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CN116083370A - 一种稳定构建表达突变型shp2重组细胞株的方法 - Google Patents

一种稳定构建表达突变型shp2重组细胞株的方法 Download PDF

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CN116083370A
CN116083370A CN202211560190.3A CN202211560190A CN116083370A CN 116083370 A CN116083370 A CN 116083370A CN 202211560190 A CN202211560190 A CN 202211560190A CN 116083370 A CN116083370 A CN 116083370A
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egfp
seq
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夏琴
李杨
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Beijing Institute of Technology BIT
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Abstract

本发明公开了一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。构建方法包括如下步骤：(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装成病毒；(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选阳性后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。本发明的构建方法得到的细胞株稳定性强，为下游白血病的治疗及药物筛选提供了很好的工具。

Description

一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法。
背景技术
SHP2(Src-homology containing phosphatase 2)广泛表达于各种组织细胞，并通过Ras-MAPK、JAK-STAT、PI3K/AKT等信号通路在细胞的增殖、分化、迁移以及周期维持等多种细胞功能中发挥重要作用。SHP2是由PTPN11编码的一种非受体蛋白酪氨酸磷脂酶。SHP2在结构上包含两个Src同源-2结构域(即N-SH2和C-SH2)、一个催化结构域(PTP)和一个C-端尾链。静息状态下，N-SH2结构域和PTP结构域上的氨基酸残基之间通过相互作用，使SHP2分子维持在一种非活化的自抑制构象；在细胞因子、生长因子等的刺激作用下，SHP2暴露出催化位点，产生催化活性。
PTPN11的生殖细胞或者体细胞突变引起的SHP2催化功能的高度活化在患有先天性疾病，比如努南(Noonan)综合征、LEOPARD综合征以及血液瘤，比如青少年髓单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、B细胞型急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、急性粒细胞白血病等的病人中都得到确证。此外，PTPN11的活化性突变也存在于比如肺癌、结肠癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和肝癌等多种实体瘤中。同时，SHP2在PD 1/PD L1介导的肿瘤免疫逃逸中也扮演着重要角色。因此，SHP2蛋白在人肿瘤和其他疾病中的活化或上调使其成为发展创新疗法的理想靶标，针对SHP2药物开发已成为未来可期的重要策略。建立一种可稳定表达激活型SHP2细胞株将为疾病的机制及相关领域的基础及临床转化研究具有重要的意义和广阔的应用前景。
与大多数SHP2激活突变不同，SHP2中的T507K突变表现出致癌的Ras样转化活性。T507K取代改变了SHP2底物特异性及其变构调节机制。尽管SHP2/T507K存在于与WT酶相似的封闭的、自抑制的构象中，但其N-SH2和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域之间的相互作用减弱，使得SHP2/T407K对支架蛋白Grb2相关结合蛋白1(Gab1)具有更高的亲和力。另外，T507K取代改变了SHP2活性位点的结构，导致SHP2底物对Sprout1的偏好发生变化，Sprout1是已知的Ras信号负调节因子，也是潜在的肿瘤抑制因子SHP2/T507K在底物特异性上的改变及其与Gab1的优先结合使突变SHP2能够更有效地在pTyr-53处去磷酸化Sprout1。这种去磷酸化过度激活Ras信号，这可能是SHP2/T507K的Ras样转化活性的原因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何构建一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株。
本发明的技术方案为：一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株的构建方法，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；
(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装病毒；
(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。
进一步地，构建方法包括如下步骤：
(1)pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)重组质粒的构建
将绿色荧光蛋白EGFP连接至高拷贝质粒载体pCDH-3HA-Puro上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的SHP2-T507K)连接至载体pCDH-3HA-Puro-EGFP，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒；
(2)pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒导入细胞
利用PEI转染试剂将pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、psPAX2和pMD2G质粒转染进293T细胞中，然后将转染后的293T细胞扩大培养；转染24h后的收集病毒上清液；采用超速离心的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，并根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标；将病毒加入待建立稳转表达的细胞中。
(3)pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)细胞筛选
利用Puromycin筛选细胞，获得阳性表达率高的细胞群；通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，或利用流式分选，选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株；通过Western-bolt实验，利用HA抗体进一步对细胞株进行鉴定。
进一步地，所述的步骤(1)中，具体包括：
1a)用Taq DNA聚合酶分别对EGFP(引物1，引物2)及pCDH-3HA-Puro(引物3，引物4)进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
1b)将回收后的EGFP、pCDH-3HA-Puro、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物；
1c)将步骤1b)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；
1d)用Taq DNA聚合酶分别对pCDH-3HA-Puro-EGFP(引物5，引物6)及SHP2cDNA(引物7，引物8)进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
1e)将回收后的pCDH-3HA-Puro-EGFP、SHP2、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物；
1f)将步骤1e)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2质粒。
1g)用Q5点突变试剂盒以pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2为模板进行点突变(引物9，引物10)，对所得产物进行电泳以及切胶回收，得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物；
1h)将步骤1g)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒。
进一步地，所述的PCR扩增的过程中，所用的引物序列为引物1(SEQ ID No.4)、引物2(SEQ ID No.5)、引物3(SEQ ID No.6)、引物4(SEQ ID No.7)、引物5(SEQ ID No.8)、引物6(SEQ ID No.9)、引物7(SEQ ID No.10)、引物8(SEQ ID No.11)、引物9(SEQ IDNo.12)、引物10(SEQ ID No.13)。
进一步地，所述质粒载体pCDH-3HA-Puro的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述载体pCDH-3HA-Puro-EGFP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述的步骤(2)中PEI转染试剂的体积与pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、psPAX2和pMD2G混合质粒的质量比为2:1，其中体积以L计，质量以g计。
