメントをＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端平滑化後、ｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（タカラバイオ社製）に挿入し、組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎを取得した。次に、当該プラスミドとＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉｔ Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）を用いてエコトロピックＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルスを作製した。その後、これをＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３に感染させた。感染細胞から高力価のウイルス産生細胞をクローニングしてレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎを樹立した。さらに当該産生細胞を用いて、５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含有する培地で常法によりＧａＬＶ／ＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎウイルス液を取得した（以下、ＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎレトロウイルスベクターと称す）。なお、取得したウイルス液のＲＮＡタイターは１．８８×１０^１０コピー／ｍＬであった。

（２）ＳｕｐＴ１細胞へのＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子導入
表面未処理２４ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に１ウェルあたり５００μＬの２０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（商品名レトロネクチン；タカラバイオ社製）を添加して４℃で一晩放置した後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。本明細書の実施例では、このプレートをＣＨ−２９６コートプレートとし、必要に応じて作製した。

実施例１−（１）で調製したＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎレトロウイルスベクターをＲＰＭＩ培地にて６０倍に希釈し、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ添加した。プレローディング（ＲＢＶ法におけるレトロウイルスベクターの培養容器への結合）中のプレートの振とう条件は、プレローディング中にプレートを振とうしない（静置した）もの、３５ｒｐｍで傾斜角９度のシーソー型の振とう機（Ｍｉｌｄ Ｍｉｘｅｒ， ＳＩ−３６（ＴＡＩＴＥＣ社製））による振とうを行ったもの、及び１００ｒｐｍでの傾斜０度、振とう幅３ｃｍの横揺れによる振とう機（Ｐｅｒｓｏｎａｌ１０ ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ ＰＥＲＳＯＮＡＬ、ＴＡＩＴＥＣ社製）による振とうを行ったものの３種類について検討した。プレローディングは、これらの各振とう条件について、４℃〜３７℃のインキュベーション温度、及び２時間〜２４時間のインキュベーション時間で実施した。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１ウェルあたり１ｍＬずつ使用して各ウェルを洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含む培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＳｕｐＴ１細胞（ＡＴＣ ＣＣＲＬ−１９４２）を懸濁し、前述のウイルスをプレロードしたウェルに１ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養してレトロウイルス感染（レトロウイルスベクターによる遺伝子導入）を行った。培養開始から１日目（培養１日目）に細胞懸濁液を新たな表面未処理２４ウェルプレートに移した後、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含む培地を１ウェルあたり４ｍＬずつ添加し、細胞懸濁液を５倍希釈した。この細胞懸濁液について、培養３日目まで培養を継続した。

（３）遺伝子導入効率の解析
実施例１−（２）で得られた培養３日目の細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、遺伝子導入効率としてＺｓＧｒｅｅｎ陽性率を算出した。その結果を表１に示す。

表１に示されるように、４℃もしくは１６℃で４時間以上プレローディングすることにより、高い遺伝子導入効率が示された。特に４℃もしくは１６℃で６時間以上の振とうによるプレローディングを行うことにより、高い導入効率が示された。一方、３７℃については４時間のプレローディング時間で最も導入効率が高く、それ以降は時間が長くなるに従って導入効率は著しく低下した。さらに振とうの速度に関しては１００ｒｐｍでの横揺れにおいて高い導入効率が示された。

実施例２ ４℃振とうプレローディング法の繰り返しによるＳｕｐＴ１細胞への遺伝子導入
（１）実施例１−（１）で調製したＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎレトロウイルスベクターをＲＰＭＩ培地にて３０倍に希釈し、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ添加した。プレローディング中のプレートは、１００ｒｐｍで傾斜０度の横揺れによる振とうに供した。インキュベーション時間は、２４時間行ったもの（２４時間試験区）、及びプレローディングの繰り返しによる効果を調べるため、１６時間後に新鮮なウイルス液１ｍＬに置換し、さらに８時間のインキュベーション行ったもの（１６＋８時間試験区）の２試験区について試験した。インキュベーション温度は、いずれの試験も４℃で実施した。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１ウェルあたり１ｍＬずつ使用して各ウェルを洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含む培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＳｕｐＴ１細胞を懸濁し、前述のウイルスをプレロードしたウェルに１ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養してレトロウイルス感染を行った。培養開始から１日目（培養１日目）に０．４ｍＬの細胞懸濁液を新たな表面未処理２４ウェルプレートに移した後、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含む培地を１ウェルあたり１．６ｍＬずつ添加し、細胞懸濁液を５倍希釈した。この細胞懸濁液について、培養３日目まで培養を継続した。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例２−（１）で得られた培養３日目の細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、遺伝子導入効率としてＺｓＧｒｅｅｎ陽性率を算出した。その結果を表２に示す。

