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CN108251376A - 人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体t细胞扩增中的应用 - Google Patents

人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体t细胞扩增中的应用 Download PDF

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CN108251376A CN201711390193.6A CN201711390193A CN108251376A CN 108251376 A CN108251376 A CN 108251376A CN 201711390193 A CN201711390193 A CN 201711390193A CN 108251376 A CN108251376 A CN 108251376A
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Abstract

本发明涉及一种人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用，属于医疗技术领域。本发明以K562细胞为载体，通过慢病毒转染在细胞膜表面稳定表达 CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19，构建新型人工抗原递呈细CD137L CD86 CD64 mIL‑15 CD19‑K562 细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从外周血淋巴细胞中直接扩增CD19 CAR‑T细胞。流式细胞分选表明建立的aAPC表面分子标志构建完成。经构建的aAPC扩增的后的CD19 CAR‑T细胞增殖良好、纯度高、细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。

Description

人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩 增中的应用
技术领域
本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用。
背景技术
T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。但是，由于肿瘤细胞长期形成的免疫逃逸机制，能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击，肿瘤快速增殖。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者 T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体 T细胞(CAR-T细胞)疗法。近年来，CAR修饰T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。
尽管嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗具有良好的抗肿瘤效应和巨大的应用前景，但在体外经过重组的细胞毒性T淋巴细胞只是一个很小的群体，难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要在数量上保证重组细胞毒性T淋巴细胞的有效供给，因此，探索各种有效的细胞毒性T淋巴细胞体外扩增(Exvivo expansion)方法已成为嵌合抗原受体T细胞疗法的重要发展趋势。
应用人工抗原递呈细胞(artificial antigen presenting cell，aAPC)作为饲养细胞(feeder cell)进行细胞毒性T淋巴细胞体外扩增已成为细胞毒性T淋巴细胞扩增的一种重要方法。以往有研究者应用mIL21和CD137L转化的k562细胞进行T细胞扩增，这种方法可以获得较高细胞毒性的T细胞，但是细胞增殖受到限制，2周后细胞不再增殖。因此如何克服现有技术的不足是目前医疗技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用。本发明方法构建的抗原递呈细胞，其表面携带CD137L、C D86、CD64、mIL-15和CD19这5个表面分子，有效的在体外扩增得到CD19特异性表达的 T细胞，并在后期能良好的增殖，有较强的肿瘤杀伤效应，为生物治疗提供了新的方法学和物质基础。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种人工抗原递呈细胞，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15CD1 9-aAPC，其细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19。
进一步，优选的是，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562细胞。
本发明还提供上述人工抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别构建包含CD137L、CD86、CD64、mIL-15、CD19的慢病毒表达载体；
(2)将包含CD137L慢病毒表达载体转染相应的细胞，挑单细胞克隆，流式细胞分选，获得CD137L稳定表达的细胞CD137L-aAPC；
(3)在步骤(2)获得的CD137L-aAPC基础上通过包含CD86慢病毒表达载体转染来导入CD86，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86-aAPC；
(4)在步骤(3)获得的CD137L CD86-aAPC基础上通过包含CD64慢病毒表达载体转染来导入CD64，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64-aAPC；
(5)在步骤(4)获得的CD137L CD86 CD64-aAPC基础上通过包含mIL-15慢病毒表达载体转染来导入mIL-15，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC；
