CN112662625B

CN112662625B - 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法

Info

Publication number: CN112662625B
Application number: CN202110061155.6A
Authority: CN
Inventors: 杨翅春; 林晓杰; 鲁哲然
Original assignee: Individual
Current assignee: Cao Tong
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112662625A

Abstract

本发明公开了一种T细胞的培养基及其用于T细胞的扩增培养方法，其特征在于，包括，T细胞培养基，所述T细胞培养基包括无血清培养基、IL‑2、IL‑21、IL‑15和OKT‑3以及人血浆；本发明不需要使用胎牛血清，可以避免外源血型带来的风险；不需要使用流式细胞仪或免疫磁珠技术进行分选纯化；扩增效率高，9天能获得高纯度T细胞，CD3+的纯度不低于90％。

Description

一种T细胞培养基及其用于T细胞的扩增培养方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，尤其是涉及一种T细胞的培养基及其用于T细胞的扩增培养方法。

背景技术

T淋巴细胞，简称T细胞，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞，在免疫反应中扮演着重要的角色，可识别和靶向处理感染了病原体的细胞或癌症细胞，以将其清除。T细胞来源于骨髓的造血干细胞，其前体被运送至胸腺中分化、发育成熟后，通过淋巴和血液循环而分布到全身的免疫器官和组织中发挥免疫功能。T细胞产生的免疫应答形式主要有两种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。T细胞按其功能可分为四个亚群：辅助CD4+ T细胞、调节CD4+T细胞、杀手CD8+T细胞、记忆T细胞。辅助T细胞在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。调节T细胞负责调节机体免疫反应，通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用，调节T细胞有很多种，目前研究最活跃的是CD25+ CD4+ T细胞。杀手CD8+ T细胞负责消灭受感染的细胞，这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭，细胞毒性T细胞的主要表面标志是CD8。记忆T细胞在再次免疫应答中起重要作用，但暂时还没有发现记忆T细胞表面存在非常特异的表面标志物。

利用生物工程改造的具有嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T技术)这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。

人体可天然产生T细胞，但数量较少。成功培育T细胞让将这种细胞大量注入患者体内，以增强免疫系统成为一种可能。检索相关专利，发现之前有一些相近的培养方法，比如：中国专利申请号CN103013914A“体外培养杀伤性t细胞的方法”公开了一种利用IL-2和抗CD3单克隆抗体联合大青叶水煎剂协同刺激取离体血液的淋巴细胞并将其诱导为具有细胞毒活性的T细胞的方法。该方法需要处理大青叶干药材，需要在冷水浸泡20～30分钟，3次水煎混合液浓缩至约lg/mL，离心取上清液照射灭菌，过程复杂麻烦，而且不易操作。

中国专利申请号CN102433303A“用于T淋巴细胞的体外培养方法”中，公开了一种T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增等步骤，该方法需要用CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子包被细胞培养瓶，包被需要几天的时间，不但耗时，而且还需要用到冷冻包被的仪器。因此，进一步研究一种耗时短、成本低、容易制备的体外T细胞扩增的培养基和培养方法十分必要。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种培养周期短、扩增效率高的T细胞的培养基及其用于T细胞扩增培养中的方法。

本发明的第一个目的，提供一种T细胞培养基，包括，

T细胞培养基；

所述培养基包括无血清培养基、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3以及人自体血浆；

优选的，所述无血清培养基为康宁KBM581淋巴细胞无血清培养基。

优选的，所述培养基中，IL-2的浓度为100-2500U/mL。

优选的，所述培养基中，IL-2的浓度为400U/mL。

优选的，所述培养基中，IL-21的浓度为5-15ng/mL、IL-15的浓度为1-10ng/mL、OKT-3的浓度为1-10ng/mL。

优选的，IL-21的浓度为10ng/mL、IL-15的浓度为5ng/mL、OKT-3的浓度为5ng/mL。

优选的，所述培养基中，所述人血浆的体积分数为5-15％。

优选的，所述培养基中，所述人血浆的体积分数为10％。

本发明的第二个目的，提供一种T细胞扩增培养的方法，包括如下步骤，

步骤1：从人脐血中分离出脐血单个核细胞；

步骤2：将步骤1所得到的脐血单个核细胞接种到培养基上进行培养，接种密度为1×10⁶～2×10⁶个/mL；

步骤3：每2-3天添加入上述T细胞培养基，使细胞的密度维持在1×10⁶～2×10⁶个/mL；

步骤4：扩增到9-14天之后收集T细胞。

优选的，所述步骤2具体操作如下，

将脐血单个核细胞用上述T细胞培养基进行重悬，重悬后细胞的密度为1×10⁶个/mL，将细胞接种在低吸附培养瓶中，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