进一步地，所述的步骤(2)中PEI转染试剂的体积与pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、pMD2.G、psPAX2混合质粒的质量比为2:1。
进一步地，所述的步骤(3)中利用Puromycin筛选细胞初始使用的Puromycin浓度为全部杀死待建立稳转表达的细胞的最低浓度；待对照组细胞全部死亡后，在单克隆形成之前，Puromycin浓度为最低浓度的1/2；待挑选单克隆后，Puromycin浓度维持在最低浓度的1/4。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于外源重组质粒pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)构建的稳定高表达突变型SHP2的重组细胞。该细胞株的筛选可通过Puromycin和/或GFP荧光分选进行，并可利用HA抗体对细胞株进行western-blot鉴定。此细胞的建立可以为以肿瘤的SHP2通路相关药物筛选及耐药研究提供细胞模型，提高筛选的特异性及灵敏性；也可应用于SHP2影响的相关通路蛋白的差异性比较研究。本发明的构建为下游白血病的治疗及药物筛选提供了很好的工具。
附图说明
图1pCDH-3HA-Puro质粒图谱
图2pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒图谱
图3为反向测序结果(部分)；
图4为突变型与野生型质粒对比(部分)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
1、pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)的构建
1)设计并合成以下引物：
引物 序列
SEQ ID No.4 引物1 AGATTACGCTCTCGAGAATTCGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
SEQ ID No.5 引物2 ATCCGATTTAAATTCGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT
SEQ ID No.6 引物3 GAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCTAGATAACTGAGGCCGC
SEQ ID No.7 引物4 CGAATTCTCGAGAGCGTAATCTGGAACGTCATATGGATAGGA
SEQ ID No.8 引物5 ATGACATCGCGGAGATGGTTTCACCCAAATATCACTGGTGTG
SEQ ID No.9 引物6 ATCCGATTTAAATTCGAATTCTCATCTGAAACTTTTCTGCTG
SEQ ID No.10 引物7 GAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCTAGATAACTGAGGCCGC
SEQ ID No.11 引物8 AAACCATCTCCGCGATGTCATCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
SEQ ID No.12 引物9 CTGTGCTTCTTTCTGGACCAT
SEQ ID No.13 引物10 TACCGATTTATCTATATGGCG
2)用Taq DNA聚合酶分别对EGFP(引物1，引物2)及pCDH-3HA-Puro(核苷酸序列如SEQ ID No.2，质粒图谱如图1所示)(引物3，引物4)进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
3)将回收后的EGFP、pCDH-3HA-Puro、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物(核苷酸序列如SEQ ID No.3，质粒图谱如图2所示)；
4)将步骤3)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物转化至感受态大肠杆菌中。转化过程为：取10μl产物加入到25μl感受态大肠杆菌中，冰上静置30min，42℃热激90s，冰上静置5min；向其中加入200μl不含抗生素的培养基后，37℃220rpm摇1h后。随后涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒。
5)用Taq DNA聚合酶分别对pCDH-3HA-Puro-EGFP(引物5，引物6)及SHP2 cDNA(引物7，引物8)进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
6)将回收后的pCDH-3HA-Puro-EGFP、SHP2、同源重组酶以及缓冲液混合均匀后，置于50℃孵育15min，得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物；
7)将步骤6)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物转化至感受态大肠杆菌中(转化过程如步骤4)所述)，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2质粒。
8)用Q5点突变试剂盒以pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2为模板进行点突变(引物9，引物10)，对所得产物进行电泳以及切胶回收，得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物；
9)将步骤8)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物转化至感受态大肠杆菌中(转化过程如步骤4)所述)，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒。
2、表达绿色荧光的肝癌细胞(EGFP)单克隆筛选
1)pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒转染293T细胞：将细胞按照5×105/孔均匀地接种于6孔板中，培养24h；将pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)(1.96μg)、pMD2.G(0.58μg)、psPAX2(1.84μg)混合质粒与PEI转染试剂按照1:2(g/L)分别加入到100μl DMEM中进行稀释，将各组溶液分别混合均匀，室温放置5min；然后将含PEI转染试剂的DMEM加入到含pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒的DMEM中，混匀，室温放置20min，随后，逐滴加入到对应的孔中，5h后更换为新的完全培养基，然后放入CO2培养箱中继续培养24h；吸取上清冻存于-80℃冰箱中并向培养皿中补加完全培养放入37℃5％ CO2培养箱中继续培养；24h后取出，取上清，并于37℃水浴锅中复苏昨日冻存上清。提前预冷离心机4℃，将两天收获的上清放于离心机2000g离心10min(目的是清除剩余的细胞碎片)。离心后吸取上清于离心管中，将离心管放于4℃预冷的离心机13000r/min(大约18000g)离心两个半小时，升速9降速0；离心结束后弃去上清，用DMEM完全培养基100倍浓缩慢病毒，并将其分装于冻存管中放于-80℃保存。
2)病毒侵染目的细胞：测量病毒滴度；
将对数生长期的目的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜；将70-80％铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS稀释的浓缩病毒，加入10ug/ml polybrene，混合均匀后，800g，32℃，离心感染1h后放入37℃5％ CO2培养箱中继续培养。8-16h后将培养基更换为DMEM完全培养基。
3)利用Puromycin对细胞的筛选：
提前24h将目的细胞铺入24孔板，细胞量根据细胞生长状态及大小调节，在24h后，细胞密度在70％左右；细胞生长24h后，加入不同终浓度的Puromycin，再培养48h，显微镜下观察，将全部杀死细胞的最低浓度的Puromycin组作为工作浓度。
慢病毒感染48-72h后(70-80％融合度)，将细胞继续培养于含适当浓度Puromycin的培养液中，筛选48h。将Puromycin浓度减至最低浓度的1/2继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。
4.1)利用荧光显微镜对细胞的筛选：
通过荧光显微镜，在细胞培养皿下方标记绿色荧光表达高的细胞群落，然后用细胞刮刀刮下标记处细胞群落，并加入含Puromycin的EP管中，重悬后，将单细胞稀释铺板到96孔板继续扩大培养；在继续培养过程中，再次挑选荧光表达强烈的细胞群落，再次扩大培养；在扩大培养过程中，控制Puromycin浓度为最低浓度的1/4，使得其不影响细胞的正常生长；并在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，直至筛选出表达绿色荧光蛋白的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)细胞系。
4.2)利用流式分选细胞：
或将细胞制成单细胞悬液样品，上机前用300目滤网过滤；利用流式细胞仪分选出含绿色荧光的细胞进行收集，并接种到含Puromycin(最低浓度的1/4)的培养基中培养。
5)通过Western-bolt实验，利用HA抗体进一步对细胞株进行鉴定：
用RIPA裂解液裂解细胞后提取细胞总蛋白，用BCA法对蛋白含量进行定量。经SDS-PAGE电泳、转膜、免疫染色(一抗：HA小鼠单克隆抗体，购于MBL公司；二抗：HRP型羊抗小鼠IgG，购于博士德生物工程有限公司)和显影，对所得细胞株进行鉴定。