表２に示されるように、４℃振とう条件下でプレローディングを繰り返すことにより、１回のプレローディングより高い遺伝子導入効率が示され、プレローディングを繰り返すことによるＣＨ−２９６がコートされた容器上へのレトロウイルスベクターの濃縮効果が示された。

実施例３ 細胞培養用バッグを用いた各種閉鎖系プレローディング法によるＳｕｐＴ１細胞への遺伝子導入
（１）培養面積６０ｃｍ^２の培養バッグＣｕｌｔｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｓｐｉｎ（タカラバイオ社製）に２０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を１０ｍＬ注入して４℃で一晩以上放置した後、１５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。このバッグをＣＨ−２９６コートバッグとし、以下の実験に使用した。

実施例１−（１）で調製したＤＯＮ−ＺｓＧｒｅｅｎレトロウイルスベクターをＲＰＭＩ培地にて３０倍及び６０倍に希釈し、ＣＨ−２９６コートバッグに３０ｍＬずつ注入した。プレローディング中のＣＨ−２９６コートバッグの振とう条件は、プレローディング中にバッグを振とうしない（静置した）もの、及び１００ｒｐｍでの傾斜０度の横揺れによる振とうを行ったものについて検討した。プレローディングは、これらの各振とう条件について、４℃のインキュベーション温度、２０時間のインキュベーション時間で実施した。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１バッグあたり１５ｍＬずつ使用して各バッグを洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含む培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＳｕｐＴ１細胞を懸濁し、前述のウイルスをプレロードしたバッグに３０ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で３日間培養してレトロウイルス感染を行った。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例３−（１）で得られた培養３日目の細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、遺伝子導入効率としてＺｓＧｒｅｅｎ陽性率を算出した。その結果を表３に示す。

表３に示されるように、４℃振とう条件下でプレローディングすることにより、３７℃４時間のプレローディングと比較して高い遺伝子導入効率が示された。この結果は、実施例１の表１の２４ウェルプレートを培養容器として用いた試験と同等の結果であることから、本発明の方法では、処理容量の３０倍ものスケールアップを容易に行えることが示された。

実施例４ 各種ウイルスプレローディング法によるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団への遺伝子導入
（１）ＬＮＧＦＲ及びＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製
ＬＮＧＦＲ及びＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製は国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレットの実施例１及び２と同様の方法で行った。すなわち、ＨＩＶ ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入され、かつヒトＬｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒの細胞外ドメインをコードする遺伝子がヒトＰＧＫプロモーターの下流に順方向に挿入された組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２を取得し、当該プラスミドを用いてエコトロピックＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルスを作製した後、これをＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３に感染させ、高力価のウイルス産生細胞をクローニングしてレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２を樹立した。さらに当該産生細胞を用いて、５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含有する培地で常法によりＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液を取得した。なお、取得したウイルス液のＲＮＡタイターは６．６×１０^９コピー／ｍＬであった。

（２）ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団の調製
インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナーＴＫ１９及びＴＫ２９から常法に従い調製したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、Ｂｕｆｆｅｒ１と称す）を用いて１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、Ｂｕｆｆｅｒ１で洗浄したＣＤ８ポジティブセレクションビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−４５０ ＣＤ８：インビトロジェン社製）をＰＢＭＣ１×１０^７ｃｅｌｌｓあたり２×１０^７ビーズとなるように添加した。ローテーターを用いて４℃で３０分間緩やかに攪拌したのち、ビーズを含む細胞懸濁液を磁気分離装置ＭＰＣ−１５（Ｄｙｎａｌ社製）上に２〜３分静置してビーズ非結合細胞を回収した（以下、ＣＤ８除去細胞集団と記載）。回収したＣＤ８除去細胞集団を５００×ｇで５分間遠心したのち、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（ロンザ社製）を基礎とするリンパ球培養用培地（以下、Ｘ−ＶＩＶＯ１５ＣＭと称する）を用いて、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。