(6)在步骤(5)获得的CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC基础上通过包含CD19 慢病毒转染表达载体来导入CD19，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 C D64 mIL-15 CD19-aAPC。
进一步，优选的是，步骤(2)中所述的相应的细胞为K562细胞，但不限于此。
本发明同时提供人工抗原递呈细胞在CD19-CAR T细胞扩增中的应用。
另外，本发明提供一种CD19-CAR T细胞扩增方法，利用上述人工抗原递呈细胞进行扩增，包括以下步骤：
(1)制备人外周血单核淋巴细胞，细胞浓度为106cells/ml；
(2)按照1×106cells/ml将人外周血单核淋巴细胞种在培养板中，放于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h，得到细胞悬液；其中，培养板中的培养基为含体积百分浓度为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基；
(3)向预热至37℃的lonza核转染试剂中加入PB-19CAR-puro至终浓度为0.1ug/ul和Super PiggyBac Transposase至终浓度为0.05ug/ul，混合均匀，之后向其中以体积比为1:1比例加入步骤(2)孵育得到的细胞悬液，得到混合液；
(4)用lonza电转仪的U-014程序对步骤(3)得到的混合液进行电转，再以体积比为2:1比例加入预热至37℃的含体积百分浓度为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，接着将细胞转移到培养板中在37℃温箱中孵育2小时；
(5)孵育完成后将细胞转移到离心管中，离心，弃上清，再用含体积百分浓度为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞制备成浓度为106cells/ml的细胞悬液并放于培养板中，置于37℃温箱中过夜，得到电转化CAR-T细胞；
(6)次日将CD137L CD86 CD64 mIL-15CD19-aAPC细胞用100Gy进行辐照；将辐照后的CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞以数量比为1:2的比例加入到步骤(5)得到的电转化CAR-T细胞中，再加入IL-21至终浓度为30ng/ml和IL-2至终浓度为 300IU/ml；在培养第7天、14天、28天，再次以细胞数量比为1:2比例将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞重复刺激CD19 CAR-T细胞，同时加入30ng/ml的IL-21 和300IU/ml的IL-2；连续培养至28天以获得足够量的CD19-CAR-T细胞。
进一步，优选的是，步骤(2)中所采用的培养基为预热的培养基，预热温度为37℃。
进一步，优选的是，步骤(5)所述的离心参数为140g，离心时间为8min。
本发明经feeder细胞刺激后的CAR-T细胞增殖良好、纯度高、细胞毒性强和明显的肿瘤细胞杀伤效应。具体是：经细胞膜稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15 (mIL-15)和CD19的人工抗原递呈细胞刺激后，从外周淋巴细胞中直接扩增后得到的CD1 9 CAR-T细胞，具有细胞增殖良好、纯度高、细胞毒性强和明显的肿瘤细胞杀伤效应。
扩增所获得的CD19-CAR T细胞与K562细胞、Raji细胞(淋巴瘤细胞系)共培养，用EuTDA细胞毒性试剂盒(货号AD0116)检测细胞毒性。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明建立一种高效和高细胞毒性的CAR-T淋巴细胞体外扩增方法，通过在细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、mIL-15和CD19，构建新型人工抗原递呈细胞CD137LCD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC，如CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562细胞，以此作为扩增的饲养细胞，直接扩增特异性的CD19 CAR-T细胞。经流式细胞分析、细胞毒性试验等表明所扩增的特异性T淋巴细胞纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。本发明提供的CD19 CAR-T细胞扩增方法简单、易于操作；扩增效率好，能以104数量级增长，且细胞状态良好；扩增持续时间长，能达到28天的扩增周期，肿瘤细胞杀伤效应明显(图28为可见CD19 CAR-T细胞对人类红白血病细胞系具有显著的杀伤作用。图29为可见CD19 CAR-T细胞对淋巴瘤细胞具有明显的杀伤作用)。
附图说明
图1为CD137L在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。对比图二CD137L同型对照可见表达且表达量较高。
图2为CD137L同型对照在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。
图3为CD86在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。对比图四CD86同型对照可见表达且表达量较高。
图4为CD86同型对照在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。
图5为CD64在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。对比图六CD64同型对照可见表达且表达量较高。
图6为CD64同型对照在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。
图7为mIL-15在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。对比图八mIL-15同型对照可见表达且表达量较高。
图8为mIL-15同型对照在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。
图9为CD19在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。对比图十CD19同型对照可见表达且表达量较高。