综上所述：本发明的方法，不需要使用胎牛血清，可以避免外源血型带来的风险；不需要使用流式细胞仪或免疫磁珠技术进行分选纯化；扩增效率高，9天能获得高纯度T细胞，CD3+的纯度不低于90％。

附图说明

图1为细胞数目增殖图线。

图2为利用细胞表面标记物CD3-FITC、CD8-PE、CD4-APC、CD56-PE-Cy7对培养出来的细胞进行流式检测的结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

一种T细胞的培养基，包括无血清培养基、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3以及人自体血浆，所述无血清培养基为康宁KBM581淋巴细胞无血清培养基，所述IL-2的浓度为100～2500U/mL之间，具体的，可以选择200U/mL，400U/mL，800U/mL，1500U/mL，2000U/mL，在本实施例中，IL-2的浓度为400U/mL，在其余实施例中，所述IL-2的浓度为可以200U/mL、400U/mL、800U/mL、1500U/mL、2000U/mL；

所述IL-21的浓度为5-15ng/mL，IL-15的浓度为1-10ng/mL，OKT-3的浓度为1-10ng/mL。在本实施例中，所述IL-21的浓度优选10ng/mL、IL-15的浓度优选5ng/mL、OKT-3的浓度优选5ng/mL。其中所述人自体血浆的体积为5-15％，在本实施例中，人自体血浆的体积的体积优选5-15％。

一种T细胞扩增培养的方法包括如下步骤，

步骤1：从人脐血中分离出脐血单个核细胞；

步骤2：将步骤1所得到的脐血单个核细胞接种到培养基上进行培养

步骤3：每2～3天添加培养基，使细胞的密度维持在1×10⁶～2×10⁶个/mL；

步骤4：扩增到9～14天之后收集T细胞。

所述步骤2的具体操作方式如下，将细胞接种在低吸附培养瓶中，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养之后，以2～3天为周期进行培养基换液。

下面结合实验情况对一种T细胞扩增培养的方法进行验证

(1)制备脐血单个核细胞

A.获得脐血50mL；

B.制备血浆：将脐血800g，离心10分钟，吸取上层血浆转至新的50mL离心管内，置于56℃水浴锅中灭活30分钟，然后在4℃冷却30分钟，然后1200g离心10分钟。取上层血清15～20mL左右，供培养细胞时使用。

C.吸取血浆后用生理盐水将的标本还原至30mL并充分混匀，缓慢加入在人淋巴细胞分离液Ficoll液面上，700g，室温离心20分钟。

D.离心完毕后吸弃上层上清，小心吸取脐血单个核细胞白膜层，移至两支50mL离心管中每管生理盐水50mL，每支分离管对应一个50mL离心管，并充分混匀，离心800g，10分钟。

E.弃上清，生理盐水重悬细胞并定容至50mL，此时已经获得了脐血单个核细胞，取样计数；同时取一部分样品进行流式检测，确定样本起始的T细胞的数目。

(2)扩增培养T细胞具体方法

如图1-2所示，取制备脐血单个核细胞中获得的脐血单个核细胞，以T细胞培养基进行重悬，重悬后细胞的密度为1×10⁶个/mL，取8mL细胞悬液接种在低吸附T25培养瓶中，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。每2～3天补充T细胞培养基，连续培养9天，每天记录细胞数量。

该实验中，细胞保持良好的增长态势，从第5天开始细胞生长进入快速生长阶段，培养至第9天。取细胞进行流式检测，发现CD3+细胞比例为93.8％，CD3+CD8+比例为70.35％，CD4+CD8+比例为29.73％，CD3-CD56+比例为1.61％，该结果表明扩增出来的细胞为T细胞，而不是NK细胞。对记录的细胞数量进行计算，计算细胞扩增培养效率，可以确定总细胞数增长了约46倍；由于接种时T细胞占比为20％，培养9天后，T细胞占比为93.8％，通过换算，确定T细胞的增长了约218倍。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种T细胞扩增培养方法，其特征在于，包括如下步骤，

步骤1：从人脐血中分离出脐血单个核细胞；

步骤2：将步骤1所得到的脐血单个核细胞用T细胞培养基进行重悬，重悬后细胞的密度为1×10⁶～2×10⁶个/mL，将细胞接种在低吸附培养瓶中，并置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；

步骤3：每2-3天添加T细胞培养基，使细胞的密度维持在1×10⁶～2×10⁶个/mL；

步骤4：扩增到9-14天之后收集T细胞；

所述T细胞培养基由康宁KBM581淋巴细胞无血清培养基、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3以及人自体血浆组成，其中IL-2的浓度为400U/mL、IL-21的浓度为10ng/mL、IL-15的浓度为5ng/mL、OKT-3的浓度为5ng/mL，人自体血浆的体积分数为5-15％。

2.根据权利要求1所述的T细胞扩增培养方法，其特征在于，所述T细胞培养基中人自体血浆的体积分数为10％。