（３）実施例４−（２）で調製した細胞集団への遺伝子導入及び拡大培養
（３）−１ レトロウイルスベクターのプレローディング
ウイルスベクターのプレローディングは４℃、１９時間の振とう区、３７℃、４時間の振とう区、及び３２℃、３時間の遠心区の３種の方法で行った。すなわち、ＣＨ−２９６コートプレートに実施例２−（１）で調製したＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液を１ウェルあたり１ｍＬずつ添加し、４℃、１９時間の振とう、３７℃、４時間の振とう、もしくは３２℃、２０００×ｇ、３時間の遠心により、レトロウイルスベクターのプレローディングを行った。振とう条件は、シーソー型の振とう機であるＭｉｌｄ Ｍｉｘｅｒ， ＳＩ−３６を用いて傾斜角度は９度、振とう速度は３５ｒｐｍで行った。その後、上清を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１ウェルあたり１ｍＬずつ使用して各ウェルを洗浄した。こうして作製したプレローディングプレートは、使用するまで４℃で保存した。

（３）−２ 培養開始
実施例４−（２）で調製したＣＤ８除去細胞集団を底面積２５ｃｍ^２細胞培養用フラスコ（コーニング社製）に１０ｍＬ添加した。細胞数に対して３倍量のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（インビトロジェン社製）を遠心管に分注後、Ｘ−ＶＩＶＯ１５で洗浄し、上記細胞を含むフラスコに添加し、フラスコを立てて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内での培養を開始した（培養０日目）。

（３）−３ 遺伝子導入
培養３日目に細胞を遠心管に回収し、５００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した後、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを加えて懸濁した。実施例３−（３）−１で作製したプレローディングプレートから上清を除去した後、上記細胞懸濁液を１ウェルあたり１ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートして細胞へのレトロウイルス感染を行った。なお、非感染区では、プレローディングプレートの代わりにＣＨ−２９６コートプレートを用いる以外は上記と同様の操作を行った。

（３）−４ 拡大培養
培養４日目に実施例４−（３）−３でレトロウイルス感染を行った細胞を遠心管に回収し、５００×ｇで５分間遠心して上清を除去し、２ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭに懸濁して２倍希釈培養した。さらに培養５日目にＨｕｍａｎ ＡＢ Ｓｅｒｕｍ（ロンザ社製）を終濃度５％となるように添加したＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを加えて、５倍希釈培養を培養７日目まで行った。

（４）遺伝子導入効率の解析
実施例４−（３）で得られた培養７日目の細胞を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ここに抗体反応液として、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、遺伝子導入効率として、各々の細胞集団のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞中のＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。その結果を表４に示す。

その結果、いずれのドナーにおいても４℃、１９時間の振とう区の遺伝子導入率が最も高く、３２℃、３時間の遠心区よりもはるかに高効率であることが明らかになった。

実施例５ 振とうウイルスプレローディング法によるＣＤ４陽性Ｔ細胞集団への遺伝子導入
（１）レトロウイルスベクターの調製
実施例４−（１）に記載のレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２を用いて、５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含有する培地もしくは含有しない培地で常法によりＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液を取得した。なお、取得したウイルス液のＲＮＡタイターを下記表５に示す。

（２）ＣＤ８除去細胞集団の調製
実施例４−（２）と同様の方法で、インフォームド・コンセントの得られた健常人ドナーＴＫ１９からＣＤ８除去細胞集団を調製し、Ｘ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを用いて、５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。