图10为CD19同型对照在CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞中的表达。
图11为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞刺激CD19 CA R-T细胞后第1天细胞增殖状态。
图12为无aAPC刺激的CD19 CAR-T细胞后第1天细胞增殖状态。
图13为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞刺激CD19 CA R-T细胞后第7天细胞增殖状态。
图14为无aAPC刺激的CD19 CAR-T细胞第7天细胞增殖状态。
图15为CD137L CD86 CD64mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞刺激的CAR-T 细胞第14天细胞增殖状态。
图16为无aAPC刺激的CD19 CAR-T细胞第14天细胞增殖状态。
图17为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞刺激的CAR-T 细胞第28天细胞增殖状态。
图18为无aAPC刺激的CD19 CAR-T细胞第28天细胞增殖状态。
图19为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562人工抗原递呈细胞所扩增CD19特异性CAR-T细胞的细胞数量(W代表扩增周数)。
图20为加入aAPC共培养CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD19-CAR的表达量。
图21为加入feeder细胞共培养CD19 CAR-T对照组细胞扩增28天后CD19-CAR的表达量。
图22为未加入aAPC的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD19-CAR的表达量。
图23为加入aAPC的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD62L、CD45RO的表达量。
图24为加入aAPC的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD62L、CD45RO的同型对照表达量。
图25为加入feeder细胞的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD62L、CD45RO的表达量。
图26为加入feeder细胞的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD62L、CD45RO的同型对照表达量。
图27为未加入aAPC的CD19 CAR-T细胞扩增28天后CD62L、CD45RO的表达量。
图28为人类红白血病细胞系(K562)细胞分别与feeder刺激后的CD19-CAR T细胞(圆形)、第14天刺激后CD19-CAR T细胞(正方形)、第21天刺激后的CD19-CAR T细胞(三角形)按照1:16、1:4、1:1共培养后检测EuTDA释放量。
图29为淋巴瘤细胞(Raji)分别与feeder刺激后的CD19-CAR T细胞(红色)、第1 4天刺激后CD19-CAR T细胞(绿色)、第21天刺激后的CD19-CAR T细胞(三角形)按照1:16、1:4、1:1共培养后检测EuTDA释放量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562的制备方法和 CD19 CAR-T细胞扩增方法的具体实施方式做详细说明。以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，如用其它类型的细胞721.221细胞等替代K562细胞，用其它方式实现CD86、CD64、mIL-15、CD19在细胞膜表面的表达，对扩增条件和程序进行改进，利用不同表面分子构建的人工抗原提呈细胞刺激不同CAR-T细胞等等，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数。
实施例1，人工抗原递呈细胞CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562的构建方法
1、用PCR方法得到目的序列片段
1)从含有CD137L基因的质粒克隆模板(上海吉玛制药技术有限公司保存)中，利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法钓取CD137L基因，利用全基因合成的方法得到CD86、CD64和mIL-15基因。
2)引物设计，目的基因上下游引物分别加上LV6载体上NotI和BamHI两侧同源序列，用于载体的亚克隆，CD137L、CD86、CD64和mIL-15基因引物序列分别如下： CD137L基因引物序列如表1所示。
表1
NM_003811.3 CEF agggttccaagcttaagcggccgcgccaccatggaatacgcctctgacgcttca SEQ ID NO.1
NM_003811.3 CER atcagtagagagtgtcggatccttattccgacctcggtgaaggga SEQ ID NO.2
CD64基因引物序列如表2所示。
表2
CD86基因引物序列如表3所示。
表3
m-IL15基因引物序列如表4所示。
表4
m-IL15-1 agggttccaagcttaagcggccgcgccaccatggccttaccagtgaccg SEQ ID NO.83
m-IL15-2 tggagcagcaaggccagcggcaggagcaaggcggtcactggtaaggccat SEQ ID NO.84
m-IL15-3 ctggccttgctgctccacgccgccaggccgaactgggtgaatgtaataag SEQ ID NO.85
m-IL15-4 ttgaataagatcttcaatttttttcaaatcacttattacattcacccagttcgg SEQ ID NO.86
m-IL15-5 tgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacg SEQ ID NO.87
m-IL15-6 actggggtgaacatcactttccgtatataaagtagcatcaatatgcataga SEQ ID NO.88