Claims (8)

1.一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株，其特征在于，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
2.权利要求1所述的一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；
(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装成病毒；
(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选阳性后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将绿色荧光蛋白EGFP连接至高拷贝质粒载体pCDH-3HA-Puro上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示SHP2(T507K)连接至载体pCDH-3HA-Puro-EGFP，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒；
(2)利用PEI转染试剂将pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、psPAX2和pMD2G质粒转染进293T细胞中，然后将转染后的293T细胞扩大培养；转染24h后的收集病毒上清液；采用超速离心的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，将病毒加入待建立稳转表达的细胞中。
(3)利用Puromycin筛选细胞，获得阳性表达率高的细胞群；通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，或利用流式分选，选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株；通过Western-bolt实验，利用HA抗体进一步对细胞株进行鉴定。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体方法为：
1a)用Taq DNA聚合酶分别对EGFP及质粒载体pCDH-3HA-Puro进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
1b)将回收后的EGFP、pCDH-3HA-Puro、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物；
1c)将步骤1b)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；
1d)用Taq DNA聚合酶分别对pCDH-3HA-Puro-EGFP及SHP2 cDNA进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
1e)将回收后的pCDH-3HA-Puro-EGFP、SHP2、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物；
1f)将步骤1e)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2质粒。
1g)用Q5点突变试剂盒以pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2为模板进行点突变，对所得产物进行电泳以及切胶回收，得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物；
1h)将步骤1g)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1a)中，对EGFP扩增所用的引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，对pCDH-3HA-Puro扩增所用的引物如SEQ IDNo.6和SEQID No.7所示，步骤1d)中，对pCDH-3HA-Puro-EGFP扩增所用的引物如SEQ ID No.8和SEQ IDNo.9所示，对SHP2 cDNA扩增所用的引物如SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11所示，步骤1g)中，对pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2定点突变所使用的引物如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示。
6.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述质粒载体pCDH-3HA-Puro的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中PEI转染试剂的体积与pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、psPAX2和pMD2G混合质粒的质量比为2:1，其中体积以L计，质量以g计。
8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)中利用Puromycin筛选细胞初始使用的Puromycin浓度为全部杀死待建立稳转表达的细胞的最低浓度；待对照组细胞全部死亡后，在单克隆形成之前，Puromycin浓度为最低浓度的1/2；待挑选单克隆后，Puromycin浓度维持在最低浓度的1/4。
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