（３）実施例５−（２）で調製した細胞集団への遺伝子導入及び拡大培養
（３）−１ レトロウイルスベクターのプレローディング
ウイルスベクターのプレローディングは４℃、３０時間振とうすることにより行った。すなわち、実施例１−（２）と同様の方法で得られたＣＨ−２９６コートプレートに実施例５−（１）で調製した酪酸ナトリウム含有もしくは非含有のＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ−ＰＬ２ウイルス液を１ウェルあたり０．７ｍＬずつ添加し、４℃、３０時間の振とうによりレトロウイルスベクターのプレローディングを行った。振とうは、シーソー型の振とう機であるＭｉｌｄ Ｍｉｘｅｒ， ＳＩ−３６を用いて傾斜角度は９度、振とう速度は３５ｒｐｍで行った。プレローディング後は、上記ウイルス液を除去し１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１ウェルあたり１ｍＬずつ使用して各ウェルを洗浄する区（ウイルス洗浄区）と、ウイルス液を除去しない区（ウイルス非洗浄区）を設定した。こうして作製したプレローディングプレートは、使用するまで４℃で保存した。

（３）−２ 培養開始
実施例５−（２）で調製したＣＤ８除去細胞集団を底面積２５ｃｍ^２細胞培養用フラスコ（コーニング社製）に１２ｍＬ添加した。細胞数に対して３倍量のＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（インビトロジェン社製）をＸ−ＶＩＶＯ１５で洗浄した後、上記細胞を含むフラスコに添加し、フラスコを立てて３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内での培養を開始した（培養０日目）。

（３）−３ 遺伝子導入
培養３日目に細胞を遠心管に回収し、５００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した後、７．１４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを加えて懸濁した。実施例５−（３）−１で作製したプレローディングプレートから、ウイルス洗浄区については上清を除去した後、上記細胞懸濁液を１ウェルあたり０．７ｍＬずつ添加後、さらに１ウェルあたり０．３ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを添加した（最終密度５×１０^５／ウェル）。ウイルス非洗浄区については、各ウイルス液の入ったウェルに上記細胞懸濁液を１ウェルあたり０．７ｍＬずつ添加した（最終密度５×１０^５／ウェル）。これらのプレートを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートして細胞へのレトロウイルス感染を行った（感染１回目）。

さらに培養４日目に細胞を遠心管に回収し、５００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した後、各細胞を０．７ｍＬのＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭに懸濁し、培養３日目と同様にレトロウイルス感染を行った（感染２回目）。

（３）−４ 拡大培養
培養５日目にＨｕｍａｎ ＡＢ Ｓｅｒｕｍ（ロンザ社製）を終濃度５％となるように添加したＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを加えて、５倍希釈培養を培養７日目まで行った。さらに培養７日目にＨｕｍａｎ ＡＢ Ｓｅｒｕｍ（ロンザ社製）を終濃度５％となるように添加したＸ−ＶＩＶＯ１５ＣＭを加えて、４倍希釈培養を培養１０日目まで行った。なお、非感染区では、プレローディングプレートの代わりにＣＨ−２９６コートプレートを用いる以外は上記の実施例５−（３）−２〜実施例５−（３）−４と同様の操作を行った。各試験区の拡大培養率を表６に示す。

以上より、酪酸ナトリウム添加ウイルス液を用いた場合、ウイルス液の洗浄を行わないと細胞増殖が阻害されることが示された。一方、酪酸ナトリウム無添加ウイルス液を用いた場合は、ウイルス液の洗浄を行わなくとも非感染区と比較して同等の拡大培養率が示された。

（４）遺伝子導入効率の解析
実施例５−（３）で得られた培養１０日目の細胞を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ここに抗体反応液として、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、及びＡＰＣ‐Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を含む抗体液を添加し、抗体反応を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、遺伝子導入効率として、各々の細胞集団のＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞中のＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。その結果を表７に示す。

その結果、酪酸ナトリウム添加ウイルス液を用いてウイルスプレローディングを行い、ウイルス液の洗浄を行った区が最も遺伝子導入効率が高いことが示された。また酪酸ナトリウム無添加ウイルスを用いた場合は、酪酸ナトリウム添加ウイルスを用いた場合よりは劣るものの、同等レベルの遺伝子導入を実施できることが示された。