m-IL15-7 gaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttct SEQ ID NO.89
m-IL15-8 tcaagtgaaataacttgtaactccaagagaaagcacttcattgctgttac SEQ ID NO.90
m-IL15-9 ttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatga SEQ ID NO.91
m-IL15-10 tgctaggatgatcagattttctactgtatcatgaatacttgcatctccgg SEQ ID NO.92
m-IL15-11 agtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatggga SEQ ID NO.93
m-IL15-12 ttctttgcatccagattctgttacattcccattagaagacaaactgttgt SEQ ID NO.94
m-IL15-13 gtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatat SEQ ID NO.95
m-IL15-14 tatgtacaaaactctgcaaaaattctttaatatttttttcctccagttcctcac SEQ ID NO.96
m-IL15-15 taaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttc SEQ ID NO.97
m-IL15-16 tggtcgcggcgctggcgtcgtggtagaagtgttgatgaacatttggacaa SEQ ID NO.98
m-IL15-17 cagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctg SEQ ID NO.99
m-IL15-18 cccgccgctggccggcacgcctctgggcgcagggacaggggctgcgacgc SEQ ID NO.100
m-IL15-19 cggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctg SEQ ID NO.101
m-IL15-20 gtcccggccaagggcgcccagatgtagatatcacaggcgaagtccagccc SEQ ID NO.102
m-IL15-21 gcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcacct SEQ ID NO.103
m-IL15-22 atcagtagagagtgtcggatccttaggtgataaccagtgacagga SEQ ID NO.104
CD19基因引物序列如表5所示。
表5
NM-001178098.1-1 atgccacctcctcgcctcctcttcttcctcctcttcctcaccc SEQ ID NO.105
NM-001178098.1-2 agaggttcctcgggcctgacttccatgggggtgaggaagagga SEQ ID NO.106
NM-001178098.1-3 gcccgaggaacctctagtggtgaaggtggaagagggagataac SEQ ID NO.107
NM-001178098.1-4 aggtccccttgaggcactgcagcacagcgttatctccctcttc SEQ ID NO.108
NM-001178098.1-5 gcctcaaggggacctcagatggccccactcagcagctgacctg SEQ ID NO.109
NM-001178098.1-6 gaagggtttaagcggggactcccgagaccaggtcagctgctga SEQ ID NO.110
NM-001178098.1-7 ccgcttaaacccttcttaaaactcagcctggggctgccaggcc SEQ ID NO.111
NM-001178098.1-8 atggccaggggcctcatgaggattcccaggcctggcagcccca SEQ ID NO.112
NM-001178098.1-9 gaggcccctggccatctggcttttcatcttcaacgtctctcaa SEQ ID NO.113
NM-001178098.1-10 gctggcacaggtagaagccccccatctgttgagagacgttgaa SEQ ID NO.114
NM-001178098.1-11 tctacctgtgccagccggggcccccctctgagaaggcctggca SEQ ID NO.115
NM-001178098.1-12 gccctccacattgactgtccagccaggctgccaggccttctca SEQ ID NO.116
NM-001178098.1-13 gtcaatgtggagggcagcggggagctgttccggtggaatgttt SEQ ID NO.117
NM-001178098.1-14 aggccacagcccaggccacctaggtccgaaacattccaccgga SEQ ID NO.118
NM-001178098.1-15 cctgggctgtggcctgaagaacaggtcctcagagggccccagc SEQ ID NO.119
NM-001178098.1-16 tggggctcatgagcttcccggaaggggagctggggccctctga SEQ ID NO.120
NM-001178098.1-17 agctcatgagccccaagctgtatgtgtgggccaaagaccgccc SEQ ID NO.121
NM-001178098.1-18 acacggaggctctccctcccagatctcagggcggtctttggcc SEQ ID NO.122
NM-001178098.1-19 ggagagcctccgtgtctcccaccgagggacagcctgaaccaga SEQ ID NO.123
3)以上oligo由上海吉玛制药技术有限公司合成。
4)将引物溶解成50μM，将引物分别取相同体积至一1.5ml离心管，充分混匀，配成引物mix。
5)用配制好的oligo mix进行第一轮PCR反应，PCR体系如表5.