実施例６ 細胞培養用バッグを用いた閉鎖系プレローディング法によるＳｕｐＴ１細胞への遺伝子導入
（１）ＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製
ＭａｚＦ遺伝子搭載レトロウイルスベクターの調製は国際公開第２００８／１３３１３７号パンフレットの実施例１および２と同様の方法で行った。すなわち、ＨＩＶ ＬＴＲ−ＭａｚＦカセットがレトロウイルスベクターゲノムの転写とは逆方向に挿入された組換えレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＴ−ＭＦＲ３を取得し、当該プラスミドを用いてエコトロピックＭＴ−ＭＦＲ３ウイルスを作製した後、これをＧａＬＶレトロウイルスパッケージング細胞ＰＧ１３に感染させ、高力価のウイルス産生細胞をクローニングしてレトロウイルスベクター産生細胞株ＰＧ１３／ＭＴ−ＭＦＲ３を樹立した。さらに、５ｍＭ 酪酸ナトリウムを含有するＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地（タカラバイオ株式会社製）にて上記のレトロウイルス産生細胞を３２℃で２４時間培養して得られた培養上清を採取し、ＧａＬＶ／ＭＴ−ＭＦＲ３ウイルス液を取得した。なお、取得したウイルス液のＲＮＡタイターは１．４×１０^１０コピー／ｍＬであった。

（２）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
ＯｒｉＧｅｎ社のガス透過性培養バッグＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３０に、１バッグあたり９ｍＬの２０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を添加して４℃で一晩放置した後、１５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。このバッグをＣＨ−２９６コートバッグとし、以下の実験に使用した。

実施例６−（１）で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて２倍に希釈した。プレローディング条件は、ＣＨ−２９６コートバッグに希釈後のウイルス液を２５ｍＬ注入した後に振とうを１６時間、または２４時間行ったもの、ＣＨ−２９６コートバッグに２５ｍＬのウイルスベクターと１０ｍＬの無菌の空気を注入した後に振とうを１６時間行ったもの、の３種類について検討した。振とうは、傾斜０度、振とう幅２．５ｃｍの横揺れ振とう機（ＭＭＳ−３０１０：東京理化器械社製）を用いて、１００ｒｐｍの振とう速度で行った。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１バッグあたり１５ｍＬ使用してバッグを洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたバッグに２５ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。次に、各試験区の細胞を懸濁し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５倍希釈した後、さらに２日間培養した。

（３）遺伝子導入効率の解析
実施例６−（２）で得られた細胞１×１０^６個相当より、ＦａｓｔＰｕｒｅ（登録商標） ＤＮＡ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、Ｐｒｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ， Ｈｕｍａｎ （ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）（タカラバイオ社製）を用いて導入コピー数の測定を行った。結果を下記表８に示す。

ＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３０の素材は他のバッグに比べて硬質である。当該バッグにウイルス液のみ注入して密封した場合の振とう時の内容液の動きは小さいが、ウイルス液と空気をバッグ内に注入した場合には内容液の動きが大きくなった。また、表８に示されるように、密封された細胞培養用バッグにウイルス液と共に空気を注入することにより、プレローディングの効率が向上することが示された。

実施例７ インキュベーション時間の検討（プレート感染）
（１）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
実施例６−（１）と同様の方法で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて２倍希釈し、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ添加した。プレローディング条件は、ＣＨ−２９６コートプレートに希釈後のウイルス液を１ｍＬ注入した後に振とうを１２、１６、２４、４８または７２時間行ったものについて検討した。振とうは、傾斜０度、振とう幅２．５ｃｍの横揺れ振とう機（ＭＭＳ−３０１０：東京理化器械社製）を用いて、１００ｒｐｍの振とう速度で行った。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳを１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたプレートに１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。次に、各試験区の細胞を懸濁し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５倍希釈した後、さらに２日間培養した。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例７−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表９に示す。

その結果、ＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルスベクターによる遺伝子導入効率はインキュベーション時間が１６時間の時が最も高く、インキュベーション時間が１２〜４８時間までは１コピー／細胞以上の導入効率が実現できた。

実施例８ インキュベーション時間の検討（スモールスケールバッグ感染）
（１）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
実施例６−（１）と同様の方法で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて４倍希釈し、ＯｒｉＧｅｎ社のガス透過性培養バッグＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３０を用いて実施例６−（２）と同様に調製したＣＨ−２９６コートバッグに２５ｍＬずつ注入し、さらにバッグ中に１０ｍＬの無菌の空気を注入してインキュベーションを行った。また、コントロールとしてＣＨ−２９６コートプレートに上記の４倍希釈したレトロウイルス液を１ウェルあたり１ｍＬずつ添加してインキュベーションを行った。プレローディング条件は、ＰＬ３０については振とうを１２、１６もしくは２４時間、プレートについては１６時間のみ行ったものについて検討した。振とうは、傾斜０度、振とう幅２．５ｃｍの横揺れ振とう機を用い、１００ｒｐｍの振とう速度で行った。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳをバッグあたり１５ｍＬ、プレートについては１ウェルあたり０．５ｍＬ注入して洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたバッグに２５ｍＬずつ、プレートについては１ウェルあたり１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で８時間培養した（総細胞数１×１０^７細胞／ＰＬ３０バッグ）。次に、各試験区の細胞を懸濁し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて４倍希釈した後、さらに３日間培養した。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例８−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表１０に示す。

その結果、ＰＬ３０バッグを用いた場合でも、いずれの試験区も十分な遺伝子導入効率が示され、さらにインキュベーション時間が２４時間の時はプレートよりも高い遺伝子導入効率が示された。

実施例９ ラージスケールバッグ感染の検討
（１）ラージスケールバッグでの溶液可動性試験
ＯｒｉＧｅｎ社のガス透過性培養バッグＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３２５（培養面積３６２．６ｃｍ^２）に１８０ｍＬの１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を注入し、傾斜０度、５０ｒｐｍの空気を入れない横揺れ振とう、傾斜４度、３５ｒｐｍの空気を入れないシーソー型振とうを行った。その結果、ＰＬ３２５を用いた場合は、バッグ中に空気を入れなくてもバッグ端部まで十分な可動性が得られていることを確認した。

（２）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
ＰＬ３２５に、１バッグあたり６５ｍＬの２０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を添加して４℃で一晩放置した後、１０８ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。このバッグをＣＨ−２９６コートバッグとし、以下の実験に使用した。

実施例６−（１）で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて４倍希釈してウイルス希釈液を調製し、ＣＨ−２９６コートバッグに１８０ｍＬずつ、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり１ｍＬずつ添加した。プレローディング条件は、ＰＬ３２５バッグについては、傾斜０度、５０ｒｐｍの空気を入れない横揺れ振とう、傾斜４度、３５ｒｐｍの空気を入れないシーソー型振とうの２条件を実施した。プレートについては、傾斜０度、１００ｒｐｍの横揺れ振とうを行った。インキュベーション時間は、いずれも１６時間行った。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳをバッグあたり１０８ｍＬ、プレート１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたバッグに１８０ｍＬずつ、プレートに１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で８時間培養した（総細胞数７．２×１０^７細胞／バッグ）。

８時間後、プレート試験区については、表面未処理２４ウェルプレートにて細胞を１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて４倍希釈してさらに３日間培養を行った。ＰＬ３２５バッグ試験区については、１．５ｍＬをサンプリングし、表面未処理２４ウェルプレートにてプレート試験区と同様に４倍希釈してさらに３日間培養を行った。サンプリング後のバッグは、上下を反転させて５％ＣＯ_２インキュベータ内でさらに３日間培養することで、感染から８時間目までとは異なるバッグ面での感染を行った。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例９−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表１１に示す。

その結果、ＰＬ３２５のラージスケールバッグを用いた場合でも、横揺れやシーソー型の振とうを伴うプレローディングにより、遺伝子導入効率は２４ウェルプレートと同程度の十分な遺伝子導入効率が示され、さらに感染途中でバッグを反転させることでプレートよりも高い遺伝子導入効率が示された。これにより、本発明の遺伝子導入方法は、ラージスケールバッグを用いた大量の細胞への遺伝子導入に極めて適していることが示された。

実施例１０ ウイルス液再利用試験
（１）ウイルス液のプレローディング１（使用済ウイルス液の回収）
ＰＬ３２５バッグに、１バッグあたり６５ｍＬの２０μｇ／ｍＬのＣＨ−２９６を添加して４℃で一晩放置した後、１００ｍＬのＡＣＤ−Ａで２回洗浄した。このバッグをＣＨ−２９６コートバッグとした。