表5
循环条件如表6所示。
表6
6)用Forward primer和Reverse primer进行第二轮PCR反应，模板为第一轮PCR反应的产物。
PCR体系如表7所示。
表7
第一轮PCR产物 1μl
10×Pfu Buffer(添加Mg2+) 5μl
dNTP 1μl
forward primer(标号的尾数为单数标记) 1μl
reverse primer(标号的尾数为双数标记) 1μl
ddH2O 41μl
Pfu DNA polymerase 0.3μl
反应条件与第一轮相同。
7)聚合酶链式反应做完之后，利用Agarose琼脂糖电泳并切胶回收CD137L、CD86、CD64和mIL-15或CD19基因片段。
8)得到第一个基因片段后，利用相同的方法继续得到下一个基因片段，最后得到含有CD137L、CD86、CD64、mIL-15、CD19这5个基因。
2、目的基因克隆到载体LV6中
1)用NotI和BamHI双切酶向LV6进行双酶切，37℃酶切2h，酶切反应体系如表8 所示。
表8
10×Buffer 5μl
DNA 15μl
NotI 1μl
BamHI 1μl
ddH2O 28μl
2)琼脂糖电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收载体。
3)利用Entry One Step Cloning Kit，将上述扩增好的片段，重组克隆到线性化的LV6载体中，反应体系如下表9所示。
表9
5×CE Entry Buffer 4μl
LV6 1μl
Objective gene 2μl
Exnase Entry 2μl
ddH2O 11μl
运用移液器轻轻吹打，混匀以上各组成。置于37℃反应30分钟。30分钟后快速将EP管放于冰水上冷却5分钟，得到重组连接产物。每得到一个重组质粒后用相同方法将下一个质粒进行重组，直到最后得到含有CD137L、CD86、CD64、mIL-15和CD19这5个基因的重组质粒。
3、感受态细胞的制备：
1)从于37℃培养16小时的新鲜培养平板中挑取阳性转化DH5α单个菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃震荡培养3h。
2)保持无菌下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷(0℃预冷)的50ml聚丙烯管中，在冰上冷却10分钟，使培养物降温至0℃。
3)以4000转/分的转速在4℃下离心10min，弃去上层液体。
4)将管倒置1分钟，使剩下的少量培养液尽量流完。
5)以10ml用冰预冷(预冷至0℃)的0.1mol/L CaCl2重悬聚丙烯管中细胞沉淀物，重悬均匀后放于冰上。
6)以4000转/分的转速在4℃下离心10min，弃去上层液体。
7)收集到的菌体沉淀，以4000转/分的转速在4℃下再次离心10min，离心结束后，弃去上层液体。
8)用4ml用冰预冷(预冷至0℃)的0.1mol/L CaCl2(含体积百分数为20％甘油)重悬每份细胞，得到感受态细胞。
9)将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-80℃保存。
4、目的基因和载体连接后转化感受态细胞
1)从-80℃中取出感受态细胞(含有上述步骤所制备100μl感受态细胞)，放于冰上融化，待感受态细胞解冻后，加入10μl重组连接产物，用枪头轻轻混匀，在冰中放置30 min。
2)将EP管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的悬浮架上，放置90秒。
3)快速将EP管转移到冰浴中，使EP管快速降温冷却3min。
4)向每支EP管加入800μl LB培养基，然后将EP管转移到37℃摇床，250转/分钟，培育45min，使EP管中原有的100μl转化细菌复苏，得到细菌复苏培养物。
5)取200μl细菌复苏培养物，均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin LB平板上。
6)等平板上液体被吸收后，将平板倒置，于37℃培养箱中，培养16小时。
7)16小时后，平板上能长出重组菌落。从平板上挑取单个重组菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。
8)从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Ampicillin)LB培养基的试管中。
9)将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250转/分钟，培养16小时。
10)将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，(质粒抽提步骤详见质粒小提试剂盒说明书)。
11)将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下表10所示。
表10
10×Buffer 1μl
质粒 1μl
NotI 0.5μl
BamHI 0.5μl
ddH2O 7μl
12)酶切37℃，1小时后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。(条带位置为目的基因相应的核苷酸长度)
5、重组质粒测序验证并大量抽提.
1)取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。
2)测序结果显示与目的基因相符后，用保存的甘油菌液接种LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。
3)利用Axygen质粒大量抽提试剂盒(AP-MN-P-500)方法制备慢病毒包装质粒(pHelper)。
4)至此，载体构建实验完成。
6、携带目的基因的重组慢病毒包装
扩增后的重组质粒转染293T细胞，包装出重组慢病毒。本节以CD137L重组质粒为例介绍实验方法，其余四个重组质粒的包装与此相同，在此不再重复。
1)293T细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，按照5000个细胞/cm2接种15cm培养皿。
2)倾去培养液，用1ml D-Hank’s solution洗涤细胞两次。
3)加入1ml Trypsin-EDTA solution，混匀后，37℃放置2-3分钟。
4)小心吸去Trypsin-EDTA solution，加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。
5)将单细胞悬液接种又一15cm培养皿，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，混匀后37℃5％CO2培养过夜。
6)在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM，按质量比1:1比例加入重组质粒CD137L和包装质粒，混匀，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清DM EM，再加入300μl RNAi-mate，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20～25 分钟后即为转染混合物。
7)除去步骤5)的15cm培养皿中的培养液，加入8ml无血清的DMEM培养液。
8)将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃5％CO2培养箱中温育4-6小时。
9)吸弃细胞培养上清液，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液。37℃5％CO2 继续培养72小时，得到大量含重组质粒的慢病毒载体。
10)10)同理地，将剩余四个在重组质粒也按此操作步骤进行包装，最终得到含5个目的基因的重组质粒。
7、重组慢病毒收集
1)取第6部分9)步骤培养72小时的培养皿，将培养皿中的上清液吸到50ml离心管中，4℃，4000rpm离心4min。
2)离心后，将离心管上清液倒入50ml注射器内，用0.45um过滤膜过滤。
3)滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，2h。
4)将超速离心后的上清液收集分装至EP管中，得到纯化的含有目的基因的慢病毒表达载体。分装，贴上标签，-80℃冰箱保存。
8、含有目的基因慢病毒表达载体感染载体细胞K562
1)将含有目的基因的慢病毒表达载体以及polybrene从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶化。
2)将K562细胞从培养瓶中移到50ml离心管中，以800rpm转速离心5分钟。
3)离心后弃去培养上清，加入1640完全培养基吹打重悬细胞。
4)使用细胞计数板进行活细胞的计数。
5)将细胞悬液稀释成细胞密度为1×105细胞每毫升。
6)接种1ml细胞铺板于24孔板中，保证1ml细胞悬液中含有1×105个细胞。
7)根据参考细胞转染MOI值为100，吸取100ul1×108TU/ml慢病毒表达载体加入24孔板中。
8)向每孔中加入8ug polybrene，提高转染效率。
9)以3000g的离心力25℃离心2小时。
10)放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
11)8到12小时以后观察细胞形态，如果细胞状态与未感染无明显差异，表明慢病毒对细胞没有明显的毒性作用，继续培养，感染24小时后更换新鲜的培养基。
9、免疫磁珠分选免疫分子表达阳性的细胞
1)取第8部分11)步感染慢病毒72小时后的K562细胞，1×107个细胞。
2)细胞经1000rpm离心5分钟，弃上清液。
3)重新加入新鲜的1640完全培养基重悬细胞并计数细胞浓度。
4)取107个细胞到15ml离心管中1000rpm离心5分钟，弃上清液。
5)用100ul磁珠分选buffer重悬细胞并转移至1.5mlEP管中。
6)加入10ul PE标记免疫分子的流式抗体混匀并4℃避光孵育10分钟。
7)孵育完成后向EP管中加入1ml磁珠分选buffer。
8)300g离心力离心10分钟，弃去上清，再次加入1ml磁珠分选buffer清洗一次。
9)弃去上清并使用80ul磁珠分选buffer重悬细胞。
10)向EP管中加入20ul Anti-PE免疫磁珠并充分混匀，4℃避光孵育15分钟。
11)孵育完成后向EP管中加入1ml磁珠分选buffer。
12)300g离心力离心10分钟，弃去上清，再次加入1ml磁珠分选buffer清洗一次。
13)收集106个细胞并使用500ul磁珠分选buffer重悬细胞，得到细胞悬液。
14)将MS细胞分离柱安装在磁力架上并加入500ul磁珠分选buffer使其在重力作用下流完。
15)将细胞悬液加入到MS细胞分离柱中把未进行磁性标记细胞分离出来。
16)使用500ul磁珠分选buffer冲洗三次MS细胞分离柱。