実施例６−（１）と同様の方法で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液原液を、ＣＨ−２９６コートバッグに１８０ｍＬ添加した。プレローディング条件は、傾斜０度、５０ｒｐｍの空気を入れない横揺れ振とうを実施した。インキュベーション温度は４℃、インキュベーション時間は１６時間とした。インキュベーションの終了後ウイルス液を回収し、使用済ウイルス液とした。

（２）ウイルス液のプレローディング２
使用済ウイルス液を用いた場合の感染効率を調べるため、実施例１−（２）と同様の方法で得られたＣＨ２９６コートプレートにウイルス液を１ウェルあたり１ｍＬずつ添加した。ウイルス液は、実施例１０−（１）で使用したウイルス液原液と同ロットのウイルス液原液（Ｎｅｗ Ｖｉｒｕｓ）、使用済ウイルス液（Ｕｓｅｄ Ｖｉｒｕｓ）、Ｎｅｗ ＶｉｒｕｓをＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩで２倍希釈したもの（Ｎｅｗ Ｖｉｒｕｓ＋ＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ）およびＮｅｗ ＶｉｒｕｓをＵｓｅｄ Ｖｉｒｕｓで希釈したもの（Ｎｅｗ Ｖｉｒｕｓ＋Ｒｅｕｓｅ Ｖｉｒｕｓ）の計４種類を用いた。その後、傾斜０度、振とう幅２．５ｃｍの横揺れ振とう機（ＭＭＳ−３０１０：東京理化器械社製）を用いて、１００ｒｐｍの振とう速度で４℃にて１６．５時間の振とうを行った。インキュベーション終了後、ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含む生理食塩水を１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して洗浄した。

（３）細胞への遺伝子導入
１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたプレートに１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で２４時間培養した。次に、各試験区の細胞を懸濁し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５倍希釈した後、さらに２日間培養した。

（４）遺伝子導入効率の解析
実施例１０−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表１０に示す。

その結果、４℃条件下で１６．５時間のプレローディングを行った後の使用済ウイルス液は、未使用のウイルス液の２倍希釈と同等の力価を有していることが示された。本実施例により、本発明の遺伝子導入方法における低温でのウイルスプレロードで使用したウイルス液は、再利用に適していることが明らかになった。

実施例１１ インキュベーション時間の検討１（ラージスケールバッグ感染）
（１）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
実施例６−（１）と同様の方法で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて４倍希釈してウイルス希釈液を調製し、ＯｒｉＧｅｎ社のガス透過性培養バッグＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３２５を用いて実施例９−（２）と同様の方法で調製したＣＨ−２９６コートバッグに１８０ｍＬずつ、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり０．５ｍＬずつ添加した。プレローディング条件は、ＰＬ３２５バッグについては、傾斜０度、５０ｒｐｍの空気を入れない横揺れ振とうを実施した。プレートについては、傾斜０度、１００ｒｐｍの横揺れ振とうを行った。インキュベーション時間は、ＰＬ３２５については１６、２４もしくは４８時間とし、プレートについては１６時間とした。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳをバッグあたり１０８ｍＬ、プレート１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたバッグに１８０ｍＬずつ、プレートに１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した（総細胞数７．２×１０^７細胞／バッグ）。８時間後、バッグ試験区についてはバッグを反転させて、引き続き３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した。

翌日、プレート試験区については、表面未処理２４ウェルプレートにて細胞を１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５倍希釈してさらに２日間培養を行った。ＰＬ３２５バッグ試験区については、１．５ｍＬをサンプリングし、表面未処理２４ウェルプレートにてプレート試験区と同様に５倍希釈してさらに２日間培養を行った。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例１１−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表１３に示す。

その結果、ＰＬ３２５のラージスケールバッグを用いた場合、いずれの試験区においてもプレートと比較してより高い遺伝子導入効率が示され、さらにインキュベーション時間は今回の試験区では１６時間が最も効果的であった。