17)将MS细胞分离柱从磁力架上取出并置于1.5ml EP管上，向MS细胞分离柱上快速加入1ml磁珠分选buffer立即推动活塞，将磁性标记细胞收集并计数。
18)将收集到的磁性标记细胞收集，300g离心弃去1ml磁珠分选buffer并选择合适培养瓶继续培养细胞。
10、挑单克隆细胞
1)取第9部分18步骤培养且经过分选的细胞1×105个。加入10ml新鲜的1640完全培养基重悬。
2)1000rpm离心5分钟，弃上清液。
3)重新加入10ml新鲜的1640完全培养基重悬细胞并计数细胞浓度。
4)根据细胞浓度，通过1640完全培养进行有限稀释方法取出200个细胞加入50ml离心管中。
5)向离心管中加入20ml新鲜的1640完全培养基吹打混匀细胞，得到细胞混合液。
6)取细胞混合液加入到96孔板中，每孔100ul。
7)在倒置显微镜中观察寻找单细胞的孔，并做好标记。
8)72小时后向标记孔中补充100ul的新鲜的1640。
9)7天后将细胞群从96孔板中转移至24孔板，继续扩增细胞建立单克隆细胞株。
11、流式细胞术检测K562细胞表面免疫分子表达情况
1)将所建立的单克隆细胞株扩增至1×107个细胞以上，取1×107个单克隆细胞，收集至离心管中。
2)1000rpm离心5分钟，弃上清液。
3)加入PBS重悬细胞并计数细胞浓度。
4)取106个细胞转移至1.5ml EP管中，离心并弃去上清。
5)离心并弃去95％乙醇，加入100ul含1％BSA的PBS重悬细胞。
6)加入20ul流式抗体并混匀，4℃避光孵育30分钟。
7)孵育完使用1ml含1％BSA的PBS洗涤细胞2次。
8)使用500ul鞘液混匀细胞，等待上机。
图1-图10可见表面构建分子稳定表达。
至此，经过检测，我们获得了稳定表达CD137L的K562细胞。以稳定表达CD137L的K562细胞，同理利用第8部分-第10部分技术方法稳定表达CD86、CD64、mIL-15和CD19。在此不再赘述(附图1至图10可见构建的5个分子在K562细胞中均表达且表达量较高)。
12、辐照技术处理人工抗原提呈细胞
1)将稳定表达CD137L、CD86、CD64、mIL-15和CD19的K562细胞扩增，并收集至离心管中。
2)1000rpm离心5分钟，弃上清液。
3)加入PBS重悬细胞并计数细胞浓度。
4)调整细胞浓度至106/ml，将调整好浓度细胞悬液转移至15ml离心管中，确保每管10ml 细胞悬液，封口膜密封。
5)将细胞悬液送至辐照中心(云南华源核辐射技术有限公司)进行辐照，辐照剂量为 100Gy。
辐照完细胞使用细胞冻存液常规冻存，液氮保存。
13、CD19 CAR-T细胞扩增方法
1)制备人外周血单核淋巴细胞，细胞浓度为106cells/ml。
2)按照1×106cells/ml将人外周血单核淋巴细胞种在培养板中，放于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h，得到细胞悬液；其中，培养板中的培养基为含体积百分浓度为10％BI胎牛血清的RPMI 1640培养基；
3)向预热至37℃的lonza核转染试剂中加入PB-19CAR-puro至终浓度为0.1ug/ul和S uper PiggyBac Transposase至终浓度为0.05ug/ul，混合均匀，之后向其中以体积比为1:1 比例加入步骤(2)孵育得到的细胞悬液，得到混合液；
4)用lonza电转仪的U-014程序对步骤3)得到的混合液进行电转，再以体积比为2:1 比例加入预热至37℃的含体积百分浓度为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，接着将细胞转移到培养板中在37℃温箱中孵育2小时；
5)孵育完成后将细胞转移到离心管中，离心，弃上清，再用含体积百分浓度为10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞制备成浓度为106cells/ml的细胞悬液并放于培养板中，置于37℃温箱中过夜，得到电转CAR-T细胞；
6)次日将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞用100Gy进行辐照；将辐照后的CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞以数量比为1:2的比例加入到步骤 5)得到的电转CAR-T细胞中，再加入IL-21至终浓度为30ng/ml和IL-2至终浓度为300IU/ ml；在培养第7天、14天、28天，再次以细胞数量比为1:2比例将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞重复刺激CD19 CAR-T细胞，同时加入30ng/ml的IL-21和300I U/ml的IL-2；连续培养至28天以获得足够量的CD19-CAR-T细胞(附图11-图19显示经过 CD137L CD86 CD64 mIL-15CD19-aAPC刺激的CD19 CAR-T细胞相比于未刺激的CD1 9 CAR-T细胞在第1、7、14、28天细胞增殖状态好且呈对数级增长)。