実施例１２ インキュベーション時間の検討２（ラージスケールバッグ感染）
（１）ＳｕｐＴ１細胞へのＭａｚＦ遺伝子導入
実施例６−（１）と同様の方法で調製したＭＴ−ＭＦＲ３レトロウイルス液をＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩ培地にて４倍希釈してウイルス希釈液を調製し、ＯｒｉＧｅｎ社のガス透過性培養バッグＰｅｒｍａＬｉｆｅ ＰＬ３２５を用いて実施例９−（２）と同様の方法で調製したＣＨ−２９６コートバッグに１８０ｍＬずつ、ＣＨ−２９６コートプレートに１ウェルあたり０．５ｍＬずつ添加した。プレローディング条件は、ＰＬ３２５バッグについては、傾斜０度、５０ｒｐｍの空気を入れない横揺れ振とうを実施した。プレートについては、傾斜０度、１００ｒｐｍの横揺れ振とうを行った。インキュベーション時間は、ＰＬ３２５については８、１２、１６もしくは２０時間とし、プレートについては１６時間とした。インキュベーションの終了後ウイルス液を除去し、１．５％ＨＳＡを含むＰＢＳをバッグあたり１０８ｍＬ、プレート１ウェルあたり０．５ｍＬ添加して洗浄した。次に１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製したＳｕｐＴ１細胞懸濁液を、前述のウイルスをプレロードしたバッグに１８０ｍＬずつ、プレートに１ｍＬずつ注入し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した（総細胞数７．２×１０^７細胞／バッグ）。２時間後、バッグ試験区についてはバッグを反転させて、引き続き３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で培養した。

翌日、プレート試験区については、表面未処理２４ウェルプレートにて細胞を１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて５倍希釈してさらに３日間培養を行った。ＰＬ３２５バッグ試験区については、１．５ｍＬをサンプリングし、表面未処理２４ウェルプレートにてプレート試験区と同様に５倍希釈してさらに３日間培養を行った。

（２）遺伝子導入効率の解析
実施例１２−（１）で得られた細胞１×１０^６個相当より、実施例６−（３）と同様の方法で導入コピー数の測定を行った。結果を下記表１４に示す。

その結果、ＰＬ３２５のラージスケールバッグを用いた場合、いずれの試験区においてもプレートと比較してより高い遺伝子導入効率が示され、さらにインキュベーション時間は今回の試験区では１２時間と１６時間が効果的であることが示された。

本発明により、簡便でかつ高効率な遺伝子導入方法が提供される。本発明は、特に医学、細胞工学、遺伝子工学、及び発生工学等の分野において有用である。

Claims (7)

1. レトロウイルスベクターによる標的細胞への外来遺伝子の導入方法であって、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法：
   （ａ）レトロウイルス結合性物質が固定化された細胞培養用バッグに、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で８時間〜４８時間、振とうを伴ったインキュベーションを行い、レトロウイルスベクターが結合された細胞培養用バッグを得る工程；
   （ｂ）工程（ａ）により得られた細胞培養用バッグに標的細胞を入れ、インキュベートする工程；
   （ｃ）細胞培養用バッグの上下を反転させる工程；及び
   （ｄ）上下を反転させた細胞培養用バッグをインキュベートする工程。
2. 細胞培養用バッグが培養面積２００ｃｍ ^２ 以上の細胞培養用バッグである、請求項１に記載の外来遺伝子の導入方法。
3. 請求項１又は２に記載の外来遺伝子の導入方法であって、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法：
   （ａ）レトロウイルス結合性物質が固定化された細胞培養用バッグに、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で８時間〜４８時間、振とうを伴ったインキュベーションを行い、レトロウイルスベクターが結合された細胞培養用バッグを得る工程；
   （ｂ１）工程（ａ）により得られた細胞培養用バッグを洗浄する工程；
   （ｂ２）工程（ｂ１）で洗浄された細胞培養用バッグに標的細胞を入れ、インキュベートする工程；
   （ｃ）細胞培養用バッグの上下を反転させる工程；及び
   （ｄ）上下を反転させた細胞培養用バッグをインキュベートする工程。
4. レトロウイルス結合性物質が、フィブロネクチン、繊維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、及びこれらのフラグメントから選択された少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. レトロウイルス結合性物質が、細胞結合性を併せ持つ物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. レトロウイルス結合性物質が固定化された細胞培養用バッグが、レトロウイルス結合性物質及び細胞結合性物質が固定化された細胞培養用バッグである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. 細胞結合性物質が、細胞接着性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、及び炭水化物から選択された少なくとも１種である、請求項６に記載の方法。