7)通过构建新型人工抗原递呈细胞，以此作为扩增的饲养细胞，从单核淋巴细胞电转后 CD19 CAR后经CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC特异性扩增CD19 CAR-T淋巴细胞。通过流式细胞分析(附图20-图27显示经过CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aA PC特异性刺激的CD19 CAR-T淋巴细胞在增殖的各个时期其表面分子均稳定表达)、细胞毒性试验等表明所扩增的CD19 CAR-T细胞纯度高和细胞毒性强，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应(附图28-图29可见经过CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC特异性刺激的CD1 9 CAR-T有较强的肿瘤细胞杀伤效应)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64mIL-15 CD19-aAPC，其细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19。
2.根据权利要求1所述的人工抗原递呈细胞，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562细胞。
3.权利要求1所述的人工抗原递呈细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别构建包含CD137L、CD86、CD64、mIL-15、CD19的慢病毒表达载体；
（2）将包含CD137L慢病毒表达载体转染相应的细胞，挑单细胞克隆，流式细胞分选，获得CD137L稳定表达的细胞CD137L-aAPC；
（3）在步骤（2）获得的CD137L-aAPC基础上通过包含CD86慢病毒表达载体转染来导入CD86，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86-aAPC；
（4）在步骤（3）获得的CD137L CD86-aAPC基础上通过包含CD64慢病毒表达载体转染来导入CD64，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64-aAPC；
（5）在步骤（4）获得的CD137L CD86 CD64-aAPC基础上通过包含mIL-15慢病毒表达载体转染来导入mIL-15，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC；
（6）在步骤（5）获得的 CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC 基础上通过包含CD19慢病毒转染表达载体来导入CD19，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64 mIL-15CD19-aAPC。
4.根据权利要求3所述的人工抗原递呈细胞的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述的相应的细胞为K562细胞。
5.权利要求1或2所述的人工抗原递呈细胞在CD19-CAR T细胞扩增中的应用。
6.一种CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，利用权利要求1所述人工抗原递呈细胞进行扩增，包括以下步骤：
（1）制备人外周血单核淋巴细胞，细胞浓度为106cells/ml；
（2）按照1×106cells/ml将人外周血单核淋巴细胞种在培养板中，放于37℃、5%CO2培养箱中孵育2h，得到细胞悬液；其中，培养板中的培养基为含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基；
（3）向预热至37℃的lonza核转染试剂中加入PB-19CAR-puro至终浓度为0.1ug/ul和Super PiggyBac Transposase至终浓度为0.05ug/ul，混合均匀，之后向其中以体积比为1:1比例加入步骤（2）孵育得到的细胞悬液，得到混合液；
（4）用lonza电转仪的U-014程序对步骤（3）得到的混合液进行电转，再以体积比为2:1比例加入预热至37℃的含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，接着将细胞转移到培养板中在37℃温箱中孵育2小时；
（5）孵育完成后将细胞转移到离心管中，离心，弃上清，再用含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞制备成浓度为106 cells/ml的细胞悬液并放于培养板中，置于37℃温箱中过夜，得到电转化CAR-T细胞；
（6）次日将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞用100Gy进行辐照；将辐照后的CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞以数量比为1:2的比例加入到步骤（5）得到的电转化CAR-T细胞中，再加入IL-21至终浓度为30ng/ml和IL-2至终浓度为300IU/ml；在培养第7天、14天、28天，再次以细胞数量比为1:2比例将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞重复刺激CD19 CAR-T细胞，同时加入30ng/ml 的IL-21和300IU/ml的IL-2；连续培养至28天以获得足够量的CD19-CAR-T细胞。
7.根据权利要求6所述的CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，步骤（2）中所采用的培养基为预热的培养基，预热温度为37℃。
8.根据权利要求6所述的CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，步骤（5）所述的离心参数为140g，离心时间为8min。
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